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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abhängig vom Reifungszustand der DC. Während unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, während die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erhöht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgemäß keine Migration der eingesetzten DC gegenüber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpräparation behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkulturüberstände aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu Überständen aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand für das DCspezifische Oberflächenmolekül DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusstämme an DC-SIGN binden können, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor für MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verstärkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor für MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC ermöglicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivität der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese veränderten T-Zellen gegenüber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgeführten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den kürzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch.
The putative attachment protein G of pneumonia virus of mice (PVM), a member of the Pneumoviruses, is an important virulence factor with so far ambiguous function in a virus-cell as well as in virus-host context. The sequence of the corresponding G gene is characterized by significant heterogeneity between and even within strains, affecting the gene and possibly the protein structure. This accounts in particular for the PVM strain J3666 for which two differing G gene organizations have been described: a polymorphism in nucleotide 65 of the G gene results in the presence of an upstream open reading frame (uORF) that precedes the main ORF in frame (GJ366665A) or extension of the major G ORF for 18 codons (GJ366665U). Therefore, this study was designed to analyse the impact of the sequence variations in the respective G genes of PVM strains J3666 and the reference strain 15 on protein expression, replication and virulence.
First, the controversy regarding the consensus sequence of PVM J3666 was resolved. The analysis of 45 distinct cloned fragments showed that the strain separated into two distinct virus populations defined by the sequence and structure of the G gene. This division was further supported by nucleotide polymorphisms in the neighbouring M and SH genes. Sequential passage of this mixed strain in the cell line standardly used for propagation of virus stocks resulted in selection for the GJ366665A-containing population in one of two experiments pointing towards a moderate replicative advantage. The replacement of the G gene of the recombinant PVM 15 with GJ366665A or GJ366665U, respectively, using a reverse genetic approach indicated that the presence of uORF within the GJ366665A significantly reduced the expression of the main G ORF on translational level while the potential extension of the ORF in GJ366665U increased G protein expression. In comparison, the effect of the G gene-structure on virus replication was inconsistent and dependent on cell line and type. While the presence of uORF correlated with a replication advantage in the standardly used BHK-21 cells and primary murine embryonic fibroblasts, replication in the murine macrophage cell line RAW 264.7 did not. In comparison, the GJ366665U variant was not associated with any effect on replication in cultured cells at all. Nonetheless, in-vivo analysis of the recombinant viruses associated the GJ366665U gene variant, and hence an increased G expression, with higher virulence whereas the GJ366665A gene, and therefore an impaired G expression, conferred an attenuated phenotype to the virus.
To extend the study to other G gene organizations, a recombinant PVM expressing a G protein without the cytoplasmic domain and for comparison a G-deletion mutant, both known to be attenuated in vivo, were studied. Not noticed before, this structure of the G gene was associated with a 75% reduction in G protein expression and a significant attenuation of replication in macrophage-like cells. This attenuation was even more prominent for the virus lacking G. Taking into consideration the higher reduction in G protein levels compared to the GJ366665A variant indicates that a threshold amount of G is required for efficient replication in these cells.
In conclusion, the results gathered indicated that the expression levels of the G protein were modulated by the sequence of the 5’ untranslated region of the gene. At the same time the G protein levels modulated the virulence of PVM.
Expression of human foamy virus is differentially regulated during development in transgenic mice
(1992)
Tbe human foamy virus (HFV) is a recently characterized member ofthe spumavirus family. Although no diseases have been unequivocally associated with HFV infection, expression of HFV regulatory genes in transgenie mice induces a characteristic aeute neuro degenerative disease and a myopathy. To better eharaeterize the sequenee of events leading to disease, and to gain a better understanding of the underlying pathogenetic meehanisms, we have analyzed in detail the transgene expression pattern during development. Transcription of a construet containing all regulatory elements and aneillary genes of mv was analyzed by in situ hybridization and was shown to occur in two distinct phases. At midgestation, low but widespread expression was first deteeted in eells of extraembryonie tissues. Later, various tissues originating from embryonie mesoderm, neuroeetoderm, and neural erest transeribed the transgene at moderate levels. However, expression deereased dramatically during late gestation and was suppressed shortly after birth. After a latency period of up to 5 weeks, transeription of the transgene resumed in single eelJs distributed irregularly in the central nervous system and in the skeletal museIe. By the age of 8 weeks, an increasing number of eells displayed much higher expression levels than in embryonie Iife and eventually underwent severe degenerative ehanges. These findings demonstrate that HFV transgene expression is differentially regulated in development and that HFV cytotoxicity may be dose-dependent. Such biphasic pattern of expression differs from that of murine retroviruses and may be explained by the specificity of HFV regulatory elements in combination with cellular faetors. Future studies of this model system should, therefore, provide novel insights in the mechanisms controlling retrovirallatency.
Humanfoamy virus (HFV) is a retrovirus encoding structural genes and, like human immunodeficiency virus and human T ceU leukemia virus I, several anciUary reading frames collectively termed the belgenes. We have previously shown that HFV transgenic mice develop an encephalopathy with neuronal loss in hippocampus and cerebral cortex. We have now raised and characterized rabbit antisera to various recombinant portions of gag, pot, env, and bel-I, the viraltransactivator. Immunoreactivity for gag and bel-I was observed in nuclei and processes of hippocampal and cortical neurons before the onset of morphological lesions and correlated with the appearance of HFV mRNA. Astrocyte-derived multinucleated giant ceUs containing HFV proteins were present in the brain oftransgenic mice coexpressingfuU- length HFV genes but not in mice expressing truncated gag and env, suggesting that these genes contain afusogenic domain. Expression of fuU-length structural genes decreased the life expectancy oftransgenic mice, implying an a4Juvant rolefor these proteins in HFV-induced brain damage. (Am] Pathol 1993, 142:1061-1072)
Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Quantification of the peripheral nerve myelin glycoprotein PO and antibodies to PO is difficult due to insolubility of PO in physiological solutions. We have overcome this problern by using the water-soluble recombinant form of the extracellular domain of PO (PO-ED) and describe newly developed assays which allow detection and quantitation of PO and antibodies to PO, in serum and cerebraspinal fluid (CSF). These sensitive and specific assays based on the ELISA technique were used to study humoral immune responses to PO during experimental autoimmune ("allergic") neuritis (EAN). In order to establish these tests, monoclonal antiborlies to different epitopes of rodent and human PO-ED were produced. A two-antibody sandwich-ELISA allowing quantitation of PO Oower detection Iimit of 0.5 ngjml or 30 fmoljml) and an antibody-capture ELISA (lower detection Iimit 1 ng specific antibody jml) to detect antiborlies to PO in serum and CSF were developed. EAN was induced in rats by active immunization with bovine myelin or the neuritogenic protein P2 or by adoptive transfer using P2 specific CD4 positive T cells. Serum and CSF were assayed for the presence of PO-ED and antibodies to PO-ED or P2. Antibodies to PO-ED were detected during active myelin-induced EAN, but not during P2-induced or adaptive transfer EAN. The anti-PO-ED antibodies in the CSF showed a correJation with disease activity. In contrast, in the same model antibodies to P2 persisted long after the disease ceased. No soluble PO-Iike fragments could be found in serum or CSF during any of the three types of EAN. We conclude that PO may be a B-eeil epitope in EAN. These findings warrant a screen for antibodies to PO-ED in human immune neuropathies.
Seven monoclonal antibodies were raised against the immunoglobulin-like extracellular domain of PO (POED), the major protein of peripheral nervous system myelin. Mice were immunized with purified recombinant rat PO-ED. After fusion, 7 clones (POI-P07) recognizing either recombinant, rat, mouse, or human PO-ED were selected by ELlS A and were characterized by Western blot, immunohistochemistry, and a competition assay. Antibodies belonged to the IgG or IgM class, and P04-P07, reacted with PO in fresh-frozen and paraffin-embedded sections of human or rat peripheral nerve, but not with myelin proteins of the central nervous system of either species. Epitope specificity of the antibodies was determined by a competition enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and a direct ELlS A using short synthetic peptides spanning the entire extracellular domain of PO. These assays showed that POl and P02 exhibiting the same reaction pattern in Western blot and immunohistochemistry reacted with different distant epitopes of PO. Furthermore, the monoclonal antibodies P05 and P06 recognized 2 different epitopes in close proximity within the neuritogenic extracellular sequence of PO. This panel of monoclonal antibodies, each binding to a different epitope of the extracellular domain of PO, will be useful for in vitro and in vivo studies designed to explore the role of PO during myelination and in demyelinating diseases of the peripheral nervous system.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch anhaltende Gelenksentzündungen gekennzeichnet ist und mit einer fortschreitenden Degradierung des Knorpels und Knochen einhergeht. Ungefähr 2 % der erwachsenen Bevölkerung weltweit sind betroffen und leiden unter erheblichen Gelenkschmerzen und Beeinträchtigungen. Der intraartikuläre Transfer anti-entzündlicher Gene (z.B. des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten – IL1RA) zeigte signifikante Bedeutung in präklinischen und Phase-I klinischen Studien der RA Therapie. Die meisten dieser Studien verwendeten MLV-basierte orthoretrovirale Vektoren für eine stabile Transgenexpression, tragen aber das Risiko der Insertionsmutagenese. Wir haben foamyvirale Vektoren (FVV) etabliert, welche von apathogenen Elternviren abgeleitet sind und sich durch ein breites Wirtsspektrum und ein vorteilhaftes Integrationsmuster ins zelluläre Genom auszeichnen. In dieser Arbeit wurden IL1RA exprimierende prototypische foamyvirale Vektoren (PFV) generiert, deren chondroprotektives Potential in vitro und in einem indirekten Gentransferansatz in Kniegelenken von Wistar und athymischen Nacktratten in vivo evaluiert wurde. PFV Vektoren mit der kodierenden Sequenz für den humanen IL1RA, einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und EGFP wurden generiert und mit Verwendung eines Vier-Plasmidsystem, bestehend aus dem Vektorplasmid (IL1RA-IRES-EGFP) und den Expressionsplasmiden FV-gag, FV-pol und FV-env in 293T Zellen produziert. Ebenso wurden Kontrollvektoren welche nur EGFP exprimieren generiert. Transduktionsexperimente wurden mit primären humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZ) aus Knochenmarkaspiraten, der Tert-4 mesenchymalen Stammzelllinie, HT1080 Fibroblasten und primären Ratten Synovialfibroblasten durchgeführt. Die Transgenexpression wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (EGFP), ELISA (IL1RA) und quantitativer Real-Time PCR (IL1RA) evaluiert. Die Funktionalität des IL1RA-Proteins wurde mit einem Prostaglandin E2 (PGE2) Assay gezeigt. Dazu wurden FV.IL1RA transduzierte Tert-4 Zellen und unbehandelte Zellen mit 10 ng/ml IL1 inkubiert. Als readout für die IL1-Stimulation dienten die PGE2 Mengen in den konditionierten Medien. Die Zellkulturüberstände wurden 48 h nach IL1-Gabe auf ihren PGE2 und IL1RA Gehalt hin untersucht. Die PGE2 Menge war dabei, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, in den FV.IL1RA transduzierten Zellen signifikant erniedrigt. Nach der Transplantation von foamyviral transduzierten Synovialfibroblasten in Kniegelenke von Wistar und athymischen Nacktratten, war die intraartikuläre (i.a.) Transgenexpression in den Wistar Ratten zunächst hoch, fiel jedoch nach ungefähr 3 Wochen ab. Im Gegensatz dazu war die foamyviral vermittelte IL1RA-Expression in den immundefizienten Ratten für 12 Wochen auf sehr hohen Leveln stabil. Ein Maximum wurde an Tag 10 nach i.a. Transplantation mit ca. 450 ng pro Gelenk erreicht. Untersuchungen zur Biodistribution zeigten keine extraartikuläre Transgenexpression in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Gonaden und Serum). Diese Resultate, zusammen mit dem Ausbleiben von sekundären Erkrankungen, wie bspw. Tumoren, in allen behandelten Tieren, sprechen für die Sicherheit des Ansatzes. Die Arbeit zeigt, dass FVV verwendet werden können, um primäre Synovialfibroblasten und MSZ effizient mit Markergenen und dem anti-entzündlichen IL1RA Transgen zu transduzieren. Die dabei erzielten Transgenlevel sind in der Lage, die Effekte von hochdosiertem IL1 zu blockieren. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass FVV sehr effiziente Werkzeuge für den ex vivo Gentransfer sind und unterstreichen ihr großes Potential für die Bereitstellung anti-entzündlicher Transgene in primären Zellen und Geweben. Zukünftig soll diese Technologie in Tiermodellen der Arthritis angewendet werden. Das Fernziel der Arbeiten besteht in der Etablierung und Evaluierung eines Gentransfersystems, welches die in vivo Applikation am Menschen erlaubt.
Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) and their chondrogenic differentiation have been extensively investigated in vitro as MSCs provide an attractive source besides chondrocytes for cartilage repair therapies. Here we established prototype foamyviral vectors (FVV) that are derived from apathogenic parent viruses and are characterized by a broad host range and a favorable integration pattern into the cellular genome. As the inflammatory cytokine interleukin 1 beta (IL1β) is frequently present in diseased joints, the protective effects of FVV expressing the human interleukin 1 receptor antagonist protein (IL1RA) were studied in an established in vitro model (aggregate culture system) of chondrogenesis in the presence of IL1β.
Materials and Methods: We generated different recombinant FVVs encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) or IL1RA and examined their transduction efficiencies and transgene expression profiles using different cell lines and human primary MSCs derived from bone marrow-aspirates. Transgene expression was evaluated by fluorescence microscopy (EGFP), flow cytometry (EGFP), and ELISA (IL1RA). For evaluation of the functionality of the IL1RA transgene to block the inhibitory effects of IL1β on chondrogenesis of primary MSCs and an immortalized MSC cell line (TERT4 cells), the cells were maintained following transduction as aggregate cultures in standard chondrogenic media in the presence or absence of IL1β. After 3 weeks of culture, pellets were harvested and analyzed by histology and immunohistochemistry for chondrogenic phenotypes.
Results: The different FVV efficiently transduced cell lines as well as primary MSCs, thereby reaching high transgene expression levels in 6-well plates with levels of around 100 ng/ml IL1RA. MSC aggregate cultures which were maintained in chondrogenic media without IL1β supplementation revealed a chondrogenic phenotype by means of strong positive staining for collagen type II and matrix proteoglycan (Alcian blue). Addition of IL1β was inhibitory to chondrogenesis in untreated control pellets. In contrast, foamyviral mediated IL1RA expression rescued the chondrogenesis in pellets cultured in the presence of IL1β. Transduced MSC pellets reached thereby very high IL1RA transgene expression levels with a peak of 1087 ng/ml after day 7, followed by a decrease to 194 ng/ml after day 21, while IL1RA concentrations of controls were permanently below 200 pg/ml.
Conclusion: Our results indicate that FVV are capable of efficient gene transfer to MSCs, while reaching IL1RA transgene expression levels, that were able to efficiently block the impacts of IL1β in vitro. FVV merit further investigation as a means to study the potential as a gene transfer tool for MSC based therapies for cartilage repair.
Hintergrund: Die HIV-Infektion wird von einer allgemeinen Hyperimmunaktivierung begleitet, die wahrscheinlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Im Rahmen einer 24-monatigen, Placebo-kontrollierten, randomisierten Doppelblindstudie wurde in unserer Arbeitsgruppe der Einfluss von gering-dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) auf die Progression der Erkrankung untersucht (ProCort-Studie, clinicaltrials.gov NCT01299948). Es konnte gezeigt werden, dass gering-dosiertes Prednisolon bei weiblichen Studienteilnehmerinnen zu einer signifikant verlangsamten Progression hin zum Studienendpunkt AIDS geführt hat. Die immunologischen Grundlagen dieses Effektes sind noch nicht ausreichend verstanden. Es ist bekannt, dass die HIV-Infektion zu einer Zunahme der aktivierten T-Zellen im Blut führt und dass der Anteil dieser aktivierten T-Zellen mit der Krankheitsprogression korreliert. Diese T-Zell Hyperaktivierung wird unter antiretroviraler Behandlung wieder normalisiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Prednisolon-Behandlung auf die T-Zell-Aktivierung untersucht werden, um zu verstehen, ob die Prenisolon-Behandlung ähnliche positive Effekte auf das Immunsystem hat, wie die antiretrovirale Therapie.
Methoden: In dieser Studie wurden insgesamt 154 PBMC-Proben (77 Placebo, 77 Prednisolon) des Studienzeitpunktes 12 Monate untersucht. Die PBMC wurden mit Fluorochrom-markierten Antikörpern gegen CD3 (PerCP-Cy 5.5), CD8 (FITC), CD38 (PE) und HLA-DR (APC) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Folgende Populationen wurden definiert: T-Zellen (CD3+), CD8-positive T Zellen (CD3+/CD8+), CD4-positive T Zellen (CD3+/CD8-), aktivierte T Zellen (CD38+/HLA-DR+). Eine statistische Analyse der Daten erfolgte mit Hilfe der GraphPad Prism Software.
Ergebnisse: Patienten mit Prednisolon-Behandlung zeigten im Vergleich zu Patienten mit Placebo-Behandlung eine geringere Aktivierung der CD8+ T Zellen (median 8.04 % [CI95% 8.158-11.54]) vs. median 9.74 % [CI95% 9.71-13.05] sowie der CD4+ T Zellen (median 6.910% [CI95% 6.862-8.721] vs. median 8.185 % [CI95% 8.088-10.49]). Die Unterschiede sind jedoch statistisch nicht signifikant (p=0.1250 bzw. p=0.1032, U test). Bei einer Stratifizierung der Daten nach Geschlecht erreichten die festgestellten Unterschiede zwischen Placebo- und Prednisolonbehandlung bei weiblichen Studienteilnehmern statistische Signifikanz (CD8+ Aktivierung: median 7.3 % [CI95% 7.413-10.26] vs. median 10.3 % [CI95% 9.927-13.69], p = 0.0248, U-test), sowie der CD4+ T Zellen (median 6.735% [CI95% 6.448-8.476] vs. (median 8.36% [CI95% 8.274-10.72], p = 0.0158, U-test), während bei männlichen Studienteilnehmern kein Unterschied auftrat. Die Lymphozytenaktivierung zeigte eine positive Korrelation zur HIV-Viruslast (p = 0.0521 für CD8+ und p = 0.0078 für CD4+, lineare Regression) und zum Immunaktivierungsmarker sCD14 (p = 0.0075 für CD8+ und p < 0.0085 für CD4+, lineare Regression) und zum Aktivierungsmarker supar (p = 0.0261 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). Aktivierte CD4+ Zellen zeigten eine positive, aktivierte CD8+ Zellen eine negative Korrelation zum Anteil an memory-B-Zellen (p = 0.0080 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). In einer Kaplan-Meyer-Analyse innerhalb des Placebo-Arms zeigten Patienten mit einer höherne Immunaktivierung bei CD8+ T-Lymphozyten (Quartilen Q1 und Q2) eine signifikant schnellere Progression zu AIDS als Patienten mit einer niedrigen Immunaktivierung (Quartilen Q3 und G4, p = 0.0176).
Diskussion: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen mit Prednisolon-Behandlung zum Zeitpunkt 12 Monate eine signifikant niedrigere Lymphozytenaktivierung zeigen als Studienteilnehmerinnen mit Placebo-Behandlung. Die Prednisolon-vermittelte Reduktion der Immunaktivierung korrelierte mit verlangsamter Krankheitsprogression. Die HIV-induzierte Immunaktivierung ist damit ein treibender Faktor in der Progression der Erkrankung. Immunmodulatorische Therapien bei Patienten mit ungenügender Immunrekonstitution unter antiretroviraler Behandlung könnten daher möglicherweise einen positiven Behandlungseffekt erzielen.
Zielsetzung dieser Arbeit ist die Bestimmung der Aktivierung von CD8+ und CD4+ T-Lymphozyten bei Teilnehmern eines RCT, in dem der Effekt von niedrig-dosiertem Prednisolon auf die Progression der HIV-Infektion untersucht werden sollte. Die Ergebnisse sollten mit der Art der Behandlung (Placebo oder Prednisolon), weiteren Markern der Immunaktivierung sowie der Viruslast korreliert werden und der Effekt auf die Krankheitsprogression untersucht werden. Aus diesen Ergebnissen sollten Rückschlüsse auf die Effekte von Prednisolon auf das Immunsystem, sowie ein besseres Verständnis der Immunpathogenese der Infektion gewonnen werden.
