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Monolayer or suspension cell cultures are of only limited value as experimental models for human cancer. Therefore, more sophisticated, three-dimensional culture systems like spheroid cultures or histocultures are used, which more closely mimic the tumor in individual patients compared to monolayer or suspension cultures. As tissue culture or tissue engineering requires more sophisticated culture, specialized in vitro techniques may also improve experimental tumor models. In the present work, a new miniaturized hollow-fiber bioreactor system for mammalian cell culture in small volumes (up to 3 ml) is characterized with regard to transport characteristics and growth of leukemic cell lines (chapter 2). Cell and medium compartment are separated by dialysis membranes and oxygenation is accomplished using oxygenation membranes. Due to a transparent housing, cells can be observed by microscopy during culture. The leukemic cell lines CCRF-CEM, HL-60 and REH were cultivated up to densities of 3.5 x 107/ml without medium change or manipulation of the cells. Growth and viability of the cells in the bioreactor were the same or better, and the viable cell count was always higher compared to culture in Transwellâ plates. As shown using CCRF-CEM cells, growth in the bioreactor was strongly influenced and could be controlled by the medium flow rate. As a consequence, consumption of glucose and generation of lactate varied with the flow rate. Influx of low molecular weight substances in the cell compartment could be regulated by variation of the concentration in the medium compartment. Thus, time dependent concentration profiles (e.g. pharmacokinetic profiles of drugs) can be realized as illustrated using glucose as a model compound. Depending on the molecular size cut-off of the membranes used, added growth factors like GM-CSF and IL-3 as well as factors secreted from the cells are retained in the cell compartment for up to one week. Second, a method for monitoring cell proliferation the hollow-fiber bioreactor by use of the Alamar BlueTM dye was developed (chapter 3). Alamar BlueTM is a non-fluorescent compound which yields a fluorescent product after reduction e.g. by living cells. In contrast to the MTT-assay, the Alamar BlueTM-assay does not lead to cell death. However, when not removed from the cells, the Alamar BlueTM dye shows a reversible, time- and concentration-dependent growth inhibition as observed for leukemic cell lines. When applied in the medium compartment of a hollow-fiber bioreactor system, the dye is delivered to the cells across the hollow-fiber membrane, reduced by the cells and released from the cell into the medium compartment back again. Thus, fluorescence intensity can be measured in medium samples reflecting growth of the cells in the cell compartment. This procedure offers several advantages. First, exposure of the cells to the dye can be reduced compared to conventional culture in plates. Second, handling steps are minimized since no sample of the cells needs to be taken for readout. Moreover, for the exchange of medium, a centrifugation step can be avoided and the cells can be cultivated further. Third, the method allows to discriminate between cell densities of 105, 106 and 107 of proliferating HL-60 cells cultivated in the cell compartment of the bioreactor. Measurement of fluorescence in the medium compartment is more sensitive compared to glucose or lactate measurement for cell counts below 106 cells/ml, in particular. In conclusion, the Alamar BlueTM-assay combined with the hollow-fiber bioreactor offers distinct advantages for the non-invasive monitoring of cell viability and proliferation in a closed system. In chapter 4 the use of the hollow-fiber bioreactor as a tool for toxicity testing was investigated, as current models for toxicity as well as efficacy testing of drugs in vitro allow only limited conclusions with regard to the in vivo situation. Examples of the drawbacks of current test systems are the lack of realistic in vitro tumor models and difficulties to model drug pharmacokinetics. The bioreactor proved to be pyrogen free and is steam-sterilizable. Leukemic cell lines like HL-60 and primary cells such as PHA-stimulated lymphocytes can be grown up to high densities of 1-3 x 107 and analyzed during growth in the bioreactor by light-microscopy. The cytostatic drug Ara-C shows a dose-dependent growth inhibition of HL-60 cells and a dose-response curve similar to controls in culture plates. The bioreactor system is highly flexible since several systems can be run in parallel, soluble drugs can be delivered continuously via a perfusion membrane and gaseous compounds via an oxygenation membrane which also allows to control pO2 and pH (via pCO2) during culture in the cell compartment. The modular concept of the bioreactor system allows realization of a variety of different design properties, which may lead to an improved in vitro system for toxicity testing by more closely resembling the in vivo situation. Whereas several distinct advantages of the new system have been demonstrated, more work has to be done to promote in vitro systems in toxicity testing and drug development further and to reduce the need for animal tests.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.
