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Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass humane neutrophile Granulozyten auf mRNA-Ebene hIK1-Kanäle exprimieren. Die spezifischen hIK1-Kanalblocker Clotrimazol und Charybdotoxin führten zu einer dosisabhängigen Verringerung der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Eine Hemmung der hIK1-Kanäle mittels Clotrimazol und Charybdotoxin fürte zu einer signifikanten Zellschwellung. Die mittels Hypotonie erzwungene Zellschwellung führte zu einer signifikanten Reduktion der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Migration humaner neutrophiler Granulozyten von der Aktivität der hIK1-Kanäle abhängig ist.
Neutrophile Granulozyten sind wichtige Effektorzellen des menschlichen Immunsystems. Eine Suppression der Neutrophilen kann zur Immundeffizienz mit Gefahr für bakterielle Erkrankungen und maligne Tumoren führen, eine Überstimulation dieser Zellen ist jedoch an der Entstehung der Autoimmunerkrankungen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aktivierende und hemmende Wege untersucht, die für zukünftige Strategien in Prävention und Therapie dieser Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Neutrophile Granulozyten enthalten VASP in hoher Konzentration. VASP ist ein bereits gut charakterisiertes Substrat der cAMP-PK und der cGMP-PK. Phosphorylierungsversuche mit cAMP-erhöhenden Substanzen ergaben eine rasche, reversible Phosphorylierung dieses Proteins an Ser-157 und Ser-239 in intakten humanen Neutrophilen Granulozyten. Versuche mit cGMP-erhöhenden Substanzen zeigten jedenfalls eine Phosphorylierung am Ser-157, jedoch keine Phosphorylierung am Ser-239. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich das Vorhandensein und die physiologische Funktion der cAMP-PK bezüglich der Phosphorylierung von VASP, stellen jedoch die Funktion der cGMP-PK in humanen Neutrophilen Granulozyten in Frage. Basierend auf der Methode der Immunfluoreszenz wurde gezeigt, dass VASP bei der Adhärenz der Neutrophilen eine entscheidende Rolle spielt. So ist mit Hilfe der spezifischen monoklonalen Antikörper eine Phosphorylierung am Ser-157 und am Ser-239 nach der Adhäsion der Neutrophilen an die Objektträger nachgewiesen worden. Nach zusätzlicher Stimulation mit PG-E1 zeigte sich kein wesentlicher Phosphorylierungsanstieg in adhärierten Neutrophilen. Zahlreiche chemotaktische Faktoren wie fMLP führen zur Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie auch der PKB. Diese intrazellulären Signalmoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Neutrophilenaktivierung. Da es bereits von hemmenden Einflussen der Vasodilatatoren auf die Aktivierung der Neutrophilen Granulozyten berichtet worden ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von cAMP- und cGMP-erhöhenden Substanzen auf die fMLP-induzierte Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie der PKB untersucht. Flolan, ein cAMP-erhöhender Vasodilatator führte zur signifikanten Hemmung der fMLP-induzierten p42/p44-, p38- sowie PKB-Phosphorylierung. cGMP-erhöhender Vasodilatator SNP zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fMLP-induzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle. Physiologisch vorkommende cAMP-erhöhende Substanzen besitzen im menschlichen Körper eine wichtige regulatorische Funktion, die Neutrophile Granulozyten vor der „Überstimulation“ bewahrt.
Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht.
After myocardial infarction, an inflammatory response is induced characterized by a sterile inflammation, followed by a reparative phase in order to induce cardiac healing. Neutrophils are the first immune cells that enter the ischemic tissue. Neutrophils have various functions in the ischemic heart, such as phagocytosis, production of reactive oxygen species or release of granule components. These functions can not only directly damage cardiac tissue, but are also necessary for initiating reparative effects in post-ischemic healing, indicating a dual role of neutrophils in cardiac healing after infarction.
In recent years, evidence has been growing that neutrophils show phenotypic and functional differences in distinct homeostatic and pathogenic settings.
Preliminary data of my working group using single-cell RNA-sequencing revealed the time- dependent heterogeneity of neutrophils, with different populations showing distinct gene expression profiles in ischemic hearts of mice, including the time-dependent appearance of a SiglecFhigh neutrophil population. To better understand the dynamics of neutrophil heterogeneity in the ischemic heart, my work aimed to validate previous findings at the protein level, as well as to investigate whether the distinct neutrophil populations show functional differences. Furthermore, in vivo depletion experiments were performed in order to modulate circulating neutrophil levels.
Hearts, blood, bone marrow and spleens were processed and analyzed from mice after 1 day and 3 days after the onset of cardiac ischemia and analyzed using flow cytometry.
Results showed that the majority of cardiac neutrophils isolated at day 3 after myocardial infarction were SiglecFhigh, whereas nearly no SiglecFhigh neutrophils could be isolated from ischemic hearts at day 1 after myocardial infarction.
No SiglecFhigh neutrophils could be found in the blood, spleen and bone marrow either after 1 day or 3 days after myocardial infarction, indicating that the SiglecFhigh state of neutrophils is unique to the ischemic cardiac tissue.
When I compared SiglecFhigh and SiglecFlow neutrophils regarding their phagocytosis activity and ROS production, SiglecFhigh neutrophils showed a higher phagocytosis ability than their SiglecFlow counterparts, as well as higher ROS production capacity.
In vivo depletion experiments could not achieve successful and efficient depletion of cardiac neutrophils either 1 day or 3 days after myocardial infarction, but led to a shift of a higher percentage of SiglecFhigh expressing neutrophils in the depletion group. Bone marrow neutrophil levels only showed partial depletion at day 3 after MI. Regarding blood neutrophils, depletion efficiently reduced circulating neutrophils at both time points, 1 and 3 days after MI. To summarize, this work showed the time-dependent presence of different neutrophil states in the ischemic heart. The main population of neutrophils isolated 3 days after MI showed a high expression of SiglecF, a unique state that could not be detected at different time points or other organs. These SiglecFhigh neutrophils showed functional differences regarding their phagocytosis ability and ROS production. Further investigation is needed to reveal what role these SiglecFhigh neutrophils could play within the ischemic heart.
To better target neutrophil depletion in vivo, more efficient or different anti-neutrophil strategies are needed.