Sphingolipids are essential components of eukaryotic cells. In this review, we want to exemplarily illustrate what is known about the interactions of sphingolipids with various viruses at different steps of their replication cycles. This includes structural interactions during entry at the plasma membrane or endosomal membranes, early interactions leading to sphingolipid-mediated signal transduction, interactions with internal membranes and lipids during replication, and interactions during virus assembly and budding. Targeted interventions in sphingolipid metabolism – as far as they can be tolerated by cells and organisms – may open novel possibilities to support antiviral therapies. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infections have intensively been studied, but for other viral infections, such as influenza A virus (IAV), measles virus (MV), hepatitis C virus (HCV), dengue virus, Ebola virus, and severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2), investigations are still in their beginnings. As many inhibitors of sphingolipid metabolism are already in clinical use against other diseases, repurposing studies for applications in some viral infections appear to be a promising approach.
Sphingolipids are major components of cellular membranes, and at steady-state level, their metabolic fluxes are tightly controlled. On challenge by external signals, they undergo rapid turnover, which substantially affects the biophysical properties of membrane lipid and protein compartments and, consequently, signaling and morphodynamics. In T cells, external cues translate into formation of membrane microdomains where proximal signaling platforms essential for metabolic reprograming and cytoskeletal reorganization are organized. This review will focus on sphingomyelinases, which mediate sphingomyelin breakdown and ensuing ceramide release that have been implicated in T-cell viability and function. Acting at the sphingomyelin pool at the extrafacial or cytosolic leaflet of cellular membranes, acid and neutral sphingomyelinases organize ceramide-enriched membrane microdomains that regulate T-cell homeostatic activity and, upon stimulation, compartmentalize receptors, membrane proximal signaling complexes, and cytoskeletal dynamics as essential for initiating T-cell motility and interaction with endothelia and antigen-presenting cells. Prominent examples to be discussed in this review include death receptor family members, integrins, CD3, and CD28 and their associated signalosomes. Progress made with regard to experimental tools has greatly aided our understanding of the role of bioactive sphingolipids in T-cell biology at a molecular level and of targets explored by a model pathogen (measles virus) to specifically interfere with their physiological activity.
In common with most viruses, measles virus (MV) relies on the integrity of the cytoskeleton of its host cells both with regard to efficient replication in these cells, but also retention of their motility which favors viral dissemination. It is, however, the surface interaction of the viral glycoprotein (gp) complex with receptors present on lymphocytes and dendritic cells (DCs), that signals effective initiation of host cell cytoskeletal dynamics. For DCs, these may act to regulate processes as diverse as viral uptake and sorting, but also the ability of these cells to successfully establish and maintain functional immune synapses (IS) with T cells. In T cells, MV signaling causes actin cytoskeletal paralysis associated with a loss of polarization, adhesion and motility, which has been linked to activation of sphingomyelinases and subsequent accumulation of membrane ceramides. MV modulation of both DC and T cell cytoskeletal dynamics may be important for the understanding of MV immunosuppression at the cellular level.
As pattern recognition receptor on dendritic cells (DCs), DC-SIGN binds carbohydrate structures on its pathogen ligands and essentially determines host pathogen interactions because it both skews T cell responses and enhances pathogen uptake for cis infection and/or T cell trans-infection. How these processes are initiated at the plasma membrane level is poorly understood. We now show that DC-SIGN ligation on DCs by antibodies, mannan or measles virus (MV) causes rapid activation of neutral and acid sphingomyelinases followed by accumulation of ceramides in the outer membrane leaflet. SMase activation is important in promoting DC-SIGN signaling, but also for enhancement of MV uptake into DCs. DCSIGN-dependent SMase activation induces efficient, transient recruitment of CD150, which functions both as MV uptake receptor and microbial sensor, from an intracellular Lamp-1+ storage compartment shared with acid sphingomyelinase (ASM) within a few minutes. Subsequently, CD150 is displayed at the cell surface and co-clusters with DC-SIGN. Thus, DCSIGN ligation initiates SMase-dependent formation of ceramide-enriched membrane microdomains which promote vertical segregation of CD150 from intracellular storage compartments along with ASM. Given the ability to promote receptor and signalosome co-segration into (or exclusion from) ceramide enriched microdomains which provide a favorable environment for membrane fusion, DC-SIGN-dependent SMase activation may be of general importance for modes and efficiency of pathogen uptake into DCs, and their routing to specific compartments, but also for modulating T cell responses.
Measles virus (MV) efficiently causes generalized immunosuppression which accounts to a major extent for cases of measles-asscociated severe morbidity and mortality. MV infections alter many functions of antigen presenting cells (APC) (dendritic cells (DCs)) and lymphocytes, yet many molecular targets of the virus remain poorly defined. Cellular interactions and effector functions of DCs and lymphocytes are regulated by surface receptors. Associating with other proteins involved in cell signaling, receptors form part of receptosomes that respond to and transmit external signals through dynamic interctions with the cytoskeleton. Alterations in the composition and metabolism of membrane sphingolipids have a substantial impact on both processes. In this review we focus on the regulation of sphingomyelinase activity and ceramide release in cells exposed to MV and discuss the immunosuppressive role of sphingomyelin breakdown induced by MV.
Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induce anti-PrPC antibody responses in PrPC-competent mice. In a first step it was assessed whether VLP have the capacity to induce antibody responses that are protective against conventional pathogens. For this purpose, VLP displaying the vesicular stomatitis virus-gylcoprotein (VLP-VSV) were generated and tested for their immunogenicity. Similarly to live vesicular stomatitis virus (VSV), replication deficient VLP-VSV induced T help-independent VSV neutralizing IgM responses that switched to the IgG subclass in a T help-dependent manner. Furthermore, type I IFN receptor (IFNAR) triggering only marginally affected VLP-VSV induced neutralizing IgM responses, whereas it was critically required to promote the IgG switch. The analysis of conditional knockout mice with a lymphocyte-specific IFNAR deletion revealed that IFNAR triggering of lymphocytes did not play a crucial role, neither upon VLP-VSV nor VSV immunization. Collectively, these data verified the high immunogenicity of VLP. Therefore, in a next step VLP were generated displaying the C-terminal half of PrP (residues 121-231aa) fused to the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) transmembrane region (VLP-PrPD111) for anti-PrPC immunization. On the surface of such retroparticles, PrPC was expressed at high levels as determined by electron microscopy. VLP-PrPD111 immunization of Prnp-deficient (Prnp0/0) mice resulted in antibody response specifically binding the cellular form of PrPC. Upon intravenous injection of wild-type mice, high PrPC-specific IgM responses were induced, whereas the T cell-dependent switch from the IgM to the IgG subclass was less pronounced. As a consequence, anti-PrPC titers were rather short-lived. The impaired subclass switch was probably related with host T cell tolerance to endogenous PrPC. Attempts to increase anti-PrPC IgG responses in wild-type mice via administration of VLP-PrPD111 emulsified in various different adjuvants failed. Nevertheless, in single individuals low IgG antibodies were induced after immunization of VLP-PrPD111 emulsified in CFA. To circumvent T cell tolerance in wild-type mice, a multitude of different immunization strategies was tested, including priming and boosting protocols with different types of VLP or VLP expressing PrPC together with foreign T helper epitopes. Overall, those efforts did not improve anti-PrPC IgG responses in wild-type mice. Interestingly, anti-PrPC antibodies induced in Prnp0/0 mice reduced PrPSc levels in prion infected cell cultures, whereas serum of vaccinated wild-type mice did not. To assess the protective capacity of VLP-PrPD111 induced immune responses, vaccinated wild-type mice were infected with scrapie (RML 5.0). Unfortunately, vaccinated mice did not show a significant delay in the onset of scrapie. In a last part of the thesis it was studied whether in the absence of T cell help activated “memory” B cells were able to produce anti-PrPC specific antibodies. To address this question, PrPC-specific memory B cells were sorted from vaccinated Prnp0/0 mice and adoptively transferred into wild-type recipient mice. Upon VLP-PrPD111 challenge, no PrPC-specific IgG titers were induced in the recipients. Nevertheless, several VLP-PrPD111 challenged recipient mice were protected against scrapie infection. In conclusion, VLP were characterized as highly immunogenic vaccines that were used to elucidate various questions concerning adaptive immune response and basic mechanisms of PrPC-specific tolerance vs. immunity. Remarkably, VLP-PrPD111 was able to induce native PrPC-specific antibodies in wild-type mice but major difficulties associated with PrPC-specific tolerance made efficacious scrapie vaccination impossible. New vaccination approaches are being tested to overcome these limitations.
Background
Regulatory CD4\(^+\)CD25\(^+\)FoxP3\(^+\) T cells (Treg) are a subgroup of T lymphocytes involved in maintaining immune balance. Disturbance of Treg number and impaired suppressive function of Treg correlate with Parkinson’s disease severity. Superagonistic anti-CD28 monoclonal antibodies (CD28SA) activate Treg and cause their expansion to create an anti-inflammatory environment.
Methods
Using the AAV1/2-A53T-α-synuclein Parkinson’s disease mouse model that overexpresses the pathogenic human A53T-α-synuclein (hαSyn) variant in dopaminergic neurons of the substantia nigra, we assessed the neuroprotective and disease-modifying efficacy of a single intraperitoneal dose of CD28SA given at an early disease stage.
Results
CD28SA led to Treg expansion 3 days after delivery in hαSyn Parkinson’s disease mice. At this timepoint, an early pro-inflammation was observed in vehicle-treated hαSyn Parkinson’s disease mice with elevated percentages of CD8\(^+\)CD69\(^+\) T cells in brain and increased levels of interleukin-2 (IL-2) in the cervical lymph nodes and spleen. These immune responses were suppressed in CD28SA-treated hαSyn Parkinson’s disease mice. Early treatment with CD28SA attenuated dopaminergic neurodegeneration in the SN of hαSyn Parkinson’s disease mice accompanied with reduced brain numbers of activated CD4\(^+\), CD8\(^+\) T cells and CD11b\(^+\) microglia observed at the late disease-stage 10 weeks after AAV injection. In contrast, a later treatment 4 weeks after AAV delivery failed to reduce dopaminergic neurodegeneration.
Conclusions
Our data indicate that immune modulation by Treg expansion at a timepoint of overt inflammation is effective for treatment of hαSyn Parkinson’s disease mice and suggest that the concept of early immune therapy could pose a disease-modifying option for Parkinson’s disease patients.
Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind übertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern gehören. Der infektiöse Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellulären Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquitär exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das körpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden“ Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenität des Proteins verstärkt werden. Zusätzlich wurde für die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die Fähigkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgeführt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antikörper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gewählten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen möglich, hohe Antikörperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten Mäuse wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antikörper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die Mäuse gegenüber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verlängerte Inkubationszeit von ca. 30%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zusätzliche T-Helferepitop keine Verlängerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellulärer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Dafür wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_Mäusen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabhängig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage für weitere Forschungsansätze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-Mäusen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und können PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Veränderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zusätzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Veränderungen untersucht und dabei TUNEL-Färbungen und aktivierte-Caspase-3 Färbungen durchgeführt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Ausprägung und Stärke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag für das bessere Verständnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind für die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.
Wiskott–Aldrich syndrome (WAS) is caused by loss-of-function mutations in theWASp gene.
Decreased cellular responses in WASp-deficient cells have been interpreted to mean that
WASp directly regulates these responses in WASp-sufficient cells. Here, we identify an
exception to this concept and show that WASp-deficient dendritic cells have increased
activation of Rac2 that support cross-presentation to CD8þ T cells. Using two different skin
pathology models, WASp-deficient mice show an accumulation of dendritic cells in the skin
and increased expansion of IFNg-producing CD8þ T cells in the draining lymph node and
spleen. Specific deletion of WASp in dendritic cells leads to marked expansion of CD8þ
T cells at the expense of CD4þ T cells. WASp-deficient dendritic cells induce increased
cross-presentation to CD8þ T cells by activating Rac2 that maintains a near neutral pH of
phagosomes. Our data reveals an intricate balance between activation of WASp and Rac2
signalling pathways in dendritic cells.
Foamyviren enthalten vier zentrale purinreiche Sequenzen, die Elemente A bis D. Bekannt sind solche auch bei anderen Retroviren, u.a. bei HIV, wo der cPPT (central polypurine tract) für eine effektive Replikation benötigt wird und eine Kopie des 3´PPT darstellt. Bei FV ist nur das Element D sequenzidentisch zum 3´PPT, welcher sich bei allen Retroviren findet und von welchem die Plusstrang-Synthese bei der Bildung der cDNA intiiert wird. Vermutet wurde daher für das Element D, das es einen zweiten Initiationsort für die Plusstrang-Synthese darstellt und analog zum cPPT bei HIV die Replikation zu beschleunigen vermag. Um die Funktion der purinreichen Sequenzen zu verstehen, führten wir Mutationen in die Elemente A bis D ein und untersuchten sie im infektiösen Volllängenklon sowie im Vektorkontext; zusätzlich analysierten wir die viralen Proteine in infizierten Zellen und Viruspartikeln.
Several new N-substituted 1,2-benzisothiazol-3(2H)-ones (BITs) were synthesised through a facile synthetic route for testing their anti-dengue protease inhibition. Contrary to the conventional multistep synthesis, we achieved structurally diverse BITs with excellent yields using a two-step, one-pot reaction strategy. All the synthesised compounds were prescreened for drug-like properties using the online Swiss Absorption, Distribution, Metabolism and Elimination (SwissADME) model, indicating their favourable pharmaceutical properties. Thus, the synthesised BITs were tested for inhibitory activity against the recombinant dengue virus serotype-2 (DENV-2) NS2BNS3 protease. Dose–response experiments and computational docking analyses revealed that several BITs bind to the protease in the vicinity of the catalytic triad with IC\(_{50}\) values in the micromolar range. The DENV2 infection assay showed that two BITs, 2-(2-chlorophenyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-one and 2-(2,6-dichlorophenyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-one, could suppress DENV replication and virus infectivity. These results indicate the potential of BITs for developing new anti-dengue therapeutics.
Background: Kerinokeratosis papulosa (KP) is considered an extremely rare genodermatosis presenting usually as waxy papules on the trunk in childhood.
Objective: To describe and analyze the clinical, histological and potential etiopathological aspects of KP.
Methods: The dermatoscopic features of a new case of KP of childhood are investigated. The presence of human papillomavirus (HPV) DNA in lesional skin was studied by polymerase chain reaction. Furthermore, all cases of KP of childhood reported so far were reviewed.
Results: As a diagnostic tool, we describe for the first time a dermatoscopic feature, namely a cribriform pattern of KP, in an 11-year-old boy. In addition, we detected HPV (type 57) in his KP lesions.
Conclusions: Dermatoscopic examination might be a useful tool to distinguish KP from other skin lesions, e.g. common warts. The detection of HPV type 57 might hint to an etiological role of HPV for KP.
Die Arteriosklerose ist ein chronisch entzündlicher Prozess der Gefäßwand, in dem CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen („\(T_{reg}\)“) eine atheroprotektive Rolle spielen. Durch exogenen \(T_{reg}\)-Transfer konnten andere Gruppen eine Reduktion der Arteriosklerose nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität der endogenen Treg durch spezielle Antikörper modifiziert, ihr Einfluss auf die Entwicklung arteriosklerotischer Plaques in ApoEko-Mäusen untersucht sowie eine mögliche Abhängigkeit dieser Wirkung vom zellulären Immunstatus des Wirts geprüft.
Im Abstand von 28 Tagen wurde weiblichen ApoEko-Mäusen zweimal der CD28-spezifische superagonistische monoklonale Antikörper D665 injiziert, um eine polyklonale Vermehrung ihrer \(T_{reg}\) anzuregen. In einer zweiten Versuchsreihe wurden endogene \(T_{reg}\) zweimal im Abstand von 28 Tagen durch Gabe eines CD25-spezifischen Antikörpers (PC61) zunächst depletiert und jeweils 7 Tage später durch D665 geboostert, um den Effekt der \(T_{reg}\) auf ein initial Treg defizientes Tiermodell zu testen. Verglichen wurde mit der alleinigen Treg-Depletion durch PC61 sowie mit einem Kontrollantikörper (Isotyp-IgG, MOPC). Die Quantifizierung der Arterioskleroseentwicklung erfolgte mittels Planimetrie der Plaquefläche der Aorta. Die Wirksamkeit der Antikörper auf die \(T_{reg}\)-Konzentrationen wurde mittels FACS-Analysen aus Blut und Milz untersucht.
Nach alleiniger \(T_{reg}\)-Amplifikation durch D665-Injektion zeigte sich kein Unterschied in der prozentualen Plaquefläche im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch eine alleinige Depletion mit PC61 zeigte keine Veränderungen in der Läsionsfläche. Durch Kombination beider Antikörper jedoch kam es nach Treg-Depletion mittels PC61, gefolgt von Treg-stimulierender D665-Behandlung, zu einer signifikanten Verminderung der prozentualen Plaquefläche der Aorta um 32,02% im Vergleich zur MOPC Kontrolle und um 28,73% im Vergleich zur alleinigen \(T_{reg}\)-Depletion mit PC61+MOPC. Die FACS-Analysen bestätigten eine signifikante Depletion durch PC61-Injektion sowie eine signifikante Zunahme der Treg eine Woche nach D665-Injektion.
Die Stimulation regulatorischer T-Zellen in einem Treg-defizienten arteriosklerotischen Tiermodell reduzierte die aortale arteriosklerotische Läsionsfläche signifikant. In der immunkompetenten ApoEko Maus jedoch bewirkte die alleinige Vermehrung oder die alleinige Depletion regulatorischer T-Zellen keine messbare Veränderung in der Plaqueentwicklung. Diese Arbeit zeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit regulatorischer T-Zellen und der inflammatorischen Veränderung der Gefäßwand besteht.
Um die Verdteidigungsmechanismen der Wirtszelle gegen Sindbisvirusinfektion zu charakterisieren, haben wir in den Extrakten infizierter Zellen. Interferon(IFN)- stimulated- response- element (ISRE)- Bindungsproteine untersucht, welche in der transkriptionellen Induktion von IFN Typ I induzierter Gene beteiligt sind. Mittels Gelretentionsanalyse in der ein humanes Interferon-stimuliertes Gen 15 ( ISG15 ) Verwendung fand, wiesen wir in Extrakten von sindbisinfizierten L-929 Zellen verschiedene Proteinkomplexe nach, die nicht in Extrakten uninfizierter Zellen nachweisbar waren. Übereinstimmung im Laufverhalten mit Extrakten NDV-infizierter Zellen, in der ISRE-Bindungsspezifität und in Antikörperversuchen zeigt, dass die sindbisinduzierten Komplexe in L-929 Zellen den bekannten DRAF1 und ISGF3 entsprechen. Transfektion von L-929 Zellen mit polyr I:rC induzierte lediglich ISGF3.
Hsp90 inhibition ameliorates CD4\(^{+}\) T cell-mediated acute Graft versus Host disease in mice
(2016)
Introduction:
For many patients with leukemia only allogeneic bone marrow transplantion provides a chance of cure. Co‐transplanted mature donor T cells mediate the desired Graft versus Tumor (GvT) effect required to destroy residual leukemic cells. The donor T cells very often, however, also attack healthy tissue of the patient inducing acute Graft versus Host Disease (aGvHD)—a potentially life‐threatening complication.
Methods:
Therefore, we used the well established C57BL/6 into BALB/c mouse aGvHD model to evaluate whether pharmacological inhibition of heat shock protein 90 (Hsp90) would protect the mice from aGvHD.
