Refine
Has Fulltext
- yes (122)
Is part of the Bibliography
- yes (122)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (74)
- Journal article (48)
Keywords
- active zone (12)
- cGMP (8)
- Guanylatcyclase (7)
- Kaliumkanal (7)
- Maus (7)
- optogenetics (7)
- ANP (6)
- Atriales natriuretisches Hormon (6)
- Drosophila (5)
- Niere (5)
- synapse (5)
- Aldosteron (4)
- Cyclo-GMP (4)
- GC-A (4)
- Knockout <Molekulargenetik> (4)
- SPRED2 (4)
- Signaltransduktion (4)
- Taufliege (4)
- cAMP (4)
- Blutdruck (3)
- Bruchpilot (3)
- Drosophila melanogaster (3)
- Elektrophysiologie (3)
- Fibrose (3)
- Gen-Knockout (3)
- Genregulation (3)
- Ionenkanal (3)
- Migration (3)
- NGF (3)
- Nozizeption (3)
- PDZ-Domain (3)
- Renin-Angiotensin-System (3)
- Rezeptor (3)
- Spred-Proteine (3)
- Synapse (3)
- aldosterone (3)
- dSTORM (3)
- kidney (3)
- mineralocorticoid receptor (3)
- neuromuscular junction (3)
- nociception (3)
- plasticity (3)
- potassium (3)
- super-resolution microscopy (3)
- Aktive Zone (2)
- Angiogenese (2)
- Angiotensin II (2)
- CA3 (2)
- Calciumkanal (2)
- Capsaicin (2)
- Cyclo-AMP (2)
- Electrophysiology (2)
- Genexpression (2)
- Glatte Muskulatur (2)
- Guanylylcyclase (2)
- HDBSCAN (2)
- Herzmuskelzelle (2)
- Immunfluoreszenz (2)
- K2P (2)
- Kidney (2)
- Kollagen (2)
- Latrophilin (2)
- MAP-Kinase (2)
- Mena (2)
- Mineralokortikoidrezeptor (2)
- NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (2)
- NO-sensitive guanylyl cyclase (2)
- OCD (2)
- Ochratoxin A (2)
- PDZ-Domäne (2)
- PFE (2)
- Potassium Channel (2)
- Proteine (2)
- Proteinkinase C (2)
- Proximaler Tubulus (2)
- RIM1α (2)
- Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (2)
- Stickstoffmonoxid (2)
- Synaptische Transmission (2)
- TRESK (2)
- VASP (2)
- acute brain slices (2)
- behavior (2)
- dCIRL (2)
- depression (2)
- electron tomography (2)
- heart (2)
- high-pressure freezing/freeze substitution (2)
- hippocampus (2)
- inflammation (2)
- insulin (2)
- mechanotransduction (2)
- migration (2)
- neurotransmitter release (2)
- nitric oxide (2)
- presynaptic (2)
- smooth muscle (2)
- synaptic plasticity (2)
- 2-photon microscopy (1)
- 2-pore potassium channel (1)
- 212-2 (1)
- ADHD (1)
- ADP-Rezeptor (1)
- AGEs (1)
- AP1 (1)
- Adeno (1)
- Adhesion-GPCR (1)
- Advanced Glycation Endproducts (1)
- Afferenzen (1)
- Aktive Zonen (1)
- Albumin (1)
- Aldosteronantagonist (1)
- Aldosterone (1)
- Alzheimer' Disease (1)
- Alzheimer' schen Erkrankung (1)
- Alzheimer-Krankheit (1)
- Amygdala (1)
- Amyloid <beta-> (1)
- Anandamid (1)
- Ang II (1)
- Angiopoietin-1 (1)
- Antidepressivum (1)
- Aorta (1)
- Apoptose (1)
- Apoptosis (1)
- Arachidonsäure (1)
- Arteriogenese (1)
- Atherosklerose (1)
- Atrial natriuretic peptide (1)
- Atriales Natriuretisches Peptid (1)
- Atriales natriuretisches Peptid (1)
- Aureobasidium (1)
- Axotomie (1)
- B-Typ Natriuretisches Peptid (1)
- BNP (1)
- BRET (1)
- Bauchspeicheldrüse (1)
- Behavioral neuroscience (1)
- Beta-Receptor (1)
- Beta-Rezeptor (1)
- Bindestelle (1)
- Bindungsstellen (1)
- Bleomycin (1)
- Botulinustoxin (1)
- Brain natriuretic Peptide (1)