Neuromelanin (NM) is a complex polymer pigment found in catecholaminergic neurons of the human substantia nigra and locus ceruleus. The structure of this molecule is poorly characterised, and the physiological function of it in the brain is unknown. In vitro data, based upon synthetic dopamine melanins (DAM), suggest that these pigments may exhibit radical scavenging properties, but in the presence of iron, DAM acts as a proxidant. These data suggested that NM may be associated with the especial vulnerability of pigmented dopaminergic cells in Parkinson´s disease (PD), a disorder in which nigral iron levels are increased and the relatively specific loss of the pigmented neurons of the substantia nigra. Given the rarity of NM, and the difficulty of isolating this material from the human brain, all functional studies of NM published to date have utilised a synthetic dopamine melanin in place of the native pigment. In the current work we investigated the effects of NM from the healthy human brain and synthetic DAM on cell health and oxidative status in human-derived cell lines. Methods SK-N-SH, a human neuroblastoma cell line, and U 373, a human glioblastoma cell line was chosen to represent human neuronal and glial cell types. NM was isolated from the SN of adult human subjects from Australia and Germany with no history of neurological or neurodegenerative diseases. Synthetic DAM was prepared by autooxidation of dopamine. DAM and NM samples were added to the cultures with fresh media to final concentrations of 0.05 or 0.1 mg/ml. In some experiments cells were incubated with Fenton reagent (400µM FeSO4 plus 200µM H2O2) in the presence or absence of melanin or the iron chelator desferoxamine mesylate (100µM). The cells were incubated at 37 °C at 5% CO2 for varying periods of time as described. Lactate dehydrogenase (LDH) activity and Lipid peroxidation were measured. Hydroxyl radical production in the cultures was estimated used a modification of the salicylic acid spin-trapping method. All experiments were performed three times in triplicate and analysed using regression analysis and one- or two-way Analysis of Variance followed by Bonferroni’s t test corrected for multiple comparisons as appropriate. Results Following 24 hr incubation, both the native NM and the synthetic DAM pigment could be seen as electron dense granules both within the cell bodies of the SK-N-SH and U373 cells. The melanin was incorporated into the cell via an invagination of the cell membrane. DAM but not NM significantly increased the LDH activity and lipid peroxidation as well as the hydroxyl radical production. Co-incubation of Fenton reagent with either DAM or NM resulted in additive effects, compared to the levels elicited by Fenton reagent and the melanins alone. When added the iron chelator desferoximine together with Fenton reagent attentuated lipid peroxidation and hydroxyl radical production to control levels. In contrast, lipid peroxidation and hydroxyl radical production in U373 cells exposed to NM or DAM did not differ to that measured in untreated cells. Discussion Human neuron-derived cell line is a useful approach to address the effects of NM on dopaminergic neuron function. This is the first work to use internalised NM isolated from the healthy human brain as a model of intraneuronal pigment in vitro. Cell line functional studies showing cellular changes induced by DAM but not NM demonstrated that DAM is relatively toxic to cells but not NM. DAM represents a poor functional model of NM in that it displays a marked toxicity unrepresentative of the effects of the native melanin. Both NM and DAM were unable to attentuate the toxic effects of the added oxidative stimulus, this probably due to the exceeding the chelating capacity of NM. Future studies should point to the characterization and role of NM under in vivo conditions. The development of strategies to protect the neuromelanin in dopaminergic neurons may have important therapeutic implications not only for PD.
Die in vitro-Langzeitkultivierung von Zellen in einer Drei-Dimensionalen Matrix (3D-Matrix) stellt nach wie vor eine Herausforderung im Tissue engineering dar. Die Kultivierung von Zellen auf/in komplexen 3D-Trägern erfordert hohe Zellzahlen und lange Kulturzeiten. Um die Probleme des schnellen Mediumverbrauches und der limitierten Zellzahl bzw. Zelldichte in konventionellen Kulturmethoden zu umgehen, wurde ein „Zweikreis-Perfusionssystem“ entwickelt. Hierzu wurde ein Cell-Pharm System (Cell-Pharm System 100®-Basisgerät) modifi-ziert. Das Grundprinzip des Systems besteht darin, dass ein kleinvolumiger (50-70 ml) „Zellkultur-Kreislauf“ über einen Bioreaktor (semipermeable Hohlfasermembran) durch einen großvolumigen (1000 ml) „Regenerations-Kreislauf“ kontinuierlich im Gegenstromprinzip regeneriert wird. Die Regulation des ph-Wertes und der Sauerstoffsättigung des Kulturmediums geschieht über einen integrierten, Druckluft-CO2-begasten Oxygenator. Während die Zirkulationsgeschwindigkeit (Durchflussrate) und Temperatur (37°C) im Regenerations-Kreislauf konstant gehalten werden, lassen sich diese Parameter im „Zellkultur-Kreislauf“ beliebig variieren. Es hat sich gezeigt, dass sich auf diese Weise kontinuierlich über einen langen Zeitraum ohne Mediumwechsel konstante und optimale Milieuverhältnisse in beiden Mediumkompartments einstellen lassen. Zur Untersuchung der Wachstumseigenschaften von Zellen in diesem Perfusions-system wurden humane osteoblastenähnliche Zellen oder Ratten-Knochenmarkszellen auf eine Matrix aus demineralisierter, GuHCl-extrahierter Rinderspongiosa unterschiedlicher Größe (Zylinder zwischen 5x3 mm und 5x10 mm) aufgetragen. Unter intermittierender Perfusion der Kulturkammern (z.B. Minucells cell container®) mit 50-70 ml/d kam es zu einem gleichmäßigen, intertrabekulären Wachstum der Zellen innerhalb des gesamten Trägers. Nach 6-8 Wochen konnte immer noch ein dichtes Netz interdigitierender ALP-positiver osteoblastenähnlicher Zellen innerhalb der gesamten Matrix beobachtet werden. Dabei scheint die physikalisch-mechanische Komponente der „Umspülung“ der Zellen mit dem kontinuierlich regenerierten Nährmedium einen positiven Einfluss auf das Anwachsverhalten und Proliferation der Zellen zu haben. Somit erlaubt das modifizierten „Zweikreisperfusionssystem“ eine gute Möglichkeit für die Langzeitperfusionskultur in einem geschlossenen System mit indi-viduell steuerbaren Strömungsverhältnissen im Zellkompartment bei einer kontinuierlichen Regeneration des Mediums.