Results:
Treatment of the BALB/c recipient mice from day 0 to +2 after allogeneic CD4\(^{+}\) T cell transplantation with the Hsp90 inhibitor 17‐(dimethylaminoethylamino)‐17‐demethoxygeldanamycin (DMAG) partially protected the mice from aGvHD. DMAG treatment was, however, insufficient to prolong overall survival of leukemia‐bearing mice after transplantation of allogeneic CD4\(^{+}\) and CD8\(^{+}\) T cells. Ex vivo analyses and in vitro experiments revealed that DMAG primarily inhibits conventional CD4\(^{+}\) T cells with a relative resistance of CD4\(^{+}\) regulatory and CD8\(^{+}\) T cells toward Hsp90 inhibition.
Conclusions:
Our data, thus, suggest that Hsp90 inhibition might constitute a novel approach to reduce aGvHD in patients without abrogating the desired GvT effect.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Opportunistic infections with the saprophytic yeast Candida albicans are a major cause of morbidity in immunocompromised patients. While the interaction of cells and molecules of innate immunity with C. albicans has been studied to great depth, comparatively little is known about the modulation of adaptive immunity by C. albicans. In particular, direct interaction of proteins secreted by C. albicans with CD4\(^{+}\) T cells has not been studied in detail. In a first screening approach, we identified the pH-regulated antigen 1 (Pra1) as a molecule capable of directly binding to mouse CD4\(^{+}\) T cells in vitro. Binding of Pra1 to the T cell surface was enhanced by extracellular Zn\(^{2+}\) ions which Pra1 is known to scavenge from the host in order to supply the fungus with Zn\(^{2+}\). In vitro stimulation assays using highly purified mouse CD4\(^{+}\) T cells showed that Pra1 increased proliferation of CD4\(^{+}\) T cells in the presence of plate-bound anti-CD3 monoclonal antibody. In contrast, secretion of effector cytokines such as IFNγ and TNF by CD4\(^{+}\) T cells upon anti-CD3/ anti-CD28 mAb as well as cognate antigen stimulation was reduced in the presence of Pra1. By secreting Pra1 C. albicans, thus, directly modulates and partially controls CD4\(^{+}\) T cell responses as shown in our in vitro assays.
Für die Replikation des Masernvirus wird den Komponenten des Zytoskeletts eine wichtige Rolle zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Aktin in polymerisierter Form vorliegen muss, um das Budding zu ermöglichen. Die Beeinflussung der ersten Schritte des Replikationszyklus konnte für Aktin, vor allem aber für Tubulin nachgewiesen werden, so dass ein Transport des viralen Genoms zum Ort seiner Replikation entlang der Mikrotubuli möglich wäre.
Die Reifung, Differenzierung und Funktion von Lymphozyten wird maßgeblich von aktivierenden und inhibitorischen Zelloberflächenrezeptoren reguliert. "Killer cell Lectin-like receptor G1" (KLRG1) ist ein Typ-II-Transmembranprotein, dessen Expression auf Subpopulationen von T-Lymphozyten und Natürlichen Killerzellen beschränkt ist. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die differentielle Expression und mögliche Funktion von KLRG1 auf diesen Zellen im Maussystem zu charakterisieren. Mit Hilfe zellbiologischer Untersuchungsmethoden konnte gezeigt werden, dass die KLRG1-Expressionsfrequenz mit dem Reifegrad der Zellen korreliert. Frühere Beobachtungen, wonach KLRG1 durch Erkennung eigener Klasse-I-Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) über inhibitorische Rezeptoren der Ly49-Familie induziert wird, konnten auf klassische Klasse-I-Moleküle und neue Ly49-Familienmitglieder ausgeweitet werden. Ferner belegen Daten dieser Arbeit, dass reife NK-Zellen die KLRG1-Expressionsfrequenz in verschiedenen lymphoiden Organen dem Klasse-I-Niveau der umgebenden Zellen anpassen können und dass T- und B-Lymphozyten möglicherweise eine zentrale Rolle hierbei spielen. Somit stellt KLRG1 einen NK-Zellrezeptor dar, dessen Expression durch Ly49-Rezeptorengagement dynamisch reguliert wird. Es ist möglich, dass KLRG1 kompensatorische (ko-)inhibitorische Eigenschaften besitzt, die für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz von NK-Zellen von Bedeutung sind. Unter den CD8-T-Zellen identifiziert ein polyklonales abT-Zellrezeptorrepertoire und die Expression von CD8 als ab-Heterodimer den 2-3%igen Anteil an KLRG1+ Zellen als konventionelle T-Zellen thymischen Ursprungs. Umfangreiche phänotypische und funktionelle Analysen ergaben, dass KLRG1-exprimierende CD8-Zellen sich aus ca. 20% proinflammatorischer Effektorzellen und ca. 80% Gedächtniszellen zusammensetzen. Aufgrund von Daten der Arbeitsgruppe Pircher scheint das Zellteilungsvermögen letzterer ausgeschöpft zu sein. Demzufolge markiert KLRG1 eine neue Subpopulation von CD8-T-Zellen, der sowohl Effektorzellen, als auch "replikativ seneszente" Gedächtniszellen angehören. Abschließende Untersuchungen ergaben, dass KLRG1 interessanterweise auch von 1-2% der CD4+ T-Zellen exprimiert wird und dass die KLRG1+ CD4-T-Zellen zum Großteil CD25 koexprimieren. Funktionelle Anschlußexperimente zeigten, dass es sich bei diesen Zellen um regulatorische T-Zellen handelt. Zusammenfassend kennzeichnet KLRG1-Expression eine Subpopulationen von NK-Zellen, die körpereigene Zellen über Klasse-I erkennen können, eine Untergruppe von Effektor- und seneszenten CD8-T-Zellen sowie neuartige regulatorische CD4-T-Zellen.
Peripheral T cell lymphomas (PTCLs) are associated with a poor prognosis due to often advanced disease at the time of diagnosis and due to a lack of efficient therapeutic options. Therefore, appropriate animal models of PTCL are vital to improve clinical management of this disease. Here, we describe a monoclonal CD8\(^+\) CD4\(^−\) αβ T cell receptor Vβ2\(^+\) CD28\(^+\) T cell lymphoma line, termed T8-28. T8-28 cells were isolated from an un-manipulated adult BALB/c mouse housed under standard pathogen-free conditions. T8-28 cells induced terminal malignancy upon adoptive transfer into syngeneic BALB/c mice. Despite intracellular expression of the cytotoxic T cell differentiation marker granzyme B, T8-28 cells appeared to be defective with respect to cytotoxic activity as read-out in vitro. Among the protocols tested, only addition of interleukin 2 in vitro could partially compensate for the in vivo micro-milieu in promoting growth of the T8-28 lymphoma cells.
Eine Masernvirus- (MV) Infektion induziert eine effiziente virus-spezifische Immunantwort. Aber parallel erfolgt eine generelle Suppression immunologischer Funktionen, die sekundäre Infektionen ermöglichen und verstärken kann. Eine Lymphopenie und die ex vivo beobachtete stark verminderte proliferative Antwort peripherer Lymphozyten auf polyklonale oder antigenspezifische Aktivierung gilt als zentraler Befund für diese Immunsuppression. Bislang konnte in vitro keine Interferenz mit dem von den MV-Glykoproteinen generierten negativen Proliferationssignal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Befunde zeigen jedoch, daß der MV induzierte Proliferationsarrest unter bestimmten Bedingungen in IPP/IL-2 (Isopentenylpyrophosphat und Interleukin-2) stimulierten gd T Zellen aufgehoben werden kann. Die Sensitivität der gd T Zellen gegenüber dem von den MV-Glykoproteinen vermittelten Signal gleicht der der konventionellen T Zellen. Dennoch reicht der Kontakt zu Monozyten und mit dem MV Vakzinestamm Edmonston (ED)-infizierten B Zellen oder dendritischen Zellen (DC) aus, eine ungehemmte Expansion der g9d2 T Zellen zu induzieren. Durch eine Interaktion mit ED-infizierten B Zellen und DC reagieren Monozyten wahrscheinlich mit einer Regulation stimulatorischer oder inhibitorischer Oberflächenmoleküle, die bei dem Kontakt mit gd T Zellen einen additiven Stimulus liefert, der das negative Proliferationssignal von MV neutralisiert. Auch Funktionen antigenpräsentierender Zellen (APC) scheinen differentiell durch MV-Stämme regulierbar zu sein. Die Erkennung von molekularen Mustern von Pathogenen über die Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR) ist eine wichtiger Schritt bei der Aktivierung einer Immunantwort durch APCs. Nachdem die Fähigkeit, mikrobieller Produkte APC über TLRs zu aktivieren, dokumentiert ist, sind nur zwei virale Proteine bekannt, die mit TLR4 interagieren. Mithilfe transgener Reporterzellen konnte demonstriert werden, daß MV-Wildtypstämme, nicht aber Vakzinestämme humanes und murines TLR2, wahrscheinlich mit CD14 als Korezeptor, und nicht TLR4, aktivieren. Die TLR2 agonistische Eigenschaft konnte dem MV-Wildtyp Hämagglutininprotein (H) zugeordnet werden. Der Austausch einer einzigen Aminosäure im WTF-H, Asparagin zu Tyrosin an der Positon 481, welche in an CD46 adaptierten Vakzinestämmen zu finden ist, reichte für den Verlust TLR agonistischer Aktivität aus. Auch in humanen Monozyten konnten Viren, die das authentische WTF-H Protein enthielten, die Expression TLR responsiver Gene wie IL-6 induzieren. Gleichzeitig verursachte die Aktivierung der Monozyten durch die TLR Agonisten, einschließlich der Wildtyp MV, die Expression des allgemeinen MV Rezeptors CD150, der von ruhenden Monozyten nicht exprimiert wird. Die Spezifität der WTF-H und TLR2 Interaktion konnte durch blockierende Antikörper und TLR2-/- Mäuse, die kein IL-6 nach Stimulation mit WTF freisetzen, gezeigt werden. Die Fähigkeit von MV-Wildtypstämmen TLR2 zu aktivieren, könnte wesentlich zu der Immunaktivierung, aber auch zur Ausbreitung und Pathogenese der Infektion beitragen und die Attenuierung von Vakzinestämmen erklären. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine MV-stammspezifische Aktivierung angeborener Immunantworten, welche die adaptive Immunität modulieren können.
Die geplante Ausrottung der Masern bis 2020 und die damit eventuell einhergehende Beendigung der Masernimpfung könnten die Voraussetzungen dafür schaffen, dass andere Morbilliviren, wie beispielsweise das Hundestaupevirus (CDV), einen Wirtswechsel zum Menschen vollbringen könnten. CDV ist ein hoch ansteckendes Pathogen und besitzt einen weiten Wirtstropismus, der sich aktuell immer weiter ausbreitet. Im Gegensatz dazu kann das Masernvirus (MV) nahezu ausschließlich Menschen und nur sehr bedingt wenige Affenarten infizieren.
In dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass eine Adaptierung des rekombinanten wildtypischen CDV-Stammes CDV-75/17red an den humanen Rezeptor SLAM (signaling lymphocytic activation molecule, CD150) reproduzierbar und innerhalb weniger Passagen erfolgt. Bei der Adaptierung an das humane SLAM ist dabei nur eine Mutation in dem Gen für das virale Hämagglutinin notwendig. Diese Mutation an Position 8697 von A zu G im viralen Genom (Aminosäure D540G im Hämagglutinin) konnte reproduzierbar detektiert werden, obwohl veröffentlicht wurde, dass unterschiedliche Mutationen im Hämagglutinin verschiedener CDV-Stämme eine SLAM-Adaptierung ermöglichen. Die Mutation D540G im Hämagglutinin des humanen SLAM-adaptierten CDV-A75/17red kompensiert eine negative Ladung der Aminosäure 71E, die speziesspezifisch im humanen SLAM vorhanden ist. Durch Wachstumskinetiken konnte belegt werden, dass das an humanes SLAM-adaptierte CDV-A75/17red auch weiterhin das canine SLAM effizient verwendet. Ein weiterer Eintrittsrezeptor, humanes Nectin4, konnte mit demselben CDV-Stamm ohne adaptive Mutation in den viralen Hüllproteingenen benutzt werden.
Wachstumskurven auf verschiedenen humanen B-Lymphozyten Zelllinien zeigen allerdings, dass eine alleinige Adaptierung an die humanen Wirtszellrezeptoren, für eine effiziente Virusreplikation, nicht ausreicht. Damit das CDV die Speziesbarriere durchbrechen kann, muss offenbar ein weiterer Adaptierungsprozess an die humanen Wirtszellen erfolgen, der voraussichtlich mit umfangreicheren Mutationen des viralen Genoms einhergehen würde.
Diese Ergebnisse unterstreichen, dass intrinsische Faktoren und das angeborene Immunsystem eine wichtige Barriere bilden und den Menschen vor einer CDV-Infektion schützen. Allerdings würde eine Fortführung der MV-Impfung auch nach Ausrottung der Masern, aufgrund der Kreuzreaktivität gegen andere Morbilliviren, den Schutz vor einer möglichen Adaptierung eines Morbillivirus, wie CDV, an den Menschen deutlich verstärken.
Mechanismen der TZR-abhängigen und -unabhängigen Aktivierung primärer T-Zellen der Ratte durch CD 28
(2000)
Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.
Die Kostimulation über den CD28 Oberflächenrezeptor spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der Proliferation von T-Zellen, in deren Differenzierung zu Effektorzellen, als auch in der Entwicklung und Kontrolle von regulatorischen T-Zellen. Diese Schlüsselrolle macht CD28 zu einer interessanten Zielstruktur, um den Einfluss monoklonaler Antikörper auf die Entwicklung und Homöostase von T-Zellen zu analysieren. Die hier verwendeten Antikörper lassen sich funktionell in zwei verschiedene Kategorien einteilen: zum Einen in konventionelle Antikörper (E18 mAk), welche die physiologische Rezeptor-Liganden Interaktion blockieren, und zum Anderen in superagonistische Antikörper (D665 mAk), die in der Lage sind ruhende T-Zellen ohne eine Ligation des T-Zell Rezeptors voll zu aktivieren. In der vorliegenden Arbeit konnte in verschiedenen in-vitro und in-vivo Experimenten gezeigt werden, dass eine Behandlung mit dem CD28 Superagonisten keinen Einfluss auf die Differenzierung von T-Zellen im Thymus nimmt, und die Zusammensetzung der einzelnen Zellpopulationen in diesem Organ unbeeinflusst bleibt. Bei Verwendung blockierender anti-Maus CD28 mAk zeigte sich in sämtlichen Untersuchungen eine beeinträchtigte Entwicklung von regulatorischen T-Zellen innerhalb des Thymus, während die anderen Zellpopulationen unbeeinflusst blieben. Auch in Analysen peripherer Lymphknoten lag der Anteil regulatorischer T-Zellen nach Behandlung mit E18 mAk unter den Kontrollwerten. Durch eine chronische Blockade von CD28 mittels E18 mAk ließ sich die Gesamtanzahl an Tregs in peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus drastisch senken, ohne dass es zu einem vollständigen Verschwinden dieser Zellpopulation kam. Auch die absolute Zahl an CD4 positiven T-Zellen innerhalb der peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus der behandelten Tiere lag deutlich unter der Kontrolle. Diese Beobachtungen waren 13 Wochen nach Beendigung der Antikörper-Applikationen vollständig reversibel und zu keinem Zeitpunkt des Experimentes ergaben sich klinische oder serologische Hinweise auf die Entwicklung von Autoimmunität trotz niedriger Treg- Zahlen über mehrere Wochen.
Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.
Dies ist ein Lehrbuch über die HIV-1 Replikation, Pathogenese und Therapie. Es richtet sich an Studenten der Biologie und der Medizin, die etwas mehr über HIV erfahren wollen und stellt neben virologischen Themen auch die zellulären Grundlagen dar. Es umfasst den Viruseintritt, die reverse Transkription, Genom-Integration, Transkriptionsregualtion, die Kotrolle des Spleißens, der Polyadenylierung und des RNA-Exportes. Die Darstellung wird abgerundet mit Kapiteln zum intrazellulärem Transport, zu Nef und zum Virusassembly. In zwei weiteren Kapitel wird die HIV-1 Pathogenese und die Therapie besprochen. Zur Lernkontrolle sind den Kapiteln Fragen und auch Klausurfragen angefügt.
Recent evidence indicates that foamy viruses (FVs) are the oldest retroviruses (RVs) that we know and coevolved with their hosts for several hundred million years. This coevolution may have contributed to the non-pathogenicity of FVs, an important factor in development of foamy viral vectors in gene therapy. However, various questions on the molecular evolution of FVs remain still unanswered. The analysis of the spectrum of animal species infected by exogenous FVs or harboring endogenous FV elements in their genome is pivotal. Furthermore, animal studies might reveal important issues, such as the identification of the FV in vivo target cells, which than require a detailed characterization, to resolve the molecular basis of the accuracy with which FVs copy their genome. The issues of the extent of FV viremia and of the nature of the virion genome (RNA vs. DNA) also need to be experimentally addressed.
Background
During reverse transcription, retroviruses duplicate the long terminal repeats (LTRs). These identical LTRs carry both promoter regions and functional polyadenylation sites. To express full-length transcripts, retroviruses have to suppress polyadenylation in the 5′LTR and activate polyadenylation in the 3′LTR. Foamy viruses have a unique LTR structure with respect to the location of the major splice donor (MSD), which is located upstream of the polyadenylation signal.
Results
Here, we describe the mechanisms of foamy viruses regulating polyadenylation. We show that binding of the U1 small nuclear ribonucleoprotein (U1snRNP) to the MSD suppresses polyadenylation at the 5′LTR. In contrast, polyadenylation at the 3′LTR is achieved by adoption of a different RNA structure at the MSD region, which blocks U1snRNP binding and furthers RNA cleavage and subsequent polyadenylation.
Conclusion
Recently, it was shown that U1snRNP is able to suppress the usage of intronic cryptic polyadenylation sites in the cellular genome. Foamy viruses take advantage of this surveillance mechanism to suppress premature polyadenylation at the 5’end of their RNA. At the 3’end, Foamy viruses use a secondary structure to presumably block access of U1snRNP and thereby activate polyadenylation at the end of the genome. Our data reveal a contribution of U1snRNP to cellular polyadenylation site selection and to the regulation of gene expression.
Despite recent therapeutic advances the prognosis of heart failure remains poor. Recent research suggests that heart failure is a heterogeneous syndrome and that many patients have stimulating auto-antibodies directed against the second extracellular loop of the \(β_1\) adrenergic receptor \((β_1EC2)\). In a human-analogous rat model such antibodies cause myocyte damage and heart failure. Here we used this model to test a novel antibody-directed strategy aiming to prevent and/or treat antibody-induced cardiomyopathy. To generate heart failure, we immunised n = 76/114 rats with a fusion protein containing the human β1EC2 (amino-acids 195–225) every 4 weeks; n = 38/114 rats were control-injected with 0.9% NaCl. Intravenous application of a novel cyclic peptide mimicking \(β_1EC2\) (\(β_1EC2-CP\), 1.0 mg/kg every 4 weeks) or administration of the \(β_1-blocker\) bisoprolol (15 mg/kg/day orally) was initiated either 6 weeks (cardiac function still normal, prevention-study, n = 24 (16 treated vs. 8 untreated)) or 8.5 months after the 1st immunisation (onset of cardiomyopathy, therapy-study, n = 52 (40 treated vs. 12 untreated)); n = 8/52 rats from the therapy-study received \(β_1EC2-CP/bisoprolol\) co-treatment. We found that \(β_1EC2-CP\) prevented and (alone or as add-on drug) treated antibody-induced cardiac damage in the rat, and that its efficacy was superior to mono-treatment with bisoprolol, a standard drug in heart failure. While bisoprolol mono-therapy was able to stop disease-progression, \(β_1EC2-CP\) mono-therapy -or as an add-on to bisoprolol- almost fully reversed antibody-induced cardiac damage. The cyclo¬peptide acted both by scavenging free \(anti-β_1EC2-antibodies\) and by targeting \(β_1EC2\)-specific memory B-cells involved in antibody-production. Our model provides the basis for the clinical translation of a novel double-acting therapeutic strategy that scavenges harmful \(anti-β_1EC2-antibodies\) and also selectively depletes memory B-cells involved in the production of such antibodies. Treatment with immuno-modulating cyclopeptides alone or as an add-on to \(β_1\)-blockade represents a promising new therapeutic option in immune-mediated heart failure.
