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Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren.
In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert.
Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können.
Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist.
Zielsetzung
Die Entwicklung von Präventionsstrategien zur Senkung der Morbidität und Mortalität aufgrund von kardiovaskulären Erkrankungen (KVE) in der Bevölkerung stellt eine Hauptaufgabe der Epidemiologie und Public Health Forschung dar.
In den vergangenen 20 Jahren rückte die Hochrisikoprävention im Zuge der Weiterentwicklung der Scoringsysteme für das KVE Hochrisiko-Screening in den Fokus der Leitlinien zur KVE Prävention.
Jedoch sind die größten Erfolge aus einer komplementären Strategie aus Hochrisiko- und Populationsprävention mit Priorität auf der Reduktion der Exposition von Risikofaktoren für KVE in der gesamten Population zu erwarten.
Die Grundvoraussetzung für die Entwicklung effizienter, populationsweiter Präventionsprogramme ist das Verständnis einerseits der Rolle von Risikofaktoren bei der Krankheitsentstehung und andererseits der Bedeutung der Risikofaktoren auf Populationsebene.
Der Populations-assoziierte Risikoanteil (PAF) ist das bevorzugte statistische Maß zur Quantifizierung des Effekts von Risikofaktoren auf Populationsebene, da er neben der Effektstärke eines Risikofaktors auch dessen Prävalenz berücksichtigt.
In der Praxis erfolgt die Berechnung des PAF in multifaktoriellen Situationen mithilfe von Adjustierungsansätzen oder Partialisierungsansätzen.
Partialisierungsansätze, zu denen auch der gemittelt sequenzielle PAF (gsPAF) gehört, erfüllen die Additivitätseigenschaft.
Insbesondere der gsPAF kommt daher in der praktischen Anwendung zunehmend häufiger zum Einsatz.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung des gsPAF am Beispiel der Epidemiologie von KVE.
Methoden
In Projekt 1 erfolgt die theoretische Abgrenzung des gsPAF von anderen Adjustierungs- und Partialisierungsverfahren in Bezug auf Intention, Definition, Modellvoraussetzungen und -annahmen und Interpretation. Diese verschiedenen Konzepte werden in einer einheitlichen mathematischen Symbolik dargestellt, um das Verständnis zu erleichtern und Abweichungen in den Definitionen hervorzuheben. Anschließend wird in Projekt 2 der praktische Vergleich von modellbasierten Punktschätzern vorgenommen. Im Rahmen der Sekundäranalyse der ProsCIS-Studie über den Populationseinfluss von Risikofaktoren auf schlechtes Outcome nach Schlaganfall werden dem gsPAF ein additiver und ein multiplikativer Adjustierungsansatz gegenübergestellt und die Schätzergebnisse hinsichtlich Übereinstimmung der Größenordnung und Rangfolgen analysiert. In Projekt 3 werden im Rahmen einer Simulationsstudie nach dem proof-of-concept-Prinzip die asymptotischen Eigenschaften existierender modellfreier und modellbasierter Schätzer des gsPAF in Verbindung mit resamplingbasierten Konfidenzschätzern in einer Situation mit einem binären Outcome und drei binären Risikofaktoren unter insgesamt 296 Modellsituationen charakterisiert. Dabei wird die Abhängigkeit von der Stichprobengröße, der Prävalenz des Outcomes, der Prävalenz und Effektstärke der Risikofaktoren, der stochastischen Abhängigkeit der Risikofaktoren und ihrer Effekte auf das Outcome, der Vollständigkeit des statistischen Modells sowie des Outcome-Mechanismus untersucht. Abschließend erfolgt in Projekt 4 die Demonstration der gsPAF-Schätzung exemplarisch im Rahmen der Sekundäranalyse des deutschen Arms der EUROASPIRE IV-Studie. Hier wird der Einfluss von Baselinefaktoren auf das Auftreten rekurrenter kardiovaskulärer Ereignisse nach erstmaliger Hospitalisierung auf Populationsebene modelliert. Die Ergebnisse werden anschließend einer umfassenden Methodenkritik unterzogen. Dazu wird die Modellanpassung der Regressionsmodelle überprüft, die Performanz der gsPAF-Schätzung mit Hilfe der zuvor entwickelten Simulationsstudie evaluiert, eine exemplarische Stichprobenumfangsplanung durchgeführt sowie die Angemessenheit der Modellannahmen des gsPAF diskutiert.
Ergebnisse
%Die Möglichkeiten der statistischen Modellierung von PAF sind nahezu unbegrenzt.
Projekt 1: Adjustierungs- und Partialisierungsmethoden beantworten verschiedene Fragestellungen. Dies resultiert aus dem unterschiedlichen Umgang beider Methoden mit Subgruppen, die bezüglich mehrerer Risikofaktoren gleichzeitig exponiert sind, und führt infolgedessen auch zu unterschiedlichen Interpretationen. Der PAF beschreibt den Anteil an der Ereigniswahrscheinlichkeit, der mit dem Vorliegen eines Risikofaktors assoziiert ist. Für den gsPAF muss zusätzlich betont werden, dass der Effekt in Subgruppen mit mehreren Risikofaktoren auf additive Weise zerlegt und der Anteil des Zusammenwirkens der beteiligten Risikofaktoren (Surplus) zu gleichen Anteilen den Risikofaktoren zugewiesen wird.
Dahinter steckt die Annahme, dass dieser Teil nur durch das Zusammenwirken überhaupt entstehen konnte, wofür beide Risikofaktoren gleichermaßen verantwortlich gemacht werden. Im Gegensatz zu Adjustierungsmethoden erfüllen Partialisierungsmethoden zwar die Additivitätseigenschaft, gehen jedoch gleichzeitig mit spezifischen Modellannahmen einher, die Kenntnisse über die kausalen Verläufe der Risikofaktoren voraussetzen. Im Falle des gsPAF ist dies die Annahme, dass unter den betrachteten Risikofaktoren keine hierarchischen Abhängigkeiten herrschen.
Die theoretische Basis des gsPAF ist derzeit nur für dichotome Outcomes umfangreich erarbeitet und deckt hier alle Ansprüche für den Praxiseinsatz ab: Modellfreie und modellbasierte Punktschätzer, zugehörige Varianzschätzer mit und ohne Berücksichtigung von Störgrößen und Konfidenzschätzer stehen zur Verfügung. Mathematische Eigenschaften wie Symmetrie, Dummyeigenschaft, Additivität und (internen) marginalen Rationalität des gsPAF und anderer Partialisierungsansätze wurden erörtert. Die verfügbare Software stellt derzeit nur Ausschnitte des Methodenspektrums zur Schätzung des gsPAF bereit und ist deshalb für den Einsatz in der empirischen Forschung zu KVE nur begrenzt nützlich. Eine erfolgreiche und effiziente Recherche zum gsPAF wird durch die uneinheitliche Verwendung der Fachtermini ''partieller'' und ''gemittelt sequenzieller'' PAF erschwert.
Projekt 2: Der Vergleich von Ergebnissen aus einem Adjustierungsansatz mit Ergebnissen aus einem Partialisierungsansatz ist über den kombinierten PAF möglich, da der unterschiedliche Umgang mit Subgruppen, die bezüglich mehrerer Risikofaktoren gleichzeitig exponiert sind, nicht zum Tragen kommt, solange nur der kombinierte Risikofaktor im statistischen Modell berücksichtigt wird. Anhand des Datenbeispiels der ProsCIS-Studie wurde für diesen Parameter keine Abweichung der Ergebnisse des multiplikativen Ansatzes (Faktor 1,0) und nur eine geringe Abweichung des additiven Ansatzes (Faktor 1,1) vom gsPAF beobachtet. Die Größenordnungen der Schätzwerte einzelner Risikofaktoren sowie deren Summe sind zwischen Adjustierungs- und Partialisierungsmethoden nicht vergleichbar. Die Ergebnisse aus dem multiplikativen Regressionsmodell weichen bis zu einem Faktor von 1,3 von den Schätzwerten des gsPAF ab. Die Abweichungen aus dem additiven Regressionsmodell gehen deutlich darüber hinaus. Der gsPAF liefert nahezu additive Schätzergebnisse, während die Summe der risikofaktorspezifischen Schätzwerte aus den beiden Adjustierungsmethoden den kombinierten PAF übersteigt. Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien wird die Rangfolge der Risikofaktoren im Datenbeispiel nicht wesentlich von der Schätzmethode beeinflusst.
Projekt 3: Die Simulationsstudie charakterisiert die modellfreien und modellbasierten Punktschätzer des gsPAF und belegt deren Konsistenz und (asymptotische) Erwartungstreue, sofern das statistische Modell korrekt spezifiziert ist. Es zeigt sich, dass in kleinen Stichproben oder bei kleinen Ereigniswahrscheinlichkeiten der modellbasierte Schätzer erwartungstreu und damit dem modellfreien Schätzer überlegen ist. Die Berechnungszeit des modellbasierten Schätzers steigt jedoch superlinear mit steigender Stichprobengröße und mit steigender Anzahl von Variablen im Regressionsmodell an. Resamplingbasierte Methoden wie Bootstrap Normal, Perzentil und Jackknife eignen sich für die Schätzung von Konfidenzintervallen des gsPAF. Auch hier ist ein superlinearer Anstieg der Berechnungszeit insbesondere in Verbindung mit dem modellbasierten Schätzer mit steigender Stichprobengröße und mit steigender Anzahl der Risikofaktoren im statistischen Modell zu beobachten.
Biologische Interaktionen von Risikofaktoren im Outcome-Mechanismus verändern die Wahrscheinlichkeit für Ereignisse in Subgruppen mit mehreren Risikofaktoren weg von einem stochastisch unabhängigen und hin zu einem stochastisch abhängigen Szenario. Diese Ereigniswahrscheinlichkeiten werden durch die Anpassung der Parameter im binär-logistischen Regressionsmodell angenähert. Modelle ohne Interaktionsterme repräsentieren aus statistischer Sicht immer einen Outcome-Mechanismus mit stochastischer Abhängigkeit. Interaktionsterme sind nur dann als biologische Interaktionen zu interpretieren, wenn der biologische Outcome-Mechanismus korrekt durch die logistische Regressionsfunktion beschrieben wird. Anderenfalls dienen die Interaktionsterme nur der Modellanpassung und spiegeln nicht die An- oder Abwesenheit biologischer Interaktionen wider. Die Vernachlässigung von relevanten Interaktionstermen führt zu ernstzunehmenden Verzerrungen der Modellparameter und infolgedessen zu stark verzerrten gsPAF-Schätzungen. Dies ist jedoch durch eine gewissenhafte Überprüfung der Modellanpassung während der Auswertung vermeidbar. Grundsätzlich liefert die modellbasierte Schätzung des gsPAF mit allen Interaktionstermen immer unverzerrte Ergebnisse.
Die benötigte Stichprobengröße für eine aussagekräftige Schätzung des gsPAF übersteigt die für relative Maße und steigt mit der Anzahl zu betrachtender Variablen im Modell und mit sinkender Prävalenz des Outcomes an. Während für den PAF steigende Effektgrößen der Risikofaktoren die benötigte Stichprobengröße verkleinern, wurde in der Simulationsstudie ein umgekehrter Zusammenhang für den gsPAF beobachtet.
Projekt 4: Die in den Projekten 1 und 3 gewonnenen Erkenntnisse wurden im Rahmen der Datenanalyse der EUROASPIRE IV-Studie am Praxisbeispiel untersucht und diskutiert. Das Regressionsmodell ohne Interaktionsterme lieferte verzerrte gsPAF-Schätzungen, was durch die Berücksichtigung von Interaktionstermen korrigiert werden konnte. Die resamplingbasierten Konfidenzintervalle überdeckten große Teile des Wertebereiches des gsPAF und liefern somit keine nützlichen Informationen für die epidemiologische Interpretation der Studienergebnisse. Die Validierung der gsPAF-Schätzungen mit Hilfe der Simulationsstudie machte auf die mangelnde Performanz der Punkt- und Konfidenzintervalle aufgrund der verhältnismäßig kleinen Stichprobengröße für die betrachtete Anzahl der Risikofaktoren aufmerksam. Die benötigte Stichprobengröße für eine performante Schätzung des gsPAF in einer Datensituation wie in der EUROASPIRE IV-Studie beobachtet wurde mit Hilfe der Simulationsstudie ermittelt.
Dabei wurde deutlich, dass etwa das Zehnfache der vorliegenden Stichprobengröße benötigt würde, um den modellfreien Schätzer des gsPAF zusammen mit resamplingbasierten Konfidenzintervallen mit einer ausreichenden Performanz schätzen zu können.
Da unter den in EUROASPIRE IV betrachteten Risikofaktoren hierarchische Abhängigkeiten vorliegen könnten, sind die Voraussetzungen für die Schätzung des gsPAF nicht erfüllt. Anstelle des gsPAF könnte im vorliegenden Beispiel ein adjustierter Schätzer zum Einsatz kommen, oder, sofern genügend Informationen über die kausalen Zusammenhänge unter den Risikofaktoren vorliegen, auch sequenzielle oder proportionale Partialisierungsansätze. Die durchgeführte Methodenkritik in Projekt 4 ermöglicht es, weitere Schritte zur Steigerung der Aussagekraft der Studienergebnisse zu unternehmen, beispielsweise durch die Wahl geeigneter statistischer Methoden und die Erhöhung des Stichprobenumfangs.
Schlussfolgerungen
Die Grundvoraussetzungen für die Gewinnung qualitativ hochwertiger Daten sind bekanntermaßen die Wahl eines der Forschungsfrage angemessenen Studiendesigns sowie die sorgfältige Studienplanung. Aufgrund der hohen Anzahl der Risikofaktoren und Störgrößen für kardiovaskuläre Erkrankungen sowie der Komplexität ihrer kausalen Verläufe erfordern Beobachtungsstudien zu KVE große Stichproben, um eine unverzerrte und valide Schätzung der Effekte von Risikofaktoren zu ermöglichen.
Doch die gewonnenen Erkenntnisse eignen sich nur dann für Schlussfolgerungen im epidemiologischen und Public Health Kontext dann, wenn auch die statistische Analyse der Studiendaten mit einer ebenso hohen Qualität erfolgt.
Eine qualitativ hochwertige Datenanalyse zeichnet sich aus durch
(1) die Auswahl der statistischen Methoden passend zur Forschungsfrage,
(2) die Berücksichtigung aktueller methodischer Forschungsergebnisse,
(3) die sorgfältige Überprüfung der Modellannahmen und Modellanpassung,
(4) die Sicherstellung und Überprüfung einer guten Performanz der Punkt- und Konfidenzschätzer und
(5) die realistische Interpretation der Ergebnisse unter Berücksichtigung der Modellvoraussetzungen und -annahmen.
Ein gewissenhafter Umgang mit den statistischen Methoden ist erforderlich, um belastbare Schlussfolgerungen aus Beobachtungsstudien ziehen zu können. Dies gilt insbesondere im Kontext von Sekundärdatenanalysen, die einen beträchtlichen Anteil der Publikationen darstellen. Simulationsstudien sind ein schlagkräftiges Werkzeug für die Validierung der verwendeten statistischen Methoden und ermöglichen die Einschätzung des Informationsgehaltes von Analyseergebnissen. Sie sind ausgesprochen flexibel und lassen sich an beliebige Datensituationen anpassen. Das macht sie zu einem unverzichtbaren Qualitätskriterium für die Publikation empirischer Studien. Jeder Validierungsschritt trägt wesentlich zu einer verbesserten Qualität der Publikationen bei. Damit entsteht eine solide Basis, um die kausalen Verläufe der Risikofaktoren aufzudecken und die Entwicklung von Präventionsprogrammen zur Verbesserung des Gesundheitsstatus in der Population durch Reduktion der Morbidität und Mortalität von KVE voranzubringen.
Depressionen und Angststörungen sind die beiden häufigsten psychischen Erkrankungen. Für Angststörungen wurde in zahlreichen Untersuchungen die Bedeutung veränderter Muster in den basalen emotional-assoziativen Lernprozessen für die Ätiologie und Aufrechterhaltung der Erkrankung gezeigt. Hierzu zählen eine verstärkte Akquisitionsreaktion auf den konditionierten Stimulus, Defizite in der Inhibition der Furchtreaktion auf den Sicherheit signalisierenden Stimulus, Übergeneralisierung und Beeinträchtigungen in der Extinktion konditionierter Reaktionen.
Aufgrund der hohen Prävalenzen einer Komorbidität mit Depressionen rückte in den letzten Jahren zunehmend die Untersuchung der genannten Prozesse bei Depressionen in den Fokus. Hierfür konnten bisher keine einheitlichen Ergebnisse gezeigt werden.
Weiterhin wird der Subtyp der ängstlichen Depression einerseits mit hohen Prävalenzen beschrieben, andererseits zeigen Untersuchungen eine schlechtere Prognose, stärkere Einschränkungen in der Funktionalität und ein schlechteres Ansprechen auf die Therapie im Vergleich zu depressiven Patienten ohne hohes Ängstlichkeitsniveau.
In dieser Arbeit wurden die Akquisition, Generalisierung und Extinktion in einem differentiellen Konditionierungsparadigma bei schwer depressiven ängstlichen und nicht ängstlich-depressiven Patienten sowie einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Ängstliche und nicht ängstlich-depressive Patienten zeigten ein beeinträchtigtes Sicherheitslernen in der Akquisition und Beeinträchtigungen in der Extinktion der konditionierten Furcht. Es ergaben sich keine Unterschiede hinsichtlich der Stärke der Generalisierung zwischen Patienten und den gesunden Kontrollen und es konnten keine differenzierenden Muster zwischen den ängstlich- und den nicht ängstlich-depressiven Patienten gezeigt werden.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf Veränderungen im Furchtlernen bei Patienten mit Depressionen hin. Es konnten keine Belege für unterschiedliche Mechanismen im Furchtlernen von ängstlich- und nicht ängstlich-depressiven Patienten gefunden werden. Unsere Ergebnisse stützen somit die Klassifikation der ängstlichen Depression als Subtyp der Depression. Weiterhin weisen die Ergebnisse der beeinträchtigten Extinktion bei Patienten mit Depressionen darauf hin, dass Expositionselemente, welche bei der Therapie von Angststörungen als Verfahren der Wahl eingesetzt werden, auch bei der Behandlung von Depressionen integriert werden sollten, um so den Therapieerfolg zu verbessern.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine anodale tDCS über der Elektrodenposition AF3 und der Kathode über dem kontralateralen Mastoid Extinktionslernen modulieren kann. Auf Basis aktueller Forschungsergebnisse wurden die Hypothesen aufgestellt, dass im Vergleich von real stimulierter zu sham stimulierter Gruppe ein Unterschied in der Hautleitfähigkeitsrekation, dem Arousalrating und dem Valenzrating der Versuchsteilnehmenden im Vergleich von CS+ und CS- und im zeitlichen Verlauf von Akquisition zu Extinktion gezeigt werden kann. Um dies zu prüfen wurde eine randomisiert doppelt-verblindete Studie mit insgesamt 86 Probanden durchgeführt, von denen nach Überprüfen einer suffizienten Furchtkonditionierungsreaktion nach der Akquisitionsphase noch 46 Teilnehmer eingeschlossen wurden. Diese wurden auf zwei tDCS Gruppen im Sinne von realer Stimulation und sham Stimulation verblindet und zufällig aufgeteilt. Alle Teilnehmer durchliefen ein eintägiges Furchtkonditionierungsparadigma mit drei Phasen: Habituation, Akquisition und Extinktion. Während allen Phasen wurde die Hautleitfähigkeitsreaktion gemessen und die Probanden wurden gebeten die ihnen präsentierten Stimuli hinsichtlich deren Valenz und Arousal einzuschätzen. Die tDCS fand in einer zehnminütigen Pause vor der Extinktion und während destdcs
Extinktionsdurchlaufs statt. In den Ergebnissen zeigt sich kein differenzieller Effekt der tDCS. In den erhobenen Hautleitfähigkeitsdaten zeigt sich in der frühen Extinktionsphase eine verringerte Hautleitfähigkeit in der verum stimulierten tDCS Gruppe unabhängig davon, ob ein CS+ oder ein CS- zu sehen war. Dies deutet auf eine generell verminderte Aufregung bei realer tDCS hin. In den Bewertungen bezüglich Arousal und Valenz findet sich ebenfalls kein Effekt der tDCS. In den Bewertungen zeigt sich jedoch die erfolgreiche Konditionierung und deren Extinktion. Nachfolgend stellt sich die Frage, ob zukünftig Paradigmen mit einem zweitägigen Design bevorzugt werden sollten, da diese realen Bedingungen näherkommen und teilweise auch Effekte der tDCS gezeigt haben. Abschließend lässt sich die große Rolle des vmPFC in der Verarbeitung von aversiven Reizen darstellen und betonen, welch großes Potential in einer Beeinflussung der Aktivität des vmPFC liegt, das zukünftig genauer untersucht werden muss.
Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird.
Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden...
DNA-Stabilität und -Regenerationsfähigkeit von humanen Nasenschleimhautzellen in Kulturmodellen
(2021)
Kulturmodelle des respiratorischen Epithels werden zur Klärung multipler Fragestellungen, zum Beispiel der Untersuchung seltener respiratorischer Erkrankungen, wie der primären Ziliendyskinesie (PCD) herangezogen. Hierbei könnten in Zukunft Kulturmodelle integraler Bestandteil des Diagnosealgorithmus werden. Die Isolierung und Kultivierung von Primärzellen des menschlichen Respirationstrakts ist dabei wesentlich komplexer als die Nutzung etablierter Zelllinien. Jedoch ermöglicht die Verwendung der Primärzellkulturen eine exaktere Darstellung des mehrreihigen Flimmerepithels der oberen Atemwege. Die Gewinnung der Primärzellen kann mechanisch mit zusätzlichem enzymatischen Verdau, oder durch sequentielles Auswachsen der Zellen erfolgen. Angewendet werden sowohl Epithelzell-Monokulturen wie auch Cokulturen mit Fibroblasten. Die Nutzung des Air-Liquid Interface in Transwell Systemen ermöglicht in beiden Kulturen die Differenzierung zu einem Kinozilien tragenden Flimmerepithel. Hierbei ist nicht endgültig geklärt, welches Modell die in vivo Gegebenheiten besser darstellt und welche Vorteile diese haben. Außerdem liegen bislang keine Daten über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit nach genotoxischer Behandlung sowie Informationen über chromosomale Veränderungen während des Zellkultivierungsprozesses über mehrere Passagen vor. Derartige Informationen sind allerdings für die Etablierung eines Kulturmodells der oberen Atemwege von essentieller Bedeutung. Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der DNA-Stabilität und -Regenerationsfähigkeit über drei Passagen nach genotoxischer Behandlung, vergleichend für beide Kulturmodelle sowie die Überprüfung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kultivierungsprozesses und der Funktionsfähigkeit beider Zellkulturen. Zu diesem Zweck wurde eine toxikologische Versuchsreihe von jeweils 10 Spendern für beide Kulturmodelle, Mono- bzw. Cokultur im Air-Liquid Interface über drei Passagen durchgeführt. Hierbei wurde die Grundschädigung, die Schädigung nach einstündiger Behandlung mit 300μl des Alkylanz Methylmethansulfonat (MMS) und nach einer 24-stündigen Regenerationszeit mit dem Comet Assay überprüft. Zur Untersuchung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kulturprozesses wurden parallel Chromosomenaberrationstests an unbehandelten Zellen über drei Passagen durchgeführt. Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Zellen wurde ein Interleukin-8 (IL-8) ELISA für 10 Versuchsansätze in der jeweils ersten Passage beider Kulturen verwendet. Hierbei wurde die IL-8-Konzentration im Überstand der unbehandelten Zellkulturen sowie nach 1μg/ml bzw. 10μg/ml Lipopolysaccarid(LPS)- Exposition untersucht. Für die Cokultur wurden sowohl beide Zelltypen gemeinsam als auch die Epithelzellen bzw. die Fibroblasten getrennt betrachtet. In beiden Modellen wurden zusätzlich rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen zur Untersuchung der ziliären Strukturen durchgeführt. Zur Überprüfung der Fibroblastenkontamination in der Monokultur wurden als einmaliger Versuchsablauf Vimentin- Färbungen über drei Passagen angewendet. Mit dem Comet Assay konnte in beiden Modellen eine gute Regeneration der DNA-Integrität nach MMS-induzierter DNA-Schädigung über alle Passagen nachgewiesen werden. Als einmaliger Versuchsansatz wurde das Enzym Methylpuringlykosylase (MPG) als Teil der Basenexzisionsreparatur nachgewiesen. Es ergaben sich Unterschiede in der Kultivierbarkeit der Zellen: die Monokultur zeigte eine gute Zellkultivierbarkeit bis zur dritten Passage. Es konnte jedoch mit der Vimentinfärbung eine Fibroblastenkontamination von Beginn an sowie eine Zunahme mit Höhe der Passage nachgewiesen werden. Es handelt sich hierbei demnach nicht um eine Reinkultur respiratorischer Epithelzellen. Die Cokultur ermöglicht getrennte Epithelzell- bzw. Fibroblastenkulturen, jedoch keine gute Kultivierbarkeit bis in höhere Passage. Methodisch konnte die prinzipielle Funktionsfähigkeit des Chromosomenaberrationstests an primären Nasenschleimhautzellen erstmals für eine große Stichprobenanzahl gezeigt werden. In den durchgeführten Chromosomenaberrationstests konnte eine gewisse Grundschädigung über alle Passagen nachgewiesen werden, jedoch sollten weitere Tests erfolgen, um diese Tendenz zu verifizieren. Die funktionelle Integrität wurde mit dem IL-8 ELISA nach LPS-Exposition sowie durch den Nachweis ziliärer Strukturen im REM exemplarisch bestätigt. Die erhobenen Daten liefern zusammengefasst wichtige Informationen über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit der bislang verwendeten Kulturmodelle. Insbesondere Informationen über chromosomale Veränderungen sollten in Zukunft genauer betrachtet werden. Von großem Interesse wäre außerdem die Überprüfung derartige Zelleigenschaften in Zellkulturen von PCD erkrankten Spendern.
Patienten mit leicht bis hochgradigen Schallleitungs-, Schallempfindungs- und kombinierten Schwerhörigkeiten werden routinemäßig nach erfolglosem Hörgerätetrageversuch mit aktiven Mittelohrimplantaten versorgt. Aktive Mittelohrimplantate können an verschiedene Strukturen des Mittelohrs angekoppelt werden. Der Ort der Ankopplung ist abhängig vom Hörverlust und der individuellen Physiologie des Mittelohres. Die Hörverbesserung ist dabei stark von der Kopplungseffizienz des Implantatwandlers an die Mittelohrstruktur abhängig.
Aktuell gibt es keine zufriedenstellende Möglichkeit die Kopplungseffizienz intraoperativ zu bestimmen. Daher wird eine objektive Methode eingeführt, um intraoperativ auditorische Hirnstammantworten (BERAs) bei Stimulation über das Implantat abzuleiten. Die Vibrant Soundbrigde® (VSB) wird dabei mit einem Drahtlosüberträger (miniTEK, Signia GmbH, Erlangen) und der Carina®-Aktuator über ein Audiokabel mit der BERA-Anlage verbunden. Die BERA-Anlage überträgt die Stimuli direkt an das Implantat, welches an die Mittelohrstruktur angekoppelt ist. Die BERA-Antworten werden bei der VSB durch einen optimierten VSB-CE-Chirp und beim Carina®-System durch den Standard CE-Chirp evoziert, beginnend bei Pegeln oberhalb der Knochenleitungshörschwelle bis unter die Registrierungsschwelle. Diese Methode kann die intraoperative Integrität des Implantats sowie die Kopplungseffizienz bestimmen, um eine Aussage über den zu erwartenden Hörerfolg treffen zu können. Darüber hinaus kann die versorgte Hörschwelle verwendet werden, um die Anpassung bei Kindern oder schwierigen Fällen zu unterstützen und um eine Hörverschlechterung über die Zeit zu erfassen.
Zusammenfassend, konnte eine Methode zur Bestimmung der intraoperativen Kopplungseffizienz während der Implantation von VSBs und Carinas® etabliert werden. Darüber hinaus werden intraoperative BERA-Daten von 30 VSB- und 10-Carina®-Patienten sowie deren Hörergebnisse gezeigt.
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) und stellt die häufigste Ursache frühzeitiger Behinderung junger Erwachsener dar. Kennzeichnend sind multifokale ZNS-Läsionen, die durch Inflammation, Demyelinisierung und Axonschäden geprägt sind und zu multiplen neurologischen Defiziten führen. Derzeit ist es mithilfe der verlaufsmodifizierenden Therapie möglich, die Immunantwort abzuschwächen und damit die Krankheitsprogression zu verzögern. Geheilt werden kann die Erkrankung jedoch bislang nicht. Dabei ist nicht hinreichend geklärt, ob die neuen Therapieoptionen über die Immunmodulation/-suppression hinaus einen anhaltenden Schutz vor der langfristigen Neurodegeneration bieten.
Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen klinischer Studien zur Therapie der schubförmig-remittierenden MS mit dem Anti-CD52-Antikörper Alemtuzumab, der zu einer Depletion CD52-exprimierender Immunzellen führt, wurden diesbezüglich Analysen in MS-Tiermodellen durchgeführt. Da die Untersuchung der zugrunde liegenden Patho- und Effektormechanismen am Menschen kaum möglich ist, ist die MS-Forschung für ein tiefergehendes Verständnis auf Tiermodelle angewiesen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist hierbei das am weitesten verbreitete Modell der MS, wofür vor allem der C57BL/6 (B6) -Mausstamm verwendet wird, da auf diesem Hintergrund die meisten genmodifizierten Mäuse gezüchtet werden. Jene tierexperimentellen Studien, in denen ein muriner Anti-CD52-Antikörper im frühen Krankheitsstadium der EAE (Auftreten erster paralytischer Symptome) verabreicht wurde, erbrachten den Hinweis einer neuroprotektiven und scheinbar regenerativen Wirkung des Antikörpers.
Über einen neuroprotektiven Effekt von Alemtuzumab im schwer behandelbaren chronisch-progredienten Stadium der MS ist jedoch wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit ist die erste detaillierte Untersuchung zum Einfluss des murinen Anti-CD52-Antikörpers auf die Demyelinisierung, den Axonschaden und die Hirnatrophie in der MP4-induzierten EAE der B6-Maus im chronischen Verlauf der Erkrankung (ab stabilem Plateau der klinischen Symptomatik). MP4 ist ein Myelinfusionsprotein aus MBP (Myelin-Basisches-Protein) und PLP (Proteolipidprotein), welches in B6-Mäusen durch aktive Immunisierung eine EAE induziert, die chronisch verläuft und als eines von wenigen Modellen neben der T-Zell-Abhängigkeit die an Bedeutung zunehmende B-Zell-Komponente der MS darstellt. Histopathologisch finden sich in der chronischen MP4-induzierten EAE eine ausgeprägte Rückenmarks- und Kleinhirnschädigung, die vor allem im Kleinhirn durch eine B-Zell-Aggregation charakterisiert ist.
Nachdem die MP4-immunisierten Mäuse im chronischen Stadium der EAE an fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit 10 mg/kg Körpergewicht murinem Anti-CD52-spezifischem IgG2a-Isotypantikörper bzw. murinem unspezifischem IgG2a-Isotyp-Kontroll-Antikörper behandelt worden waren, wurde die Lymphozytendepletion im peripheren Blut durchflusszytometrisch ermittelt und deren Einfluss auf MP4-spezifische Antikörper anhand eines indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) untersucht. Als Marker für Axonschäden wurde im Serum vorhandenes phosphoryliertes Neurofilament-Heavy (pNF-H) mithilfe eines indirekten Sandwich-ELISAs quantitativ bestimmt. Rückenmark und Kleinhirn wurden ultrastrukturell auf Veränderungen der Myelinisierung (mittels g-Ratio: Axondurchmesser geteilt durch Gesamtdurchmesser der Nervenfaser) und auf Axonpathologien (verringerter Abstand benachbarter Neurofilamente, axolytische Axone, axonaler Verlust) untersucht. Die Hirnatrophie wurde MRT-basiert gemessen und der klinische Verlauf täglich evaluiert.
Durch die Anti-CD52-Antikörperbehandlung wurde die T- und B-Zellzahl zwar drastisch vermindert, die MP4-spezifische Antikörperproduktion blieb davon jedoch unbeeinträchtigt. Ein günstiger Effekt auf die De- und Remyelinisierung war nicht festzustellen. Das Hirnvolumen und die klinische Präsentation der Mäuse blieben ebenfalls unverändert. Während kein Unterschied der pNF-H-Konzentration zu erkennen war, konnte ultrastrukturell jedoch ein geringerer Axonschaden nachgewiesen werden.
Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass der Anti-CD52-Antikörper im chronischen Verlauf der EAE/MS wenig Einfluss auf die neurodegenerativen Prozesse nimmt und die Regeneration nicht fördern kann. Die Ursache liegt vermutlich in der Undurchlässigkeit der Bluthirnschranke für Antikörper sowie dem limitierten Verständnis der Antikörperwirkung im ZNS. Die vorliegende Studie regt somit zur Etablierung von ZNS-wirksamen Antikörpern an und unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung von selektiveren neuroprotektiven und remyelinisierungsfördernden Behandlungsansätzen, die eine wertvolle Ergänzung zur verlaufsmodifizierenden Therapie darstellen könnten.
Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann.
Neuropathische Schmerzen treten in der klinischen Praxis häufig auf und
beeinträchtigen in hohem Maße die Lebensqualität der Patienten. Bedingt durch eine
Schädigung somatosensorischer Nervenstrukturen im peripheren oder zentralen
Nervensystem ist der Schmerz meist durch eine Allodynie, Hyperalgesie oder
einschießende Schmerzen charakterisiert. Diese Symptome lassen sich durch
gängige Schmerzmittel kaum lindern. In jüngerer Zeit rückte die Blut-Rückenmarkschranke immer mehr in den Fokus verschiedener Untersuchungen, da auch
einige nicht-schmerzhafte Erkrankungen (z.B. Multiple Sklerose und Amyotrophe
Lateralsklerose) zur Veränderung dieser Barriere mit folgender Permeabilitätserhöhung
durch reduzierte Tight Junction-Protein-Expression führen. Die Blut-
Rückenmarkschranke dichtet Gefäße des Rückenmarks ab und verhindert das
Eindringen toxischer oder proanalgetischer Mediatoren in das zentrale Nervensystem.
Dafür ist die Funktion der Tight Junction-Proteine zur Aufrechterhaltung dieser Barriere
essentiell. Dennoch konnte die Rolle der Blut-Rückenmarkschranke bei Neuropathie
noch nicht vollständig erörtert werden. Die Untersuchungen meiner Arbeitsgruppe
konnten bereits zeigen, dass eine lockere Ligatur des N. ischiadicus bei Ratten (CCI;
chronic constriction injury) zur Entwicklung einer thermischen und mechanischen
Hyperalgesie sowie eingeschränkten motorischen Funktionen führt. Zudem konnte
eine Störung der Blut-Rückenmarkschranke nach einer CCI nachgewiesen werden, da
es Tracern unterschiedlicher molekularer Größe möglich war das Rückenmark zu
penetrieren. Daher sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht werden, inwieweit
es zu einer Veränderung unterschiedlicher Tight Junction-Proteine nach peripherer
Nervenverletzung (CCI) kommt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine CCI zu einer
Herabregulation der mRNA-Expression von Claudin-1, Claudin-19, Tricellulin und
Occludin im Rückenmark führt, wobei diese Veränderungen insbesondere 7 und 14 d
nach der CCI auftraten. Die membranäre Expression dieser Proteine im Rückenmark
blieb bis auf Occludin unverändert, das 7 d nach der CCI signifikant reduziert war. Am
deutlichsten waren jedoch Claudin-5 und ZO-1 verändert. Folglich vermindert eine CCI
signifikant die Claudin-5-mRNA sowie die Immunreaktivität in isolierten Kapillaren des
Rückenmarks. Das Ankerprotein ZO-1 war sogar auf allen Ebenen, also in der Genals
auch Proteinexpression, und darüber hinaus in den Rückenmarkskapillaren
signifikant reduziert.