Die Auswahl der Zellkulturmodelle hFOB 1.19 und C3H10T1/2 – BMP-2 erfolgte basierend auf den Hypothesen zur Entstehung heterotoper Ossifikationen. So kann die humane fetale Osteoblastenzell-Linie hFOB 1.19 in diesem Zusammenhang als determined osteoblastic progenitor cell und die murine mesenchymale Zell-Linie C3H10T1/2–BMP-2 als inducable osteoblastic progenitor cell angesehen werden. Die Zell-Linie hFOB 1.19 bietet aufgrund ihres humanen Ursprungs und der reproduzierbaren Expression osteogener Marker wie Alkalische Phosphatase, Prokollagen I und Osteocalcin die Möglichkeit, den humanen in vivo Osteogeneseprozess in vitro im Zellkultursystem zu imitieren. In der vorliegenden Studie gelingt es, im Rahmen der NSAR-Versuche die Schlüsselrolle des PGE2 sowohl im Knochenmetabolismus als auch bei der Entstehung heterotoper Ossifikationen, sowie dessen Mediatorfunktion in der Regulation osteoblastenspezifischer Differenzierungsparameter im Zellkulturmodell zu demonstrieren, obgleich der Nachweis der kalzifizierungsinhibierenden Wirkung Nichtsteroidaler Antiphlogistika, wie auch in der einschlägigen Literatur, am Zellkultursystem weiterhin aussteht. Unter Berücksichtigung aller gewonnenen Daten kann in dieser Studie dokumentiert werden, dass die murine mesenchymale Progenitorzelle C3H10T1/2 unter BMP-2-Transfizierung und der Zugabe von Ascorbat und -Glycerophosphat zu osteoblastärer Differenzierung induziert wird, osteogene Eigenschaften entwickelt und im Längsschnitt der Studie deutliche Mineralisationstendenz aufweist.
Aus vorherigen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der Säugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivität und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen könnten Rückschlüsse auf funktionelle Strukturen des Säugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die übergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivität unterscheiden. Für die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von Küken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgeführt, um eine mögliche Veränderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierfür wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinwärtsströmen untersucht. Zunächst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabhängig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die nächste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierfür wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3% ± 0,5% bei pH 7,4 auf 35,0% ± 4,0% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabhängig ist. Hierfür wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgeführt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einwärtsströme gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einwärtsstroms temperaturabhängig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einwärtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Küken TRPV1 ähnlich wie der der Säugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entzündlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verstärkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone.