Progressive encephalopathy and myopathy in transgenic mice expressing human foamy virus genes
(1991)
Transgenie mice carrying the bel region of human foamy retrovirus (HFV) under transcriptional control of its own long terminal repeat expressed tbe transgene in their centrat nervous systems and in smootb and striated muscle tissues. The animals developed a progressive degenerative disease of tbe centrat nervous system and of the striated muscle. Because expression of tbe transgene was dosely correlated witb the appearance of structural damage and inflammatory reactions were scanty, the disease is likely to be caused directly by tbe HFV proteins. These unexpected findings call for a reevaluation of tbe patbogenic potential of HFV in humans.
Die MV-induzierte Immunsuppression ist unter anderem durch eine Leukopenie gekennzeichnet und so wurde in der vorliegenden Studie die Frage nach den Auswirkungen einer Interaktion des MV mit Knochenmarkszellen adressiert. Humane HSC, multipotente und oligopotente hämatopoetische Vorläuferzellen (HPC) können, im Gegensatz zu murinen, nicht anhand des SLAM-codes unterschieden werden. Während CD244 auf allen HS/PC exprimiert wird, markieren CD150 und CD48 eher humane HPC als HSC. Trotz vorhandener CD150+-HPC beschränkt sich die Infektion mit wildtypischen MV nicht auf diese Subpopulation, sondern erfolgt, wie bei CD150- Stromazellen, unabhängig von diesem Rezeptor. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die MV-Exposition von HS/PC in vitro weder deren Proliferation noch die Fähigkeit zur Koloniebildung stört. Dass sich eine MV-Infektion in Kokulturen von HS/PC mit Stromazellen vom jeweils einen auf den anderen Zelltypen überträgt, könnte als möglicher Mechanismus zur Ausbreitung und Etablierung einer Infektion im Knochenmark angesehen werden. Obwohl in vitro keine Inhibition der Expansion von HS/PC beobachtet wurde, stört eine vorangegangene MV-Exposition die Kurzzeitrekonstitution bestrahlter NOD/SCID-Mäuse massiv. Diese Inhibition der Hämatopoese ist jedoch transient und hat keine Auswirkungen auf die Langzeitrekonstitution. Da weder die Migration der transplantierten HS/PC zum Knochenmark gestört ist noch die Knochenmarkszellen der Maus permissiv für eine MV-Infektion sind, ist die beobachtete Inhibition auf einen direkten Einfluss der MV-Exposition auf die HS/PC zurückzuführen.
Transforming growth factor \(\beta\) (TGF-\(\beta\)) has a growth-inhibitory effect on numerous different cell types of the immune system, including T lymphocytes. We show in this study that the inhibitory action of TGF-\(\beta\) on T lymphocytes is accompanied by a block of interleukin 2 (IL-2) gene expression which is mediated, at least in part, by inhibition of IL-2 promoter/enhancer activity. The functional analysis of cis-regulatory (protoenhancer) elements of the IL-2 enhancer/promoter region showed that the most TGF-\(\beta\)-responsive element maps to its so-called upstream promoter site. The proto-enhancer activity of the upstream promoter site element is also inhibited by cyclosporin A. The upstream promoter site DNA harbors two noncanonical, closely linked binding sequences for octamer and AP-1-like factors. Both sites are involved in the establishment of IL-2 enhancer activity. Since the activity of genuine octamer sites but not that of AP-1-binding sites is also impaired by TGF-\(\beta\) and cyclosporin A in E14 T lymphoma cells, we conclude that both immunosuppressives interfere with the activity but not the DNA binding of octamer factors in T lymphocytes.
Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-γ-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-γ Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-γ Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INFγ und TNFα, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich.
Background: Integrase strand transfer inhibitors (INSTIs) are the latest addition to the array of antiretroviral compounds used to treat an infection with Human Immunodeficiency Virus (HIV). Due to their high efficacy and increased tolerability, INSTIs have become an integral part of first-line therapy in most high-income countries over the past years. However, little is known about HIV-1’s genetic inter- and intra-subtype diversity on the Integrase (IN)-gene and its impact on the emergence of INSTI-resistance. In the absence of a functional cure, long-term efficacy of first-line compounds remains paramount for reducing virological failure and curbing on-going HIV transmissions. South Africa, harbouring more than 20% of the global HIV burden (7.7 / 37.9 million people), requires international attention in order to globally pursue UNAIDS’ (Joint United Nations Programme on HIV/AIDS) 90-90-90 goals and the road to ending the HIV/AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) pandemic by 2030.
Methods: In this study, the prevalence of INSTI-resistance associated mutations (RAM) was investigated in a cohort of 169 archived drug-naïve blood samples from multiple collection sites around Cape Town, South Africa. Viral RNA was isolated from plasma samples, the integrase fragment amplified by RT-PCR and subsequently sequenced by Sanger-sequencing. Additionally, all publicly available drug-naïve, South African IN sequences, isolated before the availability of the first INSTIs in 2007, were retrieved from the Los Alamos HIV sequence database (n=284). All sequences were analysed for RAMs using the Stanford HIV Drug resistance database. The identification of polymorphism in the South African subtype C IN consensus sequence allowed for comparative analyses with global subtype B, as well as subtype C sequences, from countries other than South Africa.
Results: The IN gene could be amplified and sequenced in 95/169 samples (56%). Phylogenetic inference revealed close homology between three sequence-pairs, warranting the exclusion of 3/95 sequences from further analyses. Of the 92 samples used for mutational analyses, 86/92 (93.5%) belonged to subtype C, 5/92 (5.4%) to subtype B and 1/92 (1.1%) to subtype A. The prevalence of major and accessory INSTI RAMs was 0/92 (0%) and 1/91 (1.1%), respectively, similar to the observed rates of 8/284 (2.8%) and 8/284 (2.8%) in the database sequences (p = 0.2076 and p = 0.6944, Fisher’s exact test). Compared to subtype B IN sequences, 15 polymorphisms were significantly enriched in South African subtype C sequences (corrected p<0.0015. Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure).
Compared to subtype C IN sequences isolated outside South Africa, four polymorphisms were significantly enriched in this study cohort (corrected p<0.0014, Fisher’s exact test, Bonferroni post-hoc procedure). The highest prevalence margin was observed for the polymorphism Met50Ile being present in 60.1% of South African subtype C sequences, compared to 37% in non-South African subtype C sequences.
Conclusions: The low prevalence of major and minor RAMs in all South African Integrase sequences predicts a high susceptibility to INSTIs, however, the presence of natural polymorphisms, in particular Met50Ile, in the majority of sequences warrants further monitoring under therapeutic pressure, as their role in mutational pathways leading to INSTI- resistance is yet to be determined. Additionally, this study revealed the presence of substantial inter- and intra-subtype diversity within the HIV-1 Subtype C IN-gene. These results implicate the need for more research on a regional, potentially patient-specific level, as mutational insights from other diverse backgrounds may not accurately represent the South African context. The implementation of a national pre-treatment INSTI-resistance screening program may provide necessary insights into the development of mutational pathways leading to INSTI-resistance under therapeutic pressure for the South African context and thereby bring South Africa one step closer to achieving UNAIDS 90-90-90 goals and ending the AIDS epidemic by 2030.
Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe war bekannt, dass Mäuse durch Injektion von tolerogenen, TNF-gereiften und MOG-beladenen DZ vor EAE geschützt werden können. Eines der Ziele dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das koinhibitorische Molekül B7-H1 auf der Oberfläche der DZ einen Einfluss auf das tolerogene Potential der DZ hat. Dazu wurden B7-H1-defiziente DZ generiert, mit TNF gereift, mit MOG-Peptid beladen und intravenös in Mäuse injiziert, bevor die EAE induziert wurde. Es zeigte sich, dass diese DZ die Tiere sogar noch besser vor der Krankheit schützen konnten als die WT DZ. Die Injektion der B7-H1-/- DZ bewirkte eine verstärkte Produktion von IL-10 and IL-13 nach Restimulation der Milz-Zellen in vitro und eine erhöhte Menge von protektiven Serum-Zytokinen (IL-4 und IL-13), welche von NKT-Zellen produziert wurden. Versuche mit CD1d-/- und Jα281-/- Mäusen haben ergeben, dass diese Zytokine von Typ II NKT-Zellen produziert wurden. Weitere Versuche mit Typ I und II NKT-Zell-Linien haben bestätigt, dass nur die Typ II NKT-Zellen von einem endogenen CD1d-Ligand der DZ stimuliert werden können. Außerdem wird dies über B7-H1 reguliert, da die NKT-Zell-Reaktion in Abwesenheit von B7-H1 stärker ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass neben den NKT-Zellen MZ B-Zellen nötig sind, um die Mäuse vor der EAE-Entwicklung zu schützen. Versuche mit CD22-/- Mäusen, welche eine Reduktion in der MZ B-Zell-Population zeigen, haben ergeben, dass in Abwesenheit von MZ B-Zellen keine EAE-Protektion mehr möglich ist. In dieser Arbeit wurde auch der Effekt von Glykolipid-Antigenen, welche einen Großteil der Myelinscheide des ZNS ausmachen, auf DZ untersucht. Ausgewählte Lipide führen zu einer Reifung der DZ, welche sich in der verstärkten MHC II- und CD86-Expression, jedoch nicht in der Produktion von Zytokinen äußert. Außerdem sind diese Lipid-gereiften DZ in der Lage T-Zellen zu stimulieren. Als letzter Punkt wurde in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen Masern-Virus-Infektionen und EAE untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine cerebrale Masern-Infektion zusammen mit einer EAE-Induktion einen dramatischen Effekt auf die Tiere hat. Für diese Versuche wurde ein Maus-Modell einer persistierenden Masern-Infektion im Gehirn verwendet. Diese Tiere leben nach der Virus-Behandlung ohne Symptome. Nach der EAE-Induktion starben diese Tiere jedoch bereits wenige Tage später aufgrund einer MOG-Peptid-spezifischen Reaktion.
Background: Dendritic cells (DC) can act tolerogenic at a semi-mature stage by induction of protective CD4+ T cell and NKT cell responses. Methodology/Principal Findings: Here we studied the role of the co-inhibitory molecule B7-H1 (PD-L1, CD274) on semimature DC that were generated from bone marrow (BM) cells of B7-H12/2 mice and applied to the model of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). Injections of B7-H1-deficient DC showed increased EAE protection as compared to wild type (WT)-DC. Injections of B7-H12/2 TNF-DC induced higher release of peptide-specific IL-10 and IL-13 after restimulation in vitro together with elevated serum cytokines IL-4 and IL-13 produced by NKT cells, and reduced IL-17 and IFN-c production in the CNS. Experiments in CD1d2/2 and Ja2812/2 mice as well as with type I and II NKT cell lines indicated that only type II NKT cells but not type I NKT cells (invariant NKT cells) could be stimulated by an endogenous CD1d-ligand on DC and were responsible for the increased serum cytokine production in the absence of B7-H1. Conclusions/Significance: Together, our data indicate that BM-DC express an endogenous CD1d ligand and B7-H1 to ihibit type II but not type I NKT cells. In the absence of B7-H1 on these DC their tolerogenic potential to stimulate tolerogenic CD4+ and NKT cell responses is enhanced.
Intrathecal, Polyspecific Antiviral Immune Response in Oligoclonal Band Negative Multiple Sclerosis
(2012)
Background: Oligoclonal bands (OCB) are detected in the cerebrospinal fluid (CSF) in more than 95% of patients with multiple sclerosis (MS) in the Western hemisphere. Here we evaluated the intrathecal, polyspecific antiviral immune response as a potential diagnostic CSF marker for OCB-negative MS patients.
Methodology/Principal Findings: We tested 46 OCB-negative German patients with paraclinically well defined, definite MS. Sixteen OCB-negative patients with a clear diagnosis of other autoimmune CNS disorders and 37 neurological patients without evidence for autoimmune CNS inflammation served as control groups. Antibodies against measles, rubella, varicella zoster and herpes simplex virus in paired serum and CSF samples were determined by ELISA, and virus-specific immunoglobulin G antibody indices were calculated. An intrathecal antibody synthesis against at least one neurotropic virus was detected in 8 of 26 (31%) patients with relapsing-remitting MS, 8 of 12 (67%) with secondary progressive MS and 5 of 8 (63%) with primary progressive MS, in 3 of 16 (19%) CNS autoimmune and 3 of 37 (8%) non-autoimmune control patients. Antibody synthesis against two or more viruses was found in 11 of 46 (24%) MS patients but in neither of the two control groups. On average, MS patients with a positive antiviral immune response were older and had a longer disease duration than those without.
Conclusion: Determination of the intrathecal, polyspecific antiviral immune response may allow to establish a CSF-supported diagnosis of MS in OCB-negative patients when two or more of the four virus antibody indices are elevated.
Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Analyse von verschiedenen immunologisch relevanten Parametern im Verlauf einer Masern-Erkrankung bzw. nach einer Masern-Vakzinierung im Hinblick auf ein Verständnis der Ursache für die mit einer Masern-Infektion einhergehende Immunsuppression. Dabei wurden Blutproben von Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten nach Auftreten des Exanthems bzw. nach der Impfung untersucht. Zunächst konnte in einer quantitativen Analyse aufgezeigt werden, dass im Rahmen der auftretenden Leukopenie, der prozentuale Anteil distinkter Zelltypen, wie B-, NK-, α/β- und γ/δ-T-Zellen, sowie Monozyten und dendritische Zellen (DCs), sowohl bei Patienten mit akuter Masern-Erkrankung, als auch nach einer Masern-Impfung weitgehend konstant blieb. Für eine Erfassung des Aktivierungsgrades von α/β- und γ/δ-T-Zellen wurde der jeweilige Anteil CD11a-, CD54-, CD69- und CD25-exprimierender CD3-positiver Zellen bei Masernpatienten und Impflingen bestimmt. Dabei ergab sich generell in allen o.g. Untersuchungen für γ/δ-T-Zellen auf der Basis distinkter Aktivierungsmarker ein höherer Prozentsatz positiver Zellen als für α/β-T-Zellen. Es konnte sowohl für α/β-T-Zellen, als auch für γ/δ-T-Zellen ein erhöhter Prozentsatz CD54 (ICAM-1)-exprimierender Zellen und ein deutlich geringerer Anteil CD69-exprimierender α/β-T-Zellen gezeigt werden. Diese Unterschiede blieben über den gesamten Zeitraum (d21 nach Vakzinierung bzw. post Exanthem) erhalten. Desweiteren konnte bei den γ/δ-T-Zellen von Masernpatienten für die CD11a-exprimierenden Zellen eine prozentuale Zunahme festgestellt werden; nicht jedoch bei Impflingen. Den regulatorischen CD4+/CD25+/CTLA-4+ T-Zellen werden suppressive Aktivitäten im Verlauf einer Immunreaktion zugeschrieben. Ein Vergleich der Proben von Masernpatienten in verschiedenen Infektionsstadien ergab, Anzeichen auf zunehmende Aktivität CD4+/CD25+/CTLA-4+ Treg-Zellen. Beim Vergleich der Akutpatienten und Impflinge bei der Produktion von Typ1 IFN im Rahmen der Immunreaktion zeigten die Ergebnisse, dass im Verlauf der Erkrankung die Mengen an Typ1 IFN allmählich abfielen, während sich nach Vakzinierung das Bild uneinheitlich darstellte. Beim Vergleich der Proliferationsfähigkeit der α/β- und der γ/δ-T-Zellen von Masernpatienten und Impflingen zeigte sich im Verlauf der Akuterkrankung eine deutliche Reduktion, während die Ergebnisse der Impflinge weitgehend unverändert bis progredient waren. Für die Ermittlung der Kapazität zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen wurden isolierte Monozyten restimuliert und die Produktion von IL-6 mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die Monozyten von Impflingen im Vergleich zu Kontrollen mit einer erhöhten IL-6 Produktion reagierten. Dagegen war bei den Monozyten von Masern-Patienten die IL-6 Produktion insgesamt supprimiert. Insgesamt zeigen die Befunde, dass eine Reihe von Parametern im Verlauf der Masernerkrankung und nach einer Vakzinierung bemerkenswert unterschiedliche Reaktionsmuster aufweisen.
Background
Alveolar echinococcosis (AE), caused by the metacestode of the tapeworm Echinococcus multilocularis, is a lethal zoonosis associated with host immunomodulation. T helper cells are instrumental to control the disease in the host. Whereas Th1 cells can restrict parasite proliferation, Th2 immune responses are associated with parasite proliferation. Although the early phase of host colonization by E. multilocularis is dominated by a potentially parasitocidal Th1 immune response, the molecular basis of this response is unknown.
Principal Findings
We describe EmTIP, an E. multilocularis homologue of the human T-cell immunomodulatory protein, TIP. By immunohistochemistry we show EmTIP localization to the intercellular space within parasite larvae. Immunoprecipitation and Western blot experiments revealed the presence of EmTIP in the excretory/secretory (E/S) products of parasite primary cell cultures, representing the early developing metacestode, but not in those of mature metacestode vesicles. Using an in vitro T-cell stimulation assay, we found that primary cell E/S products promoted interferon (IFN)-γ release by murine CD4+ T-cells, whereas metacestode E/S products did not. IFN-γ release by T-cells exposed to parasite products was abrogated by an anti-EmTIP antibody. When recombinantly expressed, EmTIP promoted IFN-γ release by CD4+ T-cells in vitro. After incubation with anti-EmTIP antibody, primary cells showed an impaired ability to proliferate and to form metacestode vesicles in vitro.
Conclusions
We provide for the first time a possible explanation for the early Th1 response observed during E. multilocularis infections. Our data indicate that parasite primary cells release a T-cell immunomodulatory protein, EmTIP, capable of promoting IFN-γ release by CD4+ T-cells, which is probably driving or supporting the onset of the early Th1 response during AE. The impairment of primary cell proliferation and the inhibition of metacestode vesicle formation by anti-EmTIP antibodies suggest that this factor fulfills an important role in early E. multilocularis development within the intermediate host.
Recently, we have shown that C6-ceramides efficiently suppress viral replication by trapping the virus in lysosomes. Here, we use antiviral assays to evaluate a synthetic ceramide derivative α-NH2-ω-N3-C6-ceramide (AKS461) and to confirm the biological activity of C6-ceramides inhibiting SARS-CoV-2. Click-labeling with a fluorophore demonstrated that AKS461 accumulates in lysosomes. Previously, it has been shown that suppression of SARS-CoV-2 replication can be cell-type specific. Thus, AKS461 inhibited SARS-CoV-2 replication in Huh-7, Vero, and Calu-3 cells up to 2.5 orders of magnitude. The results were confirmed by CoronaFISH, indicating that AKS461 acts comparable to the unmodified C6-ceramide. Thus, AKS461 serves as a tool to study ceramide-associated cellular and viral pathways, such as SARS-CoV-2 infections, and it helped to identify lysosomes as the central organelle of C6-ceramides to inhibit viral replication.
In vitro and in vivo infection of rhesus monkey microglial cells by simian immunodeficiency virus
(1993)
The observation that microglial cells in brain tissue are probably a major target for human immunodeficiency virus (HIV) infection has raised interest in the pathogenic role of this cell population for the development of neuro-AIOS. Since it is very difficult to obtain microglia from normal or diseased human brain we studied microglial cells isolated from fresh brain tissue of uninfected and simian immunodeficiency virus (SIV) infected rhesus monkeys (Macacca mulatta) in comparison to peripheral blood macrophages. Besides the characterization of the phenotypes of these two cell populations, we examined the replication of SIV in the cells in addition to the effect of viral infection on the expression of cell surface molecules. We found that microglia and macrophages support replication of the wild-type SIV\(_{mac25}\), strain as well as the infectious clone (SIV\(_239\)). Infectious viruswas produced and a CPE developed. Isolated microglial cells from SIV-infected monkeys were latently infected independent of the presence of neuropathological lesions and produced infectious virus after 20-25 days in culture. In situ hybridization revealed that only a small percentage of isolated microglial cells are productively infected in vivo, yet the majority of these expressed MHC class II molecules. This indicated a state of activation that is acquired in vivo. These findings indicate that microglia are a prime target cell for SIV infection in CNS tissue.