Die Interpretation dieser Ergebnisse legt nahe, dass ZO-1, und zum Teil auch
Claudin-5, für die gestörte Blut-Rückenmarkschranke verantwortlich sind und die
anderen untersuchten Proteine vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Die
Bedeutung der Tight Junction-Proteine in der Blut-Rückenmarkschranke konnte somit
weiter untermauert werden. In zukünftigen Untersuchungen wäre es wichtig den
Signalweg, der zur Veränderung der Tight Junction-Proteine führt sowie die
subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, um Möglichkeiten zum Wiederverschluss
der Barriere zu finden. Somit könnten Therapien zur Aufrechterhaltung der Blut-
Rückenmarkhomöostase den neuropathischen Schmerz unter Umständen kausal, und
nicht nur symptomatisch, behandelbar machen.
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind unverändert die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in den Industrienationen [1]. Die Risikoprädiktion und -prävention dieser Erkrankungen ist von großer Bedeutung, unter anderem deswegen weil primäre Ereignisse bei bis dato asymptomatischen Personen auftreten können [2]. Die zugrundeliegende Pathogenese, die Arteriosklerose, ist immer besser erforscht und zugleich sind Risikofaktoren identifiziert, die einen schädlichen Einfluss haben [3, 4]. Durch die Messung der Karotis-Intima-Media-Dicke (Carotid-Intima-Media-Thickness, CIMT) mittels B-Mode Ultraschall steht eine weit verbreitete, sichere und anerkannte Methode zur Verfügung, mit der bereits subklinische Formen der Arteriosklerose erfasst werden können [5]. Die CIMT ist als Surrogatparameter für eine generalisierte Arteriosklerose im gesamten Gefäßsystem etabliert und ihre Zunahme wird mit dem Vorliegen von kardiovaskulären Risikofaktoren assoziiert [6-8]. In der Risikoprädiktion mit Hilfe der CIMT bilden geschlechts-, alters- und regionalspezifische Normwerte die Basis [5]. Die aktuellen internationalen Leitlinien empfehlen in ihren neusten Fassungen, nicht mehr die CIMT zur kardiovaskulären Risikoprädiktion in der Allgemeinbevölkerung einzusetzen [1, 9]. Die Experten berufen sich auf Studien, in denen lediglich ein singuläres Messsegment betrachtet wurde [1, 9-11]. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Einfluss spezifischer kardiovaskulärer Risikofaktoren auf die verschiedenen Segmente der A. carotis zu erfassen und – davon ausgehend – den Stellenwert der vorhandenen Modelle zur Risikoprädiktion zu evaluieren. Des Weiteren wurden Normwerte aus einer repräsentativen Gruppe der Würzburger Allgemeinbevölkerung gebildet und die Reproduzierbarkeit der Ultraschalluntersuchung im Bereich der Halsschlagader überprüft.
Den Berechnungen liegen Daten der STAAB-Kohortenstudie (Häufigkeit und Einflussfaktoren auf frühe STAdien A und B der Herzinsuffizienz in der Bevölkerung) zugrunde, einer große Bevölkerungsstudie, die seit 2015 Daten der Würzburger Bevölkerung erhebt [12]. Es wurden Probanden zwischen mit einem Alter zwischen 30 und 79 Jahren eingeschlossen. Die CIMT wurde auf beiden Seiten des Halses auf der schallkopffernen Seite an drei vorab definierten Lokalisationen des Gefäßes, der A. carotis communis (ACC), dem Bulbus und der A. carotis interna (ACI), vermessen. Es wurden die fünf Risikofaktoren Diabetes mellitus, Dyslipidämie, Hypertonie, Rauchen und Übergewicht berücksichtigt. Mittels einer logistischen Regression wurde der spezifische Einfluss dieser Faktoren auf die individuelle, alters- und geschlechtsbasierte 75. Perzentile der CIMT in den einzelnen Lokalisationen betrachtet. Diese Grenzwerte stammten aus den eigens erstellten Normwerten für die Allgemeinbevölkerung. Es wurde eine „gesunde“ Subpopulation zur Erstellung dieser Normwerte gebildet, die keine der oben genannten Risikofaktoren sowie keine manifesten kardiovaskulären Erkrankungen aufwiesen.
Die Auswertung umfasste die Daten von insgesamt 2492 Probanden. Die segmentspezifische CIMT war am größten im Bereich Bulbus, gefolgt von der ACC und der ACI. Männer hatten höhere Wanddickenwerte und mehr Risikofaktoren als Frauen. Die Reproduzierbarkeit zwischen den einzelnen Untersuchern war insgesamt moderat bis stark. Im Vergleich zu anderen Studien zeigte sich jedoch insgesamt eine schwächere Übereinstimmung, so dass von einer potentiellen Verbesserung des Schulungsprotokolls für unerfahrene Personen ausgegangen wird. Die Ergebnisse der Reproduzierbarkeitsanalyse verdeutlichen den Bedarf eines standardisierten, international anerkannten Protokolls zur Schulung von Untersuchern der CIMT und eines exakten Messprotokolls [5, 13]. Die erhobenen Normwerte der „Gesunden“ zeigten eine Konsistenz mit verschiedenen, auf vergleichbare Weise erhobenen Werten und bildeten die Basis für die weiteren Untersuchungen. Die CIMT nahm mit dem Alter und – unabhängig davon – ebenfalls mit der Anzahl an Risikofaktoren zu. Die Faktoren Dyslipidämie, Rauchen und Hypertonie hatten einen statistisch signifikanten Einfluss für das Überschreiten des Grenzwertes der 75. Perzentile (OR (95 % KI) zwischen 1,28 (0,98 – 1,65), ACC, und 1,86 (1,53 – 2,27), Bulbus) [14]. Die Faktoren Diabetes mellitus und Übergewicht zeigten im verwendeten Modell keinen Effekt auf die CIMT. Insgesamt konnte, bis auf eine mögliche Interaktion zwischen dem Risikofaktor Rauchen und der ACI, kein segmentspezifischer Effekt beobachtet werden [14]. Daraus resultierend wurde die Hypothese aufgestellt, dass zur Erfassung des kardiovaskulären Risikos einer Person die Messung eines singulären Segments möglicherweise ausreicht [14]. Dies stärkt die neusten Empfehlungen der Leitlinien, die sich auf Studien berufen, welche eben nur ein Segment betrachteten. Die identifizierten Risikofaktoren spiegeln sich darüber hinaus in den gängigen Modellen zur Risikoprädiktion und -prävention wider. Demnach gerät der Einsatz der CIMT zur Bestimmung des individuellen Risikos von Personen der Allgemeinbevölkerung in den Hintergrund [15].
In dieser Dissertation wird der MEK5/ERK5- Signalweg als möglicher Angriffspunkt in der zielgerichteten Melanomtherapie identifiziert. Die Adressierung von ERK5 bietet eine Alternative, um einer Resistenzentwicklung gegenüber Inhibitoren des MAPK- Signalwegs entgegenzuwirken. Das maligne Melanom ist ein hochaggressiver Tumor mit steigender Inzidenz. Zunehmende Sonnenstunden im Rahmen des Klimawandels mit erhöhter Belastung der Haut durch UV-Strahlung werden die Problematik des malignen Melanoms für den Menschen in den nächsten Jahren weiter zunehmen lassen.
Die Aktivierung des MEK5/ERK5- Signalwegs scheint eine Reaktion von Tumorzellen auf Therapiestress zu sein. Diese Aktivierung liefert den Melanomzellen einen Überlebensvorteil und verhindert ein langfristiges Therapieansprechen. ERK5 beeinflusst den Zellzyklus von Melanomzellen und ist somit möglicherweise von wichtiger Bedeutung in der Tumorgenese des malignen Melanoms.
Patienten mit NRAS- Mutation profitieren auffallend weniger von einer gezielten MEKi-Therapie als solche mit BRAF Mutation. Für ersteres Patientenkollektiv steht aktuell lediglich die Immuntherapie zur Verfügung, wodurch oft nur ein kurzes, progressionsfreies Intervall erreicht werden kann und die Patienten häufig unter schweren Nebenwirkungen leiden. Grund für die problematische Behandlung könnte das häufige Auftreten einer basalen ERK5- Aktivierung in NRAS- mutierten Melanomen sein. Diese Arbeit liefert eine positive Prognose über den Nutzen einer ERK5- Inhibition als Erweiterung des Therapieschemas. Diese These gilt auch für Melanompatienten mit einer BRAF- Mutation. Patienten, die an einem malignen Melanom erkrankt sind, weisen zu 80% eine Mutation in einem dieser beschriebenen Onkogene auf. Die Arbeit lässt darauf schließen, dass eine ERK5- Inhibition in der Therapie von beiden Gruppen erfolgreich sein könnte und somit das Leben nahezu aller Melanompatienten betrifft.
Die nicht-invasive Gefäßdiagnostik stellt einen wichtigen Pfeiler in der Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen dar. Während lange Zeit die sonographische Messung der cIMT, als morphologisches Korrelat der Gefäßalterung, als Goldstandard galt, ist in den letzten Jahren in Gestalt der Pulswellenanalyse/PWV-Messung eine Technik weiterentwickelt worden, die, als funktionelles Korrelat der Gefäßalterung, aufgrund der leichteren Durchführbarkeit und geringerer Untersucherabhängigkeit und Kosten vielversprechend ist. So erlaubt die Messung der Pulswelle mittels gewöhnlicher Blutdruckmanschetten, genau wie die cIMT, die Berechnung des individuellen Gefäßalters und die Diagnostik für das Vorliegen eines Endorganschadens der Blutgefäße.
Um die Messergebnisse der beiden Untersuchungen miteinander zu vergleichen, wurden beide in der EUROASPIRE-IV Studie an Patienten mit koronarer Herzkrankheit durchgeführt. Die Auswertung der Messergebnisse der mit dem Vascular Explorer durchgeführten Pulswellenanalyse/PWV-Messung ergab überraschenderweise, dass die Mehrheit der herzkranken Patienten weder eine vaskuläre Voralterung noch einen Endorganschaden der Blutgefäße aufweisen. Im Falle der cIMT-Messung war Gegenteiliges der Fall, was trotz der medikamentösen Therapie der Patienten so zu erwarten war. Weiterhin zeigte sich lediglich eine geringe Korrelation zwischen den Messergebnissen beider Untersuchungen. Die Determinanten der einzelnen Messwerte aus cIMT und Pulswellenanalyse/PWV-Messung waren deckungsgleich mit den in der Literatur beschriebenen Faktoren, wenn auch viele der sonst signifikanten Regressoren das Signifikanzniveau in unserer Auswertung nicht unterschritten.
Eine Limitation der funktionellen Gefäßdiagnostik liegt derzeit darin, dass die Messergebnisse stark von dem verwendeten Messgerät abhängen. Es liegen noch zu wenig Vergleichsstudien vor, um die Messergebnisse, speziell von neueren Geräten wie dem Vascular Explorer, auf andere zu übertragen. Bei der Berechnung des Gefäßalters sollten daher optimalerweise gerätespezifische Normwerte vorliegen, was beim Vascular Explorer nicht der Fall ist. Gleiches gilt für die Verwendung des PWVcf-Grenzwerts für die Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße.
Analog hat auch die Messung der cIMT gewisse Einschränkungen. So wäre eine weitere Standardisierung der Messorte (A. carotis communis vs Bulbus vs A. carotis interna), zwischen denen sich die durchschnittliche cIMT erheblich unterscheidet, sowie der Messparameter (Minimal- vs Maximal- vs Mittelwert) wünschenswert. Die universelle Anwendung eines cIMT-Grenzwerts zur Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße ist daher kritisch zu sehen. Dies zeigt sich auch darin, dass in den neuesten Leitlinien der bislang geltende Grenzwert angezweifelt und kein aktuell gültiger Grenzwert mehr genannt wird.
Wir interpretieren unsere Ergebnisse dahingehend, dass unsere Messung der cIMT die zu erwartende pathologische Gefäßalterung bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit besser widerspiegelt als die Messung der Pulswelle mit dem Vascular Explorer. Welche der beiden Untersuchungen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeit überlegen ist, muss im Rahmen von Längsschnittstudien geklärt werden.
TTFields sind eine Therapieoption des GBM, welche als alternierende elektrische Felder den Aufbau des mitotischen Spindelapparates stören. Gleichzeitig überwacht der SAC, mit seiner Schlüsselkomponente der Kinase MPS1, eine korrekte Anheftung der Spindelfasern an die Kinetochore der Chromosomen. Eine Inhibition des SAC durch den Inhibitor MPS1-IN-3 in Kombination mit Vincristin führt zu einem synergistischen Effekt auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Aus diesen Erkenntnissen folgerten wir die Hypothese, dass eine SAC-Inhibition die Wirkung von TTFields verstärken könnte. Um dies zu testen, wurden Zellen der Zelllinien U87 und GaMG über 72h mit TTFields, MPS1-IN-3 oder einer Kombination aus den beiden behandelt. Anschließend wurden die Zellen gezählt, es wurde eine Analyse des Zellzyklus vorgenommen und apoptotische Zellen wurden via TUNEL-Assay detektiert. Die Kombinationsbehandlung aus TTFields und MPS1-IN-3 führte zu einer Reduktion der Zellzahl (U87: -54,3% vs. TTFields, p=0,0046; -52,9% vs. MPS1-IN-3, p=0,0026; GaMG: -74,3% vs. TTFields, p=0,0373; -84% vs. MPS1-IN-3, p<0,00001). Nur 28,1% mehr Zellen als ausgesät waren bei der Zelllinie U87 zu finden (TTFields: 179,1%; MPS1-IN-3: 168,3%), während es bei GaMG-Zellen sogar 62% weniger Zellen als ausgesät waren. Im Zellzyklus zeigte sich eine Abnahme der Zellen von der G1-Phase (U87: -59,9% vs. TTFields, p=0,0007; -42,1% vs. IN-3, p=0,0426; GaMG: -45,1% vs. TTFields, p=0,0276; -51,6% vs. IN-3, p=0,0020), während es zu einem massiven Anstieg von toten Zellen kam (U87: 2,9fach vs. TTFields, p=0,0022; 2,2fach vs. IN-3, p=0,0046; GaMG: 5,6fach vs. TTFields, p=0,0078; 7,8fach vs. IN-3, p=0,0005). Diese Zellen ließen sich im TUNEL-Assay als durch Apoptose zu Grunde gegangene Zellen weiter identifizieren (U87: 5,4fach vs. TTFields, p=0,0489; 6,2fach vs. IN-3, p=0,0278; GaMG: 8,9fach vs. IN-3, p=0,0110). Diese Ergebnisse sind erste und wichtige Hinweise für eine Verstärkung der Wirkung von TTFields durch eine Inhibition des SAC und liefern eine gute Grundlage für weitere Forschung zur Verbesserung der Therapie des GBM.
Graft-versus-Host Disease (GvHD) stellt einen häufigen, den Gesamterfolg einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation limitierenden Faktor dar. Bei dieser Komplikation attackieren vor allem alloreaktive T-Lymphozyten des Stammzellspenders gesunde Körperzellen des Patienten. Infolgedessen kommt es zu Gewebeschäden in den Zielorganen Haut, Leber und Darm. Die Behandlung der GvHD erfordert eine effektive Immunsuppression, was wiederum Graft-versusTumor-Effekte kompromittiert und den Rückfall der malignen Grunderkrankung bedingen kann. Viele Patienten sprechen aus bisher ungeklärten Gründen nicht auf die klassische immunsuppressive Therapie mit Steroiden oder second-line Therapien an. Neue zelluläre Therapien zur Behandlung der refraktären GvHD sind auf dem Vormarsch, bedürfen aber einer weiterführenden klinischen Testung, auch um die exakten Wirkungsmechanismen zu verstehen. Idealerweise könnten neue Testsysteme das GvHD-Potential von allogenen Stammzellpräparaten oder aber das immunsuppressive Potential von neuen GvHD-Therapien vorhersagen, bevor diese in klinischen Studien eingesetzt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein erstes, in multiplen Replikaten einsetzbares, humanes organotypisches Gewebemodell zur Simulation einer GvHD-Reaktion am Beispiel der Haut zu etablieren.
Zu diesem Zweck wurden artifizielle humane Hautmodelle unter statischen (KollagenHautmodelle) und dynamischen Kulturbedingungen (vaskularisierte Hautmodelle) generiert. Die Injektion unstimulierter PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells) führte zu keinen histomorphologischen Veränderungen in den KollagenHautmodellen. Im Gegensatz dazu hatte die Injektion vorstimulierter allogener PBMCs eine Zerstörung der epidermalen Strukturen der Kollagen-Hautmodelle zur Folge, welche vergleichbar waren mit Gewebeschäden bei einer akuten GvHD der Haut. Dieselben Schädigungen der Epidermis wurden durch die Injektion von Mediumüberständen vorstimulierter PBMCs in die Kollagen-Hautmodelle erreicht. Im Kulturmedium der Kollagen-Hautmodelle wurden hohe Konzentrationen von Interleukin 2 und 17, Interferon gamma sowie Tumornekrosefaktor alpha gemessen, wodurch auf die Beteiligung von Zytokinen an der inflammatorischen Reaktion geschlossen werden konnte. Auch im komplexeren vaskularisierten Hautmodell verursachte die Injektion vorstimulierter PBMCs histomorphologische Veränderungen entsprechend einer akuten Haut-GvHD sowie einen zeitabhängigen Anstieg proinflammatorischer Zytokine.
Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Induktion einer starken Inflammations- und Immunreaktion in artifiziellen humanen Hautmodellen, welche histomorphologisch eine GvHD imitiert, möglich ist. Dieses Modell könnte als Grundlage für die Entwicklung eines klinisch relevanten Testsystems zur Bestimmung des GvHD-Restpotentials oder zur Festlegung der immunsuppressiven Kapazität innovativer Zellpräparate dienen. Somit könnten humane artifizielle GvHDModelle in klinischen Studien eingesetzt werden und die Erfahrungen aus Tiermodellen ergänzen sowie erste in vitro Ergebnisse im humanen System liefern, welche dann mit dem tatsächlichen klinischen Resultat verglichen werden könnten.
Depressionen gehören zu den häufigsten psychischen Erkrankungen. Neben Symptomen wie Niedergeschlagenheit, Interessenlosigkeit oder Schlafstörungen sind Depressionen auch durch Defizite in kognitiven Funktionen, wie z.B. Aufmerksamkeitsprozessen oder der Wahrnehmung, und eine negativ verzerrte Informationsverarbeitung gekennzeichnet.
Aufgrund der hohen Prävalenz, der starken psychosozialen Funktionseinschränkungen durch depressive Erkrankungen und deren rezidivierenden Charakter besteht die Notwendigkeit, die therapeutischen Interventionen zur Behandlung affektiver Störungen zu verbessern, dadurch die Krankheitsphase der Patienten zu verkürzen und letztendlich auch die Kosten für das Gesundheitssystem zu reduzieren. In diesem Zusammenhang werden in den letzten Jahren verstärkt mögliche Prädiktoren und Korrelate des Therapieerfolgs untersucht. Hierfür könnten negativ verzerrte Informationsverarbeitungsprozesse und Defizite in kognitiven Funktionen objektive Marker darstellen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Covariation Bias, der als Überschätzung des Zusammenhangs zwischen einem krankheitsrelevanten Stimulus und einer aversiven Konsequenz definiert wird, in einem Querschnittsdesign bei schwer depressiven Patienten zu Behandlungsbeginn im Vergleich zu einer Gruppe von Patienten nach einer sechswöchigen Behandlung sowie einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Diese kognitive Verzerrung war bei Patienten mit schwererer Symptomatik unabhängig vom Behandlungszeitpunkt stärker ausgeprägt. Zudem prädizierte der Covariation Bias zu Behandlungsbeginn das Therapieoutcome nach sechs Behandlungswochen dahingehend, dass Patienten mit einer stärkeren kognitiven Verzerrung ein schlechteres Ansprechen auf die Therapie zeigten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Emotional Processing Paradigma, das aus Aufgaben zur Emotionserkennung und zur Aufmerksamkeitslenkung besteht, zum ersten Mal bei schwer depressiven Patienten im intraindividuellen Verlauf der Behandlung eingesetzt und in Zusammenhang mit dem Therapieerfolg gestellt. Neben Hinweisen darauf, dass Patienten, bei denen sich in den ersten Behandlungswochen unter anderem die Salienz negativer Emotionen verringerte, mit höherer Wahrscheinlichkeit remittierten, zeigten sich vor allem zeitlich stabile Unterschiede im Sinne einer Trait-Variablen zwischen Patienten, die auf die initiale Therapie ansprachen, und Patienten, die keine bedeutsame Verbesserung erfuhren, in den globalen kognitiven Funktionen: Patienten, bei denen es zu keiner klinisch relevanten Verbesserung durch die Therapie kam, wiesen stärkere Defizite auf.
Zusammengenommen weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf ein stabiles Muster von Defiziten in globalen kognitiven Funktionen bei Patienten mit Depressionen hin. Diese Abweichungen liegen jedoch nicht bei allen schwer depressiven Patienten gleichermaßen vor. Bei Patienten mit Defiziten scheint das Therapieoutcome schlechter zu sein. Somit könnten diese Prozesse der Informationsverarbeitung und kognitive Defizite auf neuropsychologischer Ebene Prädiktoren und Korrelate des Therapieoutcomes darstellen. Im Sinne der personalisierten Medizin könnte in Zukunft die Diagnostik um die Parameter der Informationsverarbeitungsprozesse ergänzt werden und so die Prognose des Therapieerfolgs verbessert und die Behandlung der Patienten individualisiert werden.
Angsterkrankungen sowie die posttraumatische Belastungsstörung sind weit verbreitete psychische Erkrankungen. Trotz gut evaluierter Therapiemethoden gibt es immer noch therapierefraktäre oder rezidivierend erkrankende Patienten, für die nicht-invasive Hirnstimulationsverfahren wie die transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) eine zusätzliche Option darstellen können. Diese Studie untersuchte daher die förderliche Wirkung der tDCS auf das Extinktionslernen, dem neuronalen Hintergrundmechanismus der Expositionstherapie. Für die Untersuchung der Extinktionsprozesse wurde ein Ein-Tages-Furchtkonditionierungsparadigma mit weiblichen Gesichtern als konditionierte Stimuli (CS) und einem 95 dB lauten weiblichen Schrei als unkonditionierten Stimulus verwendet. Die tDCS zielte darauf ab den ventromedialen präfrontalen Kortex (vmPFC), ein wichtiges Kontrollareal der Extinktion, zu aktivieren, wohingegen furchtgenerierende dorsomediale Hirnareale von der Stimulation ausgespart bleiben sollten. Hierfür wurden zwei ca. 4 x 4 cm große Elektroden in bitemporaler Anordnung etwas unterhalb der EEG 10-20-Positionen F7 und F8 appliziert und ein Gleichstrom mit einer Stärke von 1.5 mA verwendet. Die 20- minütige Stimulation startete während einer 10-minütigen Pause zwischen Akquisition und Extinktion und lief bis zum Ende der Extinktion durch. Die gesunden Probanden wurden randomisiert und doppelt verblindet zwei sham- und zwei real-Stimulationsgruppen mit jeweils entgegengesetzten Stromflussrichtungen zugeordnet. Zur Messung der Furchtreaktion dienten die elektrodermale Reaktion sowie subjektive Arousal- und Valenzbewertungen. Zusätzlich wurde die Kontingenzerwartung sowie verschiedene Fragebögen zu Depressivität, Affekt, State- und Trait-Angst, Angstsensitivität und Händigkeit erhoben. Die Untersuchung der Effekte von tDCS und Stromflussrichtung erfolgte bei allen erfolgreich konditionierten Probanden (N = 84) mittels generalisierten Schätzgleichungen. Erwartet wurde insbesondere eine Verbesserung des frühen Extinktionslernens in den real-Stimulationsgruppen, wobei vermutetet wurde, dass rechts und links anodaler Stromfluss nicht zu identischen Resultaten führen würde. Die Ergebnisse wiesen auf eine Verbesserung der frühen Extinktion unter tDCS hin. Der Effekt spiegelte sich in den Maßen der elektrodermalen Aktivität in einer stärkeren Reduktion der CS+/CS- Diskrimination und einem beschleunigten Reaktionsverlust auf CS+ wider. Der vermittelnde Mechanismus kann im intendierten Aktivitätsanstieg des vmPFC liegen, eine Steigerung der dopaminergen Neurotransmission ist jedoch ebenso denkbar. Zusätzlich ist auch die Verbesserung der Prozessierung von prediction errors durch die Veränderung der Dopaminsekretion bzw. Aktivitätssteigerung im vmPFC, Orbitofrontalkortex und mittleren temporalen Gyrus möglich. Die subjektiven Valenz- und Arousalbewertungen zeigten sich während des gesamten Experiments unbeeinflusst von der tDCS. Neben diesem Haupteffekt kam es zu weiteren nicht erwarteten Effekten. Einer dieser bedeutsamen Nebeneffekte war ein kurzer initialer Reaktionsanstieg auf den CS- zu Beginn des ersten und zweiten Extinktionsblocks in beiden real-Stimulationsgruppen, der u. a. mitverantwortlich für deren stärkeren Verlust der CS+/CS- Diskrimination war. Auch negative Auswirkungen auf die stimulierten Personen – insbesondere in Kombination mit Angsterkrankungen – können eine denkbare Folge hiervon sein. Daher stellt dieser Nebeneffekt eine wichtige Limitation des Hauptergebnisses dar, dessen Ursachen dringend in weiteren Studien evaluiert werden sollten. Als mögliche Gründe werden ein Verlust der Sicherheitsinformation des CS-, Angstgeneralisierungseffekte sowie ein erhöhtes Maß an sustained fear vermutet. Darüber hinaus wurden unerwarteterweise auch keinerlei Unterschiede der Stromflussrichtung während der frühen Extinktion manifest, in der späten bzw. gesamten Extinktion zeigten sich jedoch verschiedene Vor- und Nachteile. Vorteilhaft an der rechts anodalen im Vergleich zur links anodalen Stimulation war ein geringerer gemittelter Reaktionsanstieg auf CS+ und CS- zu Beginn des zweiten Extinktionsblocks. Dieser Effekt beruhte vermutlich auf einer Steigerung der Emotionsregulation durch Stimulation des rechten inferioren frontalen Gyrus. Als nachteilig erwies sich jedoch, dass die Reduktion der State-Angst während der Extinktion unter rechts anodaler tDCS geringer ausfiel. Bei Angstpatienten gibt es Hinweise auf eine Unteraktivierung des linken Frontalkortex, sodass angstreduzierende Effekte durch linksfrontale Aktivierung denkbar sind. Die Wahl der Stromflussrichtung sollte demnach je nach gewünschten Effekten und Angstausmaß der stimulierten Probanden abgewogen werden. Aufgrund der experimentellen Anordnung ergeben sich einige Limitationen dieser Studie. Der gesamte Extinktionsvorgang war in allen Gruppen nur von sehr kurzer Dauer, dadurch hielten auch die positiven Effekte in den real-Stimulationsgruppen nicht lange an. Zudem fand keine Testung des Extinktionsrecalls statt, sodass keine Aussage über die langfristige Wirkung der tDCS gemacht werden kann. Da die Stimulation direkt nach der Akquisition gestartet wurde, kann es neben bzw. anstelle einer Verbesserung des Extinktionslernens auch zu einer Störung der Furchtkonsolidierung und dadurch zu einer geringeren Furchtexpression gekommen sein. Zudem ist der vmPFC, das Hauptstimulationsziel dieser Studie, ebenso an der Suppression von Furchtreaktionen beteiligt, somit könnte auch dieser Mechanismus für die gefundenen Effekte verantwortlich sein. Eine Replikation der Studienergebnisse in einem mehrtägigem Konditionierungsparadigma wäre damit sinnvoll, um die Dauer und Hintergründe der gefundenen Effekte besser zu verstehen. Insgesamt bilden die Ergebnisse dieser Studie eine gute Basis zur Anwendung der tDCS des vmPFC zur Verbesserung des Extinktionslernens. Die Schwächen des hier getesteten Stimulationsprotokolls sollten jedoch in künftigen Studien weiter evaluiert und reduziert werden. Falls Testungen an Angstpatienten schließlich zu Erfolgen führen, könnte die tDCS des vmPFC als günstige und leicht anwendbare Ergänzung zu Expositionstherapien bei Patienten mit bisher therapieresistenten oder rezidivierenden Angsterkrankungen eingesetzt werden.
Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine monogenetische Erkrankung, bei der es durch den Verlust des SMN Proteins zur Degeneration der α-Motoneurone im Rückenmark kommt. Abhängig vom Schweregrad zeigen die Patienten bereits innerhalb der ersten Lebensmonate ausgeprägte Lähmungen der Skelettmuskulatur und eine Zwerchfellparese einhergehend mit einer reduzierten Lebenserwartung. Mithilfe von Mausmodellen für die SMA konnte gezeigt werden, dass der Motoneuronenverlust bei Smn-defizienten Mäusen mit Störungen der Neurotransmission an der motorischen Endplatte und mit Differenzierungsstörungen der Motoneurone einhergeht. Die Differenzierungs-störungen primärer Smn-defizienter Motoneurone sind eng gekoppelt mit einer verminderten Clusterbildung spannungsabhängiger Kalziumkanäle im distalen axonalen Bereich. Dies wiederum führt zu einer verminderten Frequenz spontaner Kalziumeinströme am Axonterminus und hat eine veränderte axonale Elongation zur Folge.
Es wurden folgende Aspekte in Bezug auf die Verstärkung und die Induktion spontaner Kalziumeinströme in Mausmodellen für spinale Muskelatrophien in dieser Arbeit adressiert:
1) Lassen sich spontane Kalziumeinströme in Smn-defizienten Motoneuronen durch die externe Applikation von Kalziumkanalagonisten verstärken?
2) Sind spontane Kalziumeinströme in primären Motoneuronen durch den Brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) induzierbar?
3) Zeigen primäre Motoneurone eines Mausmodells für spinale Muskelatrophie mit Ateminsuffizienz Typ 1 (SMARD1) ebenfalls veränderte Kalziumtransienten?
Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen, dass durch den Kalziumkanalagonisten R-Roscovitine die Frequenz der spontanen Kalziumeinströme im distalen Axon von Smn-defizienten Motoneuronen signifikant erhöht wird. Dies hat wiederum einen regulierenden Effekt auf die Differenzierung der SMA Motoneurone zur Folge. Smn-defiziente Motoneurone zeigen somit keine Unterschiede mehr in Bezug auf Axonlängen und Wachstumskegelflächen im Vergleich zu Kontrollzellen. Für R-
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Roscovitine ist neben der agonistischen Wirkung am Kalziumkanal auch ein inhibitorischer Effekt auf die Cyclin-abhängige Kinase 5 beschrieben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die erhöhten Kalziumtransienten unter der Behandlung mit R-Roscovitine durch eine direkte Bindung an die Cav2 Kalziumkanäle verursacht werden und nicht durch eine Cdk5 Blockade. Dafür spricht die schnelle und reversible Wirkung von R-Roscovitine, sowie die Aufhebung des R-Roscovitines Effekts bei gleichzeitiger Gabe des Cav2.2 Antagonisten ω-Conotoxin MVIIC.
Der zweite Aspekt dieser Arbeit behandelt den Einfluss der neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF und GDNF auf die Kalziumtransienten am Wachstumskegel wildtypischer Motoneurone. Der Vergleich der neurotrophen Faktoren zeigt, dass nur BDNF eine induzierende Wirkung auf spontane Kalziumtransienten am Wachstumskegel hat.
Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Kalziumtransienten bei Motoneuronen aus dem Nmd2J (SMARD1) Mausmodell. Die SMARD1 gilt als eigenständige Form der spinalen Muskelatrophien mit unterschiedlicher Genetik und unterschiedlichen klinischen Merkmalen. Die Motoneurone weisen in Bezug auf die Kalziumtransienten keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Nmd2J Mutante auf. Es ergibt sich somit kein Hinweis darauf, dass die Degeneration der Motoneurone bei der SMARD1 von einer Störung der Kalziumhomöostase im distalen axonalen Bereich ausgeht.
Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen.
In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven.
FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst.
Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität.
Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen.
Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro
(2020)
Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt.
Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2 (extrazellulär Signal-regulierte Kinase 1 und 2) sind die Effektorkinasen der Raf/MEK/ERK-Kaskade und verknüpfen externe Stimuli mit der intrazellulä-ren Antwort, wodurch sie wichtige Schlüsselmoleküle der zellulären Signaltransduktion darstellen. Zahlreiche Studien belegen die Beteiligung von ERK1/2 an der Entstehung pathologischer kardialer Hypertrophie. Genauso ist bekannt, dass ERK1/2 anti-apoptotische, kardioprotektive Eigenschaften besitzen.
So führte, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine Hemmung der katalytischen ERK1/2-Aktivität durch den MEK-Inhibitor PD98059 zu einer signifikanten Reduktion der hypertrophen Antwort von Kardiomy-ozyten auf den Stimulus Phenylephrin. Dies war allerdings mit einem Anstieg der Apoptoserate in diesen Zellen verbunden, wodurch sich eine Hemmung der totalen ERK-Aktivität als nicht praktika-bel für die Behandlung pathologischer kardialer Hypertrophie herauskristallisierte. In früheren Un-tersuchungen wurde eine Autophosphorylierung von ERK an Threonin 188 (murines ERK2) entdeckt und als Trigger für ERK1/2-vermitteltes hypertrophes Wachstum identifiziert. Diese Autophospho-rylierung steuert die nukleäre Lokalisation von ERK1/2 und ermöglicht so die Aktivierung nukleärer ERK-Zielproteine sowie hypertrophes Wachstum. Eine Interferenz mit der ERKThr188-Phosphorylierung konnte schon in vitro und in vivo erfolgreich einer pathologischen Hypertrophie entgegenwirken, ohne Einfluss auf physiologisches Herzwachstum oder die zytosolischen, anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 zu nehmen. Einen initialen Schritt für das Zustandekommen dieser Autophosphorylierung an Threonin 188 stellt dabei die Dimerisierung von ERK dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Inhibition der ERK-Dimerisierung im Hinblick auf die Behand-lung ERKThr188-vermittelter pathologischer Hypertrophie untersucht. Dabei sollte die endogene ERK-Dimerisierung mithilfe eines selbst generierten Peptids unterbunden werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu einer dimerisierungsdefizienten ERK2-Mutante (ERK2-Δ4) konnte das Peptid in vitro und in vivo erfolgreich pathologisch hypertrophes Herzwachstum mindern. Dabei führte es sogar zu einem Rückgang des apoptotischen Zelltodes, ausgelöst durch eine Aortenligation, füh-ren. Es zeigte sich, dass das Peptid die nukleäre Translokation von ERK2 verhindert und dadurch nukleäre ERK-Substrate geringer aktiviert werden. Da eine Dysregulation in der Raf/MEK/ERK-Kaskade auch die Entstehung von Tumoren begünstigen kann, sollte schließlich untersucht wer-den, ob das Prinzip der Hemmung nukleärer ERK-Effekte auch die Proliferation von Krebszellen beeinflussen kann. Es stellte sich heraus, dass die Peptid-vermittelte Hemmung der ERK-Dimerisierung auch die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien mit unterschiedlichen Mutations-stadien der Raf/MEK/ERK-Kaskade reduziert.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit die Intervention mit der ERK-Dimerisierung als Target der ERKThr188-Autophosphorylierung als translationale Strategie zur Reduktion nukleärer ERK-Effekte herausgearbeitet werden. Dies bietet die Möglichkeit ERK-vermittelte pathologische kardialer Hy-pertrophie und ERK-vermittelte Tumor-Proliferation zu behandeln, ohne kardiotoxische Nebenwir-kungen zu verursachen.