- C-type natriuretic peptide (1)
- CA2+ channels (1)
- CA3 pyrimidal cells (1)
- CGRP (1)
- CNG channel (1)
- CNP (1)
- CNS (1)
- COX2 expression (1)
- CRE (1)
- CRISPR/Cas-Methode (1)
- CX3CR1 (1)
- Ca2+i handling (1)
- CaV1.2 und PMCA4b (1)
- Ca\(^{2+}\) channels (1)
- Cadherin-13 (CDH13) (1)
- Calcium (1)
- Calcium-ATPasen (1)
- Calciumkanäle (1)
- Calciumoscillations (1)
- Calciumoszillationen (1)
- Calpain (1)
- Cav1.2 and PMCA4b (1)
- Cavβ subunit (1)
- Cell (1)
- Channelrhodopsin (1)
- Channelrhodopsin-2 (1)
- Chemokine (1)
- Chordontonal organ (1)
- Clostridium perfringens (1)
- Corpus amygdaloideum (1)
- Corticosteroide (1)
- Cranial window (1)
- Cremaster (1)
- Crespi effect (1)
- Cyclic GMP (1)
- D2 receptors (1)
- DMPS (1)
- DNS-Chip (1)
- DRG (1)
- DeepSqueak (1)
- Differentielle Genexpression (1)
- Drosophila melanogaster motoneuron (1)
- ECM (1)
- EGF (1)
- EGFR (1)
- ERK (1)
- Endocannabinoide (1)
- Endocytosis (1)
- Endothelium (1)
- Endozytose (1)
- Epidermaler Wachstumsfaktor (1)
- Epithelzelle (1)
- Epsilon-Toxin (1)
- Estrogen receptor (1)
- Exzitatorische Synapse (1)
- FRET (1)
- Fibronektin (1)
- Fluorescence (1)
- Fluoreszenzmikroskopie (1)
- Fluoxetin (1)
- Fluoxetine (1)
- FoxO3 (1)
- Fractalkin (1)
- Furchungsteilung (1)
- G protein coupled receptors (1)
- G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (1)
- GABA\(_{A}\) receptors (1)
- GC-A Rezeptor (1)
- GDNF (1)
- GIRK (1)
- GMPcGMP-dependent protein kinase I (1)
- GPCR (1)
- GST (1)
- Gastrointestinaltrakt (1)
- Gelatinasen (1)
- Genfallen-Insertion (1)
- Gentransfer (1)
- Glykolisierung (1)
- Glykosaminoglykane (1)
- Guanylatzklase-A (1)
- Guanylatzyklase (1)
- Guanylyl Cyclase A (1)
- Guanylyl cyclase A (1)
- Guanylyl cyclase-A (1)
- Guanylyl-Cyclase (1)
- Guanylylzyklase (1)
- Guanylylzyklase-Rezeptoren (1)
- HIS (1)
- HPA Axis (1)
- Halothan (1)
- Halothane (1)
- Hebbian plasticity (1)
- Hebbsche Lernregel (1)
- Herzfunktion (1)
- Herzhypertrophie (1)
- Herzmuskel (1)
- Heteromerisierung (1)
- Hippocampus (1)
- Hippokampus (1)
- Hirnzelle (1)
- Hitze (1)
- Hitzeantwort (1)
- Hochauflösende Lichtmikroskopie (1)
- Hyaluronsäure (1)
- Hypertonie (1)
- Hypophysen-Zwischenhirn-System (1)
- Hypothalamisch-hypophysäre Achse (1)
- IBA-1 (1)
- Idiopathische pulmonale Fibrose (1)
- Immunfluorescence (1)
- In vivo imaging (1)
- Indischer Hanf (1)
- Inhalationsanästhetika (1)
- Innervation (1)
- Insulin (1)
- Insulinsekretion (1)
- Integrine (1)
- IntelliCage (1)
- Interaktion (1)
- Interaktionen (1)
- Japankärpfling (1)
- Johnstons organ (1)
- K-Kanäle (1)
- Kalium (1)
- Kaliumkanäle mit zwei Poren-Domänen (1)
- Kaliumstrom (1)
- Kanal (1)
- Kanalkinetik (1)
- Kinetik (1)
- Kir-Kanäle (1)
- Knie (1)
- Knock out (1)
- Knock-Out <Molekulargenetik> (1)
- Knock-out Maus (1)
- Knockout mouse (1)
- Kollagenhomöostase (1)
- Konditioniertes Lernen (1)
- Küken (1)
- Küken-Spinalganglienneurone (1)
- L-type calcium channels (1)
- LIF (1)
- LTCC-independent function of Cavβ (1)
- Left Ventricular Hypertrophy (1)
- Linksherzhypertrophie (1)
- Lunge (1)