Despite the obvious clinical significance of post-stroke angiogenesis in aged subjects, a detailed transcriptomic analysis of post-stroke angiogenesis has not yet been undertaken in an aged experimental model. In this study, by combining stroke transcriptomics with immunohistochemistry in aged rats and post-stroke patients, we sought to identify an age-specific gene expression pattern that may characterize the angiogenic process after stroke. We found that both young and old infarcted rats initiated vigorous angiogenesis. However, the young rats had a higher vascular density by day 14 post-stroke. “New-for-stroke” genes that were linked to the increased vasculature density in young animals included Angpt2, Angptl2, Angptl4, Cib1, Ccr2, Col4a2, Cxcl1, Lef1, Hhex, Lamc1, Nid2, Pcam1, Plod2, Runx3, Scpep1, S100a4, Tgfbi, and Wnt4, which are required for sprouting angiogenesis, reconstruction of the basal lamina (BL), and the resolution phase. The vast majority of genes involved in sprouting angiogenesis (Angpt2, Angptl4, Cib1, Col8a1, Nrp1, Pcam1, Pttg1ip, Rac2, Runx1, Tnp4, Wnt4); reconstruction of a new BL (Col4a2, Lamc1, Plod2); or tube formation and maturation (Angpt1, Gpc3, Igfbp7, Sparc, Tie2, Tnfsf10), had however, a delayed upregulation in the aged rats. The angiogenic response in aged rats was further diminished by the persistent upregulation of “inflammatory” genes (Cxcl12, Mmp8, Mmp12, Mmp14, Mpeg1, Tnfrsf1a, Tnfrsf1b) and vigorous expression of genes required for the buildup of the fibrotic scar (Cthrc1, Il6ra, Il13ar1, Il18, Mmp2, Rassf4, Tgfb1, Tgfbr2, Timp1). Beyond this barrier, angiogenesis in the aged brains was similar to that in young brains. We also found that the aged human brain is capable of mounting a vigorous angiogenic response after stroke, which most likely reflects the remaining brain plasticity of the aged brain.
Dendritic cells (DCs) can be sub-divided into various subsets that play specialized roles in priming of adaptive immune responses. Atherosclerosis is regarded as a chronic inflammatory disease of the vessel wall and DCs can be found in non-inflamed and diseased arteries. We here performed a systematic analyses of DCs subsets during atherogenesis. Our data indicate that distinct DC subsets can be localized in the vessel wall. In C57BL/6 and low density lipoprotein receptor-deficient (Ldlr−/−) mice, CD11c+ MHCII+ DCs could be discriminated into CD103− CD11b+F4/80+, CD11b+F4/80− and CD11b−F4/80− DCs and CD103+ CD11b−F4/80− DCs. Except for CD103− CD11b− F4/80− DCs, these subsets expanded in high fat diet-fed Ldlr−/− mice. Signal-regulatory protein (Sirp)-α was detected on aortic macrophages, CD11b+ DCs, and partially on CD103− CD11b− F4/80− but not on CD103+ DCs. Notably, in FMS-like tyrosine kinase 3-ligand-deficient (Flt3l−/−) mice, a specific loss of CD103+ DCs but also CD103− CD11b+ F4/80− DCs was evidenced. Aortic CD103+ and CD11b+ F4/80− CD103− DCs may thus belong to conventional rather than monocyte-derived DCs, given their dependence on Flt3L-signalling. CD64, postulated to distinguish macrophages from DCs, could not be detected on DC subsets under physiological conditions, but appeared in a fraction of CD103− CD11b+ F4/80− and CD11b+ F4/80+ cells in atherosclerotic Ldlr−/− mice. The emergence of CD64 expression in atherosclerosis may indicate that CD11b+ F4/80− DCs similar to CD11b+ F4/80+ DCs are at least in part derived from immigrated monocytes during atherosclerotic lesion formation. Our data advance our knowledge about the presence of distinct DC subsets and their accumulation characteristics in atherosclerosis, and may help to assist in future studies aiming at specific DC-based therapeutic strategies for the treatment of chronic vascular inflammation.
Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes.
For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus.
In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human.
By promoting ceramide release at the cytosolic membrane leaflet, the neutral sphingomyelinase 2 (NSM) is capable of organizing receptor and signalosome segregation. Its role in T cell receptor (TCR) signaling remained so far unknown. We now show that TCR-driven NSM activation is dispensable for TCR clustering and initial phosphorylation, but of crucial importance for further signal amplification. In particular, at low doses of TCR stimulatory antibodies, NSM is required for Ca\(^{2+}\) mobilization and T cell proliferation. NSM-deficient T cells lack sustained CD3ζ and ZAP-70 phosphorylation and are unable to polarize and stabilize their microtubular system. We identified PKCζ as the key NSM downstream effector in this second wave of TCR signaling supporting dynamics of microtubule-organizing center (MTOC). Ceramide supplementation rescued PKCζ membrane recruitment and MTOC translocation in NSM-deficient cells. These findings identify the NSM as essential in TCR signaling when dynamic cytoskeletal reorganization promotes continued lateral and vertical supply of TCR signaling components: CD3ζ, Zap70, and PKCζ, and functional immune synapses are organized and stabilized via MTOC polarization.
The activity of neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) to catalyze the conversion of sphingomyelin (SM) to ceramide and phosphocholine at the cytosolic leaflet of plasma membrane (PM) is important in T cell receptor (TCR) signaling. We recently identified PKCζ as a major NSM2 downstream effector which regulates microtubular polarization. It remained, however, unclear to what extent NSM2 activity affected overall composition of PM lipids and downstream effector lipids in antigen stimulated T cells. Here, we provide a detailed lipidomics analyses on PM fractions isolated from TCR stimulated wild type and NSM2 deficient (ΔNSM) Jurkat T cells. This revealed that in addition to that of sphingolipids, NSM2 depletion also affected concentrations of many other lipids. In particular, NSM2 ablation resulted in increase of lyso-phosphatidylcholine (LPC) and lyso-phosphatidylethanolamine (LPE) which both govern PM biophysical properties. Crucially, TCR dependent upregulation of the important T cell signaling lipid diacylglycerol (DAG), which is fundamental for activation of conventional and novel PKCs, was abolished in ΔNSM cells. Moreover, NSM2 activity was found to play an important role in PM cholesterol transport to the endoplasmic reticulum (ER) and production of cholesteryl esters (CE) there. Most importantly, CE accumulation was essential to sustain human T cell proliferation. Accordingly, inhibition of CE generating enzymes, the cholesterol acetyltransferases ACAT1/SOAT1 and ACAT2/SOAT2, impaired TCR driven expansion of both CD4\(^+\) and CD8\(^+\) T cells. In summary, our study reveals an important role of NSM2 in regulating T cell functions by its multiple effects on PM lipids and cholesterol homeostasis.
Enterovirus D68 (EV-D68) has been recognised as a worldwide emerging pathogen associated with severe respiratory symptoms since 2009. We here report EV-D68 detection in hospitalised patients with acute respiratory infection admitted to three tertiary hospitals in Germany between January 2013 and December 2014. From a total of 14,838 respiratory samples obtained during the study period, 246 (1.7%) tested enterovirus-positive and, among these, 39 (15.9%) were identified as EV-D68. Infection was observed in children and teenagers (0–19 years; n=31), the majority (n=22) being under five years-old, as well as in adults > 50 years of age (n=8). No significant difference in prevalence was observed between the 2013 and 2014 seasons. Phylogenetic analyses based on viral protein 1 (VP1) sequences showed co-circulation of different EV-D68 lineages in Germany. Sequence data encompassing the entire capsid region of the genome were analysed to gain information on amino acid changes possibly relevant for immunogenicity and revealed mutations in two recently described pleconaril binding sites.
Um die Verdteidigungsmechanismen der Wirtszelle gegen Sindbisvirusinfektion zu charakterisieren, haben wir in den Extrakten infizierter Zellen. Interferon(IFN)- stimulated- response- element (ISRE)- Bindungsproteine untersucht, welche in der transkriptionellen Induktion von IFN Typ I induzierter Gene beteiligt sind. Mittels Gelretentionsanalyse in der ein humanes Interferon-stimuliertes Gen 15 ( ISG15 ) Verwendung fand, wiesen wir in Extrakten von sindbisinfizierten L-929 Zellen verschiedene Proteinkomplexe nach, die nicht in Extrakten uninfizierter Zellen nachweisbar waren. Übereinstimmung im Laufverhalten mit Extrakten NDV-infizierter Zellen, und in Antikörperversuchen zeigt, dass die sindbisinduzierten Komplexe in L-929 Zellen den bekannten DRAF1 und ISGF3 entsprechen. DRAF1 konnte nach in Sindbisinfektion in Mäuseembryofibroblasten, welche keinen Interferonrezeptor mehr besaßen, nachgewiesen werden.
Cotton rats (Sigmodon hispidus) replicate measles virus (MV) after intranasal infection in the respiratory tract and lymphoid tissue. We have cloned the cotton rat signaling lymphocytic activation molecule (CD150, SLAM) in order to investigate its role as a potential receptor for MV. Cotton rat CD150 displays 58% and 78% amino acid homology with human and mouse CD150, respectively. By staining with a newly generated cotton rat CD150 specific monoclonal antibody expression of CD150 was confirmed in cotton rat lymphoid cells and in tissues with a pattern of expression similar to mouse and humans. Previously, binding of MV hemagglutinin has been shown to be dependent on amino acids 60, 61 and 63 in the V region of CD150. The human molecule contains isoleucine, histidine and valine at these positions and binds to MV-H whereas the mouse molecule contains valine, arginine and leucine and does not function as a receptor for MV. In the cotton rat molecule, amino acids 61 and 63 are identical with the mouse molecule and amino acid 60 with the human molecule. After transfection with cotton rat CD150 HEK 293 T cells became susceptible to infection with single cycle VSV pseudotype virus expressing wild type MV glycoproteins and with a MV wildtype virus. After infection, cells expressing cotton rat CD150 replicated virus to lower levels than cells expressing the human molecule and formed smaller plaques. These data might explain why the cotton rat is a semipermissive model for measles virus infection.
Measles is an ancient disease with historical records as early as the 9th century.
Extensive study as well as advances in scientific knowledge of virology have led to
identification of the viral pathogen and subsequent development of an effective vaccine
leading to global efforts towards measles elimination. In 2018, around 140,000 deaths were
reported due to measles with incomplete vaccine coverage being one of the leading causes
of resurgence. Measles is highly contagious and often regarded as a childhood illness.
However, measles is associated with a number of complications and persistent infections
like subacute sclerosing panencephalitis (SSPE), which have brought into focus the need
for specific anti-viral therapies.
The aim of this study was to target host and viral factors to optimize anti-measles virus
therapy. Our approach was to test a panel of compounds known to inhibit host cell
functions or viral factors for their antiviral effect on measles replication. Primary human
lymphocytes, persistently infected NT2 cells and post-mitotic neurons were used as in vitro
model systems of acute, persistent and neuronal infection respectively to test the inhibitors.
Using the inhibitors Ceranib-2 and SKI-II to target the sphingolipid metabolism enzymes
acid ceramidase and sphingosine kinase in infected human primary lymphocytes, we
observed a decreased protein translational capacity mediated by mTORC1, EIF4E and
ribosomal protein S6 phosphorylation that probably contributes to the antiviral effect. In
the persistently infected neural NT2 cells and post-mitotic neurons derived from LUHMES
cells, we observed effective infection inhibition and viral clearance upon treatment with a
small non-nucleoside inhibitor (ERDRP-0519) specifically targeting the Morbillivirus
large polymerase. Other inhibitors such as Ribavirin and Favipiravir were less effective. To
conclude, 1) we identified a mTOR associated protein translation axis associated with the
sphingolipid metabolism, which affects measles virus replication and 2) In vitro
persistently infected neuronal and post-mitotic neuron models were successfully used as a
rapid method to test antivirals against measles virus.
The bioactive sphingolipids ceramide and sphingosine-1-phosphate (S1P) are involved in the regulation of cell homeostasis and activity ranging from apoptosis to proliferation. We recently described that the two compounds ceranib-2 (inhibiting acid ceramidase) and SKI-II [inhibiting the sphingosine kinases 1 and − 2 (SphK1/2)] reduce mTORC1 activity and measles virus (MV) replication in human primary peripheral blood lymphocytes (PBL) by about one log step. We now further investigated whether mTORC1 downstream signaling and viral protein expression may be affected by ceranib-2 and/or SKI-II. Western blot analyses showed that in uninfected cells the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) was reduced by both inhibitors. Interestingly, MV infection led to an increase of rpS6 protein levels and phosphorylation of eIF4E. Treatment with both inhibitors reduced the rpS6 protein expression, and in addition, SKI-II reduced rpS6 phosphorylation. The phosphorylation of eIF4E was slightly reduced by both inhibitors. In addition, SKI-II led to reduced levels of IKK in MV-infected cells. Both inhibitors reduced the expression of viral proteins and the titers of newly synthesized MV by approximately one log step. As expected, SKI-II and rapamycin reduced also the virally encoded GFP expression; however, ceranib-2 astonishingly led to increased levels of GFP fluorescence. Our findings suggest that the inhibitors ceranib-2 and SKI-II act via differential mechanisms on MV replication. The observed effects on mTORC1 downstream signaling, predominantly the reduction of rpS6 levels by both inhibitors, may affect the translational capacity of the cells and contribute to the antiviral effect in human primary PBL.
Donor CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatory T cells (T reg cells) suppress graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HCT allo-HCT]). Current clinical study protocols rely on the ex vivo expansion of donor T reg cells and their infusion in high numbers. In this study, we present a novel strategy for inhibiting GvHD that is based on the in vivo expansion of recipient T reg cells before allo-HCT, exploiting the crucial role of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) in T reg cell biology. Expanding radiation-resistant host T reg cells in recipient mice using a mouse TNFR2-selective agonist before allo-HCT significantly prolonged survival and reduced GvHD severity in a TNFR2-and T reg cell-dependent manner. The beneficial effects of transplanted T cells against leukemia cells and infectious pathogens remained unaffected. A corresponding human TNFR2-specific agonist expanded human T reg cells in vitro. These observations indicate the potential of our strategy to protect allo-HCT patients from acute GvHD by expanding T reg cells via selective TNFR2 activation in vivo.
Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte
(2010)
Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.
Breakdown of sphingomyelin as catalyzed by the activity of sphingomyelinases profoundly affects biophysical properties of cellular membranes which is particularly important with regard to compartmentalization of surface receptors and their signaling relay. As it is activated both upon TCR ligation and co-stimulation in a spatiotemporally controlled manner, the neutral sphingomyelinase (NSM) has proven to be important in T cell activation, where it appears to play a particularly important role in cytoskeletal reorganization and cell polarization. Because these are important parameters in directional T cell migration and motility in tissues, we analyzed the role of the NSM in these processes. Pharmacological inhibition of NSM interfered with early lymph node homing of T cells in vivo indicating that the enzyme impacts on endothelial adhesion, transendothelial migration, sensing of chemokine gradients or, at a cellular level, acquisition of a polarized phenotype. NSM inhibition reduced adhesion of T cells to TNF-α/IFN-γ activated, but not resting endothelial cells, most likely via inhibiting high-affinity LFA-1 clustering. NSM activity proved to be highly important in directional T cell motility in response to SDF1-α, indicating that their ability to sense and translate chemokine gradients might be NSM dependent. In fact, pharmacological or genetic NSM ablation interfered with T cell polarization both at an overall morphological level and redistribution of CXCR4 and pERM proteins on endothelial cells or fibronectin, as well as with F-actin polymerization in response to SDF1-α stimulation, indicating that efficient directional perception and signaling relay depend on NSM activity. Altogether, these data support a central role of the NSM in T cell recruitment and migration both under homeostatic and inflamed conditions by regulating polarized redistribution of receptors and their coupling to the cytoskeleton.
The development of two conventional dendritic cells (DC) subsets (cDC1 and cDC2) and the plasmacytoid DC (pDC) in vivo and in cultures of bone marrow (BM) cells is mediated by the growth factor Flt3L. However, little is known about the factors that direct the development of the individual DC subsets. Here, we describe the selective in vitro generation of murine ESAM\(^{low}\) CD103\(^{-}\) XCR1\(^{-}\) CD172a\(^{+}\) CD11b\(^{+}\) cDC2 from BM by treatment with a combination of Flt3L, LIF, and IL‐10 (collectively named as FL10). FL10 promotes common dendritic cell progenitors (CDP) proliferation in the cultures, similar to Flt3L and CDP sorted and cultured in FL10 generate exclusively cDC2. These cDC2 express the transcription factors Irf4, Klf4, and Notch2, and their growth is reduced using BM from Irf4\(^{-/-}\) mice, but the expression of Batf3 and Tcf4 is low. Functionally they respond to TLR3, TLR4, and TLR9 signals by upregulation of the surface maturation markers MHC II, CD80, CD86, and CD40, while they poorly secrete proinflammatory cytokines. Peptide presentation to TCR transgenic OT‐II cells induced proliferation and IFN‐γ production that was similar to GM‐CSF‐generated BM‐DC and higher than Flt3L‐generated DC. Together, our data support that FL10 culture of BM cells selectively promotes CDP‐derived ESAM\(^{low}\) cDC2 (cDC2B) development and survival in vitro.
Multiple myeloma remains a largely incurable disease of clonally expanding malignant plasma cells. The bone marrow microenvironment harbors treatment-resistant myeloma cells, which eventually lead to disease relapse in patients. In the bone marrow, CD4\(^{+}\)FoxP3\(^{+}\) regulatory T cells (Tregs) are highly abundant amongst CD4\(^{+}\) T cells providing an immune protective niche for different long-living cell populations, e.g., hematopoietic stem cells. Here, we addressed the functional role of Tregs in multiple myeloma dissemination to bone marrow compartments and disease progression. To investigate the immune regulation of multiple myeloma, we utilized syngeneic immunocompetent murine multiple myeloma models in two different genetic backgrounds. Analyzing the spatial immune architecture of multiple myeloma revealed that the bone marrow Tregs accumulated in the vicinity of malignant plasma cells and displayed an activated phenotype. In vivo Treg depletion prevented multiple myeloma dissemination in both models. Importantly, short-term in vivo depletion of Tregs in mice with established multiple myeloma evoked a potent CD8 T cell- and NK cell-mediated immune response resulting in complete and stable remission. Conclusively, this preclinical in-vivo study suggests that Tregs are an attractive target for the treatment of multiple myeloma.
Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lectine). Mit der äußersten der 7 extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialinsäure interagieren. In der cytoplasmatischen Domäne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungeklärt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerstörte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Domäne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren für CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. Für beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingeführten Mutationen vollständig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chimäre Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank ermöglichte die Verlängerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch öffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Veränderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerstörten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalität des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig für die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialinsäure auf der selben Zelloberfläche (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellulären Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialinsäure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-Mäusen, aber nur ca. 4,5% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- Mäusen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialinsäure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zurückzuführen. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In Übereinstimmung damit führte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abhängiger Demaskierung. 4. FACS-Färbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- Mäusen um ca. 70-80% gegenüber wt-Mäusen verkleinert ist. In Bestätigung früherer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabhängige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- Mäusen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant stärker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- Mäusen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zurückzuführen ist.
The opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus can cause severe infections, particularly in immunocompromised individuals. Upon infection, A. fumigatus faces the powerful and directly acting immune defense of the human host. The mechanisms on how A. fumigatus evades innate immune attack and complement are still poorly understood. Here, we identify A. fumigatus enolase, AfEno1, which was also characterized as fungal allergen, as a surface ligand for human plasma complement regulators. AfEno1 binds factor H, factor-H-like protein 1 (FHL-1), C4b binding protein (C4BP), and plasminogen. Factor H attaches to AfEno1 via two regions, via short conserved repeats (SCRs) 6–7 and 19–20, and FHL-1 contacts AfEno1 via SCRs 6–7. Both regulators when bound to AfEno1 retain cofactor activity and assist in C3b inactivation. Similarly, the classical pathway regulator C4BP binds to AfEno1 and bound to AfEno1; C4BP assists in C4b inactivation. Plasminogen which binds to AfEno1 via lysine residues is accessible for the tissue-type plasminogen activator (tPA), and active plasmin cleaves the chromogenic substrate S2251, degrades fibrinogen, and inactivates C3 and C3b. Plasmin attached to swollen A. fumigatus conidia damages human A549 lung epithelial cells, reduces the cellular metabolic activity, and induces cell retraction, which results in exposure of the extracellular matrix. Thus, A. fumigatus AfEno1 is a moonlighting protein and virulence factor which recruits several human regulators. The attached human regulators allow the fungal pathogen to control complement at the level of C3 and to damage endothelial cell layers and tissue components.