Zur Durchführung peripherer Nervenblockaden werden im klinischen Alltag nichtselektive Lokalanästhetika verwendet, die neben sensorischen auch motorische Nervenfasern blockieren. Diese Arbeit untersucht und beschreibt Grundlagen für die Verwendung selektiv wirksamer Co-Analgetika. Ziel dieser Arbeit war in diesem Kontext die Analyse der intrazellulären Signalwege, welche nach Applikation von rtPA am peripheren Nerven zur Öffnung der perineuralen Barriere und so zu einer opiat- vermittelten Analgesie führen. Gemäß unserer Hypothese bindet rtPA an den LRP-1- Rezeptor und löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus: Erk wird phosphoryliert und inhibiert über bislang unklare Mechanismen die Claudin-1-Transkription. Claudin-1 wird weniger in die Zellmembran eingebaut und/oder verlässt durch Endozytose/ Internalisierung die Zellmembran, was zur Öffnung der perineuralen Barriere führt und den Durchtritt selektiv wirksamer Analgetika erlaubt. In der späteren Phase steht die Analyse der Wiederherstellung der Barrierefunktion der Zellmembran im Vordergrund. Die ist von zentraler Bedeutung um eine Schädigung des Nervens durch das Umgebungsmilieu zu verhindern. Vermutlich wird die Wiederherstellung der Barrierefunktion über den Wnt-Signalweg gesteuert. Die Akkumulation von b-Catenin und Cdx2 führt zu einem erneuten Anstieg der Claudin-1-Transkription. Der Claudin-1- Gehalt steigt in Western Blot-Untersuchungen jedoch bereits zu einem früheren Zeitpunkt in der Zellmembran wieder an. Dies legt nahe, dass weitere von der Transkription unabhängige Mechanismen zur Wiederherstellung der Barrierefunktion beitragen. Eine mögliche Alternative zu rtPA stellt katalytisch inaktives rtPAi dar, welches in Untersuchungen ähnliche Ergebnisse wie rtPA zeigte. Dabei könnte die Verwendung von rtPAi anstatt rtPA pathophysiologisch denkbare Komplikationen wie beispielsweise Blutungen verhindern.
In Versuchen anderer Mitglieder der Arbeitsgruppe wurde die Öffnung der perineuralen Barriere mittels immunhistochemischer und funktioneller Untersuchungen bestätigt. Auch konnten keine akute Neurotoxizität oder Blutungsgefahr beobachtet werden. Somit stellt rtPA in Kombination mit Opioiden eine mögliche Alternative zur Verbesserung der postoperativen Analgesie dar, die jedoch weiterer Untersuchungen hinsichtlich von Nutzen, Risiken und Nebenwirkungen bedarf.
Analyse der Genexpression verschiedener Kandidatengene und der Methylierung im Xiphophorus Melanom
(2020)
Das Melanom ist eine der aggressivsten Formen von malignen Tumoren beim Menschen. Bei Fischen der Gattung Xiphophorus kommt es zur spontanen Tumorformation, welche auch durch zwischenartliche Kreuzung herbeiführbar ist. Hybride mit angeborenem Melanom stellen ein nützliches Tiermodell zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Tumorentwicklung dar. Ihre Tumorigenese hängt mit der pigmentzellspezifischen Überexpression der durch eine Mutation aktivierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk zusammen. In reinrassigen Fischen wird die onkogene Funktion des xmrk durch den Genlocus R, welcher molekular noch nicht identifiziert wurde, unterdrückt. Zusammen mit der Überexpression von xmrk konnten mittels einer RNA-Seq Analyse weitere Gene gefunden werden, welche differenziell in den Proben von malignen und benignen Geweben des Xiphophorus exprimiert werden. Des Weiteren ist bekannt, dass die Methylierung des xmrk Promotors Einfluss auf die Expression des Genes hat.
Um die Daten der durch RNA-Seq gefundenen Kandidatengene zu validieren, wurde deren Expression in malignen und benignen Geweben der Flossen und des Rumpfes mittels qPCR quantifiziert. Zusätzlich dazu wurde die Expression einiger humaner Orthologe dieser Gene in Proben aus humanen Melanomzelllinien gemessen. Mir war es möglich zu zeigen, dass mit Ausnahme von cdkn2ab, mitfb und xirp2b alle Kandidatengene signifikant unterschiedlich in mindestens einem Vergleich von benignem und malignem Gewebe exprimiert waren. Das mit xmrk verglichen gegensätzliche Expressionsmuster von pdcd4a macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten als vom R-Locus codierten Tumorsuppressorgen. In den humanen Melanomzelllinien konnte ausschließlich von PDGFRB keine erhöhte Expression in irgendeiner Probe nachgewiesen werden. Während die Expression von PDCD4, C-MYC und MITF in mindestens drei der vier Zelllinien mittelstark erhöht war, ließ sich bei KIT eine enorm gesteigerte Überexpression in Zellen der Linie Hermes3a nachweisen. Da drei der fünf analysierten Gene und ihre Orthologen ähnliche Expressionsmuster in Proben des Xiphophorus und der humanen Melanomzelllinien zeigen, deuten diese Ergebnisse auf die Nützlichkeit des Tiermodells zur Identifizierung entscheidender Gene und Signalwege im malignen Melanom hin. Ein zweites Ziel der Arbeit war das Erlangen tieferer Einblicke in die Methylierung des Xiphophorus Melanoms auf einer globalen und promotor- spezifischen Ebene. Um die Hypothese einer Reduzierung der globalen Methylierung zu testen, führte ich eine kolorimetrische Quantifizierung der 5-mC DNA in Kontroll- und Tumorgeweben aus. Diese Vorgehensweise zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verminderung der methylierten globalen DNA in den benignen Läsionen und malignen Melanomen der Flossen verglichen mit dem Kontrollgewebe. Um herauszufinden, on diese Demethylierung direkt mit der Überexpression des xmrk verbunden ist, analysierte ich als nächstes die Methylierung eines CpG Dinukleotids des xmrk Promotors mithilfe von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen. Obwohl nur in den Proben des exophytischen Tumorwachstums als Krebsgewebe eine verringerte Methylierung des CpG Dinukleotids verglichen mit den Kontrollen nachgewiesen werden konnte, zeigte sich die Stelle in Zellen der Xiphophorus Melanomzelllinie PSM komplett unmethyliert. Diese Ergebnisse deuten stark daraufhin, dass eine differenzierte Methylierung das onkogene Potential dieser Zellen bewirkt. Um die Effekte veränderter globaler und promotor-spezifischer Methylierung auf die Tumorigenese besser zu verstehen, sind weitere Untersuchungen nötig.
Einleitung:
TRPC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle in der Pathologie der Herzinsuffizienz und kardialen Hypertrophie. Diese Effekte werden unter anderem über den Calcineurin-NFAT-Signalweg vermittelt. Ein wichtiger Interaktionspartner und Regulator von TRPC-Kanälen ist das Protein FKBP52. Mittels eines Yeast Two-Hybrid Systems wurde in einer kardialen cDNA library eine Interaktion zwischen einem C-terminalen Fragment von TRPC3 (AS 742-848), welches außerhalb der bekannten FKBP-Bindungsdomäne (AS 703-714) liegt, und FKBP52 beobachtet. Da dies eine weitere Bindungsstelle in FKBP52 vermuten ließ, erzeugten wir ein Fragment von FKBP52, welches FKBP52s genannt wurde und dem die funktionell relevante PPIase I-Domäne mit der bekannten Bindungsstelle fehlt. Eine erste Co-IP zwischen diesem Fragment und TRPC3 war erfolgreich.
Ziel:
Die Bestimmung, ob die Anwesenheit des verkürzten FKBP52 in vivo die Komplexbildung aus TRPC3 bzw. TRPC4 und dem Wildtyp-FKBP52 unterdrückt. Zusätzlich, ob FKBP52s die Interaktion zwischen TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin in vivo unterbricht und damit die Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges hemmt.
Methoden:
Co-Immunopräzipitationen (Co-IP) wurden mit HEK-293-Zellen durchgeführt, die mit cDNA transfiziert wurden, welche Gene für TRPC3, TRPC4, Calcineurin A und FKBP52s enthielt. Zur Bestimmung der nukleären Translokation von NFATc1 mittels Fluoreszenzmikroskopie wurden HEK-293-Zellen mit TRPC3, TRPC4, GFP-NFATc1 ± FKBP52s transfiziert. Die statistische Analyse erfolgte mit einer One-Way ANOVA.
Ergebnisse:
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FKBP52 sowohl mit TRPC3 als auch mit TRPC4 interagiert. Ebenso wurde festgestellt, dass FKBP52 auch ohne seine katalytische PPIase I-Domäne Bindungen mit TRPC3 bzw. TRPC4 eingeht. Dieses FKBP52-Konstrukt nimmt ebenso an der Komplexbildung mit TRPC3 bzw. TRPC4 und Calcineurin teil. Des Weiteren ließ sich für TRPC3 zeigen, dass unter Stimulation mit Carbachol (GPCR-Agonist) bei Anwesenheit dieses gekürzten FKBP52 eine signifikant geringere Aktivierung und Wanderung des Transkriptionsfaktors NFAT in den Nucleus erfolgte.
Schlussfolgerung:
FKBP52 spielt daher eine wichtige Rolle in dieser Signalkaskade, indem es entscheidend an der Aktivierung von Calcineurin und dessen Rekrutierung zum TRPC-Kanalkomplex beteiligt ist und damit auch an der Aktivierung des Calcineurin-NFAT-Signalweges.
Das Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) steht an siebter Stelle der Inzidenzen aller Krebserkrankungen, mit jährlich steigender Tendenz. Wie kann einer so gefährlichen und heterogenen Krankheitsentität in der heutigen Medizin angemessen begegnet werden? Neben etablierten Therapien, die geraden bei rezidivierten oder refraktären NHL an ihre Grenzen stoßen, bieten experimentelle Therapieansätze neue Hoffnung: Blinatumomab ist ein bispezifischer Antikörper, der durch seine beiden Domänen als Adapter für die T-Zelle und die Tumor-Zelle fungiert und eine Zytolyse der malignen B-Zelle induziert. Bei der ALL fand Blinatumomab schon Anwendung in mehreren klinischen Studien und wurde im Dezember 2014 von der FDA in den USA zur Behandlung von Philadelphia-Chromosom-negativer rezidivierten/ refraktären B-Zell Vorläufer-ALL zugelassen. Als erste klinische Studie an NHL-Patienten wurde von 2004-2011 die MT103/104-Studie veranlasst. Im Zuge dieser unverblindeten, multizentrischen Phase I/II Studie wurden 76 Patienten mit refraktärem und rezidiviertem NHL vier bis acht Wochen mit Blinatumomab als Dauerinfusion behandelt und hierbei Informationen zu Toxizität und Tolerabilität gesammelt. Mit der Langzeitbeobachtung der Würzburger Kohorte aus dieser Studie befasst sich die vorliegende Arbeit. Ziel ist es zunächst, festzustellen, wie lange die Patienten nach Blinatumomab-Therapie im Zuge der MT103/104 Studie gesamt, rezidiv- oder therapiefrei überlebten und ob bei einem bestimmten Patientensubkollektiv ein besonders vorteilhaftes Langzeitüberleben gezeigt werden kann. Die Frage nach der Sicherheit von Blinatumomab beantwortet die Erfassung des Langzeitnebenwirkungsspektrums: Somit werden als zweiter Endpunkt die häufigsten Gründe für Krankenhausaufenthalte nach Blinatumomabtherapie, eventuelle Häufungen einer spezifischen Nebenwirkungsentität und die Reversibilität der unter der Therapie aufgetretenen Nebenwirkungen mit einem selbst entwickelten Fragebogen erfasst. Der MoCA-Test soll neurokognitive Langzeittoxizitäten ausschließen. Die Arbeit konnte nicht nur zeigen, dass Patienten, die auf Blinatumomab ansprachen gegenüber den Patienten ohne Ansprechen ein deutlich längeres Überleben zeigten, sie bestätigte die Wichtigkeit des Erhalts der effektiven Dosis von 60 µg/m²/24h für das Erreichen und den Erhalt der Progressionsfreiheit. Sechs Patienten waren bei Beobachtungsende noch in Remission. Die unterschiedlichen Eindosierungsmodi hatten keinen Effekt auf das Langzeitüberleben, können aber nebenwirkungsbedingte Therapieabbrüche während der Therapie minimieren. Alle während der Therapie aufgetretenen Nebenwirkungen waren in der Langzeitnachbeobachtung vollständig reversibel. Am häufigsten mussten Patienten auf Grund von Infektionen im Verlauf hospitalisiert werden, bei zwei Patienten traten zusätzliche Tumorerkrankungen auf, die allerdings nicht mit der Blinatumomab-Therapie assoziiert waren. Die Rate der Transformationen von indolenten in aggressive NHL war nicht erhöht. Im MoCA-Test lassen sich keine Häufungen von neurokognitiven Defiziten finden. Blinatumomab zeigt sich auch in der Langzeitbeobachtung als ein für die Behandlung von rezidivierten und refraktären NHLs effektives und sicheres Medikament.
Hintergrund:
Eine Panikattacke beginnt typischerweise mit der Wahrnehmung einer physiologischen oder psychischen Veränderung, die von der Person als bedrohlich eingestuft wird. Während in klassischen neuroanatomischen Modellen der Panikstörung die Amygdala in der sich anschließenden aufschaukelnden Symptomatik in den Mittelpunkt gestellt wurde, erweitern aktuelle Studien dieses amygdalozentrische Bild und lenken die Aufmerksamkeit auf extratemporale neuronale Netzwerke. Dysfunktionen im neuronalen Aufmerksamkeitsnetzwerk, relevant für die Wahrnehmung und Regulierung exterozeptiver und interozeptiver Prozesse, könnten zur Entstehung einer Panikstörung beitragen. Weiterhin scheinen bestimmte Risikogenotypen für die Panikstörung wie z.B. im Adenosin Rezeptor 2A (ADORA2A) oder dem Neuropeptid S Rezeptor (NPSR1) Gen und die entsprechenden Neurotransmittersysteme in der Regulierung der Aufmerksamkeitsnetzwerke involviert zu sein.
Fragestellung:
Dysfunktionen im noradrenergen bottom-up Alertingnetzwerk und in der dopaminergen exekutiven top-down Aufmerksamkeitskontrolle könnten in einem neurokognitiven Entstehungsmodell der Panikstörung eine wichtige Rolle spielen. Mit Hilfe funktioneller Bildgebung soll die Funktion des neuronalen Aufmerksamkeitsnetzwerkes in einer nichtklinischen Stichprobe abhängig von genetischen Risikofaktoren und einer klinischen Stichprobe von und nach einer kognitiven Verhaltenstherapie untersucht werden.
Methoden:
Im nichtklinischen Teil der Untersuchung wurden in Studie 1 47 gesunde Versuchspersonen für die NPSR1 rs324981 Variante stratifiziert rekrutiert. Mittels fMRT wurde die Aktivität des Alertingnetzwerks und des Executive Control Netzwerks auf neuronaler Ebene mit dem Attentional Networt Test (ANT) untersucht. In Studie 2 wurde bei N=65 Versuchspersonen stratifiziert für die ADORA2A rs5751876 Variante als zusätzliches Verhaltensmaß die Fähigkeit zur interozeptiven Wahrnehmung in Bezug zur Konnektivität im insulären Ruhenetzwerk untersucht. Im klinischen Teil der Untersuchung (Studie 3) wurden 44 Patienten mit Panikstörung sowie eine entsprechend große und gematchte Kontrollgruppe rekrutiert. Es wurden fMRT Ruhemessungen vor und nach Abschluss einer kognitiven Verhaltenstherapie erhoben. Als zusätzliches Verhaltensmaß wurde die selbstberichtete Aufmerksamkeitskontrolle zwischen der Patienten- und der Kontrollgruppe verglichen.
Ergebnisse:
Träger des NPSR1 TT und des ADORA2A TT Risikogenotyps für Angst und Angsterkrankungen zeigten eine erhöhte Aktivität in Teilen des Alertingnetzwerks. Die Aktivität im Executive Control Netzwerk war arealabhängig teilweise erhöht, teilweise reduziert. Innerhalb eines interozeptiven Netzwerks zeigten Träger des ADORA2A TT Genotyps Hinweise auf eine dysfunktionale fronto-striatale-insuläre Interaktion. Im klinischen Teil der Studie zeigten Patienten mit Panikstörung eine reduzierte Konnektivität des dorsolateralen Präfrontalkortex (dlPFC) im fronto-parietalen Aufmerksamkeitsnetzwerk. Die Konnektivität innerhalb dieses Netzwerks korrelierte mit Defiziten in selbstberichteter Aufmerksamkeitskontrolle bei Patienten mit Panikstörung. Nach Abschluss der Therapie zeigte sich bei Patienten, die von der Therapie profitiert hatten, wieder eine Zunahme oder Verbesserung der Konnektivität mit dem dlPFC.
Schlussfolgerung:
Die Ergebnisse dieser Untersuchung betonen die Rolle dysfunktionaler interozeptiver und exterozeptiver Aufmerksamkeitsnetzwerke in der Entstehung von Angsterkrankungen. Bei Patienten mit Panikstörung sowie gesunden Versuchspersonen mit bestimmten prädisponierenden genetischen Variationen scheint eine Dysbalance des neuronalen Aufmerksamkeitsnetzwerks bzgl. der Abstimmung von bottom-up und top-down Netzwerken vorzuliegen.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Kompatibilität in der medizinischen Bildgebung unter zwei verschiedenen Aspekten: (A) Beeinflussung von Gradientenfeldern durch das Magnetsystem eines Magnetresonanztomographen. (B) Beeinflussung elektronischer Bauteile durch ionisierende Strahlung.
Imperfektionen in der Gradientenhardware (7–13) führen dazu, dass nicht die ideale zeitliche Gradientenform ausgespielt wird, sondern eine verzerrte Version der Gradienten (6,14). In der nicht-kartesischen Bildgebung führen diese resultierenden Abweichungen in den k-Raum Trajektorien zu Bildartefakten, die sich negativ auf die Diagnosestellung auswirken können. Die linearen und zeitinvarianten Eigenschaften des Gradientensystems ermöglichen die Bestimmung der Übertragungsfunktion (GSTF) (20). Diese Übertragungsfunktion kann innerhalb der Bildrekonstruktion zur Trajektorienkorrektur verwendet werden (14,15,70). In dieser Arbeit wurden mit der Feldkamera (Skope Magnetic Resonance Technologies, Zürich, Schweiz) (22,23) und der schichtselektiven Phantommethode (5,6) zwei etablierte GSTF-Messverfahren verglichen. Dabei wurde die Notwendigkeit einer Abtastzeitkompensation festgestellt, um die GSTF-Informationen entsprechend der gewählten Abtastzeit zu korrigieren (s. Abbildung 16) und die Trajektorien hinreichend zu korrigieren und damit Bildartefakte zu reduzieren. Die Langzeit- und Temperaturanalyse der GSTF zeigte für zwei verschiedene Siemens-Tomographen (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany) eine Langzeit und Temperaturstabilität, auch bei extensiven Duty-Cyclen. Damit lässt sich auch einfach eine Pre-emphasis-Korrektur der Gradienten realisieren, was exemplarisch mit einer Zig-Zag- und einer Spiral-Sequenz gezeigt werden konnte. Die GSTF-Pre-emphasis-Korrektur lieferte dabei ähnliche Ergebnisse wie die GSTF-Post-Processing-Technik (s. Abbildung 44 und 47).
In Bezug auf die Kompatibilität in der medizinischen Bildgebung wurde in dieser Arbeit auch die Beeinflussung von medizinischen Implantaten durch ionisierende Strahlung untersucht. Herzschrittmacher, Kardioverter-Defibrillatoren oder andere aktive medizini- sche Implantate können in ihrer Funktion durch ionisierende Strahlung, die bei verschiedenen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen appliziert wird, beeinträchtigt werden (28,97,111). In dieser Studie wurden verschiedene elektronische Bauteile, wie Kondensatoren, Transistoren, Batterien und Speicherkarten in einer gewebeäquivalenten Messumgebung bestrahlt und dabei auf ihre Funktionalität überprüft. Die Messumgebung simuliert dabei die Wechselwirkungseigenschaften von menschlichem Gewebe mit ionisierender Strahlung in einem Energiebereich von 10 keV – 6 MeV. Zudem ermöglicht sie mit der Einschubeinheit die Integration von Implantaten/elektronischen Bauteilen, sowie eine realistische Bestrahlungsplanung und Dosisverifikation (35,77). Bei den Kondensatoren zeigten sich während der Bestrahlung ein verändertes Funktionsverhalten, mit signifikant abweichenden Spannungen und Zeitkonstanten gegenüber dem unbestrahlten Zustand. Auch die Batterien haben sich während der Bestrahlung signifikant schneller entladen, als ohne Strahlungsapplikation. Nach der Bestrahlung konnten bei den untersuchten SD-Speicherkarten auch Veränderungen in den Speicherzellen festgestellt werden. Bei den Transistoren war aufgrund von Fehlern im Messsetup und dem Schaltungsdesign keine genauere teststatistische Auswertung möglich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich charakteristische Kenngrößen der untersuchten Bauteile bei Strahlungsapplikation signifikant veränderten.
Dem Endothel, welches die luminale Oberfläche aller Blutgefäße auskleidet, kommt eine wichtige Barrierefunktion zwischen Blut und Gewebe zu. Nur durch eine bedarfsgerechte Justierung dieser Barriere, die den Durchtritt von Molekülen und Zellen reguliert, kann die Gewebehomöostase aufrechterhalten werden. Dabei ist das Endothel nicht nur passive Barriere, sondern auch an dieser dynamischen Regulation aktiv beteiligt. Störungen oder Fehlregulationen dieser Prozesse führen zu Pathologien, z.B. Arteriosklerose.
Es ist seit längerem bekannt, dass Carcinoembryonic antigen–related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1), ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, die Bildung und Morphogenese neuer Blutgefäße beeinflusst. Die spontane Entwicklung kleiner Arteriosklerose-ähnlicher Läsionen in CEACAM1 knockout (Cc1-/-) Mäusen zeigt, dass CEACAM1 auch für die Homöostase ausgereifter Blutgefäße von Bedeutung ist. Ziel dieser Dissertationsarbeit war daher, den Einfluss von CEACAM1 auf wesentliche Aspekte der Endothelfunktion in Aorten in situ bzw. in Endothelzellkulturen in vitro zu analysieren.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass CEACAM1-defiziente Endothelzellen im Vergleich zu Wildtyp (WT) Endothelzellen eine rundlichere Zellmorphologie mit meanderförmigen Zellgrenzen und interzellulären Lücken aufweisen. Diese morphologischen Unterschiede stimmen mit Befunden in situ an Aorten von WT und Cc1-/- Mäusen überein.
Weiterhin wurde eine Translokation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) von der Zellmembran in den peri-nukleären Bereich bei CEACAM1-Defizienz festgestellt. Die erhobenen Daten bieten zwei mögliche Erklärungen dafür. Einerseits könnte CEACAM1 durch Interaktion mit eNOS als Membrananker fungieren. Daneben wiesen CEACAM1-defiziente Endothelzellen eine erhöhte Expression des Enzyms APT1 auf, welches eNOS depalmitoyliert. Die daraus resultierende, ebenfalls nachgewiesene geringere Palmitoylierung könnte auch zur verminderten Membran-lokalisation von eNOS beitragen.
Zur endothelialen Funktion gehört, die Adhäsion von Blutzellen an die Gefäßwand weitestgehend zu beschränken. CEACAM1-defiziente Endothelzellen zeigten im Vergleich zu WT Endothelzellen eine verstärkte Adhäsivität gegenüber murinen und humanen Monozyten. Ähnliche Unterschiede wurden für Aortenexplantate aus WT und Cc1-/- Mäusen festgestellt. Dies ist einerseits mit einer verstärkten Expression des Zelladhäsionsmoleküls ICAM-1 bei CEACAM1-Defizienz erklärbar. Darüber hinaus vermittelt die Glykokalyx anti-adhäsive Eigenschaften. Aus Vorbefunden war bekannt, dass die endotheliale Glykokalyx in der Aorta von Cc1-/- Mäuse reduziert ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies auf eine verstärkte Expression der Glykokalyx-degradierenden Enzyme MMP9, Chondroitinase sowie Hyaluronidase-2 in Cc1-/- Endothelzellen zurückgeführt werden.
Eine erhöhte Permeabilität stellt einen Indikator für ein dysfunktionales Endothel, eines der initialen Schritte in der Pathogenese der Arteriosklerose, dar. Zur Analyse der aortalen Permeabilität wurde ein modifizierter Miles-Assay etabliert. Unter Verwendung etablierter muriner Arteriosklerosemodelle konnte gezeigt werden, dass dieser Assay eine Störung der vaskulären Permeabilität bereits vor Auftreten makroskopischer Veränderungen zuverlässig detektiert.
Im Rahmen der folgenden Analysen an WT und Cc1-/- Mäusen zeigte sich ein altersabhängiger Effekt von CEACAM1 auf die Gefäßpermeabilität: Aorten von 3 Monate alten Cc1-/- Mäuse wiesen eine im Vergleich zum WT erhöhte Gefäßpermeabilität auf, welche wahrscheinlich Folge einer verzögerten Gefäßreifung ist. Im Alter von 9 Monaten zeigte sich dagegen ein entgegengesetztes Bild. Dies wurde auf eine verstärkte Expression des die Barriere schädigenden Inflammationsmediators TNF-α in 9 Monate alten WT Mäusen zurückgeführt.
Außerdem modulierte CEACAM1 die TNF-α-vermittelte Lockerung der endothelialen Barriere, indem es die Phosphorylierung von Adherens Junction Proteinen beeinflusste. Basal stabilisierte CEACAM1 die endotheliale Barriere durch Hemmung der Phosphorylierung von Caveolin-1, welches Adherens Junctions destabilisiert. Unter Einfluss von TNF-α war CEACAM1 verstärkt im Bereich von Adherens Junctions lokalisiert und rekrutierte dort Src-Kinase. Src-Kinase wiederum destabilisierte Adherens Junctions durch Phosphorylierung von β-Catenin, was in verstärkter Gefäßpermeabilität resultierte. Dagegen führte TNF-α in CEACAM1-defizienten Endothelzellen zu einer Dephosphorylierung von Caveolin-1 und β-Catenin, wodurch Adherens Junctions und damit die endotheliale Barriere stabilisiert wurden. Diese CEACAM1-abhängige differenzielle Regulation der Stabilität von Adherens Junctions unter TNF-α trägt wahrscheinlich maßgeblich zu den Unterschieden der vaskulären Permeabilität in 3 bzw. 9 Monate alten WT und Cc1-/- Mäusen bei.
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass CEACAM1 zentrale Funktionen des Endothels und hierüber die Homöostase reifer Gefäße beeinflusst. Da eine Expression von CEACAM1 auch in arteriosklerotischen Plaques nachgewiesen werden konnte, soll in weiteren Untersuchungen auch der Beitrag von CEACAM1 zur arteriosklerotischen Plaquebildung analysiert werden.
Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese der Bakterien interferieren.
Die Zellphysiologie und Zellwandsynthese wird abhängig von der Wachstumsphase und Umwelt-einflüssen in den Bakterien streng reguliert. Neben den Zweikomponentensystemen sind Serin/Threonin-Proteinkinasen und -Phosphatasen wesentliche Sensoren und Regulatoren der Bakterien. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung bewirken diese beiden Systeme eine Hemmung oder Aktivierung der entsprechenden Zielproteine. Dadurch kann sich die Bakterienzelle an innere und äußere Reize anpassen. In dieser Arbeit wurde die konservierte Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und die Serin/Threonin-Phosphatase Stp von S. aureus untersucht. Die beiden Proteine Stk und Stp haben einen großen Einfluss auf die Signalweiterleitung, den zentralen Metabolismus, die Stressantwort, die Antibiotikaresistenz und die Virulenz von S. aureus.
Im ersten Teil dieser Arbeit wird dargelegt, dass Stk und Stp in der bakteriellen Membran lokalisiert sind, dort miteinander interagieren und antagonistisch Zielproteine phosphorylieren bzw. dephospho-rylieren. Die Deletion der Phosphatase Stp bewirkt, dass zahlreiche Proteine in der Zelle permanent phosphoryliert und daher vermutlich nur noch eingeschränkt funktionstüchtig sind. Die ausbleibende Dephosphorylierung der Proteine in der stp-Mutante hat einen dramatischen Effekt auf die Zellwand-synthese und die Virulenz von S. aureus. So hat die stp-Mutante eine verdickte Zellwand und ist weniger virulent als die stk-Mutante und der Wildtypstamm. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals eine Erklärung präsentiert, die die strukturellen Besonderheiten von Stk und deren Auswirkung auf die Zellwandsynthese zusammenführt: In der stp-Mutante akkumulieren Zellwandvorläufer in der Zelle, da vermutlich die entsprechenden Zellwandsyntheseproteine durch Stk-vermittelte Phosphorylierung gehemmt werden. Die Proteine FemXAB nehmen eine zentrale Rolle in der Zellwandsynthese ein, indem sie die Pentaglycin-Interpeptidbrücke des Zellwandvorläufers Pentaglycin-Lipid II syntheti-sieren. Stk wird durch die Bindung seiner extrazellulären Domänen an Pentaglycin-Lipid II aktiviert. In der vorliegenden Arbeit konnte FemX als in vitro Substrat von Stk und Stp identifiziert werden. Die permanente Phosphorylierung von FemX in der stp-Mutante führt zur verminderten Synthese der Pentaglycin-Brücken am Lipid II und infolgedessen zum Einbau von unvollständigen Muropeptiden in den neuen Peptidoglycanstrang. Diese strukturelle Veränderung führt zur Verdickung der Zellwand und folglich zur verminderten Empfindlichkeit gegenüber der Glycyl-Glycinpeptidase Lysostaphin. Neben FemX interagiert Stk mit weiteren Zellwandsyntheseproteinen wie FemAB und einigen Zellteilungsproteinen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Stk das Vorkommen seines extrazellulären Liganden Lipid II detektiert und dementsprechend die Zellwandsynthese über FemX reguliert.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand verschiedener Omics-Techniken die stk-, stp- und stk/stp-Mutante im Vergleich zum S. aureus NewmanHG Wildtyp charakterisiert. Dabei zeigten sich teilweise große Unterschiede zwischen der stp-Mutante und den anderen Stämmen. Mit diesen Unter-suchungen konnten Ergebnisse aus anderen Studien bestätigt und mit weiteren Daten untermauert werden. So lässt sich die verminderte Virulenz der stp-Mutante mit der reduzierten Expression und Sekretion von Toxinen wie Hämolysinen und Leukozidinen erklären. Dies führt zu einer verminderten Hämolyse von Erythrozyten und einer verminderten Immunantwort gegen diese Toxine im Infektions-versuch. Stk und Stp phosphorylieren bzw. dephosphorylieren Transkriptionsfaktoren und Antwort-regulatoren von Zweikomponentensystemen, was zu der veränderten Expression und Sekretion der Virulenzfaktoren führt. Die Analyse der Mutanten offenbart, dass Stk ein negativer und Stp ein positiver Regulator der Virulenz in S. aureus ist. Außerdem regulieren Stk und Stp zentrale Aspekte des Metabolismus in S. aureus. So ist die Konzentration an Nukleotidtriphosphaten in der stp-Mutante reduziert, was auf eine verminderte Expression der Gene der Pyrimidinsynthese zurückzuführen ist. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass Stk und Stp wesentliche Aspekte der Zellphysiologie wie die Zellwandsynthese, den zentralen Metabolismus und die Virulenz von S. aureus regulieren.
Emotionale Kontrolle ist für unsere Zusammenleben unerlässlich. Zum neuronalen Netzwerk der Emotionsverarbeitung und Emotionskontrolle gehört auch der rechte inferiore präfrontale Kortex, wobei seine Funktion häufig mit der einer Bremse verglichen wird. Die Antizipationsangst, die bei manchen Angststörungen eine Rolle spielt und das daraus resultierende Vermeidungsverhalten, bieten einen relevanten Zusammenhang, den man in der Therapie von Angsterkrankungen beeinflussen könnte. Hierbei bieten nichtinvasive Hirnstimulationsverfahren einen möglichen Ansatzpunkt und der rechte IFG ein mögliches Ziel. In dieser Studie stimulierten wir den rechten inferioren frontalen Gyrus (rIFG) mittels anodaler transkranieller Gleichstromstimulation (tDCS) um zu prüfen, ob dadurch die emotionale Anspannung moduliert werden kann. Zu diesem Zwecke wurde der rIFG bei gesunden Probanden (N = 80), aufgeteilt in eine tDCS Gruppe und eine Sham Gruppe, über einen Zeitraum von 20 Minuten mit einer Stromstärke von 2 mA und einer Elektrodengröße von 35 cm² elektrisch stimuliert. Währenddessen wurde die Hautleitfähigkeiten (SCL) als psychophysiologischer Parameter in Antizipation eines akustischen neutralen bzw. aversiven Reizes gemessen. Die Art des akustischen Reizes war dabei für die Probanden durch einen visuellen Hinweisstimulus vorhersehbar, jedoch war der Zeitpunkt der Präsentation des akustischen Reizes nicht vorhersehbar. Dadurch konnte emotionale Anspannung in Antizipation des aversiven Stimulus induziert werden, was wir durch ein insgesamt höheres SCL während der aversiven Bedingung nachweisen konnten. Wir konnten einen signifikanten Effekt der tDCS des rIFG auf die psychophysiologischen Parameter der Antizipationsangst nachweisen. Der Effekt beruhte dabei auf einem geringeren Anstieg des Hautleitfähigkeitslevels der tDCS Gruppe von neutraler zu aversiver Bedingung im Vergleich zu Sham Gruppe. Wir können daher bestätigen, dass es möglich ist die physiologische Reaktion bei emotionaler Anspannung durch tDCS des rIFG zu regulieren. Darüber hinaus können wir dadurch die angenommene Rolle des rIFG in der Emotionsregulation bestätigen. Dieser scheint daher ein vielversprechender Stimulationsort für tDCS zur Verstärkung der emotionalen Kontrolle zu sein. Auf Basis unserer Ergebnisse, könnte in zukünftigen Studien tDCS des rIFG in Kombination mit Verhaltenstherapie bei Angsterkrankungen oder zur Modulation von Vermeidungsverhalten eingesetzt werden. Durch unseren Versuch konnte damit ein grundlegender Beitrag für zukünftige Therapiestudien im Zusammenhang mit tDCS geleistet werden.
Die Einhaltung eines gesunden Lebensstils, einschließlich der Behandlung modifizierbarer kardiovaskulärer Risikofaktoren, beeinflusst maßgeblich die Entstehung und Progression von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (HKE). So reduziert eine ausgewogene Ernährungsweise, ausreichend körperliche Aktivität, Tabakverzicht, das Halten des Normalgewichtes sowie die Behandlung einer Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus, die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität.
Die vorliegende Arbeit widmet sich (a) der Prävalenz und leitliniengerechten Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren von Teilnehmern aus der Allgemeinbevölkerung der STAAB Kohortenstudie („Häufigkeit und Einflussfaktoren auf frühe Stadien A und B der Herzinsuffizienz in der Bevölkerung“) sowie der Schätzung des 10-Jahres Risikos für tödliche HKE in diesem Kollektiv. Weiterhin wurde (b) der Einfluss von medikamentenbezogenen Überzeugungen auf die Blutdruckkontrolle von Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie untersucht. Schließlich wurde (c) der Erhalt von ärztlichen Lebensstilempfehlungen sowie deren Determinanten bei Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie sowie der EUROASPIRE IV Studie („European Action on Secondary and Primary Prevention by Intervention to Reduce
Events“) in Deutschland betrachtet.
Die STAAB Kohortenstudie untersucht die frühen asymptomatischen Formen der Herzinsuffizienz-Stadien A und B in einer repräsentativen Stichprobe von 5.000 Personen
ohne symptomatische Herzinsuffizienz im Alter von 30 bis 79 Jahren aus der Allgemeinbevölkerung mit Wohnsitz in der Stadt Würzburg.
Die EUROASPIRE IV Studie untersuchte bei 7.998 Koronarpatienten im Alter von 18 bis 79
Jahren aus insgesamt 24 Europäischen Ländern (536 Patienten aus Deutschland) im Zeitraum 2012 bis 2013 die Risikofaktoren sowie die Umsetzung der leitliniengerechten Versorgung und Prävention von HKE im europäischen Vergleich. Die Datenerhebung beider Studien erfolgte durch ein geschultes Studienpersonal nach standardisierten Vorgaben.