Als Therapie des Diabetes mellitus Typ II stellt die Xenotransplantation von porzinen Langerhans-Inseln in mikroverkapselter Form eine attraktive Alternative zu den täglichen Insulininjektionen dar. Kultivierung und Funktionsdiagnostik der isolierten porzinen Langerhans-Inseln sind technisch anspruchsvoll und bieten noch immer Potential für Verbesserungen. Werden die Zellen in Zellkulturflaschen über mehrere Tage kultiviert, sinkt die Vitalität unter ein akzeptables Niveau. Bei der Beurteilung der Vitalität und Funktion der Inseln gehen wertvolle Zellen für eine spätere Transplantation verloren. Dies schränkt eine ausgiebige Diagnostik vor der Transplantation ein. Ziel der Arbeit ist es, eine Möglichkeit zur Verbesserung der Kulturbedingungen zu finden und exakte Ergebnisse bei der Funktions- und Vitalitätsdiagnostik ohne Verlust von Zellen zu erreichen. Vorversuche konnten beweisen, dass eine Verbesserung der Vitalität von Langerhans-Inseln in Kultur an der Methode der Kultivierung in Zellkulturflaschen scheitert. Stattdessen wurde das Prinzip der Perfusionskultur in spezialisierten Behältnissen für die systematische Verbesserung der Kulturbedingungen und zur genaueren Diagnostik mittels Mikroskopie und Funktionsdiagnostik gewählt. Mit einem solchen System ist sowohl Kultivierung als auch Funktions- und Vitalitätsdiagnostik in einem Behälter möglich. Beim Prinzip der Perfusionskultur befindet sich das Medium stets in Bewegung um die Zellen und Gewebe und sorgt so für einen kontinuierlichen Zustrom exakt definierten Mediums und permanenten Abtransport der Stoffwechselprodukte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die Anforderungen im eigenen Labor ein maßgeschneidertes System mit mehreren Versionen von Behältnissen für Perfusionskulturen entwickelt, deren jeweils neuere Version auf den Erfahrungen mit den Vorversionen aufbaut. In die Entwicklung fließen ebenso umfangreiche theoretische Überlegungen ein, sowie systematische Tests zu den physikalischen Eigenschaften der Behältnisse. Die zuletzt entwickelte ist die Version V6SMTE, die in der Arbeit „Würzburger Kammer“ genannt wird. Dieser Behälter ist aus Edelstahl, mit einem Deckglas zur makro- und mikroskopischen Begutachtung, Zu- und Abläufen und einem Anschluss zum Entfernen von Gasblasen. Im Inneren befindet sich ein Einsatz, der eine stufenlose Regulierung des Volumens um die Zellen ermöglicht, so dass für Kultur und Funktionsprüfung bzw. Mikroskopie jeweils optimale Bedingungen erreicht werden. Weiterhin kann über einen Temperatursensor die Temperatur im Inneren des Behälters gemessen und über Heizelemente an der Außenwand computergesteuert reguliert werden. Die Zellen und Gewebe können auf unterschiedlichen Trägermaterialien eingesetzt werden. Während der Kultur kann ein Deckel geöffnet und die Zellen manipuliert werden. Das System ist unabhängig vom Brutschrank, ist sterilisierbar und wieder verwendbar. Kultiviert wurde endokrines Gewebe (isolierte Langerhans-Inseln, humanes Nebenschilddrüsengewebe). Dieses wurde zur Funktionsprüfung mit verschiedenen Mediatoren stimuliert, das Medium fraktioniert aufgefangen und sein Hormongehalt mit ELISA oder RIA bestimmt. Die Zellen wurden nativ und mit Fluoreszenzfarbstoffen (FDA, PI) gefärbt mit bis zu 400facher Vergrößerung unter dem Auflichtmikroskop beurteilt. Im Zuge der Auswertung der anfallenden Proben auf ihren Insulingehalt wurde für diese Arbeit ein Insulin-ELISA entwickelt, der bei vergleichbarer Genauigkeit deutlich günstiger ist, als der bisher verwendete kommerzielle ELISA. Mit der Würzburger Kammer kultivierte Langerhans-Inseln zeigten eine vergleichbare Vitalität im Vergleich zur Zellkulturflasche, die mit der Würzburger Kammer gewonnenen Perifusionskurven sind in hohem Maß reproduzierbar, Zusammenhänge von Höhe der Glukoseexposition und Kultivierungsdauer mit der Insulinausschüttungskurve konnten eindrucksvoll beschrieben werden. Erstmals wurde auch im eigenen Labor die aus der Literatur bekannte paradoxe Insulinausschüttung beschrieben. Beispielhaft für andere endokrine Gewebe wurde humanes Nebenschilddrüsengewebe erfolgreich in der Würzburger Kammer kultiviert und Vitalitäts- und Funktionsdiagnostik unterzogen. Das Kultursystem ermöglicht die Kultivierung und eine komplette Analyse von Funktion, Vitalität und Morphologie von endokrinen Zellen. Es kann somit in idealer Weise zur Verbesserung der Kulturbedingungen und zur Beurteilung von endokrinen Zellen vor der Transplantation herangezogen werden.
Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt.
Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) für die Endothelaktivierung. Für diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegenüberstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskulären Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-Mäusen (WT) und von eNOS-Knockout-Mäusen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen für Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei über 95%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erhöht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erhöhen beide Genotypen ihr Adhäsionsmolekülprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verfügen zudem über einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberflächenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise ermöglicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erhöhte basale ROS-Produktion. Diese lässt sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verlässliches Modell für Untersuchungen an Gefäßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adhäsionsmoleküle an der Zelloberfläche als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht für die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdrückung der endothelialen Oberflächenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO führt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalfänger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erhöht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegenüber zusätzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen können die höhere ROS-Belastung in den durchgeführten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zusätzlichem oxidativen Stress ein erhöhtes Maß an O2- das Startsignal für die Abläufe der endothelialen Aktivierung darstellt.
Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist mit einer Inzidenz von 1:6000 die zweithäufigste autosomal-rezessive Erbkrankheit im frühen Kindesalter. Die durch den Verlust des SMN- (survival of motoneuron) Gens reduzierte SMN Protein Expression führt zu einer Degeneration der spinalen Motoneurone mit proximal betonter Muskelschwäche. Deshalb zielen erste Therapieversuche darauf ab, diese zu erhöhen. Es war gezeigt worden, dass durch den Einsatz von Histon Deacetylase Inhibitoren (HDAC) in neuronalen Kontroll Zellen und in nicht neuronalen Zellen von SMA Patienten die SMN Protein Expression signifikant gesteigert werden konnte. In der vorgelegten Arbeit wurde untersucht, ob die HDAC Inhibitoren Valproat, SAHA und FK228 Einfluss auf die SMN Protein Expression in kortikalen neuronalen Vorläuferzellen (NSC), auf primär embryonale Fibroblasten (PMEF) und auf die morphologischen Veränderungen in primär kultivierten embryonalen Motoneuronen eines Mausmodells der SMA haben. Es konnte eine signifikante Steigerung der SMN Protein Expression durch den Einsatz von Valproat und FK228 in kortikalen neuronalen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Es ergab sich jedoch kein Einfluss auf die SMN Protein Expression in primär embryonalen Fibroblasten. Bei NSCs und primär kultivierten embryonalen Motoneuronen wirkten die HDAC Inhibitoren Valproat und FK228 konzentrationsabhängig toxisch auf das Überleben, die Länge der Axone und die Größe der Wachstumskegel. Es konnte kein positiver Einfluss auf die morphologischen Veränderungen des Mausmodells gesehen werden. Zusammenfassend zeigte sich in der vorgelegten Arbeit ein positiver Effekt auf die SMN Protein Expression durch den Einsatz von HDAC Inhibitoren, der jedoch mit einem toxischen Effekt auf die behandelten neuronalen Zellen einherging.
Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert.
Das CCN Protein CYR61 besitzt eine Reihe außergewöhnlicher biologischer Funktionen. Als ein Molekül der EZM dient es der Regulation zellulärer Aktivitäten wie Adhäsion, Wanderung und Proliferation. Diese Funktionen stehen im Einklang mit der Wirkung von Proteinen, die Zellwachstum und Differenzierung steuern. Die gewebespezifische und zeitlich begrenzte Expression von CYR61 in Mäuseembryonen lieferte bereits erste Hinweise über eine mögliche Beteiligung an der Entwicklung des Skelettsystems. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde das CYR61 Protein in nachfolgenden Arbeiten als ein neuer, die Chondrogenese regulierender, Faktor identifiziert. Welchen Einfluss dieses Proteins auf den Knorpelstoffwechsel unterschiedlicher humaner Chondrozytenzelllinien hat wurde Gegenstand neuer Untersuchungen. Dieses Interesse bildete die Grundlage zur Themenstellung der vorliegenden Arbeit. Die Wirkung von CYR61 auf die chondrogene Differenzierung sollte anhand zweier verschiedener Zelllinien (C-28/I2 und T/C-28a2) untersucht werden. Hierbei wurde das Expressionsverhalten von unterschiedlichen Chondrozytenmarkern unter der Wirkung von CYR61 untersucht. Die CYR61-abhängigen Effekte wurden durch RT-PCR nachgewiesen und die Ergebnisse unter serumhaltigen sowie serumreduzierten Versuchsbedingungen hierbei miteinander verglichen.