Aspf2 From Aspergillus fumigatus Recruits Human Immune Regulators for Immune Evasion and Cell Damage
(2018)
The opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus can cause life-threatening infections, particularly in immunocompromised patients. Most pathogenic microbes control host innate immune responses at the earliest time, already before infiltrating host immune cells arrive at the site of infection. Here, we identify Aspf2 as the first A. fumigatus Factor H-binding protein. Aspf2 recruits several human plasma regulators, Factor H, factor-H-like protein 1 (FHL-1), FHR1, and plasminogen. Factor H contacts Aspf2 via two regions located in SCRs6–7 and SCR20. FHL-1 binds via SCRs6–7, and FHR1 via SCRs3–5. Factor H and FHL-1 attached to Aspf2-maintained cofactor activity and assisted in C3b inactivation. A Δaspf2 knockout strain was generated which bound Factor H with 28% and FHL-1 with 42% lower intensity. In agreement with less immune regulator acquisition, when challenged with complement-active normal human serum, Δaspf2 conidia had substantially more C3b (>57%) deposited on their surface. Consequently, Δaspf2 conidia were more efficiently phagocytosed (>20%) and killed (44%) by human neutrophils as wild-type conidia. Furthermore, Aspf2 recruited human plasminogen and, when activated by tissue-type plasminogen activator, newly generated plasmin cleaved the chromogenic substrate S2251 and degraded fibrinogen. Furthermore, plasmin attached to conidia damaged human lung epithelial cells, induced cell retraction, and caused matrix exposure. Thus, Aspf2 is a central immune evasion protein and plasminogen ligand of A. fumigatus. By blocking host innate immune attack and by disrupting human lung epithelial cell layers, Aspf2 assists in early steps of fungal infection and likely allows tissue penetration.
Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation.
Background:
HIV-associated neurocognitive disorder (HAND) remains highly prevalent despite effective anti-retroviral therapy (ART). A number of adjunctive pharmacotherapies for HAND have been studied with disappointing results, but preliminary data suggest that lithium may provide clinical benefit. In addition, the low cost of lithium would facilitate access in low- and middle-income countries which carry the greatest burden of HIV.
Methods:
Our objective was to evaluate the 24-week efficacy and safety of lithium in patients with moderate to severe HAND. Our primary efficacy endpoint was the change in Global Deficit Score (GDS) from baseline to 24 weeks, whereas our secondary endpoint was the change in proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) brain metabolite concentrations. We conducted a 24-week randomized placebo-controlled trial of lithium as adjunctive pharmacotherapy. We enrolled participants with moderate to severe HAND, on ART for at least 6 months, with suppressed viral loads and attending public sector primary care clinics in Cape Town, South Africa. We randomized 66 participants to lithium (n = 32) or placebo (n = 34). Lithium or placebo was dosed 12-hourly and titrated to achieve the maintenance target plasma concentration of 0.6 to 1.0 mmol/L. Sham lithium concentrations were generated for participants receiving placebo.
Results:
Totally 61 participants completed the study (lithium arm = 30; placebo arm = 31). Participants at enrolment had a mean age of 40 years and a median CD4+ T-cell count of 500 cells/μL. The median change in GDS between baseline and week 24 for the lithium and placebo arms were –0.57 (95% confidence interval [CI] –0.77, –0.32) and –0.56 (–0.69, –0.34) respectively, with a mean difference of –0.054 (95% CI –0.26, 0.15); P = 0.716. The improvement remained similar when analyzed according to age, severity of impairment, CD4+ count, time on ART, and ART regimen. Standard 1H-MRS metabolite concentrations were similar between the treatment arms. The study drug was well tolerated in both study arms. Six serious adverse events occurred, but none were considered related to the study drug.
Conclusion:
Adjunctive lithium pharmacotherapy in patients on ART with HAND was well tolerated but had no additional benefit on neurocognitive impairment.
Der Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (MIF) ist ein Chemokin, das eine wichtige Rolle bei der Regulation der Effektorfunktionen von Makrophagen und bei der T-Zell-Aktivierung und -Migration innehat. Untersuchungen zur Bedeutung des Chemokins in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten, wie der rheumatoiden Arthritis, wurden bereits durchgeführt und finden ihre Umsetzung in klinischen Studien zu einem möglichen neuen Therapieansatz. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Rolle von MIF in der Pathogenese der EAE aufzuklären und dadurch eventuell neue Aspekte der bislang nur unvollständig verstandenen Krankheitsmechanismen aufzudecken. Außerdem soll eine Aussage darüber getroffen werden, ob anti-MIF-mAK als Therapie für die EAE und damit möglicherweise auch für die MS in Frage kommt. Es konnte demonstriert werden, dass die Behandlung mit anti-MIF-mAK von PLPp139-151-induzierter EAE in SJL-Mäusen in der akuten Phase der Erkrankung wirkt und zu einer schnelleren Besserung im Vergleich zu Kontroll-Mäusen führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das „Homing“ der pathogenen Neuroantigen-spezifischen T-Zellen in das ZNS durch die anti-MIF-mAK-Behandlung eingeschränkt ist. Als ein möglicher Mechanismus konnte die verminderte Expression von VCAM-1 auf der Oberfläche der Endothelzellen im Gehirn ausgemacht werden. Zusätzlich reduzierte die MIF-Blockade die klonale Expansion und die Pathogenität der Neuroantigen-reaktiven CD4+-T-Zellen. Weitere Experimente führten zu der Annahme, dass eine verminderte Zahl an funktionell hoch aviden T-Zellen, wahrscheinlich aufgrund erhöhter Apoptose, die eingeschränkte Pathogenität des T-Zell-Pools bedingt. Interessanterweise sind diese Ergebnisse unabhängig vom Mausstamm und vom Neuroantigen, mit dem immunisiert wurde. Zusammengefasst kann man daraus ableiten, dass die Blockade von MIF einen vielversprechenden neuen Ansatz in der Therapie der MS begründen könnte.
Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro
(2020)
Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt.
The respiratory system is amongst the most important compartments in the human body. Due to its connection to the external environment, it is one of the most common portals of pathogen entry. Airborne pathogens like measles virus (MV) carried in liquid droplets exhaled from the infected individuals via a cough or sneeze enter the body from the upper respiratory tract and travel down to the lower respiratory tract and reach the alveoli. There, pathogens are captured by the resident dendritic cells (DCs) or macrophages and brought to the lymph node where immune responses or, as in case of MV, dissemination via the hematopoietic cell compartment are initiated. Basic mechanisms governing MV exit from the respiratory tract, especially virus transmission from infected immune cells to the epithelial cells have not been fully addressed before. Considering the importance of these factors in the viral spread, a complex close-to-in-vivo 3D human respiratory tract model was generated. This model was established using de-cellularized porcine intestine tissue as a biological scaffold and H358 cells as targets for infection. The scaffold was embedded with fibroblast cells, and later on, an endothelial cell layer seeded at the basolateral side. This provided an environment resembling the respiratory tract where MV infected DCs had to transmigrate through the collagen scaffold and transmit the virus to epithelial cells in a Nectin-4 dependent manner. For viral transmission, the access of infected DCs to the recipient epithelial cells is an essential prerequisite and therefore, this important factor which is reflected by cell migration was analyzed in this 3D system.
The enhanced motility of specifically MV-infected DCs in the 3D models was observed, which occurred independently of factors released from the other cell types in the models. Enhanced motility of infected DCs in 3D collagen matrices suggested infection-induced cytoskeletal remodeling, as also verified by detection of cytoskeletal polarization, uropod formation. This enforced migration was sensitive to ROCK inhibition revealing that MV infection induces an amoeboid migration mode in DCs. In support of this, the formation of podosome structures and filopodia, as well as their activity, were reduced in infected DCs and retained in their uninfected siblings. Differential migration modes of uninfected and infected DCs did not cause differential maturation, which was found to be identical for both populations. As an underlying mechanism driving this enforced migration, the role of sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) was studied in MV-exposed cultures. It was shown in this thesis that MV-infection increased S1P production, and this was identified as a contributing factor as inhibition sphingosine kinase activity abolished enforced migration of MV-infected DCs. These findings revealed that MV infection induces a fast push-and-squeeze amoeboid mode of migration, which is supported by SphK/S1P axis. However, this push-and-squeeze amoeboid migration mode did not prevent the transendothelial migration of MV-infected DCs.
Altogether, this 3D system has been proven to be a suitable model to study specific parameters of mechanisms involved in infections in an in vivo-like conditions.
Transmission of measles virus (MV) from dendritic to airway epithelial cells is considered as crucial to viral spread late in infection. Therefore, pathways and effectors governing this process are promising targets for intervention. To identify these, we established a 3D respiratory tract model where MV transmission by infected dendritic cells (DCs) relied on the presence of nectin-4 on H358 lung epithelial cells. Access to recipient cells is an important prerequisite for transmission, and we therefore analyzed migration of MV-exposed DC cultures within the model. Surprisingly, enhanced motility toward the epithelial layer was observed for MV-infected DCs as compared to their uninfected siblings. This occurred independently of factors released from H358 cells indicating that MV infection triggered cytoskeletal remodeling associated with DC polarization enforced velocity. Accordingly, the latter was also observed for MV-infected DCs in collagen matrices and was particularly sensitive to ROCK inhibition indicating infected DCs preferentially employed the amoeboid migration mode. This was also implicated by loss of podosomes and reduced filopodial activity both of which were retained in MV-exposed uninfected DCs. Evidently, sphingosine kinase (SphK) and sphingosine-1-phosphate (S1P) as produced in response to virus-infection in DCs contributed to enhanced velocity because this was abrogated upon inhibition of sphingosine kinase activity. These findings indicate that MV infection promotes a push-and-squeeze fast amoeboid migration mode via the SphK/S1P system characterized by loss of filopodia and podosome dissolution. Consequently, this enables rapid trafficking of virus toward epithelial cells during viral exit.
Va8.2+ CD8 T-Zellen von LEW.1F Ratten (MHC-Haplotyp f) werden während der Reifung im Thymus zehnfach überselektioniert: 14 Prozent der reifen LEW.1F CD8 T-Zellen exprimieren Va8.2; CD8 T-Zellen von MHC kongenen RT1f- Stämme sind nur zu 1-2 Prozent Va8.2+. Gleichzeitig führt die RT1f-spezifische allogene Stimulation reifer LEW (MHC Haplotyp l) CD8 T-Zellen zu einer bevorzugten Expansion von Va8.2+ T-Zellen. Dies überrascht, da die positive Selektion unreifer Thymozyten eine niedrigere Avidität zwischen T-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle erfordern soll als Alloreaktivität. Ein bevorzugter Vb-Gebrauch wurde weder bei RT1f-spezifischer positiver Selektion noch Alloreaktion gefunden. Das Ja-Repertoire von RT1f-alloreaktiven Va8.2 TCR ist restringiert, ihre CDR3a Schleifen sind kurz, homogen und besitzen wenig N-Nukleotidinsertionen; ein hydrophob/amphiphatisches Motiv erhöht wahrscheinlich die Peptidpromiskuität. Va8.2+ LEW.1F T-Zellen besitzen ein weniger restringiertes Ja-Repertoire; ein hydrophobes Motiv der CDR3a-Schleife wurde seltener gefunden; weitere Restriktionen der CDR3a-Schleife fanden wir nicht. Nicht-alloreaktive LEW CD8 T-Zellen zeigten keine Restriktionen im Bereich Ja/CDR3a. Va8.2 vermittelt MHC-spezifische positive Selektion und Alloreaktivität. Alloreaktionen erfordern einen zusätzlichen Beitrag der CDR3a-Schleife, deren Gestaltung wahrscheinlich Kontakte mit einem hochdiversen Peptidsatz und zusätzliche MHC-Molekül-Kontakte ermöglicht. Unsere Ergebnisse sind vereinbar mit Röntgenstrukturanalysen des T-Zellrezeptor (TCR)/pMHC-Komplexes und dem "differential-avidity model" der TCR-vermittelten Antigenerkennung bei thymischer Selektion und Aktivierung reifer T-Zellen. Sie dokumentieren die Bedeutung der Erkennung polymorpher MHC-Strukturen durch keimbahnkodierte TCR-Segmente und sprechen gegen eine ausschließliche Peptidspezifität von positiver Selektion und Alloreaktivität.
Recently, Tummino et al. reported that 34 compounds, including Chloroquine and Fluoxetine, inhibit SARS-CoV-2 replication by inducing phospholipidosis, although Chloroquine failed to suppress viral replication in Calu-3 cells and patients. In contrast, Fluoxetine represses viral replication in human precision-cut lung slices (PCLS) and Calu-3 cells. Thus, it is unlikely that these compounds have similar mechanisms of action. Here, we analysed a subset of these compounds in the viral replication and phospholipidosis assays using the Calu-3 cells and PCLS as the patient-near system. Trimipramine and Chloroquine induced phospholipidosis but failed to inhibit SARS-CoV-2 replication in Calu-3 cells, which contradicts the reported findings and the proposed mechanism. Fluoxetine, only slightly induced phospholipidosis in Calu-3 cells but reduced viral replication by 2.7 orders of magnitude. Tilorone suppressed viral replication by 1.9 orders of magnitude in Calu-3 cells without causing phospholipidosis. Thus, induction of phospholipidosis is not correlated with the inhibition of SARS-CoV-2, and the compounds act via other mechanisms. However, we show that compounds, such as Amiodarone, Tamoxifen and Tilorone, with antiviral activity on Calu-3 cells, also inhibited viral replication in human PCLS. Our results indicate that antiviral assays against SARS-CoV-2 are cell-line specific. Data from Vero E6 can lead to non-transferable results, underlining the importance of an appropriate cell system for analysing antiviral compounds against SARS-CoV-2. We observed a correlation between the active compounds in Calu-3 cells and PCLS.
Neben dem bekannten Tropismus des Masernvirus für CD150-positive aktivierte Zellen des Immunsystems, spielt der Endothelzelltropismus für die akute Masernviruserkrankung einschließlich ihren nachfolgenden Komplikationen eine wichtige pathogene Rolle. Die Infektion der Endothelzellen steht in Zusammenhang mit dem Auftreten des MV-Exanthems. Es ist auch möglich, dass die „Akute Enzephalitits“ und der Viruseintritt ins zentrale Nervensystem wie im Falle der subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) durch Endothelzellinfektion vermittelt wird. Ziel der Arbeit war herauszufinden, wie und ob das MV Endothelzellbarrieren überwinden kann mittels Transport infizierter Leukozyten oder durch Infektion von EZs mit basolateraler Virusfreisetzung. Es wurde untersucht, ob die Fähigkeit von primären humanen T- Zellen durch polarisierte Zellschichten von „human brain microvascular endothelial cells“ (HBMECs) zu wandern durch die Infektion beeinflusst wird. Die Fähigkeit von infizierten Lymphozyten durch die Poren der Filter zu wandern war teilweise beeinträchtigt, jedoch war das Ergebnis statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu war die Fähigkeit der Zellen durch Endothelzellbarrieren zu wandern drastisch reduziert. Nach Infektion adhärierten die Leukozyten stärker auf den Endothelzellen. Bei dieser Adhäsion von PBMCs an Endothelzellen kam es trotz Infektion zur Ausbildung von sogenannten „transmigratory cups“ oder docking- Strukturen. Dieser enge Zell-Zell-Kontakt hatte zur Folge, dass die MV-Infektion vom Lymphozyten auf die Endothelzelle übertragen wurde. Die MV-Hüllproteine wurden auf der apikalen und basolateralen Seite infizierter Endothelzellen exprimiert wie anhand von Aufnahmen mit dem konfokalen Mikroskop am Beispiel des H-Proteins gezeigt werden konnte. Titrationen ergaben, dass das Virus auf beiden Seiten der Zellen freigesetzt wurde. Desweiteren wurde bestätigt, dass auch für polarisierte Endothelzellen die auf Tyrosin basierenden Transportsignale verantwortlich sind für die basolaterale Virusfreisetzung. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass das Virus mit Hilfe der Infektion und der bipolaren Virusfreisetzung über Endothelzellbarrieren
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) infection and stress responses disrupt transcription termination by RNA Polymerase II (Pol II). In HSV-1 infection, but not upon salt or heat stress, this is accompanied by a dramatic increase in chromatin accessibility downstream of genes. Here, we show that the HSV-1 immediate-early protein ICP22 is both necessary and sufficient to induce downstream open chromatin regions (dOCRs) when transcription termination is disrupted by the viral ICP27 protein. This is accompanied by a marked ICP22-dependent loss of histones downstream of affected genes consistent with impaired histone repositioning in the wake of Pol II. Efficient knock-down of the ICP22-interacting histone chaperone FACT is not sufficient to induce dOCRs in ΔICP22 infection but increases dOCR induction in wild-type HSV-1 infection. Interestingly, this is accompanied by a marked increase in chromatin accessibility within gene bodies. We propose a model in which allosteric changes in Pol II composition downstream of genes and ICP22-mediated interference with FACT activity explain the differential impairment of histone repositioning downstream of genes in the wake of Pol II in HSV-1 infection.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Präsentationsfunktion der LEW-Ratten-MHC-Klasse-II-Moleküle RT1B und RT1D für verschiedene Super- und Peptidantigene sowie die Generierung gemischter MHC-Klasse-II-Isotypen in der LEW-Ratte untersucht. Sag sind Proteine bakterieller und viraler Herkunft und führen nach Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle durch Interaktion mit dem TZR-Vb-Teil zu einer von der TZR-Spezifität unabhängigen Aktivierung von T-Zellen, die bis zu 30 % der Gesamt-T-Zellpopulation eines Organismus erfassen kann. Die dadurch bedingte Mediatorenfreisetzung aus T- oder konsekutiv aktivierten Zellen ist einerseits für die Entwicklung bestimmter akuter Krankheitsbilder wie des toxischen Schocksyndroms, Gastroenteritiden u. a. verantwortlich, kann aber auch potentiell zu einer Aktivierung autoreaktiver T-Zellen und der Entstehung von Autoimmunkrankheiten beitragen. Zur Untersuchung der LEW-MHC-Klasse-II-Charakteristika wurden zunächst mittels retroviralen Gentransfers RT1B- und RT1D-Gene in L929-Zellen übertragen und die Oberflächenexpression durch die mAK Ox6 und 14-4-4S nachgewiesen. Anschließend erfolgte der Nachweis einer Sag-Präsentation durch Stimulation des LEW-Vb8.2-TZH 53/4 durch die bakteriellen Sag SEB, SEC1-3, MAS und YPM und von aus Lymphknoten isolierten LEW-T-Zellen durch SEC1, MAS und YPM, die beide mit der durch eine HLA-DR1-positive Zelllinie getragenen Aktivierung verglichen wurden. Beide Experimente ergaben für die Sag des primär humanpathogen Staph. aureus eine weitaus stärkere Reaktivität in Anwesenheit humaner gegenüber LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen bei RT1B-dominierter Antwort innerhalb der präsentatorischen Rattenmoleküle. Für SEB ergaben sich zusätzlich Hinweise auf eine MHC-Klasse-II-unabhängige Aktivierung. Das von Yersinia pseudotuberculosis produzierte Sag YPM wurde ebenfalls wesentlich besser von humanen als LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert, zeigte allerdings nur geringe Unterschiede zwischen RT1B und RT1D. Für das aus Nagern isolierte Sag von Mykoplasma arthritidis MAS konnte eine präferentielle Bindung an RT1D mit HLA-DR1-ähnlicher Stimulationskapazität nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden die generierten Zelllinien auf Präsentation der definierten Antigene L.casein und gpMBP gegenüber reaktiven TZH getestet. Dabei konnte die RT1D-restringierte Antwort von Klon19 auf L.casein und die RT1B-restringierte Antwort von 53/4 auf gpMBP bestätigt werden. Ebenfalls wurden die erstellten Transfektanten mit einem viralen Sag der Maus, dem vSag7-Gen des mtv7, transfiziert und auf Stimulation des TZH RG17 und von LEW-Lymphozyten getestet. Dabei zeigte sich eine geringe Reaktivität gegenüber den erstellten Transfektanten, die RT1B-dominiert war. Gleichzeitig ergaben sich in der Auswertung Hinweise für einen vSag7-Transfer von MHC-Klasse-II-negativen Produzenten auf MHC-Klasse-II-positive Rattenzellen, die durch weitere Experimente inklusive eines In-vivo-Tests bestätigt werden konnten. In der Generierung gemischter Isotypen aus MHC-Klasse-II-Einzelkettengenen der LEW-Ratte konnte gezeigt werde, dass die Übertragung der RT1DaBb-Genkombination mit Hilfe eines retroviralen Gentransfers auf P80- und L929-Zellen nicht zu einer sicher detektierbaren Oberflächenexpression führte, auch nicht bei Koübertragung der invarianten Kette der Maus. Durch einen Western Blot unter reduzierenden Bedingungen konnte eine bezüglich Molekulargewicht und Quantität zu einem regulären RT1B-Molekül differente RT1Bb-Einzelkette in der Kombination RT1DaBb nachgewiesen werden.