Die Prävalenz und Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren nach den aktuellen Vorgaben der „European Society of Cardiology“ (ESC) wurde bei insgesamt 1.379 Teilnehmern, die zwischen Dezember 2013 und April 2015 an der STAAB Kohortenstudie teilgenommen haben, untersucht. Es zeigte sich eine hohe Prävalenz der kardiovaskulären Risikofaktoren Hypertonie (31.8%), Hyperlipidämie (57.6%) und Diabetes mellitus (3.5%). Hierbei erreichten
trotz Pharmakotherapie über die Hälfte der Teilnehmer mit einem Bluthochdruck (52.7%) oder erhöhten LDL-Cholesterinwerten (56.7%) sowie 44.0% der Personen mit einem Diabetes mellitus die empfohlenen Grenzwerte nicht. Weiterhin wurde erstmalig zu Studienbesuch eine Hypertonie (36.0%), Hyperlipidämie (54.2%) oder ein Langzeitzuckerwert (HbA1c) >6.5% (23.3%) detektiert. In der jüngsten Altersgruppe (30-39 Jahre) fand sich der höchste Anteil von unbekanntem Bluthochdruck (76.5%) sowie hohem LDL-Cholesterin (78.0%) und die Altersgruppe 60-69 Jahren wies mit 43.5% die höchste Prävalenz für einen bislang nicht detektierten HbA1c >6.5% auf. Die Akkumulation von drei oder mehr kardiovaskulären Risikofaktoren war mit dem männlichen Geschlecht, einem höheren Alter und einem niedrigeren Bildungsgrad assoziiert. Von 980 mittels SCORE („Systematic Coronary Risk Evaluation“) Risiko-Chart untersuchten Teilnehmern befanden sich jeweils 56.6%, 35.8% und 7.5% in der niedrigen, mittleren und hohen bis sehr hohen SCORE-Risikogruppe für tödliche HKE. Das Hochrisiko-Kollektiv für tödliche HKE war vorwiegend männlich und wies häufiger eine Hypertonie oder ein hohes LDL-Cholesterin auf.
Der Einfluss von Überzeugungen gegenüber antihypertensiver Medikation auf die Blutdruckkontrolle wurde an 293 Teilnehmern, die von Oktober 2014 bis März 2017 an der STAAB Kohortenstudie teilgenommen haben, untersucht. Auf ihre Medikamente gesundheitlich angewiesen zu sein gaben 87% der Teilnehmer an, 78.1% stimmten der Aussage zu, dass ihre Medikamente sie vor einer Verschlechterung ihrer Gesundheit schützen. Es zeigte sich ein inverser Zusammenhang zwischen einem höheren Maß an Bedenken gegenüber der verordneten blutdrucksenkenden Medikation und einer besseren Blutdruckkontrolle bei Frauen. Ein signifikanter Zusammenhang zwischen Bedenken gegenüber einer antihypertensiven Medikation und der Blutdruckkontrolle bei Männern ließ sich hingegen nicht feststellen. Es konnten keine statistisch signifikanten Assoziationen für die Notwendigkeit von Medikation in der vorliegen Untersuchung gezeigt werden.
Die Häufigkeit und Determinanten für die Empfehlung eines ärztlichen Lebensstils wurde bei 665 Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie ohne vorbestehende HKE (Primärprävention) und bei 536 Koronarpatienten der EUROASPIRE IV Studie (Sekundärprävention) untersucht.
Mit Ausnahme der Empfehlung zum Rauchverzicht erhielten die Patienten der EUROASPIRE IV Studie häufiger ärztliche Lebensstilempfehlungen verglichen mit Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie: (Rauchverzicht: STAAB 44.0%, EUROASPIRE 36.7%; Gewichtsreduktion: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 69.2%; körperliche Aktivität steigern: STAAB 52.1%, EUROASPIRE 71.4%; gesundes Ernährungsverhalten: STAAB 43.9%, EUROASPIRE 73.1%). Die Chance für den Erhalt von mindestens 50% aufgrund der individuellen Risikofaktoren adäquaten ärztlichen Lebensstilempfehlungen war bei STAAB Teilnehmern mit offensichtlichen oder beobachtbaren kardiovaskulären Risikofaktoren signifikant erhöht (BMI >25kg/m2, Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus).
Hingegen erhielten Patienten mit einer vorbestehenden HKE signifikant häufiger eine ärztliche Lebensstilempfehlung bei einem Diabetes mellitus, wobei die Empfehlungshäufigkeit mit zunehmendem Alter abnahm. Die weitergehende nicht publizierte Analyse des Interaktions
Modells zeigte, dass der Zusammenhang zwischen dem Alter und der Empfehlungshäufigkeit bei Patienten mit bereits bestehender HKE stärker ausgeprägt war, als bei Teilnehmern der STAAB Kohortenstudie ohne koronare HKE. Weiterhin war der Zusammenhang zwischen einer adäquaten Lebensstilempfehlung und Hyperlipidämie bei Teilnehmern ohne koronares Ereignis signifikant stärker ausgeprägt, im Vergleich zu Patienten mit einer bereits bestehender HKE.
Die Ergebnisse zeigten ein erhebliches Potenzial für eine verbesserte Umsetzung leitliniengerechter Behandlung modifizierbarer kardiovaskulärer Risikofaktoren in der Primär- und Sekundärprävention. Vor dem Hintergrund einer hohen Anzahl kardiovaskulärer Risikofaktoren bei jungen Erwachsenen sollte die Bedeutung der Langzeitfolgen im Arzt
Patienten-Gespräch hervorgehoben und bei der Erarbeitung von Präventionsstrategien, insbesondere für junge Altersgruppen, Beachtung finden. Geschlechtsspezifische
Determinanten hinsichtlich der Kontrolle kardiovaskulärer Risikofaktoren sowie Befürchtungen gegenüber der Medikation sollten stärker im Arzt-Patientengespräch berücksichtigt werden.
Zur Stärkung der Compliance des Patienten bei der Umsetzung eines gesunden Lebensstils,
sollte der Arzt hinsichtlich der Bedeutung von Lebensstilintervention, aber auch im Umgang mit schwierigen Situationen, wie die Empfehlung einer Gewichtsreduktion, sensibilisiert und bei der richtigen Handhabung der Leitlinienempfehlung stärker unterstützt werden.
Die Risikobewertung von Chemikalien ist für die öffentliche Gesundheit von entschei-dender Bedeutung, weshalb strenge Testverfahren zu deren toxikologischer Begutach-tung angewandt werden. Die ursprünglich tierbasierten Testverfahren werden aufgrund von neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen und wegen ökonomischer Ineffizienz sowie ethischer Fragwürdigkeit immer mehr durch alternative Methoden ohne Tiermodelle ersetzt. Für den toxikologischen Endpunkt der Augenreizung wurden bereits die ersten alternativen Testsysteme auf der Basis von ex vivo- oder in vitro-Modellen entwickelt. Jedoch ist bis dato kein alternatives Testsystem in der Lage, das gesamte Spektrum der verschiedenen Kategorien der Augenreizungen nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) vorherzusagen und damit den tierbasierten Draize-Augenreizungstest vollends zu ersetzen. Gründe hierfür sind fehlende physiologische Merkmale im Modell sowie eine destruktive Analysemethode.
Aufgrund dessen wurden in dieser Studie die Hypothesen getestet, ob ein verbessertes In-vitro-Modell oder eine zerstörungsfreie, hochsensitive Analysemethode die Vorher-sagekraft des Augenreizungstests verbessern können. Dafür wurden zunächst neue Mo-delle aus humanen Hornhaut- und Hautepithelzellen entwickelt. Die Modelle aus pri-mären cornealen Zellen zeigten eine gewebespezifische Expression der Marker Zytokera-tin 3 und 12 sowie Loricrin. In beiden Modellen konnte durch die Verkürzung der Kul-turdauer die Ausbildung einer Hornschicht verhindert werden. Die Modelle wiesen dadurch eine sensiblere Barriere vergleichbar der nativen Cornea auf. Darüber hinaus konnte durch die chemische Quervernetzung mit Polyethylenglykolsuccinimidylglutara-tester ein transparentes, nicht kontrahierendes Stroma-Äquivalent etabliert werden. Der Stroma-Ersatz konnte zur Generierung von Hemi- und Voll-Cornea-Äquivalenten einge-setzt werden und lieferte somit erste Ansatzpunkte für die Rekonstruktion der nativen Hornhaut.
Parallel dazu konnte ein zerstörungsfreies Analyseverfahren basierend auf der Impe-danzspektroskopie entwickelt werden, das wiederholte Messungen der Gewebeintegri-tät zulässt. Zur verbesserten Messung der Barriere in dreidimensionalen Modelle wurde hierfür ein neuer Parameter, der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei der Frequenz von 1000 Hz, der TEER1000 Hz definiert, der eine genauere Aussage über die Integrität der Modelle zulässt. Durch die Kombination der entwickelten cornealen Epithelzellmodelle mit der TEER1000 Hz-Messung konnte die Prädikitivität des Augenrei-zungstests auf 78 - 100 % erhöht werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die nicht destruktive Messung des TEER1000 Hz zum ersten Mal erlaubte, die Persistenz von Irritationen durch wiederholte Messungen in einem in vitro-Modell zu erkennen und somit die GHS-Kategorie 1 von GHS-Kategorie 2 zu unterscheiden. Der wissenschaftli-che Gewinn dieser Forschungsarbeit ist ein neues Testverfahren, das alle GHS-Kategorien in einem einzigen in vitro-Test nachweisen und den Draize-Augenreizungstest gänzlich ersetzen kann.
Jeder Zwanzigste im Alter von über 60 Jahren ist von einer Demenzerkrankung betroffen. Mit zunehmendem Alter steigt der Anteil Betroffener drastisch. Hierbei ist die Alzheimer-Demenz (AD) der häufigste Subtyp der Demenzerkrankungen. Symptomatisch ist diese Erkrankung vorwiegend charakterisiert durch ein Nachlassen der Gedächtnisfunktionen; neuropathologisch weisen Patienten mit AD neurofibrilläre Bündel von Tau-Protein-Ablagerungen, Amyloid-β (Aβ) Plaques sowie einen verringerten zerebralen Blutfluss auf.
Aktuell gibt es noch keine Behandlungsmöglichkeit, um die Erkrankung deutlich zu verlangsamen oder zu stoppen. Bereits Jahrzehnte vor Diagnosestellung der AD beginnen die pathologischen Mechanismen. Aktuelle Behandlungsmethoden setzen jedoch häufig erst nach Diagnosestellung einer AD an, also zu einem Zeitpunkt, an dem das Gehirn schon eine deutliche Neurodegeneration aufweist. Die Untersuchung von Risikogruppen zur Identifikation von frühen Biomarkern und nebenwirkungsarmen Behandlungsmethoden bietet ein großes Potential, um die Erkrankung möglichst früh entdecken und verlangsamen oder vielleicht sogar stoppen zu können. Risikogruppen im späteren Lebensabschnitt sind beispielsweise Träger des genetischen Hauptrisikofaktors Apolipoprotein-E4 (APOE4), Patienten mit einer subjektiven kognitiven Beeinträchtigung sowie Patienten mit einer objektiven leichten kognitiven Beeinträchtigung (engl. mild cognitive impairment; MCI).
Die Untersuchung der hämodynamischen Reaktion mittels funktioneller Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) ist aufgrund der einfachen und kostengünstigen Einsetzbarkeit dieser Methodik besonders praktikabel. Auch der wiederholte Befund einer reduzierten hämodynamischen Reaktion bei Patienten mit AD scheint vielversprechend. Untersuchungen mit AD-Risikogruppen gibt es bisher jedoch nur wenige; zudem weisen diese uneindeutige Befunde auf.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher die Untersuchung der hämodynamischen Reaktion bei den Risikogruppen ‚APOE4‘ und ‚MCI‘ im Vergleich zu gesunden Kontrollen während Wortflüssigkeitsaufgaben, die mittels fNIRS bereits gut etablierte Aufgaben darstellen. Des Weiteren wird in der vorliegenden Arbeit die Wirkung einer nebenwirkungsarmen Behandlungsmethode im Vergleich zu einer sham-Behandlung bei der Risikogruppe ‚subjektive kognitive Beeinträchtigung‘ untersucht. Bei dieser Behandlungsmethode handelt es sich um ein mittels transkranieller Gleichstromstimulation (engl. transcranial direct current stimulation; tDCS) augmentiertes kognitives Training.
Es zeigt sich für die Risikogruppe APOE4 bei gleicher Leistung im Vergleich zu Trägern anderer Allelvarianten eine verminderte hämodynamische Reaktion im typischerweise aufgabenspezifisch genutzten inferioren frontalen Gyrus. Parallel dazu weist der mediale frontale Gyrus, ein Teil des frontoparietalen Kontrollsystems, eine verstärkte hämodynamische Reaktion auf. Bei der Risikogruppe MCI zeigt sich neben einer schlechteren Testleistung eine verminderte hämodynamische Reaktion des infe-rioren frontotemporalen Kortex, welcher den inferioren frontalen Gyrus umfasst. Das tDCS-augmentierte kognitive Training bewirkt nicht nur einen gruppenunspezifischen Anstieg der hämodynamischen Reaktion im inferioren frontotemporalen Kortex, die tDCS verstärkt diesen Effekt im Vergleich zur sham-Stimulation noch zusätzlich. Dies geht jedoch nicht mit einer Veränderung der Testleistung einher.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass eine reduzierte hämodyna-mische Reaktion bereits in frühen Krankheitsstadien der AD detektierbar ist und dies möglicherweise als Biomarker für eine frühzeitige Detektion und Behandlung genutzt werden könnte. Des Weiteren bietet die tDCS für frühe Krankheitsstadien der AD das Potential einer nebenwirkungsarmen Behandlungsmethode.
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt
Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schlüssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer Möglichkeiten. Für das LIM und SH3 Domänen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine Überexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivität und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur für solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. Kürzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leukämie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante Überexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen beschäftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen übernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abhängig“ sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminosäurensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle für die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Domäne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Domäne durch intramolekulare Wechselwirkungen für andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlestück zum Verständnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern.
Die Phosphoglykolat-Phosphatase PGP (früher auch als AUM bezeichnet) wurde in unserem Labor als Mitglied der HAD-Typ-Phosphatasen identifiziert. Die genetische Inaktivierung des Enzyms im gesamten Mausorganismus führt ab E8.5 zu einer Wachstumsverzögerung muriner Embryonen und bis E12.5 schließlich zu deren Tod. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einer PGP-Inaktivierung in hämatopoetischen Zellen und im Endothel lebensfähig und phänotypisch unauffällig. Neue Erkenntnisse schreiben dem Enzym neben einer Aktivität gegenüber Phosphoglykolat auch Aktivitäten gegenüber Glycerin-3-phosphat (G3P), P-Erythronat und P-Lactat zu. Da diese Phosphatase-Aktivitäten Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel nahelegen, wurde in der vorliegenden Arbeit mittels massenspektrometrischer Methoden der Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten untersucht.
Nach Inaktivierung der PGP im gesamten Organismus wurden in E8.5-Embryonen erhöhte Diacylglycerin (DG)-, Triacylglycerin (TG)- und Sphingomyelin (SM)-Spiegel gemessen, während niedrigere Phosphatidylcholin (PC)-Level vorlagen.
In PGP-inaktivierten Lymphozyten waren G3P-, DG-, TG-, PC- und SM-Level nicht verändert. Dafür kam es zu signifikanten Erhöhungen der Phosphatidylglycerol (PG*)- und Cardiolipin (CL)-Spiegel.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die PGP in unterschiedlichen Geweben differenzielle Effekte auf die Spiegel verschiedener Lipide hat. Dies deckt neue Funktionen der PGP für die Regulation des Lipidmetabolismus auf. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen über die genauen Ursachen und Folgen dieser Regulation dar und lässt auf eine wichtige Rolle der PGP als metabolische Phosphatase im Organismus schließen.
Natrium-Glukose Transporter (SGLT) gehören zur „solute carrier 5“ (SLC5) Familie, die sich durch einen sekundär aktiven, natriumabhängigen Transport von Zuckern und an-deren Molekülen nach intrazellulär auszeichnen. Die durch das Gen SLC5A4 kodierte Isoform SGLT3 transportiert dagegen keinen Zucker, sondern verhält sich als Glukosesensor, der nach Bindung seiner Liganden eine Membrandepolarisation induziert. In genomweiten Exomsequenzierungsstudien (whole exome sequencing, WES) mehrerer erweiterter Stammbäume mit hoher Prävalenz des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndroms (ADHS) wurde im Vorfeld eine ATG-Tripletdeletion in SLC5A4 identifiziert, die zum Verlust einer Aminosäure (ΔM500) in SGLT3 führt und zumindest partiell mit dem klinischen Phänotyp kosegregiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zentralnervöse Expression von SGLT3 auf RNA- Ebene mittels Reverse-Transkriptase PCR sowie real-time PCR aus humanen Gesamt-RNAs nachgewiesen. Dabei konnte eine ubiquitäre Expression im Gehirn mit relativ erhöhter Expression unter anderem in Striatum und Hypothalamus, deren Dysfunktion in der Pathogenese des ADHS impliziert wurde, gezeigt werden. Da Mutationen in homologen Domänen der eng strukturverwandten Isoformen SGLT1 und SGLT2 sowohl intestinale als auch renale Funktionen schwer beeinträchtigen, wurden in dieser Arbeit funktionelle Charakteristika sowohl des wildtypischen als auch der ΔM500 und der benachbarten ΔI501 Deletionsvariante von SGLT3 mittels Zwei-Elektroden Spannungs- und Stromklemme in entsprechend cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten untersucht. Der hochpotente SGLT3-spezifische Iminozuckeragonist 1-Desoxynojirimycin (DNJ) induzierte an SGLT3-exprimierenden Oozyten in sauren Bedingungen etwa dreifach größere Kationeneinströme als D-Glukose, was sowohl im Spannungsklemmen-, und anhand einer entsprechenden Membrandepolarisation im Stromklemmenmodus gezeigt wurde. Die mit der ΔM500 bzw. ΔI501 Variante injizierten Oozyten dagegen zeigten in den maximalen Aktivierungsbedingungen um 92% bzw. 96% (p<0,01) reduzierte Kationeneinströme, sodass diese als hochgradig schädliche „Loss of Function“ Mutationen in SGLT3 charakterisiert wurden. Dieser Befund wurde mittels bioinformatischer in-silico Effektvorhersage validiert.
Um Konsequenzen der Sequenzalteration auf den Membraneinbau der Transporter zu untersuchen, wurden die mit einem gelb fluoreszierenden Farbstoff (YFP) markierten Transporter in Oozytenmembranen mittels Laser-Scanning Mikroskop nachgewiesen und die jeweiligen Mengen der Konstrukte anhand der Fluoreszenzintensitäten quantifiziert. Dabei zeigte sich eine um 53% bzw. 42% (p<0,01) reduzierte Menge der mutierten Konstrukte ΔM500 bzw. ΔI501 in der Membran, was zusätzliche schädliche Effekte der Mutationen auf das sogenannte Membrantargeting der Transporter belegt.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die ΔM500 Variante von SGLT3, welcher in ADHS-relevanten Hirnarealen exprimiert wird, dessen sub-stratinduzierte Natriumleitfähigkeit aufhebt und den Membraneinbau beeinträchtigen könnte, was in Wechselwirkung mit anderen genetischen ADHS Risikovarianten das Risiko für ADHS in Mutationsträgern beeinflussen kann.
Herzschrittmachersysteme sind eine weitverbreitete Möglichkeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. Wegen der natürlichen Reaktion des Immunsystems auf Fremdkörper, erfolgt aber eine fortschreitende Verkapselung der Herzschrittmacherelektrode. Die Folge ist eine ansteigende Verminderung der Stimulationseffizienz durch Erhöhung der Anregungsschwelle. Die Integration der Elektrode in das Gewebe ist dabei mangelhaft und wird bestimmt durch Implantateigenschaften wie Größe, Flexibilität und Dimensionalität. Um die Integration zu verbessern, stellen dreidimensionale (3D) bzw. gewebeartige Elektroden eine Alternative zu den derzeit verwendeten planaren Metallelektroden dar. Zur Entwicklung einer leitfähigen, 3D und faserförmigen Elektrode wurden in dieser Arbeit Kohlenstoff-Nanofaser-Scaffolds über Elektrospinnen hergestellt. Durch die Modifikation des Fasergerüstes mit Natriumchlorid (NaCl) während der Scaffoldherstellung, konnte das Fasernetzwerk aufgelockert und Poren generiert werden. Die Kohlenstofffaser-Elektroden zeigten einen effizienten Energieübertrag, welcher vergleichbar mit heutigen Titannitrid (TiN) -Elektroden ist. Die Auflockerung des Fasergewebes hatte eine verbesserte Flexibilität des Faserscaffolds zu Folge. Neben der Flexibilität, konnte auch die Infiltration von Zellen in das poröse Faserscaffold erheblich verbessert werden. Dabei konnten Fibroblasten durch das gesamte Scaffold migrieren. Die Kompatibilität mit kardialen Zellen, die Grundvoraussetzung von Herzschrittmacherelektroden, wurde in vitro nachgewiesen. Durch die Kombination aus dem 3D-Elektrodengerüst mit einer Co-Kultur aus humanen Kardiomyozyten, mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten, erfolgte eine Einbettung der Elektrode in funktionelles kardiales Gewebe. Dadurch konnte ein lebender Gewebe-Elektroden-Hybrid generiert werden, welcher möglicherweise die Elektrode vor Immunzellen in vivo abschirmen kann. Eine Zusammenführung der hybriden Elektrode mit einen Tissue-Engineerten humanen kardialen Patch in vitro, führte zu Bildung einer nahtlosen Elektronik-Gewebe-Schnittstelle. Die fusionierte Einheit wurde abschließend auf ihre mechanische Belastbarkeit getestet und konnte über einen Elektroden-Anschluss elektrisch stimuliert werden.
Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden.
Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert.
In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist.
Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente.
Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern.
Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein
inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs,
welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von
Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2-
defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie,
sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2-
Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle,
sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen
der Mitochondrien gekennzeichnet.
Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu
beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte
Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese
Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären
Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein
könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher
Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen
abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an
Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende
(E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2-
KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5-
Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das
Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als
Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die
Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten
Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des
lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich
in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als
Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die
Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht.
Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine
Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt.
Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel
durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat
zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von
SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins
VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer
verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der
Vesikel in Einklang bringt.
Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System
durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen
Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen
werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und
das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2-
defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine
gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt.
Biologische Marker für Aufmerksamkeitsverzerrungen bei sozialer Ängstlichkeit und deren Modifikation
(2019)
Diese Dissertationsschrift beschäftigt sich mit biologischen Korrelaten von Aufmerksamkeits-verzerrungen und eruiert deren Modifikation in einem längsschnittlich angelegten Experiment. Hierfür wurden über 100 sozial-ängstliche Teilnehmer mit Hilfe einer Screening-Prozedur gewonnen und hinsichtlich der Ausprägung einer ereigniskorrelierten Lateralisation namens „N2pc“ untersucht.
Während der ersten Labormessung indizierte die N2pc bei der Bearbeitung eines Dot Probe Paradigmas einen mittelgroßen, statistisch hochbedeutsamen Attentional Bias hin zu wütenden Gesichtern im Vergleich zu neutralen. Das hierfür klassischerweise verwendete Maß von Reaktionszeitunterschieden hingegen konnte diese Verzerrung der Aufmerksamkeit nicht abbilden. Ferner zeigten weder die elektrophysiologische noch die behaviorale Messgröße einen Zusammenhang mit Fragebögen sozialer Angst, was teilweise auf ein Fehlen interner Konsistenz zurückgeführt werden kann.
Im weiteren Verlauf absolvierten die überwiegend weiblichen Teilnehmer an acht unterschiedlichen Terminen über zwei bis vier Wochen fast 7000 Durchgänge eines Aufmerksamkeitsverzerrungsmodifikationstrainings oder einer aktiven Kontrollprozedur. Daraufhin zeigte sich eine Auslöschung der ereigniskorrelierten Lateralisation, allerdings in einem späteren Zeitfenster als erwartet. Dieses Verschwinden des Attentional Bias blieb bis elf Wochen nach Ende der Trainingsprozedur stabil. Außerdem trat dieselbe Modifikation ebenfalls für die Kontrollgruppe auf. Die selbstberichtete Schwere der Symptomausprägung veränderte sich zwar nicht, allerdings konnte eine Reduktion des Persönlichkeitsmerkmals Neurotizismus verzeichnet werden, welches konzeptuell mit dem Begriff der Ängstlichkeit eng verwoben ist.
Durch explorative Folgeanalysen konnte eine stärkere Modulation der rechten Großhirnhälfte, also durch Reize im linken visuellen Halbfeld aufgedeckt werden. Eine Neuberechnung des Attentional Bias separat für jede Hemisphäre scheint daher auch für künftige Untersuchungen angebracht. Ferner wurde als Träger der Modifikation über die Zeit eine Veränderung der Hyperpolarisation nach der N2-Komponente identifiziert. Ob durch eine Anpassung der Prozedur eine Modulation einer früheren ereigniskorrelierten Komponente erzielt werden kann, bleibt zum aktuellen Zeitpunkt unbeantwortet.
Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen
mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser
Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens
untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um
Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von
Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu
identifizieren und zu validieren.
Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS)
ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach
einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche
Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk
erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können
(Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und
rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität
verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker
BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im
nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus
Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der
Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung
konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten
passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu
bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren
substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden.
Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden
folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt:
1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv
durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu
vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein
Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten
Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren
von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten
Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink
zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze
Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des
Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der
positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da
das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende
Identifizierung der Peptide mit sich bringt.
2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren
Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach
diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass
quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit
18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8
Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann
während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden
mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich
heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die
Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der
Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung
für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre.
3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden
auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen
nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das
Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE,
die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten
Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der
Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert
und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der
Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen
gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die
Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist
jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50
Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer
Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216
(CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen
Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu
identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der
Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet.
Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets
aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten
Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die
angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer
geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl
Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine
spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR
und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und
Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms
(MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α-
acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er
zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets
signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl
Aminocarboxamide dar.
Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat
angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende-
und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für
das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren
3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende
Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin
A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst.
Der Hörsinn ist für uns Menschen von entscheidender Bedeutung, um mit der Umwelt kommunizieren zu können. Hörstörungen werden dabei in sensorineurale Erkrankungen der neuronalen Strukturen und nicht-sensorineurale Schallleitungsschwerhörigkeiten unterschieden.
In der vorliegenden Studie sollte es darum gehen zu untersuchen, inwiefern ein neues konditionelles Mausmodell, die Brn3.1 IRES Cre Maus, und ein bestehendes Mausmodell, die pmn-Maus, sich eignen, um die Erkrankung der auditorischen Neuropathie nachzubilden. Die Brn3.1 IRES Cre Maus wurde zur Evaluation der Expression von Cre-Rekombinase unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors mit gefloxten Reporter-Mauslinien verkreuzt. Die pmn-Maus ist ein anerkanntes Modell einer Motoneuronerkrankung, hatte aber in vorherigen Untersuchungen erhöhte Hörschwellen gezeigt.
Alle verwendeten Mauslinien wurden mittels ABR und DPOAE frequenzspezifisch untersucht, um die Funktion der Haarzellen im Corti´schen Organ zu evaluieren. Bei der pmn-Linie wurden die audiologischen Untersuchungen wöchentlich zwischen P21 und P35 durchgeführt. Zusätzlich wurde das Corti´sche Organ zu diesen Zeitpunkten morphologisch untersucht.
Es zeigte sich, dass alle verwendeten Mauslinien unauffällige Hörschwellen verglichen zur Backgroundlinie C57BL/6 hatten sowie DPOAE-Antworten zeigten. Die Verkreuzung der Brn3.1 IRES Cre Linie mit den beiden Reporterlinien zeigte eine nachweisbare Cre-Rekombinase-Expression unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors nur an den postnatalen Tagen P14 und P21. Diese Expression erfolgte mosaikartig in den äußeren Haarzellen. Mit Hilfe einer RT-PCR wurde eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Expression des Reporterproteins im Gewebe festgestellt. Dies ließ vermuten, dass die Expression von Cre-Rekombinase durch gene silencing Prozesse unterdrückt wurde und Brn3.1 als Promotor nicht leistungsstark genug war, um eine Cre-Rekombinase-Expression steuern zu können.
Die pmn-Linie zeigte in ABR-Untersuchungen bereits zum Zeitpunkt P21 erhöhte Hörschwellen in allen untersuchten Frequenzen im Vergleich zum Wildtyp. DPOAE-Antworten waren in der pmn-Linie nur bedingt auslösbar. Es zeigte sich in der morphologischen Evaluation ein Verlust von äußeren Haarzellen über die gesamte Länge des Corti´schen Organes. Durch einen TUNEL-Assay konnte das Absterben dieser Zellen durch apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Der pmn-Phänotyp entsteht durch eine Mutation im TBCE Gen. Dieses Gen kodiert für ein Protein, welches einen stabilisierenden Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli hat. Die TBCE-Verteilung im Corti´schen Organ zeigte, dass dieses hauptsächlich in den äußeren Haarzellen und inneren Stützzellen exprimiert wird und damit wahrscheinlich einen bedeutenden Einfluss auf die Erhaltung der Haarzellen hat. Eine Analyse des Hörnervs zeigte einen Verlust von Mikrotubuli.
Neben diesen in vivo Untersuchungen sollte außerdem eine gliazellfreie Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen etabliert werden. Hierfür wurden mehrere Faktoren einer Primärzellkultur in Bezug auf ihren Einfluss auf die Gesamtzellzahl, den prozentualen Neuronanteil und die Axonlänge der Neurone untersucht. Das Medium, die Beschichtung des Zellkulturgefäßes, die Gabe von Neurotrophinen/Zytokinen und der Einsatz eines Zytostatikums wurden separat untersucht. Es zeigte sich, dass das Medium, die Beschichtung und Neurotrophin-/Zytokingabe hauptsächlich einen Einfluss auf das axonale Längenwachstum von Neuronen haben. Den Prozentsatz der Neurone beeinflusste nur der Einsatz des Zytostatikums Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) signifikant. Die Ergebnisse wurden auch im Zusammenhang mit der reellen Neuronanzahl in Kultur gesehen.
Es ergab sich weiterhin eine Präferenz für DMEM- über NB-Medium sowie für zusätzliche Lamininbeschichtung, für den Einsatz des Zytokins LIF gegenüber den neurotrophen Faktoren BDNF und NT-3 und die Gabe des Zytostatikums AraC ab Tag 2 nach Ausplattierung in einer Konzentration von 5-10 µM. Ein kombinatorischer Einsatz dieser Präferenzen spiegelte in Summe die Ergebnisse der Versuchsreihen Neurotrophine/Zytokin und AraC wieder. Der Anteil der Neurone in der Kultur konnte im Durchschnitt auf 10-12 % gesteigert werden. Eine Verschiebung des Glia-/Neuronenanteils zugunsten letzterer ist vermutlich nur durch den Einsatz weiterer Faktoren oder anderer Methoden möglich.
Die untersuchten Mausmodelle zeigten auf Grund der Untersuchungsergebnisse nur teilweise Ähnlichkeiten mit der Erkrankung der auditorischen Neuropathie. Die Erkenntnisse zur pmn-Mauslinie über das frequenzspezifische Hörvermögen und die morphologische Degeneration im Corti´schen Organ im altersabhängigen Verlauf können aber hilfreich sein, um neben der motorischen auch die sensorische Degeneration dieser Pathologie besser zu verstehen. Zudem konnten auch umfassende Erkenntnisse für die Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen der Maus in Bezug auf verschiedene Variablen erhalten werden.
Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Abhängig von der betroffenen ZNS-Region kann es zu vielfältigen Symptomen kommen. Neben neurologischen Symptomen verursacht durch ZNS-Läsionen leidet ein Großteil der MS-Patienten auch unter gastrointestinalen Funktionsstörungen. Diese gastrointestinalen Symptome wurden bisher eher auf Läsionen im Rückenmark zurückgeführt und nicht direkt in Verbindung mit der autoimmunen Ätiologie der Erkrankung gebracht.
In dieser Studie wurde das enterische Nervensystem (ENS) in einem B-Zell- und Antikörper-abhängigen Mausmodell der MS untersucht. Dafür wurde der Autoimmunprozess durch Immunisierung mit MP4, einem Fusionsprotein aus dem Myelin-Basischen-Protein (MBP) und dem Proteolipid-Protein (PLP), ausgelöst. Das ZNS und ENS wurden in den unterschiedlichen Erkrankungsstadien immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch analysiert. Neben der Immunpathologie des ZNS konnte dabei eine Degeneration des ENS schon vor dem Einsetzen der ersten neurologischen Defizite nachgewiesen werden. Die ENS-Pathologie war antikörper-mediiert und ging einher mit einer verringerten gastrointestinalen Motilität sowie mit einer Gliose und Neurodegeneration des ENS.
Mithilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten im ENS vier mögliche Zielstrukturen des Autoimmunprozesses identifiziert werden, was auf sog. epitope spreading hindeutet. Auch im Plasma von MS-Patienten konnten Antikörper gegen drei dieser Antigene nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten sich in Kolon-Resektaten von MS-Patienten erste Ansätze einer Neurodegeneration und Gliose des ENS.
In dieser Studie wurde zum ersten Mal ein direkter Zusammenhang zwischen der Autoimmunreaktion gegen das ZNS und einer simultanen Reaktion gegen das ENS gezeigt. Dies kann einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Immunpathogenese der MS anstoßen und neue therapeutische und diagnostische Ansätze initiieren.
Unterschiede in Frontaler Kortex Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der Alzheimer Demenz
(2019)
Die verbesserte medizinische Versorgung führt zu einer zunehmenden Lebenserwartung unserer Gesellschaft. Damit steigt auch die sozioökonomische Relevanz neurodegenerativer Erkrankungen kontinuierlich. Für die Alzheimer Demenz (AD), die dabei die häufigste Ursache darstellt, stehen bisher keine krankheitsmodifizierenden Behandlungsoptionen zur Verfügung. Die lange präklinische Phase der Erkrankung birgt jedoch großes Potential für die Entwicklung neuer Behandlungsoptionen. Das Untersuchen von Risikogruppen ist für die Identifikation von Prädiktoren einer späteren AD Manifestation von besonderem Interesse. In diesem Zusammenhang werden insbesondere das Vorliegen genetischer Risikokonstellationen, wie dem Apolipoprotein E (APOE) Ɛ4-Allel, sowie kognitiver Risikofaktoren, wie der „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (MCI), diskutiert. Die Identifikation präklinischer Aktivierungsunterschiede in relevanten Gehirnregionen von Risikogruppen kann als Basis für die Entwicklung neurofunktioneller Früherkennungs-Marker dienen. Der präfrontale Kortex (PFC), welcher mit der Steuerung von Exekutivfunktionen assoziiert wird, hat sich in diesem Zusammenhang in bisherigen Studien als eine relevante Schlüsselregion manifestiert. Aufgrund der aufwendigen und kostenintensiven bildgebenden Untersuchungsmethoden, sind die genauen Prozesse jedoch noch unklar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Unterschiede in der PFC Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der AD mit einer kostengünstigeren Bildgebungsmethode, der funktionellen Nahinfrarot Spektroskopie (fNIRS), zu untersuchen. Dafür wurde in einem ersten Schritt, der Trailmaking Test (TMT), ein weitverbreiteter neuropsychologischer Test zur Erfassung exekutiver Funktionen, für fNIRS implementiert. Als Grundlage für die Untersuchung frühpathologischer Prozesse, wurden zunächst gesunde Alterungsprozesse betrachtet. Der Vergleich von jungen und älteren Probanden (n = 20 pro Gruppe) wies neben der Eignung der Testimplementierung für fNIRS auf eine spezifische bilaterale PFC Oxygenierung hin, welche bei jungen Probanden rechtshemisphärisch lateralisiert war. Ältere Probanden hingegen zeigten bei vergleichbaren Verhaltensdaten insgesamt mehr signifikante Kanäle sowie eine Abnahme der Lateralisierung. Dies kann als zusätzlicher Bedarf an Ressourcen in gesunden Alterungsprozessen interpretiert werden.