- Lungenfibrose (1)
- MAP Kinase Signaling (1)
- MAPK signaling (1)
- MDCK (1)
- MDCK-F cells (1)
- MDCK-F-Zellen (1)
- Massenspektrometrie (1)
- Mechanorezeptor (1)
- Mechanosensation (1)
- Mechanotransduktion (1)
- Mena promoter ativity (1)
- Mena-Promotor-Aktivität (1)
- MiMIC (1)
- Microarray (1)
- Midblastula-transition MBT MZT (1)
- Mikroglia (1)
- Mikrozirkulation (1)
- Mineralocorticoidrezeptor (1)
- Motilität (1)
- Mouse (1)
- Mouse model (1)
- Muscarinrezeptor (1)
- Myofibroblast (1)
- NF-kappa-B (1)
- NF-kappaB (1)
- NF-κB (1)
- NO-GC (1)
- NPR-A (1)
- NPR-C (1)
- NRF2 (1)
- Natriuretisches Hormon (1)
- Nephrotoxine (1)
- Nervenzelle (1)
- Neurobiologie (1)
- Neuronale Plastizität (1)
- Neurons (1)
- Neuropathie (1)
- Neurotrophe Faktoren (1)
- Neurotrophic Factors (1)
- Neurowissenschaften (1)
- Neutrophile (1)
- Nicotinischer Acetylcholinrezeptor (1)
- Nierenfunktion (1)
- OAT1 (1)
- OTA (1)
- Opossum Kidney Zellen (1)
- Opossum kidney cells (1)
- Optogenetik (1)
- PDE (1)
- PDE3 (1)
- PET (1)
- PFA in ethanol (1)
- PI-3-Kinase (1)
- PKG I (1)
- PNS (1)
- PTH1R (1)
- Perizyt (1)
- Phosphodiesterase 3 (1)
- Phosphorylierung (1)
- Physiologie (1)
- Plastizität (1)
- Plastizität <Physiologie> (1)
- Polarisation (1)
- Potassium channel (1)
- Potassium channels (1)
- Primary failure of eruption (1)
- Primäre Zahndurchbruchstörung (1)
- Proliferation (1)
- Protein Kinase C (1)
- Protein-Interaktionspartner (1)
- Protein-Protein Interaction (1)
- Protein-Protein-Interaktion (1)
- Protein-Protein-Interaktionen (1)
- Protein-protein-interaction (1)
- Proteininteraktion (1)
- Proteinkinase A (1)
- Proteinurie (1)
- Proton (1)
- Pulmonary fibrosis (1)
- Pulmonary hypertension (1)
- Pulswellengeschwindigkeit (1)
- Quecksilber (1)
- RGS2 (1)
- RIM (1)
- RIM-binding protein (1)
- RNS-Spleißen (1)
- ROMK2 (1)
- RSK (1)
- Ras-Raf-Signalweg (1)
- Renin Angiotensin System (1)
- Rezeptor-vermittelte Protein Endozytose (1)
- S6KII RSK (1)
- SH3 (1)
- SLC2A3 (1)
- SNARE proteins (1)
- SPRED (1)
- SPRED2-defiziente Mäuse (1)
- STORM (1)
- SV pool (1)
- Schmerz (1)
- Schrecken (1)
- Schreckstarre (1)
- Sensitivität (1)
- Serotonin (1)
- Serotonin-1A (1)
- Serotonin-7 (1)
- Signaltransduction (1)
- Signalwege (1)
- Sildenafil (1)
- Sorting (1)
- Spannungskontrollierter Ionenkanal (1)
- Spectrin (1)
- Spinalganglienneurone (1)
- Spred Protein (1)
- Sternzelle (1)
- Steroidhormon (1)
- Stickstoffoxide (1)
- Strommessung (1)
- Synaptische Vesikel (1)
- Synaptotagmin (1)
- TASK (1)
- TASK-1 (1)
- TASK-3 (1)
- TBI (1)
- TEVC (1)
- TGF-β (1)
- TMT (1)
- TRPC3 (1)
- TRPC6 (1)
- TSPO (1)
- Thrombozytenaggregationshemmung (1)
- Transaktivierung (1)
- Transforming Growth Factor beta 1 (1)
- Transkription <Genetik> (1)
- Transkriptionsfaktor (1)
- Transporter (1)
- Transverse Aortenkonstriktion (1)
- Tyrosine Kinase (1)
- Unc-13 (1)
- Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein (1)
- Venlafaxin (1)
- Venlafaxine (1)
- Volumenregulation (1)
- WIN 55 (1)
- Wasserstoffperoxid (1)
- X-Gal staining (1)
- X-Gal-Färbung (1)
- Xenopus Oozyten (1)