Ein bestehendes replikationsinkompetentes PFV-Vektorsystem sollte charakterisiert und optimiert werden. Dieses Ziel sollte durch Ergänzung von zusätzlichen Sicherheitsmassnahmen und der Verringerung der enthaltenen viralen Sequenzen erreicht werden. Basierend auf einem replikationsdefizienten PFV-Vektor wurde in dieser Arbeit ein modifizierter PFV-Vektor konstruiert. Dieser Vektor enthält die minimalen für einen effiziente Transduktion benötigten Sequenzen (Gesamtgröße 3,1 kbp) und ein theoretisches Verpackungslimit von 8,5 kb sowie zusätzliche Sicherheitsmerkmale. Die 3’ U3-Region wurde auf eine Grösse von 442 bp reduziert, enthalten sind 5’ Sequenzen der U3-Region und der Übergang von der U3 in die R-Region. Diese Massnahme erhöht das Verpackungslimit und schaltet eine mögliche Aktivierung des U3-Promotors in Abwesenheit des foamyviralen Transaktivators (Tas) durch zelluläre Transkriptionsfaktoren aus. Zur Vermeidung einer aberranten Proteinexpression wurde das gag Startkodon durch Mutation ausgeschaltet, und ein Stopkodon in den gag-Leseraster eingefügt. Mittels Western-Blot wurde das Ausbleiben der Gag-Expression bestätigt. Sowohl die für einen optimalen Gentransfer benötigte Grösse der cis-aktiven Sequenzen des Vektors, als auch die bevorzugte Lage der cis-aktiven Sequenzen des Vektors in Bezug auf die Expressionkassette des Vektors wurden ermittelt. Der Vektor wurde in Modulbauweise konzipiert, um ein einfaches Austauschen der einzelnen Komponenten zu gewährleisten. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikationen am Vektor keine negativen Auswirkungen auf die Transduktionsraten gegenüber dem Ausgangsvektor hatten. Mit dem Vektor pMD11 konnten Vektortiter von 6,4x104 infektiöse Partikel pro ml Überstand generiert werden. Ein Zentrifugationsprotokoll für PFV-Vektoren zur Steigerung des Vektor-Titers auf das zwanzigfache des Ursprungs-Vektortiters bei 15000g wurde beschrieben und charakterisiert. Eine erfolgreiche Methode zur Kryoprotektion von PFV-Vektoren durch Zugabe von DMSO und Lagerung bei -80°C wurde entwickelt und quantifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein PFV-Vektor mit minimalen viralen Sequenzen und dadurch gesteigertem Verpackungslimit sowie zusätzlichen Sicherheitsmerkmalen
Measles virus is a highly contagious virus causing acute and persistent diseases in man, the receptor of which is still not weil characterized. We have isolated a monoclonal antibody (mAb), designated mAb 119, which specifically inhibits measles virus infection of susceptible celllines in a dosa-dependent manner. This antibody precipitates a protein with an apparent molecular mass of 75 kDa from 1251 surface-labeled cells and its epitope is present on human peripheral blood mononuclear cells, human celllines, and the African green monkey cellline Vero. Affinity chromatography of detergent-solubilized cell membrane proteins over a Sepharose column with covalently bound mAb 119 led to the partial purification of the 75-kOa protein. Preincubation of measles virus with this affinity-purified protein inhibited measles virus infection dose dependently. Aminoacid microseq,uencing of this protein revealed its identity with the human membrane-organizing extension spike protein moesin, a protein intra- and extracellularly associated with the plasma membrane of cells. Subsequently, an antibody raised against purified moesin (mAb 38/87) was also found to specifically inhibit measles virus infection of susceptible cells and confirmed our data obtained with mAb 119. Our data suggest that moesin is acting as a receptor for measles virus.
Regulation of B lymphocyte terminal differentiation and death by the transcription factor Blimp-1
(2005)
B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) and X-box-binding protein-1 (XBP-1) are indispensible transcription factors required for B lymphocyte terminal differentiation into Ig secreting plasma cells. Occurrence of an unfolded protein response (UPR) and XBP-1 splicing, due to elevated Ig levels, are critical events during plasma cell generation. However, the upstream molecule sufficient to trigger these events remain elusive. Because ectopic expression of Blimp-1 in B cells is sufficient to generate plasma cells, it is plausible that Blimp-1 might be the upstream molecule, sufficient for the induction of UPR and XBP-1 splicing. The results from the current study indicate that ectopic expression of Blimp-1 or its N-terminal domain, in B cells, is sufficient to induce XBP-1 splicing, UPR and Ig (immunoglobulin) secretion. Further more Blimp-1 is able to directly repress the antiapoptotic gene A1, by binding to specific DNA elements in A1 promoter. This repression of A1 by Blimp-1 seems to be an important prerequisite for Plasma cell differentiation because ectopic expression of A1 in primary B cells resulted in reduced immunoglobulin secretion.
Toleranz gegenüber Selbstantigenen in den peripheren Geweben kann durch CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermittelt werden. Diese Zellen entstehen entweder in Folge der thymischen T-Zellselektion (natürlich vorkommende Tregs, nTreg) oder durch Konversion aus naiven T-Zellen in den peripheren lymphatischen Organen (induzierte Tregs, iTregs). Im Vorfeld der Arbeit war bereits bekannt, dass Dendritische Zellen (DZ) eine wichtige Rolle bei der Generierung von iTreg spielen. Allerdings bestand weitestgehend Unklarheit darüber, welche DZ in welchem Reifungszustand dazu in der Lage sind, iTregs gegen peripher-exprimierte Selbstantigene zu induzieren. Steady-state migratorische DZ (ssmDZ) gelten in dieser Hinsicht als potentielle Kandidaten, da bekannt ist, dass diese DZ bereits unter homöostatischen Bedingungen Selbstantigene aus peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort T-Zellen präsentieren können. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, den Phänotyp und die tolerogene Kapazität der ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten näher zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ssmDZ einen semireifen MHC IIint CD40hi CD80/CD86int CCR7+ Phänotyp aufweisen und in vitro mit Hilfe von endogenem TGF-β iTregs induzieren können. Darüber hinaus belegt diese Arbeit zusammen mit weiteren Daten aus unserer Arbeitsgruppe, dass ssmDZ in transgenen K5mOVA-Mäusen zellassoziertes epidermales OVA aus der Haut in die drainierenden Lymphknoten transportieren und dort an CD4+ OVA-spezifische TZR-transgene OT-II T-Zellen präsentieren können. Innerhalb der ssmDZ konnten die Langerin+ dermalen DZ als die DZ-Subpopulation eingegrenzt werden, die für die Konversion von naiven OT-II T-Zellen in CD4+ CD25+ Foxp3+ iTregs verantwortlich war. Ferner zeigte sich, dass CD103 nicht als Marker für ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten herangezogen werden kann. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war, herauszufinden, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor RelB auf die partielle Reifung und Migration der ssmDZ hat. RelB ist ein Mitglied der NF-κB-Familie und wird mit der Reifung von DZ in Verbindung gebracht. Erste Experimente zeigten eine nukleäre Translokation von RelB in ssmDZ sowie eine verringerte Frequenz dieser DZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von relB+/- Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz für den RelB-Bindungspartner p52. Allerdings konnte bei Mäusen mit einer DZ-spezifischen RelB-Inaktivierung (RelBDCko Mäuse) eine erhöhte Frequenz an ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten festgestellt, die nicht auf einer Zunahme an DZ in der Haut der Tiere zurückzuführen war. Diese Ergebnisse legen einerseits die Vermutung nahe, dass es sich bei den beobachteten Effekte in den relB+/- Mäusen um DZ-extrinsische Auswirkungen auf die ssmDZ handelt. Andererseits scheint RelB unter homöostatischen Bedingungen die Erhaltung und Migration der ssmDZ eher negativ zu beeinflussen. Weitere durchflusszytometrische Analysen wiesen zudem darauf hin, dass RelB in ssmDZ die Expression von Reifungsmarkern nur partiell reguliert. So konnte auf den ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten von RelBDCko Mäusen eine erhöhte Expression von CD40 beobachtet werden, während andere Reifungsmarker wie MHC II, CD80 und CD86 nicht signifikant in ihrer Expression betroffen waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zudem untersucht, wie sich eine RelB-Defizienz in DZ auf die Homöostase und Induktion von Tregs auswirkt. Die hierzu analysierten RelBDCko Mäuse wiesen eine erhöhte Frequenz und absolute Zellzahl an Tregs in allen untersuchten lymphatischen Organen (hautdrainierende Lymphknoten, Milz und Thymus) auf. Darüber hinaus war in diesen Organen auch eine verstärkte Proliferation der Tregs gegenüber den Kontrolltieren festzustellen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation der Tregs in RelBDCko Mäusen in den hautdrainierenden Lymphknoten sogar stärker ausfiel als in der Milz. RelB scheint somit die tolerogene Kapazität der DZ zur Regulation der Treg-Expansion im Thymus und in der Peripherie zu beeinflussen. Unter Verwendung von neutralisierenden αIL-2-Antikörpern konnte zudem belegt werden, dass die periphere Proliferation der Tregs in den RelBDCko Mäusen von IL-2 abhängig ist. Damit einhergehend zeigten erste Vorversuche eine erhöhte IL-2-Produktion in den peripheren lymphatischen Organen von RelBDCko Mäusen. Zusammenfassend legen die Daten dieser Arbeit den Schluss nahe, dass ssmDZ in den hautdrainierenden Lymphknoten in der Lage sind, Toleranz durch Induktion von iTregs gegen epidermale Selbstantigene zu induzieren. Untersuchungen an neuartigen Mäusen mit einer konditionalen RelB-Inaktivierung spezifisch in DZ deuten darauf hin, dass die Migration und Reifung von ssmDZ partiell durch RelB reguliert wird. Da Tregs eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der peripheren Toleranz einnehmen, ist die Beobachtung, dass eine RelB-Defizienz in allen DZ zu einer verstärkten Treg-Proliferation und somit zu einer veränderten Treg-Homöostase führt, ein intererssanter Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
Thymus-derived natural Foxp3\(^{+}\) CD4\(^{+}\) regulatory T cells (nTregs) play a key role in maintaining immune tolerance and preventing autoimmune disease. Several studies indicate that dendritic cells (DCs) are critically involved in the maintenance and proliferation of nTregs. However, the mechanisms how DCs manage to keep the peripheral pool at constant levels remain poorly understood. Here, we describe that the NF-κB/Rel family transcription factor RelB controls the frequencies of steady-state migratory DCs (ssmDCs) in peripheral lymph nodes and their numbers control peripheral nTreg homeostasis. DC-specific RelB depletion was investigated in CD11c-Cre × RelB\(^{fl/fl}\) mice (RelB\(^{DCko}\)), which showed normal frequencies of resident DCs in lymph nodes and spleen while the subsets of CD103\(^{-}\) Langerin\(^{-}\) dermal DCs (dDCs) and Langerhans cells but not CD103\(^{+}\) Langerin\(^{+}\) dDC of the ssmDCs in skin-draining lymph nodes were increased. Enhanced frequencies and proliferation rates were also observed for nTregs and a small population of CD4\(^{+}\) CD44\(^{high}\) CD25\(^{low}\) memory-like T cells (Tml). Interestingly, only the Tml but not DCs showed an increase in IL-2-producing capacity in lymph nodes of RelB\(^{DCko}\) mice. Blocking of IL-2 in vivo reduced the frequency of nTregs but increased the Tml frequencies, followed by a recovery of nTregs. Taken together, by employing RelB\(^{DCko}\) mice with increased frequencies of ssmDCs our data indicate a critical role for specific ssmDC subsets for the peripheral nTreg and IL-2\(^{+}\) Tml frequencies during homeostasis.
After more than one year of the COVID-19 pandemic, antiviral treatment options against SARS-CoV-2 are still severely limited. High hopes that had initially been placed on antiviral drugs like remdesivir have so far not been fulfilled. While individual case reports provide striking evidence for the clinical efficacy of remdesivir in the right clinical settings, major trials failed to demonstrate this. Here, we highlight and discuss the key findings of these studies and underlying reasons for their failure. We elaborate on how such shortcomings should be prevented in future clinical trials and pandemics. We suggest in conclusion that any novel antiviral agent that enters human trials should first be tested in a post-exposure setting to provide rapid and solid evidence for its clinical efficacy before initiating further time-consuming and costly clinical trials for more advanced disease. In the COVID-19 pandemic this might have established remdesivir early on as an efficient antiviral agent at a more suitable disease stage which would have saved many lives, in particular in large outbreaks within residential care homes.
Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) represent a major population controlling T cell immune responses. However, little is known about their molecular requirements for homing and T cell interaction to mediate suppression. Here, we investigated the functional role of the homing and collagen IV receptor VLA-1 (α1β1-integrin) on in vitro GM-CSF generated murine MDSCs from wild-type (WT) and CD49a/α1-integrin (Itga1\(^{−/−}\)) gene-deficient mice. Here, we found that effector (Teff) but not naive (Tn) CD4\(^+\) T cells express VLA-1 and monocytes further up-regulated their expression after culture in GM-CSF when they differentiated into the monocytic subset of resting MDSCs (R-MDSCs). Subsequent activation of R-MDSCs by LPS+IFN-γ (A-MDSCs) showed increased in vitro suppressor potential, which was independent of VLA-1. Surprisingly, VLA-1 deficiency did not influence A-MDSC motility or migration on collagen IV in vitro. However, interaction times of Itga1\(^{−/−}\) A-MDSCs with Teff were shorter than with WT A-MDSCs on collagen IV but not on fibronectin substrate in vitro. After injection, A-MDSCs homed to the splenic red pulp where they co-localized with Teff and showed immediate suppression already after 6 h as shown by inhibition of T cell proliferation and induction of apoptosis. Injection of A-MDSCs from Itga1\(^{−/−}\) mice showed equivalent homing into the spleen but a reduced suppressive effect. Interaction studies of A-MDSCs with Teff in the subcapsular red pulp with intravital two-photon microscopy revealed also here that MDSC motility and migration parameters were not altered by VLA-1 deficiency, but the interaction times with Teff were reduced. Together, our data point to a new role of VLA-1 adhesion to collagen IV as a prerequisite for extended contact times with Teff required for suppression.
MDSCs are suppressive immune cells with a high relevance in various pathologies including cancer, autoimmunity, and chronic infections. Surface marker expression of MDSCs resembles monocytes and neutrophils which have immunostimulatory functions instead of suppressing T cells. Therefore, finding specific surface markers for MDSCs is important for MDSC research and therapeutic MDSC manipulation. In this study, we analyzed if the integrin VLA-1 has the potential as a novel MDSC marker. VLA-1 was expressed by M-MDSCs but not by G-MDSCs as well as by Teff cells. VLA-1 deficiency did not impact iNOS expression, the distribution of M-MDSC and G-MDSC subsets, and the suppressive capacity of MDSCs towards naïve and Teff cells in vitro. In mice, VLA-1 had no effect on the homing capability of MDSCs to the spleen, which is a major reservoir for MDSCs. Since the splenic red pulp contains collagen IV and VLA-1 binds collagen IV with a high affinity, we found MDSCs and Teff cells in this area as expected. We showed that T cell suppression in the spleen, indicated by reduced T cell recovery and proliferation as well as increased apoptosis and cell death, partially depended on VLA-1 expression by the MDSCs. In a mouse model of multiple sclerosis, MDSC injection prior to disease onset led to a decrease of the disease score, and this effect was significantly reduced when MDSCs were VLA-1 deficient. The expression of Sema7A by Teff cells, a ligand for VLA-1 which is implicated in negative T cell regulation, resulted in a slightly stronger Teff cell suppression by MDSCs compared to Sema7A deficient T cells. Live cell imaging and intravital 2-photon microscopy showed that the interaction time of MDSCs and Teff cells was shorter when MDSCs lacked VLA 1 expression, however VLA-1 expression had no impact on MDSC mobility. Therefore, the VLA-1-dependent interaction of MDSC and Teff cells on collagen IV in the splenic red pulp is implicated MDSC-mediated Teff cell suppression.
A fine balance of regulatory (T\(_{reg}\)) and conventional CD4\(^+\) T cells (T\(_{conv}\)) is required to prevent harmful immune responses, while at the same time ensuring the development of protective immunity against pathogens. As for many cellular processes, sphingolipid metabolism also crucially modulates the T\(_{reg}\)/T\(_{conv}\) balance. However, our understanding of how sphingolipid metabolism is involved in T cell biology is still evolving and a better characterization of the tools at hand is required to advance the field. Therefore, we established a reductionist liposomal membrane model system to imitate the plasma membrane of mouse T\(_{reg}\) and T\(_{conv}\) with regards to their ceramide content. We found that the capacity of membranes to incorporate externally added azide-functionalized ceramide positively correlated with the ceramide content of the liposomes. Moreover, we studied the impact of the different liposomal preparations on primary mouse splenocytes in vitro. The addition of liposomes to resting, but not activated, splenocytes maintained viability with liposomes containing high amounts of C\(_{16}\)-ceramide being most efficient. Our data thus suggest that differences in ceramide post-incorporation into T\(_{reg}\) and T\(_{conv}\) reflect differences in the ceramide content of cellular membranes.
In dieser Arbeit wurde die Zytolyse, die durch HIV-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) bewirkt wird, untersucht. Grundsätzlich erscheinen in der Abwehr viraler Infekte sowohl CD4+ wie CD8+ CTL. In chronisch HIV-Infizierten sind in der Regel lediglich CD8+ CTL zu finden. HIV-spezifische CD4+ CTL können aber zum Beispiel in Impfstudien aus Probandenblut isoliert werden. Sie erwiesen sich als zytolytisch aktiv und waren außerdem, wie in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden konnte, auch an einer Fusions-vermittelten Lyse beteiligt. Diese ist Kalzium-unabhängig, auch mit heterologen Zellen möglich und die Expression des HIV-gp120 an der Zelloberfläche der Zielzellen ist essentiell, während die Präsentation von gp120 Epitopen nicht ausreicht. Die Konsequenz dieser Lyseform ist die apoptotische Zerstörung aller beteiligten Zellen. CD4+ HIV-spezifische CTL können über diesen Lysemechanismus bereits in der akuten Phase der Infektion einer negativen Selektion unterliegen, was ein Grund für das Fehlen der HIV-spezifischen CD4+ CTL in chronisch Infizierten darstellen kann. HIV-spezifische CD8+ CTL konnten aus einem HIV-positiven Patienten isoliert werden. Insgesamt wurden fünf Klone näher charakterisiert. Zwei erkannten jeweils ein Epitop aus unterschiedlichen Bereichen des extrazellulären Anteils des Glykoproteins, einer einen Bereich des p17-Anteils und zwei dasselbe Epitop im p24-Anteil des gag-Proteins. Dieses Epitop, plaziert innerhalb der Aminosäuren 71 bis 85, konnte hier zum erstenmal für die Präsentation mit HLA B51 beschrieben werden. In der spezifisch induzierten Lyse wiesen alle CD8+ CTL-Klone zwei Lysemechanismen auf, einen Perforin-vermittelten und einen CD95-vermittelten Anteil. Die CD95-vermittelte Lyse war stets prozentual geringer, und zusätzlich, sowohl Klon- wie Zielzell-spezifisch, unterschiedlich stark ausgeprägt . In HIV-infizierten primären Zellen ließ sich kein CD95-Anteil signifikant nachweisen, was darauf hinweist, daß dieser Lysemechanismus wahrscheinlich keine Rolle bei der Zerstörung infizierter Zellen im peripheren Blut spielt. In anderen Geweben kann sich die Situation unterschiedlich darstellen. Desweiteren konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß das Vakzinia-Virus B13R-Genprodukt die CD95-vermittelte Apoptose hemmt. Daher muß bei der Untersuchung apoptotischer Vorgänge, die Wahl der eingesetzten Vektoren genauestens bedacht werden.