Im Rahmen der Hauptstudie wurden anschließend insgesamt 604 ältere Probanden im Alter von 70 bis 76 Jahren untersucht. Zunächst wurde die genetische Risikogruppe der Ɛ4-Allel-Träger (n = 78) mit den neutralen Ɛ3-Allel-Trägern (n = 216) und den Trägern des als protektiv geltenden Ɛ2-Allels (n = 50) verglichen. Hierbei zeigte sich eine geringere Oxygenierung der Risikogruppe bei geringer Aufgabenschwierigkeit, während sich ein erhöhter Oxygenierungsanstieg im medialen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit zeigte. Dies deutet auf einen erhöhten Bedarf an neuronalen Kontrollmechanismen der Risikogruppe zur Bewältigung der steigenden Aufgabenschwierigkeit hin. Die protektive Gruppe zeigte hingegen eine erhöhte Oxygenierung im ventralen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit, was möglicherweise auf einen präventiven Effekt hindeuten könnte.
Weiterführend wurden MCI-Patienten mit gesunden Probanden (n = 57 pro Gruppe) hinsichtlich des kognitiven Risikofaktors verglichen. Hierbei zeigte sich ein punktuell reduzierter Oxygenierunganstieg der MCI Patienten mit steigender Aufgabenschwierigkeit vor allem im ventralen PFC bei ebenfalls stabiler Verhaltensleistung. Die gefundene Reduktion könnte ein Zeichen für eine aufgebrauchte kognitive Reserve sein, welche Einbußen auf Verhaltensebene voranzugehen scheint.
Diese charakteristischen Unterschiede in den frontalen Oxygenierungsmustern von Risikogruppen (APOE, MCI) könnten als Biomarker zur Früherkennung von AD noch vor dem Auftreten kognitiver Einbußen dienen. Die fNIRS-Untersuchung während der Durchführung des TMT hat sich in diesem Zusammenhang als potentielles Instrument zur Frühdiagnose der präklinischen Phase der AD als geeignet erwiesen. Die Ergebnisse werden unter Einbezug des wissenschaftlichen Kontexts interpretiert und Implikationen für weitere notwendige Studien sowie die klinische Anwendbarkeit diskutiert.
Das humane Schädeldach besteht aus fünf Schädelplatten, die durch intramembranöse Ossifikation entstehen. Wenn diese in der Embryonalentwicklung aufeinandertreffen, bilden sich Schädelnähte aus, die eine Fusion der Schädelplatten verhindern und damit ein Schädelwachstum parallel zu Gehirnentwicklung ermöglichen. Für diesen Prozess ist eine Balance aus Zellproliferation und Differenzierung nötig, deren Aufrechterhaltung wiederum durch eine komplexe Regulation von verschiedenen Signalwegen gewährleistet wird. Störungen in diesem regulatorischen System können zu einer vorzeitigen Fusion der Schädelplatten, Kraniosynostose genannt, führen. Die Kraniosynostose ist eine der häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen beim Menschen. Durch kompensatorisches Wachstum an den nicht fusionierten Suturen entstehen charakteristische Schädeldeformationen, die sekundär einen erhöhten intrakranialen Druck zur Folge haben können. Eine vorzeitige Fusion der Suturen kann sowohl isoliert als auch syndromal zusammen mit weiteren klinischen Auffälligkeiten vorliegen. Bisher sind über 150 verschiedene Kraniosynostose Syndrome beschrieben und insgesamt 25-30% aller Kraniosynostose Patienten sind von einer syndromalen Form betroffen. Da die klinischen Merkmale der Kraniosynostose Syndrome variabel sind und zum Teil überlappen, ist eine klare klinische Diagnose häufig erschwert. Sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische Veränderungen können die Ursache für Kraniosynostosen sein. Vor allem bei syndromalen Kraniosynostosen wurden genetische Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen in den Genen FGFR2, FGFR3, TWIST1 und EFNB1, identifiziert. Darüber hinaus wurden chromosomale Veränderungen wie partielle Monosomien von 7p, 9p oder 11p sowie partielle Trisomien von 5q, 13q oder 15q mit Kraniosynostose assoziiert. Trotzdem ist in über 50% der Fälle die genetische Ursache unbekannt und die Pathogenese von Kraniosynostosen noch nicht vollständig geklärt.
Ziel dieser Arbeit war es neue genetische Ursachen bei Kraniosynostose Patienten zu identifizieren und so zur Aufklärung der Pathogenese beizutragen. Es wurde die genomische DNA von 83 Patienten molekulargenetisch durch Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH) oder durch ein speziell entworfenes Next Generation Sequencing (NGS) Genpanel untersucht. Bei 30% der Patienten konnte eine potentiell pathogene Veränderung identifiziert werden. Davon waren 23% chromosomale Aberrationen wie unbalancierte Translokationen, isolierte interstitielle Verluste und ein Zugewinn an genomischen Material. Bei zwei Patienten wurden unbalancierte Translokationen mit partieller 5q Trisomie nachgewiesen. Das Gen MSX2 liegt innerhalb des duplizierten Bereichs, sodass möglicherweise eine MSX2 Überexpression vorliegt. Für ein normales Schädelwachstum ist jedoch die richtige Menge an MSX2 kritisch. Des Weiteren wurde eine partielle Deletion von TCF12 detektiert, die in einer Haploinsuffizienz von TCF12 resultiert. TCF12 Mutationen sind mit Koronarnahtsynosten assoziiert. In einem anderen Fall lag das Gen FGF10 innerhalb der duplizierten 5p15.1-p12 Region. Das Gen kodiert für einen Liganden des FGF Signalwegs und wurde bisher noch nicht mit Kraniosynostose assoziiert. Aufgrund dessen wurden Analysen im Tiermodell Danio rerio durchgeführt. Eine simulierte Überexpression durch Injektion der fgf10a mRNA in das 1-Zell Stadium führte zu schweren Gehirn-, Herz- und Augendefekten.
Mittels NGS wurden 77% der potentiell pathogenen genetischen Veränderungen identifiziert. Hierfür wurde in dieser Arbeit ein Genpanel erstellt, das 68 Gene umfasst. Es wurden sowohl bekannte Kraniosynostose- als auch Kandidaten-Gene sowie Gene, die mit der Ossifikation assoziiert sind, in die Analyse eingeschlossen. Das Genpanel wurde durch die Sequenzierung von fünf Kontrollproben mit bekannten Mutationen erfolgreich validiert. Anschließend wurde die genomische DNA von 66 Patienten analysiert. Es konnten 20 (potentiell) pathogene Varianten identifiziert werden. Neben bereits bekannten Mutationen in den Genen FGFR1, FGFR2, FGFR3 und TWIST1, konnten zusätzlich 8 neue, potentiell pathogene Varianten in den Genen ERF, MEGF8, MSX2, PTCH1 und TCF12 identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei das Mutationsspektrum dieser Gene zu erweitern. Bei zwei der Varianten handelte es sich um potentielle Spleißvarianten. Für diese konnte in einem in vitro Spleißsystem gezeigt werden, dass sie eine Änderung des Spleißmusters bewirken. Der Nachweis von zwei seltenen Varianten in den Genen FGFR2 und HUWE1 hat außerdem dazu beigetragen die Pathogenität dieser spezifischen Varianten zu bekräftigen. Eine Variante in POR, die aufgrund bioinformatischer Analysen als potentiell pathogen bewertet wurde, wurde nach der Segregationsanalyse als wahrscheinlich benigne eingestuft. Zusammenfassend konnten bei etwa einem Drittel der Patienten, die mit dem NGS Genpanel analysiert wurden, eine genetische Ursache identifiziert werden. Dieses Genpanel stellt somit ein effizientes diagnostisches Tool dar, das zukünftig in der genetischen Routine-Diagnostik von Kraniosynostose-Patienten eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl eine Untersuchung auf CNVs als auch auf Sequenzänderungen bei Kraniosynostose Patienten sinnvoll ist.
Kürzlich wurden bei immunvermittelten Neuropathien Autoantikörper gegen Proteine
des paranodalen axoglialen Komplexes beschrieben. Deren Charakteristika,
Prävalenzen, pathophysiologische Relevanz sowie Bedeutung für Diagnostik
und Therapie sind jedoch noch nicht abschließend erforscht.
In dieser Studie wurden daher Seren und Plasmapheresematerial (PE-Material)
von 150 Patienten mit inflammatorischen Neuropathien, nämlich 105 mit chronisch
inflammatorischer demyelinisierender Polyneuropathie (CIDP), 21 mit Guillain-
Barré-Syndrom (GBS) und 24 mit multifokaler motorischer Neuropathie
(MMN), welche etablierte diagnostische Kriterien der jeweiligen Krankheit erfüllen,
sowie 74 Kontrollen mittels immunhistochemischen Färbungen an murinen
Zupfnervenpräparaten und/oder ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
auf Autoantikörper gegen die paranodalen Proteine Caspr, Contactin-1 und Neurofascin-
155 untersucht. Bei positivem Ergebnis wurde deren Spezifität mittels
immunhistochemischen Färbungen an transfizierten HEK (Human embryonic kidney)-
293-Zellen und Präinkubationsversuchen bestätigt. Es wurden die IgG-Subklassen
und die Antikörpertiter bestimmt und das Komplementbindungsverhalten
unter Zugabe von intravenösen Immunglobulinen (IVIG) mit zellbasierten und
ELISA-basierten Methoden analysiert. Klinische Merkmale und das Therapieansprechen
Antikörper-positiver Patienten wurden ermittelt und mit den experimentellen
Ergebnissen in Zusammenhang gesetzt.
IgG-Autoantikörper gegen Contactin-1 konnten bei vier Patienten mit CIDP nachgewiesen
werden, IgG-Autoantikörper gegen Caspr bei einem Patienten mit
CIDP und einer Patientin mit GBS. Es konnten keine weiteren Autoantikörper bei
CIDP-Patienten, GBS-Patienten, MMN-Patienten oder bei den Kontrollen detektiert
werden. Die Prävalenz von Autoantikörpern gegen axogliale paranodale Proteine
liegt somit in dieser Studie bei jeweils 4,76% bei CIDP und GBS und 0%
bei MMN. Die Antikörper gehörten bei Patienten in der akuten Erkrankungsphase
(zwei der CIDP-Patienten mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern und eine GBS-Patientin mit Anti-Caspr-Autoantikörpern) hauptsächlich den Subklassen IgG1
und IgG3 an, bei Patienten in der chronischen Phase (zwei der CIDP-Patienten
mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern, ein CIDP-Patient mit Anti-Caspr-Autoantikörpern)
überwog die Subklasse IgG4. Experimentell kam es zur Komplementbindung
und -aktivierung abhängig vom Gehalt der Subklassen IgG1-3, nicht
aber IgG4; diese konnte durch die Zugabe von IVIG dosisabhängig gemindert
werden. Alle Autoantikörper-positiven CIDP-Patienten zeigten einen GBS-artigen
Beginn mit einer schweren motorischen Beteiligung. Anti-Contactin-1-positive
Patienten kennzeichnete klinisch zusätzlich das Vorkommen einer Ataxie und eines
Tremors, Anti-Caspr-positive Patienten das Vorkommen starker neuropathischer
Schmerzen. Elektrophysiologisch standen neben Hinweisen auf eine Leitungsstörung
Zeichen einer axonalen Schädigung im Vordergrund. Als histopathologisches
Korrelat lagen eine nodale Architekturstörung und ein Axonverlust
vor. Die Patienten zeigten nur in der Anfangsphase der Erkrankung ein Ansprechen
auf IVIG. Bei drei CIDP-Patienten mit IgG4-Autoantikörpern (zwei Patienten
mit Anti-Contactin-1-Antikörpern und ein Patient mit Anti-Caspr-Antikörpern)
wurde eine Therapie mit Rituximab durchgeführt. Diese führte zu einer Titerreduktion
und zur zeitgleichen klinischen und elektrophysiologischen Befundbesserung
bei zwei Patienten.
Die in dieser Arbeit angewandten Screeningmethoden führten zum erfolgreichen
Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale axogliale Proteine. Die Patienten
mit positivem Autoantikörpernachweis definieren eine kleine Untergruppe mit
ähnlichen klinischen Merkmalen im Kollektiv der Patienten mit inflammatorischen
Polyneuropathien. Histopathologische Merkmale sowie das Therapieansprechen
auf antikörperdepletierende Therapie sprechen in Kombination mit den Ergebnissen
weiterer Studien zu paranodalen Autoantikörpern für eine pathogenetische
Relevanz der Autoantikörper. Mit einem charakteristischen, am Schnürring ansetzenden
Pathomechanismus könnten Neuropathien mit Nachweis von paranodalen
Autoantikörpern der kürzlich eingeführten Entität der Nodo-Paranodopathien
angehören. Die Komplementaktivierung und das Therapieansprechen der Patienten auf IVIG stehen möglicherweise in Zusammenhang mit der prädominanten
IgG-Subklasse. Diese könnte auch in Bezug auf die Chronifizierung eine
Rolle spielen. Der Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale Proteine hat
wohlmöglich in Zukunft direkte Konsequenzen auf das diagnostische und therapeutische
Prozedere bei Patienten mit CIDP und GBS; weitere klinische und experimentelle
Daten aus größeren, prospektiven Studien sind jedoch zum weiteren
Verständnis und zur Charakterisierung dieser Entität notwendig.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Furcht und Angsterkrankungen stellt, neben der Furchtkonditionierung, die Generalisierung der konditionierten Furcht einen wesentlichen Mechanismus dar. Die der Generalisierung zugrunde liegenden psychologischen und biologischen Prozesse sind jedoch beim Menschen bisher nur wenig untersucht.
Ziel dieser Arbeit war, anhand eines neu entwickelten experimentellen Paradigmas den Einfluss eines psychometrisch bestimmbaren angstspezifischen Faktors sowie der mit Furcht und Angst assoziierten Genotypen Stathmin1, COMT Val158Met und BDNF Val66Met auf die Furchtkonditionierung und Generalisierung konditionierter Furcht zu untersuchen und somit mögliche Risikofaktoren für die Entstehung von Angsterkrankungen zu bestimmen. Hierfür wurden N = 126 gesunde Versuchspersonen (n = 69 weiblich; mittleres Alter M = 23.05, SD = 3.82) für die genannten Polymorphismen genotypisiert und zu ängstlichen und affektiven Symptomen befragt. In einer Akquisitionsphase wurden den Probanden zwei neutrale weibliche Gesichter präsentiert (CS), von denen eines mit einem Schrei sowie einem ängstlichen Gesichtsausdruck (UCS) gepaart wurde. Der sich anschließende Generalisierungstest erfolgte anhand von vier Gesichtern, die in der Ähnlichkeit zwischen den beiden CS schrittweise übergingen. Die Furchtreaktion wurde über die Bewertung von Valenz, Arousal und Kontingenzerwartung sowie über die Hautleitfähigkeitsreaktion (SCR) erfasst.
Die Analyse der Fragebögen anhand einer Hauptachsenanalyse und anhand von Strukturgleichungsmodellen erbrachte eine zweifaktorielle Lösung, die die Konstrukte Depression und Angst abbildete. Nur der Faktor Angst war mit einer veränderten Furchtkonditionierung und Furchtgeneralisierung assoziiert: Hoch Ängstliche zeigten eine stärkere konditionierte Furchtreaktion (Arousal) und wiesen eine stärkere Generalisierung der Valenzeinschätzung und Kontingenzerwartung auf. Für den Stathmin1 Genotyp ergaben sich geschlechtsspezifische Effekte. Bei den männlichen Versuchspersonen zeigte sich in Folge der Akquisition ein stärkerer Abfall der Valenz für den CS+ in der Gruppe der Stathmin1 T Allelträger, die ebenfalls eine stärkere Generalisierung der Furchtreaktion, abgebildet in allen verbalen Maßen, aufwiesen. Ein gegenteiliger Befund ergab sich für die Gruppe der Frauen, insofern eine mit dem Stathmin1 C Allel assoziierte höhere Generalisierung der Valenz, des Arousals und der Kontingenzerwartung festgestellt werden konnte. Für den COMT Val158Met Genotyp ergaben sich keine Einflüsse auf die Akquisition der konditionierten Furcht. Für Träger des COMT 158Val Allels zeigte sich jedoch eine stärkere Generalisierung der Valenz und der Kontingenzerwartung. Auch für den BDNF Val66Met Genotyp konnte keine Veränderung der Furchtakquisition beobachtet werden. Es ergaben sich jedoch Hinweise auf eine erhöhte Generalisierung der Kontingenzerwartung in der Gruppe der BDNF 66Val Homozygoten. Für keinen der beschriebenen Faktoren konnte ein Einfluss auf die Furchtkonditionierung oder deren Generalisierung anhand der SCR abgebildet werden.
Unsere Ergebnisse weisen auf einen psychometrisch erfassbaren Faktor und genetische Einflüsse hin, die über den Prozess einer stärkeren Generalisierung der konditionierten Furcht das Risiko für die Entstehung von Angsterkrankungen erhöhen können. Jedoch sollten die Befunde in größeren Stichproben repliziert werden. Neben der frühzeitigen Identifikation von Risikofaktoren sollten in zukünftigen Studien darüber hinaus wirksame Maßnahmen zur Prävention und Intervention entwickelt werden, um diesem Risiko entgegen zu wirken.
Der Tumorsupressor APC ist in der Mehrzahl aller Fälle kolorektaler Karzinome bereits in
der initialen Phase der Karzinogenese mutiert. Diese Mutationen führen zu einer aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges sowie zu weiteren die Karzinogenese vorrantreibenden Aktivitäten, beispielsweise einem veränderten Migrationsverhalten. Dieser Dissertation
zu Grunde liegt die Idee, dass durch die Trunkierung des APC-Proteins aber auch Abhängigkeiten von Genaktivitäten entstehen, die zuvor entbehrlich waren. Solche synthetisch
letalen Gene sollten in einem high-content shRNA-Screen gefunden werden.
Für die Durchführung des Screens wurde ein von der SW480 Kolonkarzinomzelllinie
abgeleitetes, isogenes Zellsystem generiert, welches durch Induktion mit Doxyzyklin das
vollständige APC-Allel (FL-APC) exprimiert. Infolge dieser Expression zeigen die Zellen
einen weniger malignen Phänotyp. Dies spiegelt sich darin wider, dass die Zellen durch
FL-APC Expression in ihrer Wnt-Signalwegsaktivität eingeschränkt werden. Doxyzyklininduzierte Zellen sind schlechter in der Lage ohne Adhäsion zu proliferieren als nicht induzierte Zellen. Andererseits ist ihre Fähigkeit einem FKS-gradienten entlang zu migrieren
verbessert.
Der shRNA-Screen wurde mit der Decipher shRNA-Bibliothek durchgeführt. Diese
enthält 27.500 verschiedene shRNAs mit Interferenzaktivität gegen 5.000 mRNAs, die potentiell pharmakologisch inhibierbare Proteine kodieren. Die besten zwei Kandidaten für
eine synthetisch letale Interaktion mit trunkiertem APC, BCL2L1 und EIF2B5 wurden im
Verlauf einer Masterarbeit bzw. direkt in dieser Disseration validiert. EIF2B5 zeigte in vitro nach Depletion durch unterschiedliche shRNAs einen di erentiellen Proliferationse ekt
bei FL-APC induzierten im Vergleich zu kontrollbehandelten Zellen. Dieser di erentielle
E ekt konnte in einem weiteren Modellsystem, SW480 Zellen mit konstitutiver FL-APC
Expression, ebenfalls validiert werden.
Durch Expression einer shRNA mit Aktivität gegen EIF2B5 werden in beiden Zellsystem die unfolded protein response (UPR) Gene DDIT3 und splXBP1 aktiviert. Interessanterweise werden durch die Expression von FL-APC diese Gene reprimiert. Im Promotor
der EIF2B5-mRNA be ndet sich eine Bindestelle für MYC. Es ist denkbar, dass durch die
Expression von FL-APC eine globale Veränderung der Genexpression vorgenommen wird,
die einerseits eine Repression von EIF2B5 nach sich zieht aber andererseits eine hierdurch
ausgelöste ER-Stress Antwort verhindert. Eine Inhibition von EIF2B5 ohne diese Adaption
andererseits führt nach diesem Model zu einer UPR-aktivierten Apoptose.
In einem zweiten Projekt wurde das überraschende Verhalten von Kolonkarzinomzellen untersucht, die nach Zugabe von BEZ235, einem dualen PI3K/mTOR Inhibitor, trotz
gegenteiliger Erwartungen MYC-Proteinmengen erhöhen. Eine Repression wurde erwar-
tet, weil die Inhibition von PI3K einerseits zu einer proteasomalen Destabiliserung und
andererseits die mTOR Inhibition zu einer verringerten Synthese von MYC führen sollte.
Während bereits gezeigt werden konnte, dass durch einen FOXO-vermittelten Mechanismus MAPK-abhängig die MYC-Expression verstärkt wird, wurde in dieser Dissertation
die erwartete Translationsinhibition untersucht. BEZ235 inhibiert zwar CAP-abhängige
Translation, das MYC Protein wird jedoch aufgrund einer IRES-vermittelten Translation
weiterhin exprimiert. Silvestrol, ein Inhibitor der Helikase eIF4A andererseits interveniert
mit CAP- und IRES-abhängiger Translation und kann die MYC-Proteinkonzentrationen
verringern. Wir konnten zudem feststellen, dass die Applikation von Silvestrol auch in vivo
möglich und wirksam ist und zudem tolleriert wird. Dies gibt Anlass zur Ho nung, dass
eine Intervention der Translation auch im Menschen eine valide Strategie zur Behandlung
MYC-getriebener Tumore sein könnte.
Die Synthese der mRNA durch die RNA-Polymerase II ist der zentrale und kritische Prozess im Rahmen
der Transkriptionsregulation Protein-kodierender Gene. Viele Jahrzehnte der intensiven Erforschung brachten viele Details über diesen Mechanismus zu Tage, der von einer unglaublichen Komplexität und Dynamik geprägt ist. Dabei stellte sich heraus, dass der Mediatorkomplex eine zentrale Rolle bei der Regulation der Polymerase II-abhängigen Transkription spielt, im Besonderen der Initiation. In der Funktion einer Schnittstelle verknüpft er die allgemeine Transkriptionsmaschinerie mit den Gen- spezifischen Transkriptionsregulatoren. Durch die Interaktion des Schwanzmoduls mit diesen Regulatoren und der Interaktion des Kopfmoduls mit der Polymerase II verbindet er wie eine Brücke die oberhalb des Promotors liegenden Aktivatorsequenzen mit dem Kernpromotor und initiiert so die Ausbildung des Pre-Initiationskomplexes. Darüber hinaus mehren sich gerade in den letzten Jahren die Hinweise darauf, dass der Mediator auch noch an anderen Prozessen der Transkription beteiligt ist. Zu diesen gehören z.B. die Elongation, die Ausbildung von Genschlaufen oder auch der Umbau der Chromatinstruktur. In Anbetracht der Tatsachen, dass der Mediator (a) aus bis zu 25 Untereinheiten mit flexibler Zusammensetzung besteht, (b) eine flexible Struktur besitzt und (c) umfassend und dynamisch über posttranslationale Modifikationen modifiziert ist, erscheint es durchaus möglich, dass der Mediator all diese Funktionen ausfüllt und die Rolle einer allgemeinen Transkriptionsplattform einnimmt. Im Zusammenhang mit dieser Dissertationsschrift ist es gelungen, den Mediator innerhalb all dieser Funktionen „abzubilden“ und die bisher umfassendste Interaktomanalyse dieses Komplexes zu präsentieren. Durch die optimierten Bedingungen der Zelllyse und Co-Immunopräzipitation, gelang es auch transiente Interaktionspartner zu isolieren. Durch das metabolische Markieren der Wildtypkontrolle konnten außerdem unspezifische und spezifische Interaktionen eindeutig voneinander unterschieden werden. Über 400 Proteine wurden als signifikante Interaktionspartner des Mediators identifiziert. Viele dieser Proteine konnten als vollständige Komplexe zusammengefasst werden, z.B die RNA-Polymerase II, alle allgemeinen Transkriptionsfaktoren, der SAGA-Komplex, viele Komplexe des Chromatin Remodelings und stark acetylierte Histone. Viele weitere Interaktionspartner spielen zudem eine Rolle bei der co-transkriptionalen Prozessierung der mRNA, wie z.B dem Splicing, dem mRNA-decapping oder Abbau. Darüber hinaus gibt es starke Hinweise darauf, dass der Mediator auch mit der Polymerase I und III interagiert und an der ribosomalen Biogenese beteiligt ist. Weitere
Analysen zeigten, dass das Interaktom zudem hochdynamisch ist
G-Quadruplex (G4)-Strukturen sind sehr stabile und polymorphe DNA und RNA Sekundärstrukturen mit einem konservierten Guanin-reichen Sequenzmotiv (G4-Motiv). Sie bestehen aus übereinander gestapelten planaren G-Quartetts, in denen je vier Guanine durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden.
Da G4-Motive in Eukaryoten an bestimmten Stellen im Genom angereichert vorkommen, wird angenommen, dass die Funktion von G4-Strukturen darin besteht, biologische Prozesse positiv oder negativ zu regulieren. Aufgrund der hohen thermodynamischen Stabilität von G4 Strukturen ist davon auszugehen, dass Proteine in die Faltung, Stabilisierung und Entfaltung dieser Nukleinsäure-Strukturen regulatorisch involviert sind. Bis heute wurden viele Proteine in der Literatur beschrieben, die G4-Strukturen entwinden können. Jedoch konnten bisher nur wenige Proteine identifiziert werden, die in vivo die Faltung fördern oder G4-Strukturen stabilisieren.
Durch Yeast One-Hybrid (Y1H)-Screenings habe ich Zuo1 als neues G4 bindendes Protein identifiziert. In vitro Analysen bestätigten diese Interaktion und es stellte sich heraus, dass Zuo1 G4-Strukturen stabilisiert. Übereinstimmend mit den in vitro Daten konnte gezeigt werden, dass Zuo1 signifikant an G4-Motive im Genom von Saccharomyces ceresivisiae bindet. Genomweit überlappen G4-Motive, an die Zuo1 bindet, mit Stellen, an denen die DNA Replikation zum Stillstand kommt und vermehrt DNA Schäden vorkommen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zuo1 eine Funktion während der DNA Reparatur oder in Zusammenhang mit dem Vorankommen der DNA Replikationsgabel hat, indem G4-Strukturen stabilisiert werden. Diese Hypothese wird außerdem durch genetische Experimente gestützt, wonach in Abwesenheit von Zuo1 die Genominstabilität zunimmt. Aufgrund dieser Daten war es möglich ein Model zu entwickeln, bei dem Zuo1 während der S-Phase G4-Strukturen bindet und stabilisiert wodurch die DNA Replikation blockiert wird. Diese Interaktion findet neben Stellen schadhafter DNA statt und unterstützt somit DNA Reparatur-Prozesse wie beispielsweise die Nukleotidexzisionsreparatur.
Als weiteres potentielles G4-bindendes Protein wurde Slx9 in Y1H-Screenings identifiziert. In vitro Experimente zeigten zwar, dass Slx9 mit höherer Affinität an G4-Strukturen bindet im Vergleich zu anderen getesteten DNA Konformationen, jedoch wurde in S. cerevisiae genomweit keine signifikante Bindung an G4-Motive festgestellt.
Als Hämostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie lässt sich in die primäre (thrombozytäre) Hämostase, in die sekundäre (plasmatische) Hämostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Plättchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgefäßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und können mit anderen Immunzellen interagieren, über Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden können. Während diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, können sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, auslösen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerstörungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen könnten auf einer überhöhten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgefäße oder auf einer Änderung der lokalen Hämostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekundärmetabolite von A. fumigatus beruhen.
Um diese Änderung der Hämostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen), deren Überstände, sowie von proteolytisch aktivem Überstand und von verschiedenen Sekundärmetaboliten von A. fumigatus auf die sekundäre Hämostase und die Aggregation und Aktivität von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekundären Hämostase konnte für keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der primären Hämostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer Überstände konnte für Hyphen und ihren ankonzentrierten Überstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die möglicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zurückzuführen ist. Proteolytisch aktiver Überstand führte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abhängige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfläche, zum Teil aber auch auf GAG zurückzuführen sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte für Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivität nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivität der Thrombozyten, möglicherweise durch die Bildung von Disulfid-Brückenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht bestätigt, aber auch nicht vollständig wiederlegt werden konnte.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verstärkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erklären kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin könnten zudem für die beobachtete Gewebezerstörung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische Änderung der lokalen Hämostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu ermöglichen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse verschiedener genotoxischer Substanzen auf Säugertierzellen untersucht. Da ein Organismus der Ontogenese unterliegt und sich Zellen aus Stamm- und Vorläuferzellen entwickelt, gilt es diese ursprünglichen Zellen vor äußeren Einflüssen zu schützen. Da bisher kaum Untersuchungen von Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien durchgeführt wurden, wurden unter Verwendung vieler unterschiedlicher biologischer Endpunkte Effekte auf die Vitalität, Proliferation, Mitose und Apoptose dieser Zellen untersucht. Zudem erfolgte eine Interpretation der Ausbildung von Mikrokernen, Entstehung von DNS-Schäden und der zugrundeliegenden Reparaturmechanismen.
So konnte mit Hilfe der Untersuchungen der hämatopoetischen Stammzellen und der TK6-Zellen postuliert werden, dass hämatopoetische Stammzellen weitestgehend weniger empfindlich gegenüber Zytostatika (Doxorubicin, Vinblastin, Methylmethansulfonat und Mitomycin C) sind als die lymphoblastoide Zelllinie TK6, welche in der Entwicklungshierarchie den Stammzellen folgt. Die Befürchtung, dass der Mikrokerntest in immortalisierten TK6-Zellen als Grundlage für Genotoxizitätsuntersuchungen nicht genügen würden, konnte mit Hilfe der Versuchsergebnisse dieser Arbeit widerlegt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der Mikrokerntest in TK6-Zellen relevant ist, da TK6-Zellen empfindlicher auf genotoxische Agentien im Vergleich zu hämatopoetischen Stammzellen reagieren.
Bei der Untersuchung der Leukämiezelllinie HL-60 wurden die Effekte klassischer (Vinblastin, Vincristin, Vinflunin und Vinorelbin) mit neu synthetisierten Vinca-Alkaloiden (4-Chlorochablastin, 4-Chlorochacristin, 16a, 17b und 18a) verglichen. Vinca-Alkaloide werden sehr häufig mit Nebenwirkungen, wie Neuropathien assoziiert, welche während einer Chemotherapie oftmals zu Therapieabbrüchen durch die Patienten führen. Aus diesem Grund war es erstrebenswert, neuartige Vinca-Alkaloide zu entwickeln, welche weniger Nebenwirkungen aber zugleich eine ähnliche Wirksamkeit aufweisen. Obwohl die Potenz der neuen Substanzen niedriger war als bei Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin, zeigte ein Teil eine ähnliche Wirkung wie das Vinca-Alkaloid Vinflunin auf die Krebszelllinie HL-60 auf. Die Ergebnisse diese Arbeit können als erste Indikation in vitro genommen werden, dass sich diese Substanzen in der Krebstherapie als wirksam erweisen könnten und nach weiteren Ergebnissen in vivo als therapeutische Alternativen in Betracht gezogen werden.
Auch bei der vergleichenden Untersuchung von exponentiell wachsenden mit differenzierten Zelllinien konnten Unterschiede detektiert werden. Die Zelllinie HT-22, welche selbst keine Krebszelllinie ist, zeigte nach Differenzierung zu nicht exponentiell wachsenden Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Alkylanz Methylmethansulfonat, was auf einer verminderten Basenexzisionsreparatur beruhen könnte. Auch die differenzierte Form der Adenokarzinom-Zelllinie CaCo2 zeigte eine gesteigerte Sensitivität gegenüber dem Topoisomerase II-Inhibitor Etoposid auf, wohingegen der unselektive Topoisomerase II-Hemmer Doxorubicin keinen Effekt aufwies. Um den Sachverhalt zu klären ob die festgestellten Unterschiede auf das Enzym Topoisomerase II zurückzuführen oder zellartspezifisch waren, wurden weitere Analysen der Zelllinien HL-60 und deren differenzierten Zellart durchgeführt. Auch hier konnten signifikante Unterschiede bei der Einzelzellgelelektrophorese nach Behandlung mit Doxorubicin und Etoposid festgestellt werden. Neben den in dieser Arbeit nachgewiesenen Unterschieden bei der Reparatur zwischen den Zelltypen, könnten aber auch weitere Faktoren zu Varianzen führen und die Mutagenitätsforschung beeinflussen. Folglich ist davon auszugehen, dass zukünftige Testungen bei der pharmakologischen Substanzentwicklung in verschiedenen Zellsystemen von Nöten sind, bevor neue Substanzen zugelassen werden.
Alles in allem konnte die Komplexität der Ergebnisse zwischen Zellen der verschiedenen Differenzierungsstadien in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Deswegen sollte auch bei weiteren Forschungsvorhaben insbesondere ein Augenmerk auf den Differenzierungszustand der zu untersuchenden Zellpopulation geworfen werden.
Eine ausgeprägte Mundtrockenheit, Xerostomie, entsteht häufig durch eine irreversible Funktionseinschränkung der Speicheldrüsen. Diese ist unter anderem durch die Einnahme bestimmter Medikamente, Autoimmunerkrankungen, fortgeschrittenes Alter oder die Bestrahlungstherapie von Tumoren der Kopf-Hals-Region bedingt, wobei letztere eine der häufigsten Ursachen darstellt. Konsequenzen der eingeschränkten Drüsenfunktion sind herabgesetzte Speichelflussraten, eine Reduktion des Mund-pH-Werts, eine veränderte Elektrolyt- und Immunglobulin-Zusammensetzung des Speichels und somit eine Verringerung des Infektionsschutzes. Die resultierenden Komplikationen erstrecken sich von Karies und rezidivierenden Infektionen bis hin zu Pilzbesiedelungen der Mundschleimhaut. Diese schränken die Lebensqualität der Patienten stark ein und führen häufig zu Therapieunterbrechungen. Fast die Hälfte der Patienten leidet unter Depressionen oder psychischen Belastungszuständen. Es gibt wenige Therapieansätze zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie: Pilocarpin erhöht zwar die Speichelflussraten, hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Lebensqualität. Die operative Translokation der Glandula submandibularis hat den Weg in die klinische Routine noch nicht gefunden, während die intensitätsmodulierte Bestrahlung (IMRT) nicht für jeden Patienten geeignet ist; beide zeigen jedoch einen positiven Effekt auf die Lebensqualität. Gentechnische und stammzellbasierte Ansätze zur Regeneration des Drüsengewebes befinden sich im Experimentalstadium. Somit ergibt sich ein dringender Bedarf an innovativen Optionen zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie. Das Tissue Engineering, die Erstellung einer künstlichen Speicheldrüse aus körpereigenen Zellen, böte hier ein potentielles Behandlungskonzept.
Diese Studie soll deshalb untersuchen, ob humane Speicheldrüsenepithelzellen (hSEZ) auf einer Matrix aus dezellularisiertem, porzinem Jejunum, der sogenannten Small intestinal submucosa + mucosa (SIS-muc), kultiviert werden können. Können die Zellen innerhalb der Wachstumsperiode wichtige physiologische Differenzierungsmarker beibehalten? Kann die Produktion von α-Amylase, einem der wichtigsten Enzyme des menschlichen Speichels, erhalten werden? Welchen Einfluss hat die Kokultur mit mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ)? Und zuletzt: Ist dezellularisierter Schweinedarm eine potentiell geeignete Matrix für das Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse?
Zunächst erfolgte die Entnahme von humanem Speicheldrüsengewebe, woraus hSEZ isoliert wurden. Diese wurden dann sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit mvEZ auf die SIS-muc aufgebracht und auf dieser kultiviert. Die SIS-muc wurde aus kurzen Schweinedarm-Segmenten gewonnen, die in einem mehrstufigen Verfahren dezellularisiert wurden. Die besiedelte SIS-muc wurde mittels konventioneller sowie Immunfluoreszenzfärbungen, Raster- und Transmissionsektronenmikroskopie (REM/TEM) sowie quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) untersucht, darüber hinaus erfolgte die Messung der α-Amylase-Enzymaktivität.