Der Ersatz von Knochengewebe durch die Methode des Tissue Engineerings stellt eine viel versprechende Alternative zu konventionellen Therapieformen dar. Jedoch müssen die bisherigen Kulturbedingungen verbessert werden, um das Differenzierungsverhalten von Zellen optimal steuern zu können. Dabei spielt nicht nur die Wahl eines geeigneten Scaffolds und der zu verwendenden Zellen, sondern auch die des Kultursystems eine entscheidende Rolle. In einem dynamischen Kultursystem zirkuliert Medium und bietet gegenüber einem statischen Kultursystem veränderte Bedingungen bezüglich Nährstoffversorgung und Stimulation durch Flüssigkeitsscherstress. Um die Einflüsse der veränderten Bedingungen zu analysieren, wird in dieser Arbeit ein dynamisches Kultursystem etabliert. Dazu werden Calciumphosphat(CaP)-Scaffolds mit dem 3D Powder Printing System gedruckt und mit Zellen der Osteosarkomzelllinie MG63 oder der Fibroblastenzelllinie L-929 besiedelt. In 17 Versuchsreihen werden die zellbesiedelten Scaffolds bei unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten und über unterschiedliche Kultivierungszeiträume kontinuierlich perfundiert. Anhand der Wachstumsparameter Zellzahl und Zellviabiltät, sowie der Morphologie und räumlichen Verteilung der Zellen werden die Qualitäten der Kultursysteme untersucht und mit statischen Kultursystemen verglichen. Die mit dem 3D Powder Printing System gedruckten Scaffolds erweisen sich als geeignet: Nach 6-tägiger Kultur können unter dem Rasterelektronenmikroskop auf den CaP-Scaffolds eine reichliche Zellbesiedelung mit morphologisch gesunden Zellen, die in das Porensystem hineinwachsen, beobachtet werden. Bei beiden Zelllinien nehmen in beiden Kultursystemen die Wachstumsparameter über einen 6-tägigen Kultivierungszeitraum stetig zu und eine Langzeitkultur über 30 Tage kann in beiden Kultursystemen am Leben erhalten werden. Die kontinuierliche Perfusion in einem dynamischen Kultursystem wirkt sich auf das Zellwachstum günstig aus. Im Vergleich von dynamischen zu statischem Kultursystem über einen 6-tägigen Kultivierungszeitraum wachsen beide Zelllinien im dynamischen Kultursystem besser. Dabei spielt die Fließgeschwindigkeit im dynamischen Kultursystem auf die verbesserte Nährstoffversorgung und Stimulation durch Flüssigkeitsscherstress eine Rolle. Außerdem ist zu beachten, dass der Einfluss der Fließgeschwindigkeit des Mediums auf die einzelnen Scaffolds innerhalb des Kulturcontainers unterschiedlich ist. Dies hängt vom Strömungsprofil im Container ab und macht sich durch eine erhöhte Standardabweichung der Messwerte gegenüber der statischen Kultur bemerkbar.
This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point.
Das triple-negative Mammakarzinom ist Hormonrezeptor- und HER2 negativ und mit einer ungünstigen Prognose verbunden. Triple-negative Patientinnen sind unempfindlich gegen die endokrine Therapie und den HER-2/neu Antikörper Trastuzumab und deshalb auf die zytostatische Chemotherapie angewiesen. Lobaplatin ist ein Platinderivat mit wenigen Nebenwirkungen und guter Antitumorwirkung in vitro und deshalb möglicherweise auch für die Behandlung triple-negativer Tumoren geeignet. Für die vorliegende Arbeit haben wir zwei triple-negative und eine klassische Brustkrebszelllinie verwendet. Die beiden triple-negativen Zelllinien wurden anhand einer vorbeschriebenen Mutation identifiziert, um eine Verwechslung auszuschließen. Die Aktivität des p53 Gens wurde in allen drei Zelllinien überprüft, ein aktives p53 Gen jedoch nur in der hormonrezeptor-positiven MCF7 Zelllinie nachgewiesen. Ein Zusammenhang zwischen p53 Status und Ansprechen der Zellen auf Lobaplatin oder Cisplatin konnte nicht belegt werden. Wir haben die zytotoxische Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin verglichen. Lobaplatin war in unseren Untersuchungen ähnlich wirksam wie Cisplatin und bei der Behandlung der MCF7 Zelllinie und einer Cisplatin-resistenten Ovarialkarzinomzelllinie sogar dem Cisplatin überlegen. Lobaplatin wies in diesen Zellen keine komplette Kreuzresistenz zu Cisplatin auf. In einem nächsten Schritt wurden unterschiedliche Zytostatika mit Lobaplatin kombiniert. Additive Synergien zwischen den einzelnen Substanzen konnten nicht bewiesen werden, jedoch war ein gutes Zusammenwirken von Lobaplatin und dem in der klinischen Erprobung befindlichen Todesliganden TRAIL zu erkennen. Mittels Nachweis von Spaltprodukten haben wir gezeigt, dass Lobaplatin und Cisplatin eine Aktivierung von Caspasen bewirken. Die aktivierte Caspase 3 konnte allerdings nicht dargestellt werden. Die Begriffe Apoptose und Nekroptose wurden diskutiert und eine Beteiligung beider Prozesse an der Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin nachgewiesen. Veränderungen des Zellzyklus wurden untersucht. Die beiden Platinderivate führten zu einem Arrest in der G2-Phase und in höheren Konzentrationen teilweise zu einem G1-Arrest. Insgesamt sind an der zytotoxischen Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin und der Entscheidung über Leben oder Tod viele wichtige Mechanismen in wechselnder Rangfolge beteiligt. In unseren Versuchen an zwei triple-negativen und einer klassischen Brustkrebszelllinie erweist sich Lobaplatin als ebenbürtiger Nachfahre des Cisplatin mit einer vergleichbaren Zytotoxizität, weniger schwerwiegenden Nebenwirkungen und der Fähigkeit, vorhandene Cisplatinresistenzen teilweise zu umgehen. Lobaplatin verspricht darüber hinaus in Kombination mit anderen Zytostatika interessante therapeutische Perspektiven, die bisher nur unzureichend erprobt sind.