Effects of desialyation on TCR-cross-linking and antigen sensitivity of CD8 positive T lymphocytes
(2005)
The featured experiments focus on changes in T cell membrane glycosylation as a possible means of controlling TCR cross-linking. Taking the long known fact that activated T cells show decreased levels of surface sialic acid as a starting point, differences in ligand binding and cellular reaction upon in vitro stimulation were investigated in naïve, activated and enzymatically desialyated CD8+, 2C TCR transgenic mouse lymphocytes. To detect differences in ligand binding lymphocytes were incubated with various concentrations of fluorescently labeled, soluble MHC/Ig fusion proteins until equilibrium was reached. Without previous washing, cells were analyzed by flow cytometry, determined MCF values were normalized to the plateau and fit to a mathematical model of equilibrium binding of divalent ligands to monomorphic receptors (Perelson 1984). Parameters derived from the model fit of binding data show, that neuraminidase treatment of T cells was sufficient to mimic a partially activated phenotype, showing enhanced TCR cross-linking. Enhanced TCR cross-linking was found to be dependent on the presence of CD8, as neuraminidase treatment of DN cells lead to decreased cross-linking. To elucidate the physiological relevance of desialyation induced increases in TCR cross-linking early tyrosine phosphorylation events and proliferative response upon in vitro stimulation of T cells were investigated. Both were found enhanced in neuraminidase treated cells, as compared to native cells. In conclusion the featured experiments suggest a role of surface sialic acid in controlling TCR cross-linking on naïve and activated T cells.
In der vorliegenden Arbeit wurden die in-vivo-Effekte eines „superagonistischen“ mAks mit Spezifität für den kostimulierenden Rezeptor CD28 der Ratte untersucht. Dieser Antikörper unterscheidet sich von konventionellen CD28-spezifischen mAk durch seine Fähigkeit, T Zellen auch ohne Ligation des TZR und damit polyklonal zu aktivieren. Die so ausgelöste Expansion der T Zellen verläuft so schnell und effizient wie eine durch Antigen gesteuerte Proliferation; die überproportionale Vermehrung anti-inflammatorischer regulatorischer T Zellen während der initialen Expansionsphase ist vermutlich für das Ausbleiben toxischer Effekte im Zuge der polyklonalen TZellvermehrung verantwortlich.
Zusammenfassung
Im Rahmen einer HIV-Infektion treten bei etwa der Hälfte aller Infizierten im Verlauf der Erkrankung neurokognitive Störungen auf. Zwar ist seit der Einführung der ART die Prävalenz der schweren HIV-Demenz zurückgegangen, aber vor allem mildere Formen sprechen nicht zufriedenstellend auf diese Therapie an und spielen auf Grund der insgesamt verbesserten Lebenserwartung von HIV-Patienten eine immer größere werdende Rolle. Um eine wirksame Therapie gegen HAND entwickeln zu können, sind detaillierte Kenntnisse über die Pathogenese und die Identifizierung von Risikofaktoren notwendig. In der vorliegenden Arbeit sollten daher drei unterschiedliche Faktoren auf ihren Zusammenhang mit HAND überprüft werden: der HIV-Protease Subtyp, die Höhe der Immunaktivierung und der DAT-Polymorphismus.
Hierfür standen Blut- und Plasmaproben von 112 HIV-Patienten und 30 Kontrollpersonen aus Tansania zur Verfügung, bei denen zuvor im Rahmen einer anderen medizinischen Doktorarbeit verschiedene neuropsychologische Tests durchgeführt worden waren. Zur Bestimmung des HIV-Protease Subtyps wurde die Virus-RNA aus dem Patienten-Plasma isoliert, in DNA umgeschrieben, gereinigt und anschließend sequenziert. Die Sequenz wurde mit Hilfe der Stanford University Database in Hinblick auf den HIV-Subtyp analysiert. Die Höhe der Immunaktivierung wurde durch Konzentrationsbestimmung der Immunaktivierungsmarker suPAR und human LBP mittels ELISA erfasst. Die Bestimmung des DAT-Polymorphismus erfolgte durch Isolation der Patienten-DNA aus den Blutproben, nachfolgender PCR und anschließender Agarosegelelektrophorese.
Die Untersuchung dieser drei Faktoren auf ihren Zusammenhang mit der neuropsychologischen Performance ergaben folgende Ergebnisse: 1. Der HIV-Protease Subtyp A und rekombinante Formen, die Subtyp A enthalten, gehen mit signifikant schlechteren Testergebnissen einher als die anderen HIV-Protease Subtypen. 2. Eine höhere Immunaktivierung korreliert ebenfalls mit schlechteren Testergebnissen. 3. Der DAT-Polymorphismus zeigt keine signifikanten Zusammenhänge mit HAND. Des Weiteren geht der HIV-Protease Subtyp C mit einer niedrigeren Immunaktivierung einher als die anderen Subtypen.
Diese Beobachtungen führen zu der Überlegung, dass der HIV-Protease Subtyp A sowie eine hohe periphere Immunaktivierung Risikofaktoren für die Entwicklung von HAND darstellen könnten und eventuell für die Pathogenese von Bedeutung sind. Der DAT-Polymorphismus scheint hierbei hingegen keine Rolle zu spielen. Bei dem Vorliegen des Subtyps A bzw. einer hohen Immunaktivierung sollte demnach über einen früheren Zeitpunkt für den Therapiebeginn mit ART nachgedacht werden, um die Entstehung von HAND zu verzögern oder sogar zu verhindern. Auf Grund der hohen Immunaktivierung als Risikofaktor für neuropsychologische Beeinträchtigungen sollte auch der Einsatz von immunmodulierenden Substanzen diskutiert werden. Die niedrigere Immunaktivierung, die bei einer Infektion mit dem HIV-Protease Subtyp C nachgewiesen werden konnte, könnte ein Hinweis auf eine niedrigere Pathogenität infolge einer Anpassung dieses Subtyps an den Menschen sein.
Da es sich bei all den durchgeführten Untersuchungen um Post-hoc-Analysen handelt, sind dringend weitere Studien zur Überprüfung der gefundenen Zusammenhänge notwendig.
Das Masernvirus (MV) interagiert mit zellulären Rezeptoren auf der Oberfläche von peripheren Blut-Lymphozyten (PBL), die Virus -Bindung und -Aufnahme vermitteln. Wir konnten einen monoklonalen Antikörper mAK 5C6 selektieren, der gegen die Zelloberfläche von B95a Zellen gerichtet ist, die mit MV gut infizierbar sind. Der Antikörper 5C6 inhibiert sowohl die Bindung, als auch die Infektion mit MV Wildtyp- und Vakzine-Stämmen. Ich verwendete eine retrovirale Genbank als Quelle für humane Milz mRNA und Proteine, um ein Screening nach Rezeptoren mit Antikörpern durchzuführen. Mit Hilfe des Antikörpers 5C6 wurde, unter Verwendung von Magnetbeats und FACS-Sortierung, ein erfolgreiches Screening Rezeptor-exprimierender Zellen durchgeführt. Das von mAK 5C6 erkannte Molekül konnte kloniert und als signaling lymphocytic activation molecule (SLAM; CD150) identifiziert werden. Zur Untersuchung der Rezeptorbenutzung verschiedener MV-Stämme wurden CHO-Zellen, die entwe-der rekombinantes CD46 oder SLAM exprimierten, mit 28 Masernvirusstämmen infiziert. Unter den getesteten Viren befanden sich sowohl Vakzine-Stämme, Wildtyp-Stämme mit verschiedener Pass-agierung und rekombinante Viren. Dabei konnte gezeigt werden, dass SLAM ein Rezeptor für MV ist, der sowohl Virusaufnahme und Synzytienbildung für alle getesteten Masernvirusstämme vermittelt. Vor allem Vakzine- und laboradaptierte-Stämme, aber auch eine kleine Fraktion der getesteten Wild-typstämme, konnten sowohl CD46 als auch SLAM verwenden. Durch Verwendung rekombinanter Viren konnte ich zeigen, dass der einzelne Aminosäureaustausch im Hämagglutinin (H) Protein an Position 481 Asn/Tyr (H481NY) determiniert, ob das Virus CD46 verwendet. Der Aminosäureaus-tausch hat keinen Effekt auf die Verwendung von SLAM als Rezeptor was andeutet, dass die Bin-dungsstelle von SLAM und CD46 unterschiedlich ist. Wie bereits für CD46 beschrieben, konnte eine schnelle Rezeptormodulation sowohl auf infizierten als auch uninfizierten Zellen nach Kontakt der MV-Glykoproteine mit SLAM, festgestellt werden. Dabei zeigte sich eine kontaktvermittelte Downregulation nach Vermischung SLAM-positiver Zellen mit per-sistent infizierten BJAB Zellen oder UV-inaktiviertem Virus. SLAM wird schnell von der Zelloberfläche SLAM exprimierender Zelllinien, wie CHO-SLAM, B95a, BJAB, sowie von peripheren Blutlymphozyten (PBL) herunterreguliert. Zusammgefasst: mit SLAM (CD150) wurde ein neuer zellulärer Rezeptor für alle Masernvirusstämme identifiziert.
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine schwere, momentan noch unheilbare Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems, die weltweit ca. 1 Mio. Menschen betrifft. Da die zur Zeit verfügbaren, anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Therapieformen lediglich krankheitsverzögernd wirken, ist es Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen, Möglichkeiten zur spezifischen Interferenz mit bei der MS ablaufenden Pathomechanismen zu ergründen und im Tiermodell zu testen. Das von uns für diese Arbeit verwendete Mausmodell einer CD8+ T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) trägt dabei neuen Erkenntnissen Rechnung, die zeigen, dass zytotoxische T-Lymphozyten bei der Pathogenese der humanen MS von entscheidender Bedeutung sind. Es handelt sich um doppelt transgene Nachkommen von Mäusen, die das Modell-Antigen Ovalbumin (OVA) unter der Kontrolle eines Oligodendrozyten (ODC-)-spezifischen MBP-Promotors im ZNS exprimieren, und Mäusen, die Ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellen besitzen (OT-I Zellen). Es kommt in diesem Modell zur Autoantigenerkennung durch die CD8+ T-Zellen mit konsekutiver Ausbildung einer fulminanten, letal verlaufenden EAE. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die therapeutische Potenz des monoklonalen Antikörpers 25-D1.16 zu evaluieren, der gegen das Autoantigen Ovalbumin in Kombination mit einem MHC-I-Molekül gerichtet ist. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Fluoreszenz-Mikroskopie konnten wir zunächst bestätigen, dass 25-D1.16 spezifisch den Komplex aus dem Peptid SIINFEKL (antigenes Epitop von Ovalbumin) gebunden an ein MHC-I-Molekül (H-2Kb) erkennt. In nachfolgenden in vitro Versuchen wurde der Einfluss des Antikörpers auf Aktivierung und Proliferation von durch SIINFEKL:MHC-I-Komplex stimulierten OT-I Zellen untersucht. Es wurden hierfür Zellproliferation (Proliferations-Assays), Expression des Oberflächenmoleküls CD69 (FACS-Analysen) sowie IFN-γ-Sekretion (ELISA) gemessen. In Gegenwart von 25-D1.16 zeigte sich durchweg eine hochsignifikante Reduktion der jeweiligen Proliferations-/Aktivierungsmarker. Wir konnten somit in vitro zeigen, dass der gegen das Autoantigen Ovalbumin/H-2Kb gerichtete, monoklonale Antikörper 25-D1.16 kompetitiv die Aktivierung und Proliferation entsprechender T-Lymphozyten inhibieren kann. Um diese Daten in vivo zu validieren und die pathogenetische Relevanz zu überprüfen, haben wir ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Mäusen verschiedene Dosen von 25-D1.16 vor Auftreten erster EAE-Symptome einmalig intraperitoneal verabreicht. Anschließend wurde der Krankheitsverlauf klinisch beurteilt. Im EAE-Stadium 4 ohne Besserungstendenz oder bei Versuchsende wurden außerdem histologische Schnitte des Zentralnervensystems angefertigt, gefärbt (H.E., CD3, Mac-3, Luxol Fast Blue/PAS) und mit unbehandelten Tieren verglichen. Ein Teil der ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Tiere blieb nach Applikation des Antikörpers völlig gesund, während bei einem anderen Teil der Ausbruch der EAE zwar nicht vollständig verhindert, ihr Schweregrad aber deutlich gemildert wurde. Der Effekt der Antikörpertherapie war jedoch nicht nur klinisch, sondern auch histopathologisch überzeugend. So zeigte das Zentralnervensystem erfolgreich therapierter Mäuse eine weitgehend bis vollständig intakte Gewebsarchitektur (H.E.-Färbung) mit im Vergleich zu unbehandelten Mäusen drastisch reduzierter OT-I Zell- und Makrophagen/Mikroglia-Infiltration (Immunhistochemie CD3 und Mac-3). In der Luxol Fast Blue/PAS-Färbung fanden sich keinerlei Entmarkungsherde sondern durchgängig myelinisierte Axone. Es gelang uns somit durch hohe Antikörperdosen (500 μg pro ODC-OVA/OT-I doppelt transgener Maus) bei 83 % der behandelten Versuchstiere den Ausbruch der EAE ganz zu verhindern bzw. deren Verlauf deutlich abzumildern. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals die antigen-spezifische Therapie einer CD8+ T-Zell mediierten EAE mittels eines gegen Peptid:MHC-I-Komplex gerichteten, monoklonalen Antikörpers. Durch Interferenz mit der Erkennung des Autoantigens durch die CD8+ T-Zellen waren wir in vivo in der Lage, den Pathomechanismus der EAE zu inhibieren. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Behandlungskonzept für die Therapie der Multiplen Sklerose am Menschen.
Das Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxovi-ridae und zählt immer noch zu den häufigsten Todesursachen bei Kindern in Entwicklungs-ländern. Nach dem Eintritt in den Körper führt eine Infektion von CD150-exprimierenden B- und T-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs) und Monozyten bzw. Makrophagen zu einer systemischen Infektion. Viele Mitglieder der Familie der APOBEC-Proteine („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins“), u. a. auch APOBEC3G, werden als Teil der angeborenen Immunantwort in diesen Zellen und infizierten Geweben exprimiert. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Proteine durch ihre RNA-bindenden Eigenschaften und ihre Fähigkeit zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu einer Inhibition von verschiedenen Retroelementen und Retroviren, wie beispielsweise den „long interspersed nuclear elements 1“ und dem humanen Im-mundefizienz-Virus (HIV) führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche antivirale Mechanismen von humanem APOBEC3G gegen das MV als Vertreter der negativ-strängigen RNA-Viren zu identifizieren. Hierzu wurden rekombinante MV-Wildtyp und -Impfstämme, sowie APOBEC3G-überexprimierende Vero-Zelllinien verwendet. Es zeigte sich, dass die Replikation des verwendeten rekombinanten Masern Wildtyp- und Impfvirus durch humanes APOBEC3G inhibiert wird. Diese Inhibition äußerte sich in einer reduzierten Synzytienbildung, einer mindestens 50 %igen Reduktion viral-exprimierter Proteine, sowie in einer 90-99 %igen Reduktion der auf APOBEC3G-exprimierenden Zellen entstandenen viralen Titer. Durch Sequenzanalysen konnte festgestellt werde, dass es zu einem Anstieg von 0,2 auf 0,95 unspezifischer Mutationen pro 1.000 Basenpaaren in MV-Transkripten kam, deren Muster mit dem in Kontrollzellen vergleichbar war, wohingegen typische C zu U(T) bzw. G zu A Hypermutationen nicht auftraten. Eine Kolokalisation von humanem APOBEC3G mit MV-spezifischen Proteinen konnte ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Es zeigte sich allerdings, dass APOBEC3G an virale RNA binden konnte. Außerdem wurde APOBEC3G in aufgereinigten viralen Partikeln um etwa den Faktor 4 angereichert. Versuche mit einem MV-Minireplikon-System ergaben, dass APOBEC3G eine Inhibition der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase bewirkt, vermutlich aufgrund der Fähigkeit des Proteins an virale RNA zu binden. Immunfluoreszenzfärbungen mit mutierten APOBEC3G-Proteinen haben auch in die-ser Arbeit erneut belegt, dass der RNA-bindenden Desaminase-Domäne bei der zellulären Lokalisation des Proteins eine besondere Rolle zukommt, da einige Mutationen innerhalb dieses Bereiches zu einem hohen Verlust der Proteinexpression sowie zu einer Ansammlung der mutierten Proteine am rauen endoplasmatischen Retikulum führen. Die in dieser Arbeit gezeigte Inhibition der Replikation von MV durch humanes APO-BEC3G lässt eine generelle antivirale Aktivität von Mitgliedern der APOBEC-Familie gegen negativ-strängige RNA-Viren vermuten, welche auf der Fähigkeit des Proteins beruht RNA zu binden. Weitere Untersuchungen bezüglich der Inhibition anderer Vertreter der Mononegavirales durch verschiedene APOBEC-Proteine könnten Aufschluss über die beteiligten Mechanismen geben.
1-5% of human blood T cells are Vγ9Vδ2 T cells whose T cell receptor (TCR) contain a TRGV9/TRGJP rearrangement and a TRDV2 comprising Vδ2-chain. They respond to phosphoantigens (PAgs) like isopentenyl pyrophosphate or (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphate (HMBPP) in a butyrophilin 3 (BTN3)-dependent manner and may contribute to the control of mycobacterial infections. These cells were thought to be restricted to primates, but we demonstrated by analysis of genomic databases that TRGV9, TRDV2, and BTN3 genes coevolved and emerged together with placental mammals. Furthermore, we identified alpaca (Vicugna pacos) as species with typical Vγ9Vδ2 TCR rearrangements and currently aim to directly identify Vγ9Vδ2 T cells and BTN3. Other candidates to study this coevolution are the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) and the nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus) with genomic sequences encoding open reading frames for TRGV9, TRDV2, and the extracellular part of BTN3. Dolphins have been shown to express Vγ9- and Vδ2-like TCR chains and possess a predicted BTN3-like gene homologous to human BTN3A3. The other candidate, the armadillo, is of medical interest since it serves as a natural reservoir for Mycobacterium leprae. In this study, we analyzed the armadillo genome and found evidence for multiple non-functional BTN3 genes including genomic context which closely resembles the organization of the human, alpaca, and dolphin BTN3A3 loci. However, no BTN3 transcript could be detected in armadillo cDNA. Additionally, attempts to identify a functional TRGV9/TRGJP rearrangement via PCR failed. In contrast, complete TRDV2 gene segments preferentially rearranged with a TRDJ4 homolog were cloned and co-expressed with a human Vγ9-chain in murine hybridoma cells. These cells could be stimulated by immobilized anti-mouse CD3 antibody but not with human RAJI-RT1Bl cells and HMBPP. So far, the lack of expression of TRGV9 rearrangements and BTN3 renders the armadillo an unlikely candidate species for PAg-reactive Vγ9Vδ2 T cells. This is in line with the postulated coevolution of the three genes, where occurrence of Vγ9Vδ2 TCRs coincides with a functional BTN3 molecule.