Refine
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- yes (2)
Document Type
- Doctoral Thesis (2) (remove)
Language
- German (2)
Keywords
- Molekularbiologie (2) (remove)
Institute
- Institut für Virologie und Immunbiologie (2) (remove)
In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Berücksichtung des FV Hüllglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. Über die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umhüllte Viren können entweder durch direkte Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abhängigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellulärer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abhängigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. Ähnlich wie bei Vesikuläres Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen lässt. Eine Analyse der pH-Abhängigkeit der FV Env Fusionsaktivität in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivität mit einer maximalen Stärke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivität bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivität in saurem Milieu weist auf eine Konformationsänderung des Hüllglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abhängigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazitäts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verstärktes Grün Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Primärinfektion über einen intrazellulären Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die über einen Se-kundärzyklus mit Hilfe extrazellulärer Partikel stabil transduzieren können, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herkömmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant höhere persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erhöhte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten.
B-Zell-Lymphome des mukosaassoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) entwickeln sich außerhalb des primären lymphatischen Gewebes und entstehen hauptsächlich im Magen aufgrund einer H. pylori-assoziierten chronischen Entzündung. Vorangegangene immunhisto-chemische und funktionelle Untersuchungen zeigten, daß die Tumorzellen phänotypisch Gedächtnis-B-Zellen entsprechen und Antigenrezeptoren auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. In der vorliegenden Arbeit konnten mit Hilfe von molekulargenetischen Antigenrezeptor-analysen die Tumorzellpopulationen identifiziert und charakterisiert werden. Dabei wurde deutlich, daß sowohl mono- als auch biklonale B-Zell-Lymphome existieren. Im Vergleich zu neueren veröffentlichten Daten von MALT-Typ Lymphomen aus der Speicheldrüse, konnte jedoch bei den hier untersuchten gastralen Tumoren keine VH-Gen-restriktion nachgewiesen werden. Die tumorspezifischen VH-Mutationsanalysen zeigten, daß es sich bei den Tumor-B-Zellen auch genotypisch um Gedächtnis-B-Zellen handelt, die jedoch offensichtlich unter-schiedlich lange dem Mechanismus der Keimzentrumsmaturation ausgesetzt worden waren. Zudem konnte bei mono- und biklonale Lymphomen, im Gegensatz zu Fällen mit poly-klonalem Entzündungsinfiltrat die Translokation t(11;18)(q21;q21) nachgewiesen werden. Ausgehend von der Tatsache, daß die Tumorprogression dieser B-Zell-Lymphome anfangs noch abhängig von dem lokal vorhandenen Mikromilieu zu sein scheint, wurden die tumorinfiltrierenden T-Zellen (TITL) genauer charakterisiert. Es wurden überwiegend CD4+ TITLs nachgewiesen, die sowohl aktiviert (C69+) als auch immunkompetent (CD28+) waren und die für T/B-Zell-Kooperationen essentiellen Moleküle wie CD40-Ligand und Fas-Ligand exprimierten. Zudem konnten im Tumorgewebe vor allem TH2/3-Typ Cytokine (IL10, IL13, TGFb1) nachgewiesen werden, die ebenfalls das Tumorwachstum in vitro positiv beeinflussen können. Um in Zukunft spezifischere Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Tumor-B-Zellen und TITLs durchführen zu können, wurde abschließend ein Zellkultursystem ent-wickelt, mit dessen Hilfe es möglich sein wird das Tumormikromilieu in vitro spezifisch zu simulieren, um so das Verhalten der Tumor-B-Zellen auch ex vivo beobachten und analysieren zu können. Die Daten dieser Arbeit geben einen vertieften und verbesserten Einblick in die tumorspezifischen Mechanismen und ermöglichen den Entwurf eines neuen detaillierteren Mo-dells zur Tumorentstehung und -progression von niedrig-maligne MALT-Typ Lymphomen.