- Xenopus oocytes (1)
- Yeast-Two-Hybrid-Screening (1)
- Zahndurchbruch (1)
- Zellkultur (1)
- Zellmigration (1)
- Zelltod (1)
- Zellvolumen (1)
- Zentralnervensystem (1)
- Zone 1-HSC (1)
- Zwangsstörung (1)
- Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (1)
- Zygote (1)
- \(\alpha\)-latrotoxin (1)
- aGPCR (1)
- acetylcholine M1 receptor (1)
- action potential (1)
- acute MK-801 (1)
- adenoviruses (1)
- adhesion GPCR (1)
- adhesion-GPCR (1)
- advanced glycation endproducts (1)
- albumine (1)
- albuminuria (1)
- alveolar bone (1)
- amyloid (1)
- analysis of variance (1)
- anandamide (1)
- animal model (1)
- antidepressant (1)
- anxiety (1)
- apoptosis (1)
- atrial natriuretic peptide (1)
- autoradiography (1)
- axonal transport (1)
- axotomy (1)
- bPAC (1)
- beige adipocytes (1)
- binding (1)
- binding sites (1)
- biophysics (1)
- black yeast (1)
- bleomycin (1)
- bloodpressure (1)
- cGKI (1)
- cGMP/cAMP-Crosstalk (1)
- cTRPV1 (1)
- caenorhabditis elegans (1)
- calcineurin signaling cascade (1)
- calcium (1)
- calcium channel (1)
- calcium signaling (1)
- calcium-imaging (1)
- cardiac hypertrophy (1)
- cardiac pacing (1)
- cardiomyocytes (1)
- cardiovascular remodeling (1)
- cells (1)
- cementoclasts (1)
- cementum (1)
- channel (1)
- channelrhodopsin (1)
- chemokines (1)
- chick (1)
- chick DRG (1)
- choanoflagellates (1)
- chordotonal organs (1)
- chronic heart failure (1)
- closed head injury (1)
- collagen homeostasis (1)
- compaction (1)
- contact-kinin system (1)
- correlative light and electron microscopy (1)
- cremaster (1)
- cyclic (1)
- cyclic nucleotides (1)
- cylic GMP (1)
- damage control orthopedics (1)
- decompensated heart failure (1)
- delayed rectifier potassium channel (1)
- diffuse (1)
- direct stochasticoptical reconstruction microscopy (1)
- dissociation (1)
- domain (1)
- domain K\(^{+}\) channels (1)
- dorsal root ganglions (1)
- drosophila larvae (1)
- drug discovery (1)
- dunce (1)
- epsilon-toxin (1)
- erectile dysfunction (1)
- excitation-secretion coupling (1)
- facilitation (1)
- fat development (1)
- femoral fracture (1)
- fibronectin (1)
- fibrosis (1)
- flexibility (1)
- fluorescent probes (1)
- fluorescent-probes (1)
- focal (1)
- freezing (1)
- fungal rhodopsins (1)
- gap junction (1)
- gastrointestinal tract (1)
- gelatinases (1)
- gene-trap (1)
- glucosaminoglycane (1)
- glutamate receptor (1)
- guanylyl cyclase (1)
- guanylyl cyclase-A (1)
- guanylyl cylcase A (1)
- hERG (1)
- hIK1 (1)
- hOAT (1)
- hOAT1 (1)
- hearing (1)
- heat (1)
- heat response (1)
- heteromerisation (1)
- high contrast (1)
- high-pressure freezing (1)
- hippocampal (1)
- hippocampal mossy fiber bouton (1)
- hippocampal-neurons (1)
- homeostasis (1)
- human induced pluripotent stem cell (hiPSC) (1)
- human neurons (1)
- hyaluronic acid (1)
- hyperalgesia (1)
- hyperexpression techniques (1)
- hypertension (1)
- image data (1)
- immunohistochemistry (1)
- induced neural stem cells (1)
- induced pluripotent stem cells (1)
- inertial idiothetic navigation (1)
- inhalational anesthetics (1)
- initiation (1)
- innervation (1)