Beschrieben ist die Isolierung und Strukturaufklärung von Naturstoffen (Naphthochinone, dimere Naphthaline und Naphthylisochinolin-Alkaloide) aus Zell- und Wurzelkulturen von Triphyophyllum peltatum. Darüber hinaus wurden Experimente zur Biosynthese der Naphthylisochinolin-Alkaloide mit 13C2-markierten Vorstufen durchgeführt. Ebenso Bestandteil der Arbeit war die Etablierung von Kalluskulturen von Aloe saponaria, aus der ebenfalls Sekundärmetabolite isoliert wurden.
Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen.
Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden.
Da Defekte im Bereich der oralen Schleimhaut infolge von Traumata, angeborenen sowie erworbenen Krankheiten die ungestörte Funktionsweise in Bezug auf Atmung, Nahrungsaufnahme und Sprache des Menschen empfindlich beeinträchtigen und ein adäquater, alle Funktionen wiederherstellender Wundverschluss mit dem limitierten Eigengewebe oft nicht möglich ist, bietet das Tissue Engineering durch die Entwicklung eines Hautäquivalents eine aussichtsreiche Alternative. Um eine ausreichende Menge an Zellen für die Herstellung eines autologen Transplantates in kurzer Zeit zur Verfügung zu stellen, sollte in der vorliegenden Arbeit eine Methode zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit primärer humaner Keratinozyten aus oraler Mukosa im Zellkultursystem etabliert werden. Dazu mussten zunächst über die Explantation von Gewebeproben gesunder Patienten orale Schleimhautzellen gewonnen und die primären Keratinozyten von den mitwachsenden Fibroblasten isoliert werden. Dies wurde durch chemische und mechanische Separationsmethoden erreicht. Die Kultivierung der exprimierten Zellen erfolgte unter ständiger Beobachtung und physiologischen Bedingungen über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Nach Konfluenz der zweiten Passage wurden die Zellen geerntet und für die Versuche vorbereitet. Die Steigerung der Proliferationsfähigkeit der Keratinozyten sollte durch die Anreicherung epidermaler Stammzellen erreicht werden, da diese insbesondere durch ihre Fähigkeit zur asymmetrischen Teilung die Grundlage für die Regeneration, Differenzierung und Homöostase des Gewebes bilden. Eine Möglichkeit zur Isolation von Zellen mit Stammzelleigenschaften stellt die Adhäsion an beschichteten Zellkulturgefäßen dar. Die Affinität des hauptsächlich in Stammzellen vorkommenden ß1‐Integrin‐Rezeptors zu Bestandteilen der Basalmembran wie Kollagen‐IV und Laminin sollte die Trennung hoch proliferativer Zellen von weniger teilungsaktiven Zellen leisten und das Protein indirekt als Marker für die Stammzellen fungieren. Über die Adhäsion der Keratinozyten an mit den Komponenten Kollagen‐IV und Laminin beschichteten Gefäßen ließen sich zwei Zellpopulationen (adhärente und nicht-adhärente Zellen) gewinnen. Unabhängig von der verwendeten Adhäsionskomponente zeigten die Fraktionen den charakteristischen Wachstumsverlauf (lag‐Phase, log‐ Phase, stationäre Phase und Absterbephase) in vitro kultivierter Zellen, allerdings konnte kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die Vitalität und die Proliferationskinetik der Keratinozyten festgestellt werden. Eine nach der geleisteten Auftrennung der Keratinozyten zwischengeschaltete Analyse und Identifikation von Stammzellen mittels ß1‐Integrin‐Marker (z.B. durch einen Immunfluoreszenztest) könnte klären ob die adhärente Population überhaupt einen erhöhten Anteil an hoch proliferativen Keratinozyten beinhaltet oder ob die zahlreichen notwendigen, aber für die Zellen belastenden, Zwischenschritte der hier angewendeten indirekten Methode auslösend für die geringen Unterschiede sind. In Anlehnung an die von Stein et al. erarbeiteten guten Ergebnisse bezüglich der Proliferationskapazität oraler Keratinozyten nach Adhäsion an Kollagen‐IV‐beschichteten Zellkulturgefäßen wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die aufwändige immunhistochemische Untersuchung verzichtet. Ein verstärktes Wachstum der adhärenten Population konnte nur bei vereinzelten Proben festgestellt werden; insgesamt konnte die prioritär gewünschte Steigerung der Proliferation primärer humaner Keratinozyten im Zellkultursystem zur raschen Bereitstellung von Zellen für die Entwicklung eines autologen Mundschleimhaut‐Transplantates nicht erreicht werden. Die drei angewandten Verfahren zur Erfassung der Quantität führten hinsichtlich der Wachstumssteigerung zu ähnlichen Ergebnissen. Da sie aber zum einen durch das Wegfallen der für die Zellzählung und den WST‐1‐Test notwendigen Zwischenschritte eine non‐invasive (ohne mechanische Irritation und Interaktion mit Zusatzstoffen), d.h. für die Zellen schonende Methode darstellt und sich zum anderen die Ergebnisse der Real-Time-Zellanalyse, im Gegensatz zur Endpunkt-Messung, direkt auf die vorangegangenen Messungen beziehen, überzeugte die Auswertung mittels Impedanzmessung in Genauigkeit und Darstellung der Veränderung des Zellwachstums über die Zeit.