Histologisch sowie in der REM zeigte sich sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur eine konfluente Besiedelung der SIS-muc mit hSEZ. In der Kokultur formten mvEZ einen Monolayer auf der serosalen Matrixseite. Bei der Charakterisierung der hSEZ zeigte sich in den Immunfluoreszenzaufnahmen eine starke Ausprägung von Zytokeratin, α-Amylase und Aquaporin-5 und eine moderate Ausprägung von Claudin-1. Bei der Untersuchung der Funktion der α-Amylase konnte in der Kokultur von hSEZ mit mvEZ eine im Gegensatz zur Mono- und 2D-Kultur signifikant erhöhte Enzymaktivität der α-Amylase nachgewiesen werden. In der qPCR-Analyse der α-Amylase-Genexpression war die 3D-Kultur der 2D-Kultur überlegen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kultur von hSEZ auf der SIS-muc möglich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen in 3D-Kultur spezifische Differenzierungsmerkmale beibehalten, die in der 2D-Kultur teils verloren gehen und dass hSEZ in Kokultur mit mvEZ eine gegenüber der Monokultur signifikant erhöhte Produktion von α-Amylase aufweisen. Diese Arbeit liefert die Datengrundlage für zukünftige Studien im dynamischen Bioreaktor-Modell (BioVaSc), die auf dem Weg zur klinischen Translation notwendig sind. Somit stellt sie einen wichtigen Schritt in Richtung einer auf Tissue Engineering basierten Therapie der belastenden Xerostomie dar.
Die Rolle von Chronophin bei Schlaganfall-induziertem Funktionsverlust der Blut-Hirn-Schranke
(2018)
Der ischämische Schlaganfall ist mit einer jährlichen Inzidenz von 200/100 000 Einwohnern die häufigste Gefäßerkrankung in Deutschland. Atherothrombose, arterielle Hypertonie und Embolien unterschiedlichen Ursprungs sind die wesentlichen Ursachen des ischämischen Schlaganfalls. Die neurologischen Defizite nach einem Schlaganfall resultieren aus einem gestörten zerebralen Blutfluss und somit einer insuffizienten Sauerstoffversorgung. Zusätzlich ist die Ödembildung, welche von einer gesteigerten Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke verursacht wird, am neuronalen Zelltod beteiligt.
Chronophin ist eine Aktinzytoskelett-regulierende Serin-Phosphatase. In einem ischämischen Schlaganfall-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der globale Verlust von Chronophin zu einer vermehrten Ödembildung und einem aggravierten neurologischen Zustand der Mäuse im Vergleich zu wildtypischen Kontrollen führte. Hirnlysate von wildtypischen Mäusen zeigten verringerte Chronophin-Level in der vom Schlaganfall betroffenen Hemisphäre. Jedoch konnten initiale immunhistochemische und zellbiologische Untersuchungen weder Chronophin-abhängige Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke feststellen noch einen zerebralen Zelltyp identifizieren, der für den schützenden Effekt von Chronophin verantwortlich ist.
Diese Ergebnisse weisen auf einen komplexen, vielzelligen Mechanismus hin, dem die schützende Rolle von Chronophin im ischämischen Schlaganfall unterliegt. Die Entschlüsselung dieses Mechanismus ist Aufgabe künftiger Untersuchungen.
Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch inhibitorische Substanzen des Mevalonatstoffwechsels
(2018)
Die Osteoporose ist eine Erkrankung, die durch verminderte Dichte und erhöhte Fragilität des Knochens gekennzeichnet ist. Sie zählt zu den häufigsten Erkrankungen weltweit und geht mit erheblicher Einschränkung der Lebensqualität und erhöhter Mortalität einher. Eine Behandlungsmöglichkeit dieses schwerwiegenden Krankheitsbilds ist die Therapie mit Bisphosphonaten. Diese hemmen mit ihren antiresorptiven Eigenschaften den Knochenabbau und fördern vermutlich gleichzeitig den Knochenaufbau. Obwohl schon lange die Wirkungsweise der Bisphosphonate erforscht wird, ist noch nicht sicher geklärt, wie beispielsweise osteoanabole oder antitumoröse Effekte vermittelt werden. Einen Erklärungsansatz bietet der MEK5/ Erk5-Signalweg. Diesem werden unter anderem antiangiogenetische, antiinflammatorische und antiproliferative Eigenschaften zugesprochen. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Statine Erk5 und Erk5-abhängige Gene aktivieren können. Statine wiederum inhibieren ebenfalls den Mevalonatstoffwechsel, jedoch weiter upstream als Bisphosphonate. Da Statine zudem osteoanabole Effekte aufweisen, lag die These nahe, dass auch Bisphosphonate ihre Wirkung über den MEK5/Erk5-Signalweg vermitteln könnten. Die These konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden: Stickstoffhaltige, nicht aber stickstofffreie Bisphosphonate aktivieren Erk5 sowohl in Endothelzellen als auch in Osteoblasten. Es gilt jedoch zu bedenken, dass eine Weiterentwicklung der Substanzen mit verbesserter Aufnahme in die Zelle zur Vermeidung von Apoptose-Induktion anzustreben ist.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Knock-down der FDPS, dem Angriffspunkt der Bisphosphonate im Mevalonatstoffwechsel, ebenfalls eine Erk5-Phosphorylierung zur Folge hat. Durch Inhibition der FDPS wird die Prenylierung kleiner G-Proteine wie Cdc42 unterbunden, was eine veränderte Funktion der Proteine zur Folge hat. Ein Knock-down von Cdc42 mittels siRNA führt wiederum zu einer Aktivierung von Erk5. Auf diese Weise wurde nicht nur ein neuer Wirkungsweg der Bisphosphonate identifiziert, sondern auch ein möglicher Aktivierungsmechanismus der MEK5/ Erk5-Signalkaskade aufgedeckt.
Erk5 wandert nach seiner Aktivierung in den Zellkern und beeinflusst dort die Genexpression. Im Rahmen dieser Arbeit wurden knochenrelevante Gene identifiziert, die durch Zoledronat-Stimulation induziert werden konnten. Zu diesen zählen INPP4B, das die Osteoklastogenese inhibiert, und PTHLH sowie FOSL1, welche die Osteoblastogenese fördern. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch Zoledronat eine Geninduktion zur Folge hat, die sowohl die osteoanabole Wirkung unterstützt, als auch die katabolen Effekte hemmt. Auf diese Weise konnte neben den bereits bekannten Wirkungswegen der Bisphosphonate ein neuer identifiziert werden, der auch einen möglichen Ansatz für weitere, bisher ungeklärte Effekte von Bisphosphonaten darstellt.
Der gyrus dentatus im Hippocampus ist die primäre Zielregion kortikaler Afferenzen des Enthorinalen Cortex. Im Laufe seiner Entwicklung erlangt der gyrus dentatus durch die Etablierung einer neurogenen Nische (tertiäre Matrix) die Fähigkeit fortwährender postnataler Neurogenese. Diese wird durch eine Vielzahl von Mediatoren wie Transkriptionsfaktoren gesteuert, die die Proliferation und Zelldifferenzierung, aber auch das Überleben der hippocampalen neuralen Vorläuferzellen (NPCs, neural progenitor cells) kontrollieren. In Säugetieren steuern die homologen RAF Kinasen ARAF, BRAF und CRAF die mitogene Kaskade, die bei der adulten Neurogenese von elementarer Bedeutung ist.
In dieser Studie wurde untersucht ob die Nullmutation von CRAF eine Auswirkung auf die postnatale und adulte hippocampale Neurogenese hat.
Unsere Analysen von BRAF- und CRAF-defizienten Mäusen zeigen in der frühen Embryonalentwicklung gemeinsame Funktionen beider Kinasen, weshalb das Fehlen einer Kinase bis zu bestimmten embryonalen Entwicklungszeitpunkten durch die jeweils andere Kinase kompensiert werden kann. Letalitätsstudien zeigen jedoch, dass BRAF und CRAF bei späteren Entwicklungsstadien jeweils unabhängig für das Überleben von Tieren relevant sind. CRAF Nullmutanten werden nicht nach der erwarteten Mendelschen Frequenz geboren und nahezu 70% der Tiere sterben bereits kurz nach der Geburt. Die maximale beobachtete Lebenserwartung adulter CRAFko Tiere lag bei postnatal Tag 55. CRAFko Mäuse haben eine reduzierte Körpergröße, veränderte Hautfarbe und einen eye-open-at-birth-Phänotyp. Verhaltensexperimente in unserer Arbeitsgruppe zeigten an heterozygoten CRAF Mäusen einen Einfluss von CRAF auf das Angst - und Lernverhalten, was einen Einfluss von CRAF auf die Neurogenese-vermittelte hippocampale Funktion andeutete. Tatsächlich konnte hier die Expression von CRAF im postnatalen Gehirn von Mäusen immunhistologisch wie auch proteinbiochemisch nachgewiesen werden. Im Hippocampus zeigte sich, dass ein Funktionsverlust von CRAF zu einer erhöhten Anzahl mitotisch aktiver NPCs führt, die massive Zellzyklusveränderungen aufweisen. Zudem wurde eine fehlerhafte Reorganisation der tertiären Matrix beobachtet. NPCs CRAF-defizienter Tiere befinden sich vermehrt im Hilus und bleiben in der Entwicklung zu reifen Körnerzellen im D Zell-Vorläuferstadium stecken. Weitere Analysen zeigen, dass diese fehlplatzierten NPCs teilweise über apoptotische Signalwege eliminiert werden. Als Resultat dieser Entwicklungsstörung ist der gyrus dentatus CRAF-defizienter Tiere verkleinert und es kann eine verlangsamte neuronale Differenzierung NPC-abgeleiteter Neurone beobachtet werden. Diese Befunde zeigen erstmals einen CRAF-spezifischen Einfluss auf die Regulation elementarer, zellulärer Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen des Hippocampus.
Transsexualität ist gekennzeichnet durch die dauerhafte Gewissheit, in einem Körper des falschen Geschlechts geboren worden zu sein. Bei Mann-zu-Frau-Transsexualität ist die Stimme ein oft unterschätzter Bestandteil der ganzheitlichen Therapie. Kann mit konservativer Therapie kein zufriedenstellend weiblicher Stimmklang erreicht werden, ist Phonochirurgie die Methode der Wahl. In Würzburg wird hierzu die Glottoplastik nach Wendler modifiziert durch Hagen angewendet.
An der vorliegenden Studie zur Qualitätsüberprüfung des operativen Verfahrens nahmen insgesamt 21 auf diese Art operierte Patientinnen teil, von denen 18 zu einer Nachuntersuchung in Würzburg erschienen und 3 die zugsandten Fragebögen ausfüllten. Erwartet wurden eine Anhebung der mittleren Sprechstimmlage sowie eine Veränderung weiterer objektiver Stimmparameter. Mit einer angehobenen Sprechstimmlage wurde auch eine höhere Zufriedenheit der Patientinnen mit ihrer Stimme vermutet. Nach Erfahrungsberichten vieler Patientinnen blieben Probleme beim Telefonieren jedoch weiterhin bestehen. Diese für den subjektiven Therapieerfolg sehr wichtige Situation wurde mit einer Perzeptionsstudie gezielt untersucht.
Insgesamt zeigte sich die Operation als risikoarme und effektive Therapieoption, um die mittlere Sprechstimmlage anzuheben. So lag die mittlere Sprechstimmlage der Patientinnen postoperativ im Median bei 170 Hz und somit im ausschließlich weiblichen Stimmlagenbereich. Die Anhebung der mittleren Sprechstimmlage ging mit einem leichten Verlust des Dynamikumfangs einher, der jedoch nur von ca. einem Drittel der Patientinnen als störend empfunden wurde. Zur subjektiven Erfolgskontrolle wurden Daten aus den standardisierten Fragebögen „Voice Handicap Index“ sowie „Fragebogen zur Lebenszufriedenheit“ und dem eigenen „Würzburger Fragebogen“ erhoben und ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Fragebögen zeigten, abweichend von den guten objektiven Messwerten, deutliche Einschränkungen gegenüber einer stimmgesunden Vergleichsgruppe aus der Literatur. Diese Defizite betrafen sowohl die stimmbezogenen Fragengebiete des Voice Handicap Index, als auch die allgemeine Lebenszufriedenheit. Dennoch gaben die Patientinnen an, durch die Stimmoperation ein selbstsichereres Auftreten gegenüber fremden Personen gewonnen zu haben. Die subjektive Stimmzufriedenheit korrelierte sowohl mit der mittleren Sprechstimmlage als auch mit der Selbsteinschätzung der Weiblichkeit der Stimme. Bei Frequenz- und Dynamikumfang zeigten sich starke Differenzen zwischen objektiven Messergebnissen und subjektiver Zufriedenheit.
Für die Perzeptionsstudie zur Telefonsituation wurden von 18 Patientinnen sowie jeweils im Alter gepaarten männlichen und weiblichen Kontrollsprechern identische Sprachaufnahmen angefertigt und in der Frequenz entsprechend der Übertragungs-bandbreite am Telefon bearbeitet. Diese Stimmproben wurden 50 männlichen und 50 weiblichen zufällig ausgewählten Laienjuroren zur Bewertung hinsichtlich des Sprechergeschlechts vorgespielt. Gemessen wurde neben dem Urteil männlich oder weiblich auch die Zeitspanne von Beginn der Wiedergabe bis zur Urteilseingabe. Ungefähr 40 % der transsexuellen Patientinnen wurden mehrheitlich, also in über 50 % der Urteile als weiblich bewertet. Die Urteilszeit lag für die Sprachproben der transsexuellen Patientinnen signifikant über der Urteilszeit für männliche und weibliche Kontrollsprecher. Bezogen auf die Juroren zeigten sich Unterschiede zwischen männlicher und weiblicher Jurorengruppe: Männer ordneten die Sprachproben häufiger einem weiblichen Sprecher zu. Weibliche Juroren fällten ihr Urteil hingegen signifikant schneller als männliche Juroren. Es zeigte sich eine positive Korrelation der Geschlechtszuordnung mit der mittleren Sprechstimmlage. Die unabhängig von der Sprechstimmlage deutlich verlängerte Urteilszeit für transsexuelle Sprecherinnen zeigte jedoch, dass neben der mittleren Sprechstimmlage auch noch andere Faktoren die Geschlechtszuordnung beeinflussen. Dementsprechend existierte keine klare Grenzfrequenz, oberhalb derer Stimmen regelhaft als weiblich wahrgenommen wurden. Auch in einem in der Literatur mehrfach als ausschließlich weiblich definierten Sprechbereich wurden die Stimmen einzelner Patientinnen mehrheitlich als männlich wahrgenommen. Es konnte kein Zusammenhang der Formantfrequenzen F1 – F3 mit der Geschlechtszuordnung gefunden werden.
Zusammenfassend zeigten diese aus objektiven Stimmdaten, Eigen- und Fremd-bewertung bestehenden Ergebnisse, dass durch alleinige Operation zwar eine höhere Stimmlage, jedoch kein vollständig weiblicher Stimmklang erreicht wurde. Deswegen muss die Phonochirurgie zukünftig stärker in ein umfassendes Behandlungskonzept aus logopädischem Stimmtraining, Übungen für eine weibliche Gestik und Mimik sowie Alltagstraining eingebunden werden. Hierzu wurde in dieser Arbeit ein neuer Behandlungsalgorithmus für die Univ.-HNO-Klinik Würzburg erstellt.
Immunologische Gedächtnisreaktionen sind die Grundlage um wiederkehrende Erreger schnell und effizient zu bekämpfen und um einen Impfschutz zu generieren. Das zellvermittelte Gedächtnis wird unter anderem durch CD8 Gedächtnis-T-Zellen aufgebaut, welche vor allem im Kontext von Immunreaktionen gegen intrazellulärer Erreger vonnöten sind, um bei Reinfektion mit den Erregerstämmen einen schnellen Schutz zu gewährleisten. Ein detailliertes Wissen über die Generierung, Kontrolle und Reaktivierung der Gedächtniszellen ist nützlich, um Gedächtnisreaktionen verstehen und lenken zu können. Durch die Entdeckung des TZR und CD28 wurden Meilensteine für das Verständnis der T-Zellaktivierung gelegt und die Grundlage geschaffen, CD8 Gedächtnisreaktionen zu verstehen. Auch wenn für primäre Immunreaktionen die „2-Signal-Theorie“ lange als erwiesen gilt, so blieb die Rolle der Kostimulation für Gedächtnisreaktionen lange umstritten. In dieser Arbeit wurden verschiedene methodische Herangehensweisen verwendet, mit denen durchgehend die Bedeutung von CD28 vermittelter Kostimulation für immunologische CD8 T-Zell-Gedächtnisreaktionen nachgewiesen wurde. CD28 blockierende Antikörper und CD28 induzierbar deletierbare Mauslinien wurden im Modellinfektionssystem mit Ovalbumin produzierenden Listeria monocytogenes zur Analyse der Primär- und Sekundärantworten verwendet. Mit diesen Methoden konnte eine Beeinträchtigung der Expansion von CD8 Gedächtniszellen in Abwesenheit von CD28 bewiesen werden. Weiterhin werden Effektorfunktionen wie Degranulation und Produktion von IFN-γ während der Sekundärinfektion in Abwesenheit von Kostimulation eingeschränkt. Mit Hilfe von Experimenten, bei denen CD28 suffizienten Mäusen eine geringe Anzahl an naiven, antigenspezifischen, CD28 deletierbaren CD8 T-Zellen transferiert wurden, wurde die Bedeutung der Kostimulation für die Expansion von Gedächtniszellen bestätigt, jedoch konnte überraschenderweise auch ein Anstieg der Effektorfunktionen in Abwesenheit von CD28 sowohl während der Primär- als auch der Sekundärantwort dokumentiert werden. Diese zur globalen Blockade bzw. Deletion widersprüchlichen Ergebnisse lassen eine Beteiligung anderer CD28 abhängiger Zelltypen an der Induktion der Effektorfunktionen der CD8 T-Zellen plausibel erscheinen, wie zum Beispiel Einflüsse von T-Helferzellen, welche die Effektorfunktionen positiv verstärken, solange sie selbst Kostimulationssignale empfangen können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Gedächtniszellen an den CD28 defizienten Phänotyp – eine CD28 intakte immunologische Umgebung vorausgesetzt – adaptieren können, wenn ausreichend Zeit nach Deletion und vor Sekundärinfektion verstreichen konnte.
Staphylococcus aureus ist ein grampositives Bakterium, welches häufig als kommensaler Besiedler auf der Nasen- und Rachenschleimhaut von Säugetieren vorkommt. Darüber hinaus besitzt dieser fakultativ pathogene Mikroorganismus die Fähigkeit schwer zu behandelnde Krankenhausinfektionen auszulösen. Aufgrund der weiten Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und dem Mangel an effektiven Therapien, verursachen S. aureus Infektionen jährlich enorme Kosten für das Gesundheitssystem. S. aureus wird meist von der Nase zum primären Infektionsort übertragen, wodurch zunächst sehr häufig Wund- und Weichteilinfektionen hervor gerufen werden. Von diesem primären Infektionsort ausgehend, kann der Erreger tiefer liegende Gewebsschichten infizieren oder sich über den Blutstrom im gesamten Organismus ausbreiten. Das Spektrum an Krankheitsbildern reicht von leichten Abszessen der Haut bis zu schweren, lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Pneumonien und akuter Sepsis.
Für die erfolgreiche Kolonisierung und Infektion des Wirtes exprimiert S. aureus eine Vielzahl unterschiedlicher Virulenzfaktoren. Die wohl größte Gruppe an Virulenzfaktoren umfasst die Proteine, die an der Immunevasion und der Umgehung von verschiedenen Abwehrstrategien des Immunsystems beteiligt sind. Das bisherige Wissen über die Interaktion von S. aureus mit dem Immunsystem des Wirtes und die zugrunde liegenden Pathogenitätsmechanismen ist bisher limitiert.
Um neue Erkenntnisse über die Interaktion von Wirt und Pathogen zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Arbeit bislang unbekannte sekretierte und Oberflächen-assoziierte Proteine von S. aureus funktionell charakterisiert. Die Funktion der ausgewählten Proteine wurde in vitro hinsichtlich Einfluss auf Komponenten des Immunsystems, Adhäsion an Wirtsfaktoren und Invasion in eukaryotische Zellen untersucht.
Mit Hilfe der vorangegangenen in-vitro-Charakterisierung der putativen Virulenzfaktoren, konnte für die cytoplasmatische Adenylosuccinat-Synthase PurA eine neuartige Funktion identifiziert werden. PurA ist bekannt als essentielles Enzym der de novo Purin-Synthese. In dieser Arbeit wurde nun gezeigt, dass PurA zudem an der Immunevasion beteiligt ist. Durch die Bindung des humanen Faktor H des Komplementsystems schützt PurA S. aureus vor der lytischen Aktivität des Komplementsystems und verhindert die Opsonisierung des Pathogens. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde PurA detailliert charakterisiert. In Bindungsstudien mit rekombinantem Faktor H und PurA wurde eine direkte Interaktion beider Proteine nachgewiesen, wobei Faktor H mit dem N-terminalen Bereich von PurA interagiert. Weiterhin konnte PurA durch Immunfluoreszenz und FACS-Analysen auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden, wo es wahrscheinlich mit der Zellwand assoziiert vorliegt. Dort rekrutiert es Faktor H an die bakterielle Oberfläche und verhindert das Fortschreiten der Komplement-Kaskade und damit die Lyse des Pathogens. Aufgrund der Multifunktionalität zählt PurA somit zur Gruppe der Moonlighting Proteine.
Des Weiteren wurde die Rolle von PurA im Infektionsgeschehen in zwei unabhängigen Tiermodellen untersucht. In beiden Modellen wurde ein signifikant reduziertes Virulenzpotential der ΔpurA-Mutante beobachtet. Zukünftig soll geklärt werden, ob die verminderte Virulenz in der fehlenden Komplementevasion oder im Defekt in der Purin-Synthese begründet ist. Aufgrund der sehr starken Attenuation in allen untersuchten Infektionsmodellen sollte PurA als potentielles Target für eine Therapie von S. aureus Infektionen weiter charakterisiert werden. Im Ergebnis dieser Arbeit wurde demnach mit PurA ein neues Moonlighting Protein identifiziert, das als Inhibitor des Komplementsystems wesentlich zur Immunevasion von S. aureus beiträgt.
Für das bessere Verständnis der humoralen S. aureus-spezifischen Immunantwort, Unterschieden in der Antikörperantwort und der gebildeten Antikörperspezifitäten wurde weiterhin das während der Kolonisierung und Infektion gebildete S. aureus-spezifische Antikörperprofil untersucht. Dazu wurden Plasmen von humanen nasalen Trägern und Nicht-Trägern sowie murine Seren von infizierten Tieren untersucht. Insbesondere wurde das Pathogen-spezifische Antikörperprofil in unterschiedlichen Infektionsmodellen mit Hilfe eines Proteinarrays analysiert, der im Rahmen dieser Arbeit in einer Kooperation mit der Firma Alere Technologies (Jena, Deutschland) und universitären Forschergruppen der Universitäten Greifswald, Münster und Jena mitentwickelt wurde. Die Antikörperprofile von intramuskulär und intravenös infizierten Tieren resultierten in jeweils spezifischen Antikörperprofilen. Diese Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Art der Infektion und der gebildeten Antikörperspezifitäten hin. Wahrscheinlich beruht dies auf einer gewebespezifischen Genexpression als Anpassung an die individuellen Bedürfnisse im Wirtsorganismus. Das ausgebildete Antikörperprofil gibt somit einen Einblick in das Expressionsmuster von Virulenzfaktoren von S. aureus unter in vivo Bedingungen und trägt damit zum Verständnis der komplexen Interaktion von Pathogen und Wirt bei. Diese Untersuchungen ergänzen zudem die bisherigen Kenntnisse über die Anpassung der humoralen Immunantwort an eine asymptomatische Kolonisierung im Gegensatz zu einer akuten Infektion durch S. aureus. Darüber hinaus können die gewonnenen Ergebnisse für diagnostische Zwecke und zur Identifikation von neuen Zielstrukturen für eine Vakzin-Entwicklung genutzt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.
Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.
Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.
Diese Dissertation analysiert BMP2 und BMP2-Derivate als neue therapeutische Strategien für die Behandlung des Multiplen Myeloms (MM). Das MM ist eine maligne neoplastische Erkrankung des Knochenmarks mit Plasmazellvermehrung und erhöhten Leveln an Aktivin A im Blutserum, wobei eines der Hauptsymptome das Auftreten von schmerzvollen Osteolysen ist. In den letzten Jahren rückte Aktivin-A als interessantes Target zur Behandlung des Multiplen Myeloms in den Vordergrund. Die Reduzierung der Aktivin-A Level durch decoy-Rezeptoren führte zu einer signifikanten Verbesserung der Osteolysen und einem reduzierten Proliferationsverhalten der neoplastischen B-Zellen, sowohl im Tierexperiment als auch in Studien der klinischen Phase II. Die Aktivin-A-Antagonisierung ist somit ein neuer und vielversprechender Ansatz in der Therapie des Multiplen Myeloms.
Das Bone Morphogenetic Protein 2 ist aufgrund seiner molekularen und biologischen Eigenschaften ein interessantes Target für die Therapie des Multiplen Myeloms. Es ist auf molekularer Ebene ein Aktivin-A-Antagonist, besitzt aber auch osteoinduktives Potential und apoptotische bzw. anti-proliferative Eigenschaften auf neoplastische B-Zellen. Da die in der Literatur bereits beschriebenen, durch Mitglieder der TGF-β-Familie induzierten Apoptosemechanismen, noch nicht genauer untersucht waren, wurde in dieser Arbeit die BMP2-induzierte Apoptose in 10 unterschiedlichen humanen MM-Zellen analysiert. Erstens konnte dabei nachgewiesen werden, dass 7 von 10 Zelllinien nicht BMP2-responsiv waren. Eine genauere Untersuchung ergab, dass neben der Expression spezifischer BMP-Rezeptoren auch die Expression von inhibitorischen Smad-Proteinen über die BMP2-Responsivität entscheidet. Zweitens zeigte die genauere Analyse der Apoptosemechanismen, dass entgegen der in der Literatur publizierten Ergebnisse, BMP2 keine apoptotische Wirkung auf die von uns untersuchten Zelllinien hat. Mehrere verschieden durchgeführte Experimente, u.a. die Verwendung von spezifischen Inhibitoren des programmierten Zelltodes, unterstützen dieses Ergebnis und klassifizieren BMP2 als einen rein anti-proliferativen Faktor.
Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse von potentiellen Aktivin-A-Antagonisten in Form verschiedener BMP2- und GDF5-Derivate und inwiefern sie sich zum Einsatz in der Therapie des Multiplen Myeloms eignen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der einzelnen Mutanten wurden in verschiedenen Zellsystemen getestet. So konnte aufgezeigt werden, dass neben einer erhöhten biologischen Aktivität in Form eines gesteigerten osteoinduktiven und anti-proliferativen Potentials auf neoplastische B-Zellen (Superagonisten), sich die verschiedenen Derivate als Super-Antagonisten zu Aktivin A eignen und damit unterschiedlichen Ansprüchen der adjuvanten Therapie im Multiplen Myelom gerecht werden.
Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert.
Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress.
Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht.
Einfluss der sauren Sphingomyelinase auf anti-virale T-Zellantworten im Masernvirus-Infektionsmodell
(2017)
Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus,
spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter
anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die
Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt
und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im
Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und
Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale"
Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere
Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen
bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen.
Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des
immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität
von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der
Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der
Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es
konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv
Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten
Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber
den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch,
dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von
IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses
von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann
hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und
Autoimmunerkrankungen sein.
Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort
entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/-
Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in
Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg
sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte
Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der
akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die
Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen
vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im
Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion
widerspiegelt.
Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und
einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im
Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg
Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle
sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg
zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt
werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis.
Diffusionsgewichtete MR-Bilder sind ein wichtiger Bestandteil für die klinische Diagnostik
verschiedener Pathologien, wie z.B. bei Schlaganfall oder Tumoren. Meistens
wird ein mono-exponentielles Diffusionsmodell verwendet und über verschiedene
Raumrichtungen gemittelt. Der Einfluss von Fluss auf das diffusionsgewichtete
Signal und eine mögliche Richtungsabhängigkeit werden dabei vernachlässigt. Dabei
machen Diffusionsmodelle, die mehr Eigenschaften des Signals abbilden, unter
Umständen eine genauere Diagnostik möglich. Mit DTI wird die Richtungsabhängigkeit
der Diffusion erfasst und bei IVIM wird der Beitrag von Fluss zum Signal
berücksichtigt. Die Niere ist ein stark strukturiertes Organ und weist Anisotropie
in der Diffusion auf. Außerdem ist die Niere ein sehr gut durchblutetes Organ. DTI
und IVIM beschreiben also unabhängig voneinander zwei wichtige Aspekte des diffusionsgewichteten
Signals in der Niere, ohne dass der Vorteil des jeweils anderen
Modells Beachtung findet.
In dieser Arbeit wurde das Modell IVOF zur umfassenden Beschreibung von Diffusionssignal
vorgestellt, bei dem sowohl die Richtungsabhängigkeit der Diffusion,
als auch das Signal der fließenden Spins und deren Richtungsabhängigkeit abgebildet
wird. Die Vorteile von DTI und IVIM werden also in IVOF vereint und darüber
hinaus auch die mögliche Anisotropie die Flusssignals berücksichtigt. Es konnte gezeigt
werden, dass dieses Modell das diffusionsgewichtete Signal in der menschlichen
Niere besser beschreibt als die herkömmlichen Modelle (DTI und IVIM) und auch
besser als eine Kombination von DTI und IVIM, bei der ein isotroper Flussanteil
des Signals angenommen wird.
Es wurde weiterhin gezeigt, dass selbst wenn der Flussanteil im verwendeten Diffusionsmodell
berücksichtigt wird, der tatsächlich gemessene Flussanteil in der Niere
von der Art der Messung, d.h. Bewegungsempfindlichkeit des Gradientenschemas
abhängt. Das bedeutet, dass der mikroskopische Fluss in der Niere nicht, wie häufig
angenommen, komplett zeitlich inkohärent ist. Bei Vergleichen von IVIM Studien
an der Niere ist es deshalb notwendig, die Bewegungsempfindlichkeit der jeweiligen
Gradientenschemata zu berücksichtigen. Wie groß das absolute Verhältnis von kohärent zu inkohärent fließendem Signal ist, konnte nicht festgestellt werden. Ebenso
wenig konnte die absolute Flussgeschwindigkeit bzw. die Art des Flusses (Laminare
Strömung, Pfropfenströmung, oder andere) ermittelt werden.
TSE hat sich als vielversprechendes, artefaktfreies Verfahren für die Aufnahme
diffusionsgewichteter Bilder der Niere gezeigt. Im Vergleich mit dem Standardverfahren EPI wurden ähnliche Werte der Parameter von DTI und IVIM gefunden.
Abweichungen zwischen EPI und TSE sind vor allem durch die Unschärfe der TSE
Bilder aufgrund von T2-Zerfall zu erklären. Bis zur klinischen Anwendbarkeit diffusionsgewichteter
TSE Bilder bzw. Parameterkarten sind noch einige Weiterentwicklungen
der Methode nötig. Vor allem sind schärfere TSE Bilder erstrebenswert und
es sollten mehrere Schichten in einer klinisch vertretbaren Zeitspanne aufgenommen
werden, ohne dass dabei die zulässigen SAR Grenzwerte überschritten werden.
Bei allen Untersuchungen in dieser Arbeit handelt es sich um Machbarkeitsstudien.
Daher wurden alle Messungen nur an erwachsenen, gesunden Probanden durchgeführt, um zu zeigen, dass das jeweilige vorgeschlagene Modell zu den Daten passt
bzw. dass die vorgeschlagene Methode prinzipiell funktioniert. Bei welchen Pathologien
die hier vorgeschlagenen Methoden und Modelle einen diagnostischen Nutzen
haben, muss in zukünftigen Studien erforscht werden. Außerdem wurden keine b-
Werte zwischen 0 und 200 s/mm2 aufgenommen, bei denen fließende Spins noch
signifikant zum Signal beitragen. Betrachtet man die Ergebnisse der Diffusionsbildgebung
mit verschiedenen m1 in dieser Arbeit, dann ist neben dem b-Wert auch die
Bewegungsempfindlichkeit m1 nötig, um das Signal in diesem Bereich korrekt zu
beschreiben.
Alles in allem sollte der Beitrag von Fluss zum diffusionsgewichteten MR-Signal
in der Niere immer berücksichtigt werden. Die vielfältigen Einflüsse, die unterschiedliche
Parameter auf das Signal von Mikrofluss haben, wurden in dieser Arbeit untersucht
und präsentieren weiterhin ein spannendes Feld für kommende Studien.
Diffusionsgewichtete TSE Sequenzen sind auch für die klinische Diagnostik eine potentielle
Alternative zu Artefakt-anfälligen EPI Sequenzen. Bis dahin sollten jedoch
die Bildschärfe und Abdeckung der diffusionsgewichteten TSE Sequenz weiter verbessert
werden.
Interleukin-6 (IL-6)-Typ Zytokine, allen voran IL-6 und Oncostatin M (OSM), besitzen pleiotrope Eigenschaften und spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl biologischer Prozesse. Als Akutphaseinduktoren sind IL-6 und OSM an der Initialisierung entzündlicher und immunologischer Prozesse beteiligt, können aber ebenso die Differenzierung und das Zellwachstum beeinflussen. Ihre biologische Wirkung vermitteln sie über die Bindung an einen multimeren Rezeptorkomplex. Dieser weist im Fall von IL-6 eine hexamere Struktur auf und besteht aus je zwei Molekülen des Glykoproteins 130 (gp130), des IL-6 α Rezeptors (IL-6R) und IL-6. Der Rezeptor von OSM hingegen ist ein Heterodimer und besteht aus gp130 und dem OSM Rezeptor (OSMR) oder aber aus gp130 und dem leukemia inhibitory factor (LIF) Rezeptor (LIFR). Die Zytokine der IL-6-Familie vermitteln die Induktion des Jak/STAT (Januskinase/signal transducer and activator of transcription), PI3K/Akt (Phosphoinositid-3-Kinasen/AKR thymoma oncogene homolog) und MAPK (mitogenaktivierte Proteinkinase) Signalwegs. Da eine unkontrollierte Aktivierung dieser Signalkaskaden jedoch zu chronisch entzündlichen Erkrankungen oder abnormen Zellwachstum führen kann, ist eine Regulation durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen essentiell. Neben der Rekrutierung inhibitorisch wirkender Proteine, wie den Mitgliedern der SOCS (suppressors of cytokine signaling) Familie und Tyrosinphosphatasen, gilt die Rezeptorinternalisierung als regulierender Mechanismus.
Der erste Teil der vorliegenden Dissertation geht der Fragestellung nach, wie die Expression des IL-6-Rezeptors während der Differenzierung und Maturierung dendritischer Zellen (DZ) reguliert ist und welche Relevanz die gp130-Internalisierung bei diesen Entwicklungsprozessen spielt.
