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Critical illness like sepsis, shock, and intestinal bowel disease are one of the leading causes of morbidity and mortality in the US and around the world. At present, studies to define new therapeutic interventions that can protect tissues and cells against injury and attenuate inflammation are fields of intense investigation. While research over the past decade has clearly identified GLN as a vital stress substrate facilitating cellular survival following injury, the initiation steps in GLN’s cytoprotective molecular mechanism still remain elusive. Previously published work suggested that stabilization of ECM proteins and activation of ECM receptor osmosignaling may play a central role in the orchestration of many cellular pathways following stress. Thus, I hypothesized that preservation of ECM protein and EGFR levels as well as ECM receptor signaling play key roles in the molecular mechanisms underlying GLN’s protection against thermal injury in the intestine. I was able to confirm via Western blotting and by using silencing RNA against FN, Ntn-1, EGFR, and their negative controls, that GLN-mediated preservation of FN, Ntn-1, and EGFR levels is critical in GLN’s protection against hyperthermia in IEC-6 cells. By using a selective FN-Integrin interaction inhibitor GRGDSP, its negative control peptide GRGESP, and Src-kinase inhibitor PP2, I showed that FN-Integrin signaling and Src-kinase activation are essential in GLN-mediated protection in the intestine. This applied to EGFR signaling as demonstrated using the EGFR tyrosine kinase inhibitor AG1478. In addition to GRGDSP and AG1478, ERK1/2 inhibitors PD98059 and UO126 as well as the p38MAPK inhibitor SB203580 revealed that GLN is protective by activating ERK1/2 and dephosphorylating p38MAPK via FN-Integrin and EGFR signaling. However, GLN-mediated PI3-K/Akt/Hsp70 activation seems to occur independently of FN-Integrin and EGFR signaling as indicated by Western blots as well as experiments using the PI3-K inhibitor LY294002, GRGDSP, and AG1478. The results showed that GLN activates cell survival signaling pathways via integrins as well as EGFRs after hyperthermia. Moreover, I found that GLN-mediated preservation of FN expression after HS is regulated via PI3-K signaling. Whether GLN-mediated PI3-K signaling happens simultaneously to FN-Integrin and EGFR signaling or whether PI3-K signaling coordinates FN-Integrin and EGFR signaling needs to be investigated in future studies. Further, experiments with PD98059 and GRGDSP revealed that ERK1/2 assists in mediating transactivation of HSF-1 following HS. This leads to increases in Hsp70 expression via FN-Integrin signaling, which is known to attenuate apoptosis after thermal injury. Fluorescence microscopy results indicated that HS and GLN regulate cell are size changes and the morphology of F-actin via FN-Integrin signaling. Experiments using GRGDSP and GRGESP showed that GLN enhances cellular survival via FN-Integrin signaling in a manner that does not require increased intracellular GLN concentrations (as quantified using LC-MS/MS). In summary, my thesis work gives new and potentially clinically relevant mechanistic insights into GLN-mediated molecular cell survival pathways. These results warrant clinical translation to assess if clinical outcome of critically ill patients suffering from gastrointestinal diseases can be improved by GLN treatment and/or by targeting the molecular pathways found in my studies.
Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden.
Osteoporose ist einer der häufigsten Knochenerkrankungen im fortschreitenden Alter und zählt, aufgrund der damit verbundenen hohen direkten und indirekten Behandlungskosten, zu einer der zehn wichtigsten volkswirtschaftlichen Krankheiten. Die Behandlung der Osteoporose ist langjährig und umfasst eine medikamentöse Therapie auf der Basis einer „knochengesunden“ Lebensweise hinsichtlich Ernährung und Bewegung. Im Rahmen von Untersuchungen zur Linderung von postmenopausalen Beschwerden, zeigte ein Extrakt der Pflanze Cimicifuga racemosa Potential zu osteoprotektiver Wirksamkeit und rückte somit in den Fokus für eine mögliche Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Osteoporose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, in enger Zusammenarbeit mit der Bionorica SE, welche für die Aufreinigung und Fraktionierung des Pflanzenextraktes zuständig war, und mit der Arbeitsgruppe um Prof. Wuttke, welche parallele Rattenstudien durchführte, Methoden anzuwenden, mit denen osteoprotektive Wirksamkeiten nachgewiesen und auf einzelne Fraktionen des Extraktes limitiert werden können. ...