Das Nebennierenrindenkarzinom ist eine hochmaligne Erkrankung und hat eine schlechte Prognose. Mitotane ist bis heute die einzige hierfür zugelassene Therapie. Um die molekularen Mechanismen der Mitotanetherapie besser zu verstehen, wurde die Nebennierenkarzinom-Zelllinie NCI-H295 mit unterschiedlichen Konzentrationen von Mitotane inkubiert und die Wirkung auf mehreren Ebenen untersucht. Dabei kam der Untersuchung der Steroidogenese und apoptotischer Vorgänge ein besonderer Fokus zu. In den Hormonanalysen via Immunoassay zeigte sich eine zeit- und konzentrationsabhängige Hemmung der adrenalen Steroidsekretion. So kam es unter 24-stündiger Inkubation mit 100µM Mitotane zu einer Reduktion der Cortisolsekretion um 89%. Diese Hormonsuppression geht einher mit einer Herabregulation von steroidogenen Enzymen in den durchgeführten Microarray-basierten Genexpressionsanalysen. So konnte gezeigt werden, dass vor allem Steroidbiosynthese-Enzyme der Zona fasciculata und reticularis betroffen sind. Als weitere wichtige Gene im Zusammenhang mit der Beeinflussung des Steroidhaushalts unter Mitotanetherapie konnten SQLE, LDLR, SCD, SREBF1 und ABCG1 identifiziert werden.
Gleichzeitig konnte durch Durchflusszytometrie und Zelltod-ELISA die proapoptotische Wirkung von Mitotane gezeigt werden (FACS: 100µM Mitotane, 24 Stunden; Zunahme der Apoptose um den Faktor 2,13). Dies bestätigte sich beispielsweise auch in der Überexpression des Apoptosegens BAX in der Real-Time-PCR. Weiterhin zeigte der RNA-Microarray eine starke Expressionszunahme bei Genen, die mit dem programmierten Zelltod zusammenhängen wie GDF15, DUSP4, TRIB3 und CHOP.
Ausgehend von den klinischen Effekten und bestätigt durch die oben genannten in vitro Ergebnisse bewirkt Mitotane auch molekular folgende Änderungen in Nebennierenrindenzellen: Hemmung der Steroidogenese und Induktion von Apotose. Es stellt sich damit die Frage, ob diese Mechanismen parallel und separat voneinander ablaufen oder ob es einen gemeinsamen Nenner gibt.
Interessanterweise ergab die Analyse der Genexpressionsdaten, dass viele der proapoptotischen Gene mit dem sogenannten ER-Stress zusammenhängen. Einerseits könnte Mitotane durch direkte Inhibition der Hormonsekretion wirken, andererseits könnte ER-Stress durch Mitotane-induzierte-Bildung toxischer Lipide, wie Cholesterol, ausgelöst werden. Um den genauen Wirkmechanismus endgültig zu klären, werden weitere Experimente benötigt.
Mitotane-induzierter ER-Stress liefert einen vollständig neuen Blickwinkel auf die molekulare Wirkweise von Mitotane auf Nebennierenrindenkarzinomzellen. Gerade da die Mediatoren des ER-Stresses gut definiert und ER-Stress spezifisch sind, könnten sie sinnvolle Ziele in der Therapie darstellen. Die Beobachtung, dass Mitotane ER-Stress hervorruft, könnte in Zukunft somit zur Entwicklung wirksamerer und spezifischerer Therapien des Nebennierenrindenkarzinoms führen und so die infauste Prognose dieser malignen Krankheit verbessern.