DZ gehören zu den professionellen antigenpräsentieren Zellen (APZ) und gelten als Bindeglied zwischen der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Sie spielen insbesondere bei der Polarisation der T-Helferzellen (Th1, Th2, Th17, Treg) eine wichtige Rolle. DZ repräsentieren eine heterogene Zellpopulation, die auf Basis ihrer Entstehung, ihres Vorkommens und/oder ihrer Funktionen in verschiedene Subtypen unterteilt werden und sich u.a. durch die Expression bestimmter Oberflächenmarker unterscheiden lassen. Es ist bekannt, dass DZ sowohl gp130 als auch den IL-6R auf ihrer Oberfläche exprimieren, weshalb ihre Differenzierung und Maturierung durch IL-6 beeinflusst werden kann. Obwohl Studien der letzten Jahre bereits eindrucksvoll die Relevanz des IL-6-Signals für die DZ Entwicklung belegt haben, bleibt dessen Funktion für diese Prozesse bisher kontrovers diskutiert. Inwiefern eine veränderte Rezeptorexpression auf diesen Zellen Einfluss auf die biologische Wirkung von IL-6 nimmt, wurde bisher nicht untersucht und war daher Ziel der hier durchgeführten Experimente. Mit Hilfe GM-CSF-gereifter DZ aus murinem Knochenmark (KM-DZ) sowie steady state DZ aus peripheren lymphatischen Organen konnte gezeigt werden, dass die Expression von gp130 und IL-6R bereits während der DZ Differenzierung unterschiedlich reguliert ist. Konventionelle DZ (kDZ) aus Milz und Lymphknoten wiesen ein höheres Expressionsniveau für den IL-6-Rezeptor auf als plasmazytoide DZ (pDZ). Es wurde nachgewiesen, dass die gp130 Expression im Verlauf der DZ Differenzierung stetig zunimmt, während nahezu keine Veränderung für die Expression des IL-6R festzustellen war. In weiteren Experimenten konnte darüber hinaus belegt werden, dass die Reifung der DZ, induziert durch Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor-α (TNFα) oder Choleratoxin (Ctx), zu einer Cross-Regulation von gp130 führt. Diese konnte im Fall von TNFα und Ctx auf eine vorübergehende Internalisierung des Rezeptors in Folge der Aktivierung der Serin-/Threonin-Kinase MK2 (MAPK-aktivierte Proteinkinase 2) zurückgeführt werden. Untersuchungen von KM-DZ aus der gp130 knockin Mauslinie gp130LLAA, die sich durch eine Punktmutation des beschriebenen Endozytose-Motivs des Rezeptors auszeichnet, führten zu dem Schluss, dass LPS gp130 über einen bisher noch nicht beschriebenen Mechanismus reguliert. Dieser vermittelt eine frühe Clathrin-abhängige Internalisierung von gp130 und führt schließlich zu einer langfristigen Inhibierung der gp130 Expression. Die Regulation der IL-6 Rezeptorexpression ist insofern von Bedeutung als dass vermutet werden kann, dass das IL-6/STAT3-Signal für die Aufrechterhaltung eines unreifen DZ Phänotyps wichtig ist. Ferner kann vermutet werden, dass die Limitierung der Responsivität gegenüber LIF (und vermutlich auch OSM) für die Differenzierung von DZ wichtig ist, da die Expression des LIFR über die Dauer der KM-DZ Differenzierung stark herunterreguliert wurde. Eine Expression des OSMR auf DZ wurde hingegen nicht nachgewiesen und steht demzufolge im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Untersuchungen.
Im Rahmen dieses ersten Projekts wurde ebenfalls untersucht, wie sich die veränderte gp130 Endozytose auf die Homöostase myeloider und lymphoider Zellen auswirkt. Bei den hierfür analysierten gp130LLAA Mäusen wurde eine geringfügige Verminderung der Frequenz und absoluten Zellzahl von kDZ in der Milz sowie eine Zunahme der Frequenz und absoluten Zellzahl von pDZ und Makrophagen in den inguinalen Lymphknoten nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein Anstieg in der Frequenz und absoluten Zellzahl von T-Zellen, jedoch eine Abnahme der B-Zellen in der Milz beobachtet.
Im zweiten Teil der Dissertation sollte die OSM-vermittelte Induktion antiviraler Gene in primären humanen dermalen Fibroblasten (HDF) untersucht werden.
Typ I Interferone (IFN) gelten als zentrale Zytokine der antiviralen Immunantwort. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass eine Reihe proinflammatorischer Zytokine ebenso die antivirale Immunantwort beeinflussen können, indem sie u.a. die Expression der pattern recognition receptors (PRR) regulieren. PRR sind Teil des angeborenen Immunsystems und für die Erkennung von Pathogenen durch die Bindung an konservierte Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (PAMPs, Pathogen-associated molecular patterns) wichtig. Im zweiten Teilprojekt der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass OSM dazu in der Lage ist, die Induktion der im Zytoplasma lokalisierten PRR Retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) und Melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5) zu vermitteln. Mit Hilfe von RNA Interferenzstudien konnte nachgewiesen werden, dass die Expression dieser beiden RNA-Helikasen von der OSM-vermittelten STAT1 Aktivierung abhängig ist und über einen STAT3/SOCS3-abhängigen Mechanismus reguliert wird. Während die Blockade der STAT1 Expression zu einer Inhibierung der OSM-induzierten Expression der Helikasen führte, wurde durch den Verlust von STAT3 oder SOCS3 die Expression von RIG-I und MDA5, aufgrund einer stärkeren und länger anhaltenden STAT1-Phosphorylierung, signifikant erhöht. Zusätzlich konnte ein additiver Effekt zwischen der OSM- und IFNγ-vermittelten Helikasenexpression belegt werden. Dieses Resultat steht im Einklang mit vorhergehenden Veröffentlichungen, die einen Crosstalk zwischen OSM und Typ I IFN bei der antiviralen Abwehr gegen das Hepatitis C Virus beschreiben.
Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen.
Für eine gesunde kindliche Entwicklung ist besonders in der frühen Kindheit
guter Schlaf sehr wichtig. Gerade im Baby- und Kleinkindalter sind
Schlafschwierigkeiten jedoch ein häufiges Phänomen. Vor allem Ein- und
Durchschlafstörungen kommen vielfach vor, die nicht automatisch mit zunehmendem
Alter eines Kindes remittieren. Sie können persistieren und zum
Teil auch schwerwiegende Folgen für die kindliche Entwicklung haben. Nicht
nur Hyperaktivität, Reizbarkeit und Aggressivität treten bei Kindern mit
Schlafstörungen gehäuft auf, sondern auch Tagesmüdigkeit, Konzentrationsund
Gedächtnisstörungen sowie kognitive Beeinträchtigungen können die
Folge sein. Darüber hinaus können Depressionen, Angststörungen und
Übergewicht langfristige Folgen von Schlafstörungen sein. Auch wirken sich
die Schlafstörungen bei jungen Kindern negativ auf die Eltern aus. Daher
ist es wichtig, Schlafprobleme im frühen Kindesalter zu erkennen, ernst zu
nehmen und frühzeitig zu behandeln.
Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen. Es wurden das elterliche
Wissen über Schlaf im Kleinkindalter sowie eine Auswahl von Elternratgeberliteratur
für kindliche Schlafprobleme untersucht. Ferner wurde das
multimodale Elterntrainingsprogramm „Mini-KiSS“, ein Elterntraining für
Kinder bis vier Jahren mit Schlafstörungen (Schlarb_2014), hinsichtlich
seiner externen Validität betrachtet.
Da Eltern diejenigen sind, die als erste mit den Schlafproblemen ihres
Kindes konfrontiert sind, sollten sie kindliche Schlafstörungen als diese
erkennen und auch einschätzen können, um ggf. weiterführende Maßnahme
einzuleiten. Deshalb ist es wichtig, dass Eltern über den kindlichen Schlaf
informiert sind. Um dieses elterliche Wissen über Schlaf von jungen Kindern
zu erfassen, wurde ein Fragebogen entwickelt, in dem Anwendungs- und Faktenwissen über Schlaf im Baby- und Kleinkindalter erfragt wurden. Dieser
wurde einer Online-Stichprobe (N = 1291) vorgelegt. Insgesamt verfügten die
Eltern über ein gutes Wissen, sie beantworteten 65% der Fragen korrekt. Es
zeigte sich jedoch ein Unterschied zwischen dem Anwendungswissen, wo die
Eltern 72% korrekt beantworteten und dem Faktenwissen, wo die Eltern 61%
der gestellten Fragen korrekt beantworteten. Allerdings wurden auch Unsicherheiten
sowie Wissensdefizite deutlich, die noch genauer erfasst werden
und denen künftig mit unverbindlichen Informations- und Beratungsangeboten
begegnet werden sollte. Insbesondere bei den Interventionsmöglichkeiten
zum Umgang mit einer Schlafproblematik im Kleinkindalter wurde ein
Dissens deutlich, der sich auch in der nachfolgenden Analyse von Elternratgeberliteratur
für Schlafschwierigkeiten widerspiegelte. Es wurden
Literaturanalysen über Ratgeber für das Kindesalter einerseits und für das
Baby- und Kleinkindalter andererseits durchgeführt. Dabei konnte gezeigt
werden, dass die Autoren entweder eine Position zum lerntheoretischen
Ansatz der graduierten Extinktion bezogen und diese Methode empfohlen
oder das Co-Sleeping, also das gemeinsame Schlafen von Eltern und Kind
in einem Bett, favorisierten. Zudem wurde in der vorliegenden Arbeit das
multimodale Elterntraining Mini-KiSS bezüglich der externen Validität im
Langzeitverlauf erfolgreich überprüft. Das Elterntraining richtet sich an
Eltern von Kindern im Alter von sechs Monaten bis vier Jahren mit Schlafstörungen
und findet in Form von sechs aufeinanderfolgenden Elternabenden
statt. Durch das Training kam es zu signifikanten Verbesserungen des kindlichen
und mütterlichen Schlafes, diese bis zur Ein-Jahres-Katamnese stabil.
Auch weitere mit problematischem kindlichem Schlafverhalten assoziierte
Parameter, wie das allgemeine kindliche Problemverhalten sowie die elterliche
Gesamtbelastung, konnten nachhaltig reduziert werden. Im Rahmen
der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Intervention
sowohl auf das Kind als auch auf die Eltern positiv auswirkte, was auch
anhand von objektiven Verfahren bestätigt werden konnte. Zusammengefasst leistet diese Arbeit somit mit der Befragung einer großen Online-Stichprobe zu frühkindlichem Schlaf, der literaturanalytischen Betrachtung
ausgewählter Ratgeberliteratur sowie der erfolgreichen Prüfung
der externen Validität des Mini-KiSS-Trainings einen wichtigen und richtungsweisenden
Beitrag zur aktuellen Forschung im Bereich der nichtorganischen
Schlafstörungen im Kleinkindalter.
Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte.
In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern.
Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen.
Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden.
Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor.
Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar.
Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert.
Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden.
Das Schädel-Hirn-Trauma (SHT) entsteht durch äußere Gewalteinwirkung auf den Kopf und verursacht mechanisch eine Schädigung des Hirngewebes. Zusätzlich tragen sekundäre Pathomechanismen, wie Entzündungsprozesse und die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), dazu bei, dass sich das initial geschädigte Läsionsareal im Laufe der Zeit vergrößert. Vor allem bei jungen Erwachsenen ist das SHT eine der häufigsten Ursachen für bleibende Behinderungen und Todesfälle. Aufgrund der schweren Auswirkungen des SHT und der bislang fehlenden Therapieoptionen ist die Identifizierung neuer Zielstrukturen für eine kausale Therapie von größter Bedeutung. Ausgehend von tierexperimentellen Studien ist das Kallikrein-Kinin-System (KKS) ein besonders erfolgversprechender Angriffspunkt zur Behandlung des SHT. Die Aktivierung des KKS über den Gerinnungsfaktor XII (FXII) und die darauf folgende Bildung von Bradykinin sind mit dem Entstehen von Hirnödemen und Entzündungsreaktionen assoziiert. Vorangegangene Studien haben weiterhin die Frage aufgeworfen, ob und in welchem Maße thrombotische Prozesse einen Einfluss auf die Pathophysiologie und die sekundären Hirnschädigungen nach SHT haben. Da FXII sowohl das KKS als auch die intrinsische plasmatische Gerinnungskaskade initiiert und somit zur Fibrinbildung beiträgt, stand FXII im Mittelpunkt der Untersuchungen dieser Dissertation. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Fragen, (I) inwiefern FXII eine Rolle bei der sekundären Hirnschädigung nach Trauma spielt und (II) ob thrombotische Prozesse ein pathophysiologisches Merkmal nach Trauma darstellen. In zwei unterschiedlichen Trauma-Modellen wurden FXII-defiziente Tiere und mit einem spezifischen Inhibitor des aktivierten FXII (FXIIa) behandelte Tiere gegen Kontrolltiere nach SHT verglichen. Die Analyse der funktionellen Ausfallerscheinungen und des Ausmaßes an neuronaler Degeneration zeigte, dass FXII-Defizienz und FXIIa-Inhibition vor den Auswirkungen eines SHT schützen. Als zugrundeliegende Mechanismen wurden die Reduktion von thrombotisch verschlossenen Gefäßen in der Mikrovaskulatur des Gehirns sowie der Schutz vor BHS-Störungen und verringerte inflammatorische Prozesse identifiziert. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Blockade der intrinsischen Gerinnungskaskade über FXII keine intrazerebralen Blutungen auslöst. In Gewebeproben von Patienten mit SHT wurde gezeigt, dass Thrombozytenaggregate auch im klinischen Verlauf auftreten und sich somit die tierexperimentellen Befunde auf die humane Situation übertragen lassen. Insgesamt tragen die Ergebnisse dazu bei, die komplexen und vielfältigen Pathomechanismen nach SHT besser zu verstehen und vor allem die Relevanz thrombo-inflammatorischer Prozesse nach SHT aufzuzeigen. Die gezielte Blockade des FXII(a) könnte als therapeutisches Prinzip zur Abschwächung der Sekundärschaden nach SHT geeignet sein.
Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz.
Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen.
Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann.
Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden.
Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert.
HIV verursacht eine progressive Zerstörung des Immunsystems und führt zusätzlich durch Veränderungen im ZNS zu neurokognitiven Störungen (HIV-associated neurocognitive disorders, HAND). Die HIV-Infektion geht mit einer Dysfunktion von dopaminergen Signalwegen einher, die sich unter anderem in einer erhöhten Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor von Therapie-naiven HIV-Patienten äußert. Der Grund für die Dysregulation der dopaminergen Signalwege in HIV-Patienten ist nicht geklärt. Aufgrund dessen war das Hauptziel dieser Arbeit die Identifizierung des pathogenetischen Mechanismus, der zu einer erhöhten Dopamin-Konzentration im Liquor von HIV-Patienten führt. Die primäre Hypothese war, dass die erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nicht durch das Virus selbst, sondern vielmehr durch die genetische Konstitution der HIV-Patienten hervorgerufen wird. Deshalb wurden Polymorphismen untersucht, die die dopaminerge Neurotransmission beeinflussen. Es wurde vermutet, dass a) verschiedene Genotypen dieser Polymorphismen in nicht-infizierten und HIV-infizierten Personen mit anderen Häufigkeiten auftreten, b) verschiedene Genotypen mit veränderten Dopamin-Verfügbarkeiten assoziiert sind, c) unterschiedliche Genotypen Auswirkungen auf Marker der Progression der HIV-Infektion haben und d) verschiedene Genotypen die Immunaktivierung beeinflussen. Dazu wurden in 190 HIV-infizierten und nicht-infizierten Teilnehmern unterschiedlicher Ethnien die Polymorphismen BDNF Val66Met, COMT Val108/158Met, DAT 3‘-UTR VNTR, DRD2 TaqIα, DRD3 Ser9Gly und DRD4 VNRT mit PCR, ggf. Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese analysiert und die Expression des Dopamin-Transporters mit real time PCR bestimmt. Darüber hinaus wurden zur weiteren klinischen Charakterisierung die Immunmarker MCP-1, sCD14, suPAR und RANTES mit ELISA analysiert, da eine Erhöhung dieser Parameter mit einer beschleunigten HIV-Progression assoziiert ist. Die Bestimmung der T-Zell-Aktivierung (CD3/CD8/CD38/HLA-DR) wurde mit einer durchflusszytometrischen Analyse durchgeführt. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass HIV-Patienten hochsignifikant häufiger homozygot für das 10-repeat Allel des Dopamin-Transporter-Polymorphismus sind als nicht-infizierte Personen (57,1 % bzw. 26,8 %, p = 0,001, OR = 3,93, 95 % CI 1,72 – 8,96, direkte logistische Regression). HIV-Patienten und nicht-infizierte Personen mit diesem Genotyp weisen eine signifikant höhere Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor auf als Personen mit dem 9/10-Genotyp (p = 0,03) und eine signifikant geringere Expression des Dopamin-Transporters auf PBMCs (p = 0,05). Der DAT 10/10-Genotyp ist im Gegensatz zu anderen Genotypen in HIV-Patienten jedoch weder mit unterschiedlichen CD4+-Zellzahlen und Viruslasten noch mit einer veränderten Häufigkeit von HAND verbunden.
Zusätzlich weisen deutsche und südafrikanische nicht-infizierte und HIV-infizierte Personen mit dem DAT 10/10-Genotyp eine signifikant höhere MCP-1-Konzentration im Plasma auf als Personen mit anderen DAT-Genotypen (p = 0,0076). Keiner der Immunmarker ist mit der Dopamin-Verfügbarkeit assoziiert. Dennoch ist die Immunaktivierung in südafrikanischen HIV-Patienten im Vergleich zu nicht-infizierten Südafrikanern signifikant erhöht: HIV-Patienten zeigen im Vergleich zu nicht-infizierten Personen eine stärkere T-Zell-Aktivierung (p = 0,0001), eine erhöhte Plasma-Konzentration von MCP-1 (p = 0,0014), eine gesteigerte sCD14-Konzentration (p = 0,0004) und eine vermehrte suPAR-Konzentration im Plasma (p = 0,006). In der vorliegenden Arbeit konnte kein Nachweis erbracht werden, dass die erhöhte Immunaktivierung in den südafrikanischen HIV-Patienten durch die Koinfektion mit Echinoccocus oder durch genetische Polymorphismen bei Chemokinen hervorgerufen wird. Eine chronisch erhöhte Immunaktivierung stellt eine treibende Kraft für die Virusreplikation dar und kann letztendlich zu einer Erschöpfung des Immunsystems führen.
Der 10/10-Genotyp des DAT VNTR könnte einen Risiko-Faktor für die HIV-Infektion darstellen, da dieser eine erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nach sich zieht. Dopamin aktiviert HIV in chronisch infizierten T-Lymphoblasten und führt zudem zu einer erhöhten Expression und Sezernierung von TNF-α, das wiederum die Expression von HIV induziert. Diese Ergebnisse untermauern den Zusammenhang von Dopamin und HIV. Es ist jedoch nicht völlig geklärt, ob die erhöhte Dopamin-Konzentration ausschließlich durch den Genotyp hervorgerufen oder auch durch die HIV-Infektion begünstigt wird.
Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob der Stoffwechsel kolorektaler Karzi-nomzellen geeignete Targetstrukturen für mögliche therapeutische Ansätze aufweist. In Krebszellen induziert sowohl der Warburg-Effekt bei Normoxie als auch die anaerobe Glykolyse bei Hypoxie eine massive Bildung von Laktat. Wird die Krebszelle dauerhaft daran gehindert, die für die Glykolyse notwendi-gen Reduktionsäquivalente NADH+H+ mit Hilfe der Laktatdehydrogenase zu reoxidieren und/oder Laktat über die Transporter MCT1 und MCT4 nach außen zu schleusen, dann löst diese Kombination aus Mangelsituation und intrazellulärer Ansäuerung den apoptotischen Zelltod aus. Für die Situation in vivo ist entscheidend, dass auch Zellen von Normalgeweben zwar Laktat in Hypoxie bilden, dies jedoch keine vorherrschende physiologische Situation darstellt.
Die Hemmstoffe Natriumoxamat (NaOx) für die Laktatdehydrogenase und α-Cyano-4-Hydroxycinnamat (αCHC) für MCT1 und MCT4 wurden an den sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 und WiDr untersucht. Zusätzlich wurde der Glukoseverbrauch und die Laktatbildung bestimmt und die Funktion der Atmungskette überprüft. Die IC50-Werte für 5-FU, NaOx und αCHC wurden bestimmt und danach NaOx in einer Konzentration von 40x10-3 mol/L, αCHC in einer Konzentration von 2x10-3 mol/L und 5-FU in einer Konzentration von 5x10-6 mol/L eingesetzt. Die Zellen wurden bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % Sauerstoff für bis zu 120 Stunden inkubiert.
Die Funktion der Atmungskette in den Mitochondrien der kolorektalen Karzi-nomzellen wurde u. a. durch Bestimmung wichtiger Kenngrößen wie dem P:O Quotienten und des respiratorischen Kontrollindex (RKI) nachgewiesen. Fünf der sechs Karzinomzelllinien wiesen im Vergleich zur Kontrollzelllinie J774 einen verringerten P:O-Quotienten und respiratorischen Kontrollindex (RKI) auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Mitochondrien dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zwar verringert war, aber nicht vollständig aufgehoben. Dieses Ergebnis stützt die allgemein akzeptierte Auffassung, dass die meisten Tumore über funktionelle Mitochondrien verfügen.
Durch die Analyse des Glukosestoffwechsels wurden die sechs kolorektalen Zelllinien, die einen unterschiedlich stark ausgeprägten glykolytischen Phänotyp aufwiesen, nach der Stärke der Laktatbildung bei 5 % Sauerstoff in drei Kategorien eingeordnet. Zudem wurde für jede der sechs Zelllinien die Expression von LDH-A, LDH-B sowie MCT-1 und MCT-4 auf Proteinebene nachgewiesen.
Wesentliches Ziel der Untersuchungen war die Überprüfung des antiprolife-rativen Potentials der beiden Inhibitoren NaOx und αCHC einzeln oder in Kombination mit 5-FU bei den tumorspezifischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 %. Die Kombination aus NaOx und αCHC induzierte bei 1 % Sauerstoff nach 9 Tagen in Kultur zytotoxische Effekte und war damit so wirksam wie 5x10-6 mol/L 5-FU. Die Zugabe von 5-FU zur Kombination aus NaOx und αCHC führte zu keiner Steigerung des zelltoxischen Effektes. Die beiden Inhibitoren NaOx und αCHC waren für SW620 Zellen weniger wirksam als für Zellen der anderen fünf Zelllinien. Das mehr „oxidative“ Profil von SW620 Zellen (bester P:O-Quotient, geringste Laktatbildung bei 5 % und 1 % Sauerstoff; zudem die höchsten IC50-Werte für NaOx und αCHC) könnte erklären, warum die beiden Stoffwechselinhibitoren, die einen glykolytischen Phänotyp (starke Bildung von Laktat) erfordern, für SW620 Zellen von geringerer Wirksamkeit waren.
Für die Hemmstoffe NaOx und αCHC wurden zytostatische bzw. zytotoxische Effekte in kolorektalen Karzinomzellen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Krebszellen auf einen ungehinderten glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind. Für beide Hemmstoffe wurde ebenfalls gezeigt, dass sie auch bei tumorre-levanten Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % wirksam sind.
Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten
jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle
Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost.
Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und
Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch
die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden.
Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus
analysiert.
In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese
Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation
das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨
großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨
dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303-
positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet
werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen
unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs.
In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen
(moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil
und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im
Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu
keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden
sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht.
Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨
etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨
Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨
wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit.
In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT
immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression
von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT
beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur
Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154-
positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und
SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine
T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und
IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur
wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB
und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨
Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion
verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die
Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨
werden.
Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und
die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden.
Epidemiologische Studien schätzen die Inzidenz chronischer Obstipation auf bis zu 27% der Gesamtbevölkerung. Betroffenen Patienten ist die Stuhlentleerung nicht oder nur unter großer Anstrengung und nicht selten nur unter Zuhilfenahme der Hand möglich. Häufig sind funktionelle Pathologien, welche sich nur während der Defäkation ausbilden, hierfür verantwortlich. Daher ist für die Diagnose und Evaluation dieser Pathologien ein bildgebendes Verfahren notwendig, welches die dynamische Darstellung der Defäkation ermöglicht. Der Goldstandard zur Untersuchung von Patienten mit funktionellen Beckenbodenstörungen ist die Entero-Colpo-Cysto-Defäkographie (ECCD). Diese Durchleuchtungsmethode erfordert die Applikation ionisierender Strahlung im Bereich des Beckens. Außerdem müssen für die Untersuchung Rektum und Vagina mit bariumhaltigem Kontrastmittel, der Dünndarm mit barium- und iodhaltigem Kontrastmittel und zusätzlich die Blase mit iodhaltigem Kontrastmittel gefüllt werden. Bei der MR-Defäkographie hingegen ist keine ionisierende Strahlung notwendig und nur eine rektale Füllung mit Ultraschallgel als Kontrastmittel erforderlich. Zudem ermöglichen statische Aufnahmen aufgrund des hohen Weichteilkontrasts der MR-Bildgebung eine detaillierte Darstellung des gesamten Beckenbodens. Die MR-Bildgebung ist jedoch im Vergleich zu anderen Bildgebungsmodalitäten, wie beispielsweise der radiographischen Durchleuchtung, langsam. Besonders zur Darstellung dynamischer Prozesse ist daher eine starke Beschleunigung des Akquisitionsprozesses notwendig. Bei der Standard 2D MR-Defäkographie wird für die Beschleunigung der Datenakquisition eine regelmäßige zweifache Unterabtastung des k-Raums vorgenommen. Hierdurch lassen sich aber nur drei räumlich voneinander getrennte
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2D Schichten mit einer zeitlichen Aktualisierungsrate der drei Schichten von ca. 1s akquirieren. Dadurch ist aber besonders die Diagnose lateral lokalisierter Pathologien eingeschränkt oder gar nicht möglich. Daher wurde in dieser Arbeit eine 3D MR-Defäkographie zur dynamischen Darstellung der Defäkation innerhalb eines vollständigen 3D Volumens entwickelt, implementiert und anhand von 9 Patientenmessungen optimiert. Die letzten 4 Patienten wurden mit den optimierten Sequenzparametern untersucht. Ausgehend von der kartesischen Datenakquisition der bestehenden 2D MRDefäkographie wurden zunächst dreidimensionale kartesische Trajektorien zur Datenakquisition und dafür geeignete Algorithmen zur Datenrekonstruktion untersucht. In diesem Zusammenhang wurde ein GRAPPA Centric-Out Akquisitionsschema in Kombination mit einer GRAPPA Datenrekonstruktion vorgestellt. Es zeigte sich jedoch, dass eine Stack-of-Stars Trajektorie in Bezug auf die stabile, rauscharme, dynamische Darstellung der Defäkation, vorteilhaft gegenüber der untersuchten kartesischen GRAPPA Centric-Out Trajektorie ist. Zur weiteren Optimierung der Messsequenz wurden daher drei radiale Stackof-Stars Akquisitionsschemata untersucht: Das Standard Stack-of-Stars Schema sowie zwei mit View-Sharing und zwei unterschiedlichen Dichtegewichtungen modifizierte Stack-of-Stars Schemata (DW-Sampling 1 und DW-Sampling 2). Das View-Sharing ermöglicht durch die Umstellung der Reihenfolge der akquirierten Partitionen nahezu eine Verdopplung der rekonstruierten Zeitpunkte der dynamisch gemessenen Zeitserie. Die Dichtegewichtung bewirkt, dass in den zentralen Partitionen mehr radiale Speichen gemessen werden und damit das k-Raum Zentrum dichter abgetastet wird als in den äußeren Partitionen. Beim Dichtegewichtungsschema DW-Sampling 2 ist der Abfall der Anzahl der innerhalb einer Partition gemessenen Speichen stärker als beim DW-Sampling 1. Trotzdem führte das mit View-Sharing und DW-Sampling 2 modifizierte Stackof-Stars Akquisitionsschema in Verbindung mit der FISTA Compressed Sensing Datenrekonstruktion zum besten Kompromiss zwischen erreichbarer räumlicher
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und zeitlicher Auflösung. Dieses optimierte Setup ermöglicht die dynamische Darstellung der Defäkation in 7 Schichten eines vollständigen 3D Volumens mit einer Volumenaktualisierungsrate von 1,3s. Im Vergleich zur standardmäßig durchgeführten 2D MR-Defäkographie ist daher eine mehr als doppelt so große Abdeckung mit einer vergleichbaren zeitlichen Aktualisierungsrate und einer etwas geringeren räumlichen Auflösung gewährleistet. Hierdurch lassen sich zusätzlich zu den gewöhnlichen zentral gelegenen Pathologien auch lateral ausgeprägte Pathologien besser abdecken und diagnostizieren.
In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie.
Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis.
Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich.
Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden.
Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher:
1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern.
2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131.
3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen.
Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde.
Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms.
Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein.
Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen.
Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden.
In dieser Arbeit wurden Einzelmolekültechniken zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und G-Proteinen in der Zellmembran lebender Zellen etabliert und angewendet. GPCR stellen die größte Familie membrangebundener Rezeptoren dar und leiten Signale über heterotrimere G-Proteine in das Zellinnere weiter. Auch wenn jüngst sowohl inaktive, als auch aktive Konformationen von GPCR und G-Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse aufgelöst werden konnten, sind die Dynamiken ihrer Aktivierung und Deaktivierung bisher nur bruchstückhaft bekannt. In der Vergangenheit wurden die Schritte der Signalkaskade, beginnend mit der Bindung des Rezeptorliganden bis hin zur Bildung von sekundären Botenstoffen, erfolgreich mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken aufgeklärt. Diesen experimentell bestimmten Aktivierungszeiten stehen Daten aus Modellierungsstudien gegenüber, die sehr viel schnellere Konformationsänderungen vorhersagen, welche bereits in Studien mittels Kernspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Folglich ist anzunehmen, dass die Zeitdomäne, innerhalb der die Aktivierung der GPCR stattfindet, sehr breit gefächert ist.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese mehrere Größenordnungen umfassenden Zeitskalen der GPCR-Aktivierung, welche in der Literatur beschrieben werden, mittels bildgebender Einzelmolekülverfolgung (SPT) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Beide Verfahren liefern durch Einzelmolekülspuren oder Korrelationskurven eine Art Fingerabdruck des dynamischen Verhaltens des untersuchten Systems, was jeweils mit Vor- und Nachteilen verbunden ist. Die Stärke der Techniken zeigte sich bei dem vorliegenden Projekt vor allem in ihrer Kombination: Die klassische FCS bietet die Möglichkeit, Dynamiken über einen weiten Zeitraum von Mikrosekunden bis Sekunden auszuwerten, allerdings nur innerhalb eines kleinen, optisch definierten Detektionsvolumens. Die bildgebende Einzelmolekülverfolgung liefert hingegen ein großes Sichtfeld und ermöglicht somit die parallele Analyse vieler Einzelmolekülereignisse über die Zelle verteilt, jedoch auf Kosten der Zeitauflösung.
Durch die Anwendung von SPT und FCS konnte in dieser Arbeit ein Zeitbereich der Rezeptor- (und G-Protein-) Dynamiken von Mikrosekunden bis Sekunden gefunden und diskutiert werden. Um die selektive Anregung der Plasmamembran zu gewährleisten, wurde die Interne Totalreflexionsfluoreszenzanregung verwendet. Diese eignet sich ideal als Grundlage für die spätere Analyse mittels SPT und FCS, welche komplementär nutzbar sind und mit dem gleichen zellulären Assay und unter Verwendung der gleichen Fluoreszenzmarker betrieben werden können.
Die Studie am Beispiel der α2A- und β2-adrenergen Rezeptoren sowie des Gαi1-Proteins demonstrierte das enorme Potential dieser Einzelmolekültechniken für die Untersuchung von GPCR und skizziert die Komplexität deren Dynamik, wie sie auch durch neueste Modellierungsstudien vorhergesagt wird.
LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen
(2016)
Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden.
Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle.
Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert.
Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig.
Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate.
Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen.
Bei der Behandlung solider Tumoren spielen systemisch verabreichte Chemotherapeutika eine wich- tige Rolle. Allerdings akkumulieren diese Therapeutika besser in normalem Gewebe als in Tumoren. Als Ursache für diesen unzureichenden Transport von Medikamenten in den Tumor wurde bisher vor allem die dysfunktionale Tumorvaskulatur diskutiert. Diese befindet sich in einem chaotischen und unreifen Zustand ohne ausreichende Bedeckung der Gefäße mit stabilisierenden Perizyten. Aus dem Zustand der Vaskulatur resultierend erreichen Medikamente den Tumor nur in geringem Ausmaß und werden dort heterogen verteilt. Als Grund für den Zustand der Vaskulatur wur- de ein großer Überschuss an pro-angiogenetischen Faktoren im Tumor ausgemacht. Durch eine anti-angiogenetische Behandlung konnte in präklinischen Modellen für einen gewissen Zeitraum die Tumorvaskulatur „normalisiert“ werden. Dies zeichnete sich vor allem durch Veränderung von zwei wichtigen Parametern für die Medikamenteneinbringung aus: zum Einen kommt es zu einer Reduktion der Gefäßdichte. Zum Anderen zu einer Reifung der Blutgefäße. In einem Teil von Pati- enten scheint dabei der Effekt der Gefäßverbesserung zu überwiegen und es kann eine verbesserte Perfusion detektiert werden. Mutmaßlich führt dies auch zu einer verbesserten Einbringung von Therapeutika in den Tumor und so zu einer erhöhten Effizienz der Therapie. In einem weiteren Teil der Patienten scheint jedoch der Effekt der Gefäßreduktion zu überwiegen und die detektierte Perfusion im Tumor wird durch die Behandlung verringert.
Das in dieser Arbeit verwendete MT6-Fibrosarkom-Modell reagierte auf eine anti-angiogenetische Therapie nicht mit einer sonst in murinen Modellen beobachteten Wachstumsreduktion. Die- se ermöglichte eine so bisher nicht mögliche Untersuchung der sekundären Effekte einer anti- angiogenetischen Therapie wie die Medikamenteneinbringung in den Tumor. Die Vaskulatur in MT6-Tumoren zeigte dabei nach einer anti-angiogenetischen Vorbehandlung, die erwarteten Merk-male einer „normalisierten“ Vaskulatur wie eine Reduktion der Gefäßdichte bei gleichzeitiger Rei- fung der verbleibenden Gefäße. Dies führte jedoch nicht zu einer verbesserten Effizienz einer subsequenten Chemotherapie. Durch Vergleich mit einem weiteren Tumor-Modell, dem 4T1-Modell für ein metastasierendes Mammakarzinom, konnten signifikante Unterschiede im Gefäßbild beider Modelle ausgeschlossen werden. Durch mikroskopische Methoden konnte dabei beobachtet werden, dass die Diffusion von Medikamenten aus den Blutgefäßen des MT6-Modells im Vergleich zum 4T1-Modell verringert war. Weitere Untersuchungen deuten auf eine Differenz in der Qualität der extrazellulären Matrix der verwendeten Tumor-Modelle. Durch mRNA-Expressionsanalysen konnte die Enzymfamilie der Lysyloxidasen als mögliche Ursache für diesen Diffusionsunterschied identi- fiziert werden. Lysyloxidasen katalysieren vor allem die Quervernetzung von Proteinen der Extra- zellulärmatrix. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Quervernetzung von Matrixproteinen durch Lysyloxidasen ursächlich für die Diffusions-Inhibierung kleiner Moleküle wie das Chemo- therapeutikum Doxorubicin sein kann. Durch spezifische Inhibition der Lysyloxidasen mittels des Inhibitors βAPN konnte diese Diffusions-Inhibition sowohl in vitro als auch im MT6-Tumor-Modell nahezu vollständig verhindert werden. Die hohe Aktivität von Lysyloxidasen im MT6-Modell stell- te allerdings kein Alleinstellungsmerkmal dieses Modells dar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen in einer Vielzahl von murinen und humanen Tumorzelllinien überexprimiert wird. Die Inhibition von Lysyloxidasen durch βAPN konnte dabei in allen unter- suchten Modellen die Einbringung von Medikamenten in den Tumor erhöhen und könnte so eine sinnvolle adjuvante Maßnahme zur Verbesserung bestehender Chemotherapien darstellen.
Die bipolare Störung ist eine psychische Erkrankung, die sich durch wiederkehrende depressive und (hypo-) manische Phasen auszeichnet. Neben Stimmungsschwankungen leiden viele Patienten unter kognitiven Beeinträchtigungen, die nicht nur während akuter Episoden, sondern auch in der Remission, d.h. in euthymer Stimmungslage persistieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit den klinischen Korrelaten von kognitiven Defiziten und der Effektivität eines kognitiven Trainings bei bipolaren Patienten (BP). In der ersten Teilstudie wurde untersucht, wie sich die kognitive Leistung der Patienten von der akuten Phase bis zur Remission verändert. Dazu wurden 55 akut depressive und (hypo-) manische BP und 55 gesunde Kontrollpersonen wiederholt mit einer neuropsychologischen Testbatterie untersucht. 29 Patienten konnten nach mindestens 3-monatiger Remission erneut getestet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die akut kranken BP domänenübergreifend kognitive Störungen im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufweisen, wobei die depressiven Patienten eher in der Verarbeitungsgeschwindigkeit, der Aufmerksamkeit und dem Gedächtnis beeinträchtigt waren. Die akut manischen Patienten hatten hingegen auffällige Defizite in den exekutiven Funktionen. Die Performanz der BP besserte sich zwar in der Remission, es waren aber weiterhin im Vergleich zu den Kontrollen Defizite in der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnis und dem verbalen Gedächtnis festzustellen. Es zeigte sich außerdem, dass die Verarbeitungsgeschwindigkeit, die Aufmerksamkeit und das verbale Gedächtnis in Zusammenhang mit subdepressiven Symptomen und Schlafstörungen standen, wohingegen die exekutiven Testmaße nicht mit diesen „State“-Faktoren assoziiert waren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die exekutiven Funktionen als Trait-Merkmale der bipolaren Störung in Frage kommen, wohingegen Aufmerksamkeit und Gedächtnis durch das Vorliegen von Residualsymptomen beeinträchtigt sind.
Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine kognitive Defizit- vs. Nondefizit Subgruppe innerhalb der BP zu identifizieren, um herauszufinden welche soziodemographischen oder krankheitsrelevanten Charakteristika mit kognitiven Störungen in Zusammenhang stehen. Dazu wurde die neuropsychologische Testleistung von 79 euthymen BP und 70 gesunden Kontrollen verglichen. Es zeigte sich erwartungsgemäß, dass die BP in der psychomotorischen Geschwindigkeit, der Aufmerksamkeit, dem Arbeitsgedächtnis, dem verbalen Gedächtnis, der Wortflüssigkeit und dem problemlösenden Denken trotz stabiler Remission signifikant schlechtere Leistungen erbrachten als die gesunden Kontrollen. Im Anschluss wurde die bipolare Stichprobe anhand ihrer Testleistung in eine Defizit- und eine Nondefizit Gruppe aufgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass 54% der BP in allen Tests eine völlig normgerechte Leistung erbrachten. Die Studie bestätigte demnach, dass nicht alle Patienten kognitive Defizite aufweisen, sondern Subgruppen bestehen, die sich in verschiedenen Variablen voneinander unterscheiden: Die Defizit-Subgruppe berichtete signifikant mehr subdepressive Symptome und es lagen häufiger persistierenden Schlafstörungen und die Diagnose einer komorbiden Erkrankung vor (Angststörung, ADHS und Migräne). Zudem zeigte sich ein Zusammenhang zwischen Polypharmazie und kognitiven Defiziten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ein Teil der kognitiven Störungen bei BP durch eine nicht vollständige Remission und sekundäre Symptome bedingt sind. Es ergab sich keine Assoziation zwischen kognitiver Leistung und krankheitsrelevanten Variablen, wie z.B. Anzahl der Phasen, Bipolar-Subtyp oder Ersterkrankungsalter. Diese Daten widersprechen zwar nicht der Hypothese, dass kognitive Störungen durch neurodegenerative Prozesse bedingt sind, sie weisen jedoch darauf hin, dass bei der bipolaren Störung häufig Residualsymptome vorliegen, welche im Rahmen von Studie als auch bei der therapeutischen Arbeit stärker als bisher berücksichtigt werden müssen.
In beiden Teilstudien zeigte sich zudem, dass kognitive Störungen mit einem reduzierten psychosozialen Funktionsniveaus in Verbindung stehen. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit bisherigen Untersuchungen, die berichten, dass Patienten mit kognitiven Defiziten soziale und berufliche Einschränkungen aufweisen, die wiederum mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert ist. Aufgrund dessen wurde von einigen Autoren vorgeschlagen, mit Hilfe spezieller Interventionen wie der kognitiven Remediation (KR) die geistigen Funktionen zu rehabilitieren. In der vorliegenden Interventionsstudie wurde deshalb der Frage nachgegangen, ob die neurokognitive Leistungsfähigkeit und das psychosoziale Funktionsniveau der bipolaren Stichprobe durch KR verbessert werden kann. Zudem sollte untersucht werden, inwiefern kognitives Training zu Veränderungen der präfrontalen Hirnaktivität führt. Dafür wurde vor und nach dem Training eine Messung mit der Methode der funktionellen Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) durchgeführt. Das 3-monatige KR-Programm bestand aus einem computerisierten kognitiven Training und der Vermittlung von kognitiven Skills im Rahmen von 12-wöchentlichen Gruppensitzungen. Im Anschluss an das Training wurden die Teilnehmer (26 bipolare und als Vergleichsgruppe 13 unipolare Patienten) im Rahmen einer Post-Messung wiederholt untersucht. Zudem wurde zum Vergleich eine Kontrollgruppe von 10 BP im Abstand von 3 Monaten untersucht, die keine Intervention, sondern die Standardbehandlung erhielt. Aufgrund zahlreicher Drop-Outs konnten am Ende des Erhebungszeitraums die Daten von 16 bipolaren und 10 unipolar depressiven Patienten ausgewertet werden. Die Trainingsteilnehmer erbrachten im Gegensatz zu der Kontrollgruppe signifikante Leistungssteigerungen in den Tests zur Erfassung der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnisses, dem verbalen Gedächtnis und dem problemlösenden Denken. Zudem zeigte sich nach dem Training eine Verbesserung des psychosozialen Funktionsniveaus und eine Reduktion der subdepressiven Symptomatik. Eine Veränderung der präfrontalen Hirnaktivierung konnte jedoch nicht verifiziert werden. Die Ergebnisse lassen demnach schlussfolgern, dass Patienten mit affektiven Störungen von einem kognitiven Training profitieren, wobei die damit einhergehenden funktionalen Veränderungen der Hirnaktivität in Studien mit größeren Stichproben untersucht werden müssen.
Das Cochlea-Implantat (CI) ermöglichte bereits >300 000 hochgradig hörgeschädigten Menschen
weltweit eine grundsätzlich wiederhergestellte Hörfunktion. Es wird angenommen, dass sich das
Sprachverständnis von CI-Trägern verbessert, wenn die funktionale Trennung der CI-Kanäle erhöht
wird. Neben verschiedenen auf die auditorische Peripherie beschränkten Ansätzen gibt es Überlegungen, eine verbesserte Kanaltrennung durch die Rehabilitation taubheitsinduzierter Degenerationen in der spektralen Verarbeitung im zentralen auditorischen System zu erreichen. Es konnte in ertaubten Tieren bislang allerdings kein adäquates CI-Stimulationsmuster beschrieben werden, dass es erlaubte, eine gezielte neuronale Plastizität in der spektralen Verarbeitung zu induzieren.
Die Arbeitsgruppe um M.P. Kilgard (UT Dallas, USA) zeigte in mehreren Studien in hörenden Tieren,
dass auditorische Stimulation gepaart mit elektrischer Vagusnerv-Stimulation (VNS) zu einer gezielten kortikalen Plastizität führt. Diese gepaarte Stimulation konnte die spektrale Verarbeitung von Signalen im auditorischen Kortex (AC) gezielt beeinflussen und so z.B. pathologisch verbreiterte Repräsentationen von Tönen wieder verfeinern. Dieses hochgradige Potential für gezielte Plastizität im AC durch die gepaarte VNS scheint eine vielversprechende Lösung darzustellen, um die durch verbreiterte Repräsentation im ertaubten AC verminderte CI-Kanaltrennung zu verbessern. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Promotion die Übertragbarkeit dieses hochgradigen Potentials auf das ertaubte und CI-stimulierte auditorische System evaluiert werden.
Um die CI-Kanaltrennung zu untersuchen, wurde ein Multikanal-CI für die Mongolische Wüstenrennmaus (Gerbil) entwickelt. Trotz der kleinen Ausmaße von Cochlea und AC im Gerbil und der generell breiten neuronalen Erregung durch intracochleäre elektrische Stimulation konnte eine tonotop organisierte und selektive Repräsentation der neuronalen Antworten für mehrere CI-Kanäle im AC nachgewiesen werden. Für die gepaarte CI/VN-Stimulation wurden die Tiere zusätzlich mit einer Manschettenelektrode um den linken zervikalen Nervus vagus (VN) implantiert. Die chronischen Implantate erlaubten über mehrere Wochen hinweg eine stabile und zuverlässige elektrische Stimulation im frei-beweglichen Gerbil. Damit kombiniert das in dieser Promotion entwickelte Multikanal-CI-VNS-Modell die Vorteile einer tonotop selektiven und stabilen neuronalen Aktivierung mit den ethischen, kostenrelevanten und entwicklungsbezogenen Vorteilen, die der Einsatz von Kleinnagern bietet.
Als nächster Schritt wurde das grundsätzliche Potential der gepaarten CI/VN-Stimulation für gezielte plastische Veränderungen im AC des Gerbils getestet. Engineer et al. (2011) hatten bereits in akustischen Studien in hörenden Ratten die kortikale Überrepräsentation eines einzelnen chronisch mit VNS gepaarten Tones gezeigt. In der vorliegenden Promotion wurde versucht, die Ergebnisse aus der akustischen Studie in hörenden Ratten in zwei verschiedenen Studien im Gerbil zu reproduzieren. Analog zur gepaarten Ton/VN-Stimulation in der Ratte untersuchten wir zuerst in ertaubten Gerbils die Auswirkungen einkanaliger CI-Stimulation gepaart mit VNS. Im AC des Gerbils konnten keine Veränderung der zentralen Repräsentation des VNS gepaarten CI-Kanals festgestellt werden. Um speziesspezifische (Ratte vs. Gerbil) und stimulusspezifische (akustisch vs. elektrisch) Unterschiede zwischen den Studien als mögliche Gründe für das Ausbleiben der VNS induzierten Plastizität auszuschließen, wurde nun die gepaarte Ton/VN-Stimulation (Engineer et al., 2011) im hörenden Gerbil wiederholt. Eine kortikale Überrepräsentation des VNS gepaarten Signals konnte aber auch im hörenden Gerbil nicht reproduziert werden.
Mögliche Gründe für die Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen im Gerbil und den publizierten
Ergebnissen in der Ratte werden diskutiert. Die generelle Funktionsfähigkeit der VNS in den chronisch stimulierten Tieren wurde durch die Ableitung VNS evozierter Potentiale (VNEP) kontrolliert. Ein speziesspezifischer Unterschied erscheint bei der biologischen Nähe von Ratte und mongolischer Wüstenrennmaus unwahrscheinlich, kann allerdings durch die vorliegenden Studien nicht vollständig ausgeschlossen werden. Eine Abhängigkeit des plastischen Potentials der gepaarten VNS von der Stimulationsintensität ist bekannt. Da Ratten und Gerbils ähnliche VNEP-Schwellen zeigten und mit identischen VNS-Amplituden stimuliert wurden, gehen wir davon aus, dass Unterschiede im plastischen Potential gepaarter VNS zwischen beiden Spezies nicht auf die verwendete Stimulationsintensität zurückzuführen sind.
Die beschriebene Diskrepanz im Potential für kortikale Plastizität durch gepaarte VNS weckt Zweifel an der Übertragbarkeit des für die Ratte publizierten Potentials auf andere Spezies, einschließlich des Menschen.
Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen.
In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung.
In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen.
Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle.
Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden.
Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen.
Untersuchung der Rolle von Rhodopsin 7 und Cryptochrom im Sehprozess von Drosophila melanogaster
(2015)
Ausgangspunkt für die Detektion von Licht ist im gesamten Tierreich die Absorption von Photonen durch photorezeptive Proteine, die sogenannten Opsine und in geringerem Ausmaß die Typ 1 Cryptochrome. Die Taufliege Drosophila melanogaster besitzt sechs eingehend charakterisierte, auch als Rhodopsine bezeichnete Opsine (Rh1-Rh6) und ein Cryptochrom (CRY). Neben den Ocellen und den Hofbauer-Buchner Äuglein werden die Rhodopsine in erster Linie in den Photorezeptorzellen der Komplexaugen, den Hauptorganen der Lichtperzeption exprimiert, wo sie der Vermittlung der visuellen Wahrnehmung dienen. Basierend auf Sequenzvergleichen wurde im Jahr 2000 ein neues Protein namens Rh7 zur Gruppe der Drosophila Opsine hinzugefügt. Bis heute fehlt allerdings jeglicher experimentelle Beleg für die photorezeptive Funktion dieses Proteins.
Im Gegensatz dazu wird Cryptochrom in erster Linie in einigen Uhrneuronen des Drosophila Gehirns exprimiert, wo es diesen Neuronen die Fähigkeit zur Lichtdetektion verleiht und das Photoentrainment der inneren Uhr lenkt. Neueren Untersuchungen zu folge spielt CRY allerdings auch bei der visuellen Wahrnehmung der Augen eine Rolle.
Die vorliegende Arbeit zielte nun darauf ab die potentielle Funktion von Rh7 als neuen Photorezeptor in Drosophila sowie die Rolle von CRY bei der visuellen Lichtperzeption zu untersuchen.
Die Aufnahmen der Elektroretinogramme (ERGs) von transgenen Fliegen, die Rh7 anstelle von oder zusammen mit dem dominanten Photorezeptor Rh1 in den Komplexaugen exprimieren, zeigen, dass Rh7 die Phototransduktionskaskade bei Belichtung mit Weißlicht nicht aktivieren kann. Die Abwesenheit von Rh7 sorgt allerdings trotzdem für eine Beeinträchtigung der lichtinduzierten Antwort der Rezeptorzellen im Komplexauge. So zeigen die Intensitäts-Response Kurven der ERG Rezeptorpotentialamplitude von rh7 Knockout-Fliegen unter Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität nach einer anfänglichen Dunkeladaptation von 15min eine insgesamt, im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Rezeptorpotentialamplitude. Der Verlauf dieser Kurven deutet außerdem darauf hin, dass die Zunahme der Rezeptorpotentialamplitude mit steigender Lichtintensität größer wird. Zudem
zeigt das Aktionsspektrum für die Rezeptorpotentialamplitude der rh7 Knockout-Fliegen, dass diese Empfindlichkeitszunahme im gesamten Bereich von 370-648nm auftritt. Diese Beeinträchtigung scheint jedoch zu fehlen, wenn die Fliegen vor Experimentbeginn nur 1min dunkeladaptiert wurden, oder wenn intensives Blaulicht zur Belichtung verwendet wird. Des weiteren ist auch das 4s nach Ende des Lichtpulses im ERG gemessene Nachpotential bei fehlendem Rh7 reduziert.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rh7, wenn auch nicht als Photorezeptor, bei Belichtung mit Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität die Lichtantwort in den Rezeptorzellen des Komplexauges in Abhängigkeit von Intensität und Adaptationszustand beeinflusst und dass dieser Einfluss scheinbar nicht durch Licht eines eng begrenzten Wellenlängenbereichs induziert wird. Des weiteren legt die Untersuchung des ERG Nachpotentials nahe, dass Rh7 möglicherweise für eine normale Beendigung der Lichtantwort benötigt wird. Die allgemeine Funktion von Rh7 als Photorezeptor in Drosophila sowie die Eigenschaften der endogenen Funktion von Rh7 werden diskutiert.
Unabhängig davon wird in der vorliegenden Arbeit auch gezeigt, dass Fliegen ohne CRY zwar nach 15-minütiger, nicht jedoch nach 1-minütiger Dunkeladaptation bei Belichtung mit Weißlicht niedriger Intensität eine insgesamt geringere ERG Rezeptorpotentialamplitude aufweisen. Dies könnte auf eine Beeinträchtigung der Dunkeladaptationsprozesse bei Abwesenheit von CRY hindeuten.
Die akute lymphatische Leukämie ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Trotz systematischer Erhebung und Auswertung von Daten im Rahmen der ALL-BFM-Studiengruppe und der damit verbundenen kontinuierlichen Verbesserung der Prognose hat man noch immer keine Ursache für eine ALL gefunden. Daher nimmt eine umfangreiche Risikostratifizierung eine zentrale Rolle in der Behandlungsplanung einer ALL ein. Basierend auf einer exakten Stratifizierung kann die Therapie risikoadaptiert und individualisiert werden, um eine Übertherapie zu vermeiden und letztlich die Heilungschancen zu verbessern.
Pro- und antiinflammatorische Zytokine kommt in den komplexen Wirkungsmechanismen des Immunsystems eine Schlüsselrolle zu. Viele Infektions-, Auto-immun- oder Tumorerkrankungen werden durch das Produktionsprofil der Zyto-kine beeinflusst. Da genetisch determinierte Zytokingenpolymorphismen Krank-heitsverläufe beeinflussen und verändern, wurde untersucht, ob Zytokine einen Einfluss auf pädiatrische Patienten mit einer ALL haben.
Im Zuge dieser Arbeit wurden 95 pädiatrische Patienten mit ALL auf Polymorphismen der Zytokine TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 und IFN-γ analysiert, die im Zeitraum vom 21.06.2004 bis zum 30.04.2014 an der Kinderklinik des Universitätsklinikums Würzburg behandelt wurden. Mittels DNA-Extraktion, sequenz-spezifischer PCR und Gelelektropherese wurden 35 Proben bei Erstdiagnose und 93 zum Zeitpunkt der Remission mit folgender zentralen Fragestellung untersucht:
Gibt es genetische Risikofaktoren, die Einfluss auf
• die Risikogruppe
• die Art der Leukämie
• die Genfrequenz
• die Rezidivrate und
• das Gesamtüberleben
einer akuten lymphatische Leukämie im Kindesalter haben und sich zudem durch Einzelnukleotidpolymorphismen in pro- und antiinflammatorischen Zytokinen auszeichnen?
Im Rahmen dieser Studie konnte festgestellt werden, dass das immunsuppressive Zytokin IL-10 einen Einfluss auf die Genfrequenz, die Risikogruppe, die Rezidivrate sowie die Prognose bei Kindern mit ALL hat. Patienten mit niedrigen Zytokinexpressionsraten (Genotypen ACC/ACC und ACC/ATA) wurden häufiger in der Hochrisikogruppe therapiert, hatten mehr Rezidive und eine schlechtere Prognose als Patienten mit hohen Zytokinexpressionsraten. Dar-über hinaus ist der Genotyp GCC/ACC signifikant häufiger bei ALL-Patienten anzutreffen als im gesunden Kollektiv. Beim immunsuppressiven IL-6 konnte festgestellt werden, dass der Genotyp C/C signifikant häufiger bei Patienten mit einer ALL auftritt als bei gesunden Patienten. Ferner zeigte sich, dass es so-wohl für IL-6 als auch für TNF-α eine Änderung des Genotyps zwischen Erstdiagnose und in Remission auftrat, die Hinweise auf einen blastenspezifischen „immune-escape“-Mechanismus geben. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass das immunmodulatorische Zytokin TGF-β1 einen Einfluss auf die Risikogruppe sowie die Rezidivrate hat. Patienten, die eine T/T Kombination am Codon 10 aufwiesen wurden häufiger im Hochrisikozweig therapiert als Patienten mit den Genotypen T/C oder C/C. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Patienten mit einem C/C an Codon 25 häufiger an Rezidiven erkrankten als Patienten mit ei-nem G/C oder G/G. Für die TH1 Zytokine IFN-γ sowie TNF-α wurde kein Zusammenhang zwischen der Genfrequenz, der Risikogruppe, der Art der Leukämie, der Rezidivrate oder dem Gesamtüberleben gefunden.
Auch wenn man bisher noch nicht genau weiß, wie Zytokingenpolymorphismen Einfluss auf pädiatrische ALL nehmen, wird anhand dieser Arbeit gezeigt, dass Zytokine einen Beitrag zur Pathogenese der ALL leisten und daher zukünftig für eine umfassendere Risikostratifizierung geeignet sind. Darüber hinaus können diese Ergebnisse dazu beitragen, dass Zytokine als biologische Marker etabliert werden, um eine weniger toxische immunmodulierende bzw. -suppressive Therapie zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass eine Therapie anhand des Risikoprofils individuell und prognoseverbessernd abgestimmt werden kann. Je-doch wäre für eine nachfolgende Untersuchung eine größere multizentrische Stichprobe sowie eine prospektive Evaluation der Daten erstrebenswert. Gera-de bei hereditären Erkrankungen haben einzelne Gene nur einen geringen Einfluss auf das Gesamtrisiko, sodass größere Fallzahlen erforderlich wären, um auch schwache Effekte zu detektieren.
Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden.
Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2.
Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt.
In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden.
Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe.
Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei.
Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR.
Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht.
Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten.
Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen.
Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann.
Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen.
Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert.
In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten.
Das humane Genom besteht zu ungefähr 8 % aus humanen endogenen Retroviren (HERVs),
jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem
wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen
und für funktionelle Hüll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2
kodieren. Diese HERV-Hüllproteine beinhalten eine suppressive Domäne (SU) und
induzieren möglicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen während einer
gesunden Schwangerschaft.
In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVHüllproteine
(Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht.
Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der
Oberfläche von T-Zellen und DCs exprimiert werden. Für funktionelle Experimente wurden
HERV-Hüllproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur-
Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten
T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Darüber hinaus
beeinträchtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach
LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-
12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-Hüllprotein-exprimierenden
Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell-
Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss
auf die phänotypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr
effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen
Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound
JEG-Zellen, aber auch HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen verändern die
durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten
Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der
Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin-
Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse,
der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden.
Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-Hüllproteine die T-Zell-
Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch
mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren.
E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt.
Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen.
Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert.
Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt.
Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen.
In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt.
Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können.
Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation könnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschränktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2’ und P2 auf die Aminosäurereste Valin und Valin/Asparagin beschränkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschränkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollständige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivität-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollständige cDNA bilden können. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann.
Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilität der wenigen Env-Trimere auf der Hüllmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molekül als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschränkten Env-Mobilität, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird.
Da für die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleinsäure benötigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Domänen für die Aktivierung der Protease benötigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivität resultierte, war die funktionelle RNaseH-Domäne essenziell für die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Domänen von anderen Retroviren resultierte in genomunabhängiger Proteaseaktivität in Zellen und genomabhängiger Proteaseaktivität in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden.
Desmogleine (Dsg1-4) sind transmembranäre Adhäsionsproteine aus der Gruppe der desmosomalen Cadherine, die Zell-Zell-Kontakte zwischen benachbarten Keratinozyten der Epidermis in und außerhalb von Desmosomen vermitteln. Eine durch Autoantikörper induzierte Störung dieser Haftstrukturen (hauptsächlich Dsg1 und Dsg3) resultiert im klinischen Bild der Pemphigus-Erkrankung. Dieses ist makroskopisch durch eine Blasenbildung der Haut gekennzeichnet. Auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene lassen sich im Falle von Pemphigus vulgaris (PV) eine Retraktion des Zytoskeletts, eine Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge und eine Aktivierung verschiedener Signalwege u.a. der p38MAPK nachweisen. PV eignet sich daher als Modellerkrankung zur Untersuchung der Bedeutung desmosomaler Cadherine für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten. Durch zahlreiche Studien wurde die wichtige Funktion von Dsg3 als Adhäsionsprotein bestätigt und eine Beteiligung an der Modulation zahlreicher Signalwege, die in Zusammenhang mit der Pemphigus-Pathogenese stehen, untersucht. Im Gegensatz dazu konnte bisher keine spezifische Funktion des desmosomalen Cadherins Dsg2 in der Epidermis identifiziert werden. Dsg2 kommt als einziges Desmoglein in allen Geweben vor, die Desmosomen enthalten, und ist auch an den Zell-Zell-Kontakten im Myokard und Darmepithel vorhanden, wo kein Dsg1 und Dsg3 exprimiert werden. Hier nimmt Dsg2 eine wichtige Rolle als Adhäsionsmolekül und als Regulator interzellulärer Prozesse ein.
In dieser Arbeit wurde daher vergleichend die Bedeutung von Dsg2 und Dsg3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten im Hinblick auf ihre Funktion als Adhäsionsmolekül und als Rezeptormolekül, speziell im p38MAPK-Signalweg, untersucht. Wesentliche Unterschiede zeigten sich zunächst in der Lokalisation beider Proteine. Während sich die in der Literatur beschriebene Lokalisation von Dsg3 im Stratum basale und spinosum der Epidermis bestätigte, konnte Dsg2 nur am Haarfollikel nachgewiesen werden. In differenzierten HaCaT-Zellen, einer Keratinozyten-Zelllinie war Dsg2 eher punktförmig und Dsg3 nahezu linear an der Zellmembran lokalisiert. Dementsprechend ließ sich Dsg2 nach Triton-vermittelter Zellfraktionierung in ähnlicher Verteilung zwischen der Zytoskelett-gebunden und -ungebundenen Fraktion nachweisen wie Desmoplakin, das an der Zellemembran ausschließlich in Desmosomen vorkommt. Durch Dsg-spezifische Antikörper, deren inhibitorische Eigenschaft in zellfreien AFM-Studien nachgewiesen wurde, konnte nur eine Inhibierung der Dsg3- und nicht der Dsg2-vermittelten Adhäsion in HaCaT-Zellen erzielt werden. Im Gegensatz dazu induzierte derselbe Dsg2-spezifische Antikörper einen signifikanten Haftungsverlust in einer Darmepithelzelllinie. Die mittels siRNA induzierte Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge führte jedoch nur unter erhöhter mechanischer Belastung der Zellen zu einem Adhäsionsverlust. Die simultane Modulation der Funktion von Dsg2 und Dsg3 mittels siRNA bzw. der Inkubation Dsg2-depletierter Zellen mit AK23, einem inhibitorischen Dsg3-spezifischen Antikörper, resultierte in einem drastischen, teilweise p38MAPK-abhängigen, Adhäsionsverlust. Dieser Befund lieferte erste Hinweise auf eine kompensatorische Funktion von Dsg2 bei eingeschränkter Dsg3-vermittelter Haftung in Keratinozyten. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Verteilung von Dsg2 an der Zellemembran Dsg3-depletierter HaCaT-Zellen untersucht. Der Verlust von Dsg3 resultierte hierbei in einer Zunahme und Linearisierung der Dsg2-Membranfärbung, was die Hypothese einer kompensatorischen Funktion im Falle einer Beeinträchtigung der Dsg3-Funktion bekräftigt. Um die Funktion von Dsg2 unter dieser Bedingung gezielter zu untersuchen, wurde das transgene Dsg3-Mausmodell eingesetzt und primäre Keratinozyten aus neonatalen Dsg3-defizienten und nicht-Dsg3-defizienten Geschwistertieren isoliert. Entsprechend der vorhergehenden Befunde zeigten die Dsg3-defizienten Zellen eine deutliche Zunahme der Dsg2-Membranlokalisation sowie zusätzlich eine erhöhte DSG2-mRNA-Expression, allerdings bei unveränderten Dsg2-Proteinmengen.
Weiterhin wurde die Funktion von Dsg2 und Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher untersucht. Der für Dsg3 identifizierte Komplex mit der phosphorylierten Form der p38MAPK (p-p38MAPK) konnte für Dsg2 nicht nachgewiesen werden. Ebenso führte eine Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge, im Gegensatz zur Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge, nicht zur Aktivierung der p38MAPK und einer Retraktion des Zytoskeletts. Der direkte Zusammenhang zwischen einem Dsg3-Funktionsverlust und der p38MAPK-Aktivität ließ sich dadurch bestätigen, dass sowohl die Keratinretraktion als auch der Haftungsverlust nach Dsg3-Depletion durch den Einsatz eines p38MAPK-spezifischen Inhibitors partiell inhibierbar waren. Auch in primären Keratinozyten mit vollständiger Dsg3-Defizienz verbesserte eine p38MAPK-Inhibierung die Zelladhäsion. Ebenso wurde in Dsg3-defizienten Zellen im Vergleich zu Zellen mit endogener Dsg3-Expression eine deutliche Lokalisation der p-p38MAPK an der Zellmembran nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass möglicherweise in Abwesenheit von Dsg3 andere Membranproteine an der Regulation dieses Signalweges beteiligt sind. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine bisher nicht beschriebene Funktion von Dsg2 als Kompensationspartner für Dsg3 in Keratinozyten identifiziert und die Rolle von Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher charakterisiert.
Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar.
Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative.
In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ).
Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten.
Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar.
Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten.
Phospholamban (PLN) reguliert in der Herzmuskelzelle die Aktivität der Kalzium-ATPase SERCA2a und damit maßgeblich die Kinetik des myozytären Kalzium-Kreislaufs. PLN liegt im Herz in Form von Monomeren und Pentameren vor, wobei angenommen wird, dass nur die Monomere die Aktivität der SERCA2a durch direkte Interaktion hemmen. Die Funktion der Pentamere ist noch immer unklar. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob PLN-Pentamere für die PKA-abhängige Phosphorylierung des PLN und damit für die Regulation der PLN-Aktivität von Bedeutung sein können.
Mit Hilfe transfizierter HEK293AD-Zellen und verschiedener PLN-Mutanten wurde gezeigt, dass sowohl PLN-Monomere als auch -Pentamere durch die PKA phosphoryliert werden, wobei die Phosphorylierung der Monomere in Anwesenheit von Pentameren geringer ist und verzögert abläuft. Ohne Pentamer war die Phosphorylierung der Monomere dagegen bereits basal und nach moderater PKA-Stimulation stärker. Ursache dafür schien eine höhere Affinität der PKA für PLN-Pentamere als für Monomere zu sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass nicht nur PLN-Monomere sondern auch das PLN-Pentamer mit der SERCA2a interagieren und das Oligomer im Gegensatz zum PLN-Monomer nach PLN-Phosphorylierung zu einem kleinen Anteil an die SERCA2a gebunden bleibt. Auch spiegelten sich die unterschiedlichen Phosphorylierungsmuster von PLN-Pentamer und Monomer in den SERCA2a-Aktivitäten wieder. Messungen der SERCA2a-Aktivität in Mäuseherzen mit (Wildtyp und TgPLN) und ohne (TgAFA-PLN) PLN-Pentamere zeigten, dass Wildtyp-PLN und TgPLN die SERCA2a stärker inhibieren als TgAFA-PLN, was auf die stärkere basale Phosphorylierung des TgAFA-PLN zurückzuführen war. Nach PKA-Stimulation war der Anstieg der Enzymaktivität in Anwesenheit von TgPLN fast dreimal höher als in TgAFA-PLN. Analog zeigte TgPLN eine deutlichere Steigerung der Phosphorylierung der PLN-Monomere als TgAFA-PLN.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PLN-Pentamere durch Hemmung der Monomer-Phosphorylierung deren Aktivität erhöhen mit der Folge einer verstärkten Inhibition der SERCA2a. Da die inhibitorische Wirkung durch PKA-Stimulation vollständig aufgehoben werden kann, erhöhen die Pentamere die Regulationsmöglichkeiten der SERCA2a-Aktivität.
Durch die Verwendung radioaktiver Substanzen mit ihrer schädigenden Wirkung auf den menschlichen Körper besteht in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ein fortwährendes Interesse an der Reduktion der applizierten Dosis bei gleichbleibender Qualität der Ergebnisse. Zusätzlich ist im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Systeme eine Reduktion sowohl der Akquisitions- als auch der Rekonstruktionszeit erstrebenswert. In dieser Arbeit werden zwei Möglichkeiten vorgestellt, diese Ziele durch den Einsatz von Compressed Sensing (CS) zu erreichen.
Neben der Entwicklung neuartiger Rekonstruktionsalgorithmen können Filtertechniken eingesetzt werden, um eine qualitative Verbesserung rekonstruierter Bilder zu erzielen. Der Vorteil eines Filters besteht unter anderem darin, dass diese retrospektiv angewandt werden können. Es ist folglich möglich, die Qualität eines Bildes zu überprüfen und lediglich im Bedarfsfall einen Filter einzusetzen.
Die Technik des CS war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten im Bereich der Bildgebung, insbesondere in der Magnetresonanztomographie und der Computertomographie (CT). Mit CS könnten bildgebende Verfahren wie die CT oder die PET mit weniger Messungen durchgeführt werden, wodurch sich die Messzeit und die Strahlenexposition reduziert. In der molekularen Bildgebung mit der PET ist CS jedoch weitgehend unbekannt.
Im ersten Teil dieser Dissertation wird eine Methode vorgestellt, welche CS als Filtertechnik in der PET einsetzt. Den Ausgangspunkt stellt ein vollständiger, analytisch rekonstruierter Datensatz dar. Dieser wird mit einer Reihe unterschiedlicher Abtastmuster retrospektiv unterabgetastet und jeweils erneut, unter Verwendung von CS rekonstruiert. Im rauschfreien Fall würde CS stets das Originalbild liefern. Das überlagerte Rauschen führt jedoch zu Artefakten und einer Verschlechterung des Ergebnisses. CS kann nun einerseits das Rauschen vermindern. Andererseits ist es durch die Mittelung mehrerer unterschiedlicher Rekonstruktionen möglich, die Artefakte zu reduzieren. Auf diesem Weg kann die Bildqualität signifikant verbessert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Technik sowohl für 2D, als auch für 3D Datensätze verwendet werden kann. Die größten qualitativen Verbesserungen werden erzielt, wenn der Datensatz lediglich aus wenigen Ereignissen besteht. In diesem Fall ist die Bildqualität der analytischen Rekonstruktionen extrem schlecht, die Verbesserung durch die Filtertechnik mit CS und die damit verbundene Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses jedoch am größten. Bei diesen Datensätzen können die Ergebnisse iterativer Rekonstruktionen übertroffen werden. In der Praxis wäre damit ein Einsatz speziell bei dynamischen oder getriggerten Aufnahmen denkbar. In beiden Fällen basieren die Rekonstruktionen nicht selten auf wenigen Ereignissen. Die resultierenden Bilder sind häufig von schlechter Qualität, womit eine Verbesserung durch Filterung sinnvoll ist.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rohdaten-basierten Triggerung am Kleintier-PET sowie mit dem Einsatz von CS zur Reduktion der Rekonstruktionszeit. Frühere Veröffentlichungen zeigten bereits die Anwendbarkeit Rohdaten-basierter Triggermethoden bei humanen Datensätzen. Im Hinblick auf eine präklinische Anwendung, speziell bei Datensätzen mit dem Fokus auf Mäuseherzen, existieren jedoch nur wenige Studien. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die segmentierte Methode des Massenschwerpunkts (COMseg) eine Technik darstellt, welche die kardiale Triggerung sowohl bei Datensätzen von Ratten, als auch von Mäusen erlaubt.
Ein nicht zu unterschätzender Nachteil der COMseg besteht darin, dass vor deren Anwendung die List-Mode Datei in kleine Zeitframes unterteilt und in Sinogramme sortiert werden muss. Auf jedes Sinogramm wird im Anschluss ein Rebinning Algorithmus angewandt. Dies stellt einen enormen Zeitaufwand dar, wodurch sich eine Anwendung bei größeren Studien in der Praxis als schwierig erweist. Ziel der Triggermethoden ist die Gewinnung eines Triggersignals, durch welches beispielsweise der Herzschlag in mehrere Phasen aufgeteilt werden kann. Das Triggersignal hat für gewöhnlich eine dünnbesetzte Repräsentation im Frequenzraum. Dieses Vorwissen ermöglicht den Einsatz von CS. Anstelle des vollständigen Datensatzes wurde lediglich ein Teil der Daten in kleine Zeitframes sortiert und mit der COMseg ausgewertet. Aus diesem unterabgetasteten Datensatz wird mit Hilfe von CS das vollständige Triggersignal rekonstruiert. Die Stärke der Unterabtastung entspricht in etwa dem Faktor der Reduktion der Rekonstruktionszeit. Auf diesem Weg ist es möglich, eine signifikante Beschleunigung zu erzielen. Die Anwendung dieser Technik ist jedoch nicht auf die COMseg beschränkt. Prinzipiell kann das Verfahren bei allen Methoden der Rohdaten-basierten Triggerung angewandt werden, welche es erlauben, die Abtastpunkte des Signals separat zu berechnen. Damit werden Algorithmen interessant, deren Einsatz aufgrund aufwändiger Berechnungen bislang in der Praxis nicht sinnvoll war.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten nahe, dass CS ein neuartiges Werkzeug in der PET darstellen könnte, mit welchem eine Filterung von Bildern sowie eine Reduktion der Rekonstruktionszeit möglich ist.