- innexins (1)
- integrin (1)
- interacting PDZ domain (1)
- interaction (1)
- interstitial fibrosis (1)
- interstitielle Fibrose (1)
- interval timing (1)
- intracellular receptors (1)
- inward rectifier (1)
- junction proteins (1)
- kardiovaskuläres Remodeling (1)
- kinetics (1)
- knee (1)
- knockout (1)
- kollagen (1)
- ligand CD55 (1)
- light-sensitive anion channel (1)
- localization micoscopy (1)
- localization microscopy (1)
- long QT syndrome (1)
- lower urinary tract (1)
- macrophages (1)
- mass spectrometry (1)
- mechanisms (1)
- mediale Amygdala (1)
- median and dorsal raphe (1)
- melanoma malignancy (1)
- membrane trafficking (1)
- memory (1)
- mercury (1)
- metabotropic signalling (1)
- mfg-e8 (1)
- mice (1)
- microbial rhodopsins (1)
- microcirculation (1)
- migraine (1)
- mitochondrial biogenesis (1)
- mitochondrial transport (1)
- modulation (1)
- molecular mechanisms (1)
- molecular neuroscience (1)
- monocytes (1)
- morris water maze (1)
- mortality (1)
- mossy fiber synapse (1)
- mossy fiber synapses (1)
- motility (1)
- motoneuron (1)
- mouse (1)
- mrsk2 KO mouse (1)
- mutation (1)
- myocardial infarction (1)
- myofibroblast (1)
- myofibroblasts (1)
- nAChR (1)
- nanoarchitecture (1)
- nanotopology (1)
- natiuretische Peptide (1)
- natriuretic peptide (1)
- natriuretic peptides (1)
- navigation (1)
- nephrotoxins (1)
- nervous-system (1)
- neural circuits (1)
- neural networks (1)
- neurobiology (1)
- neuroinflammation (1)
- neurons (1)
- neuropathic pain (1)
- neuropathy (1)
- neuropsychiatric disorders (1)
- neurotoxins (1)
- neurotransmission (1)
- neutrophil granulocytes (1)
- neutrophile Granulocyten (1)
- neutrophils (1)
- nicht-genotrope Steroidwirkungen (1)
- nongenotropic steroid effects (1)
- obesity (1)
- object recognition memory (1)
- ochratoxin a (1)
- octopamine (1)
- organotypic slice cultur (1)
- organotypische Schnittkultur (1)
- osteoclasts (1)
- pain (1)
- pankreatische ß-Zellen (1)
- pericyte (1)
- pericytes (1)
- periodontitis (1)
- phosphodiesterases (PDEs) (1)
- phosphorylation (1)
- phosphorylation sites (1)
- photoreceptor (1)
- physiologiesche Angiogene (1)
- physiology (1)
- plan sciences (1)
- platform (1)
- pollen tube (1)
- potassium-channel (1)
- potentiation (1)
- presynaptic calcium (1)
- presynaptic differentiation (1)
- presynaptic homeostasis (1)
- presynaptic plasticity (1)
- primary afferent (1)
- protein coupled receptors (1)
- protein kinase (1)
- protein kinase C (1)
- protein-coupled receptors (1)
- proteininteraction (1)
- proteins (1)
- proton channel (1)
- pulmonary hypertension (1)
- rapid gene induction (1)
- rat hippocampal neurons (1)
- rats (1)
- receptor channel (1)
- receptor-mediated-endocytosis (1)
- reconstruction (1)
- release (1)
- resolution limit (1)
- reveals (1)
- rhodopsin (1)
- rhodopsin phosphodiesterase (RhoPDE) (1)
- riociguat (1)
- senile plaque (1)
- seniler Plaques (1)
- sensory neurons (1)
- sensory physiology (1)
- serotonin (1)
- serotonin transporter deficient mice (1)
- serotonin-1A (1)
- serotonin-7 (1)
- serotonin-specific neurons (1)
- serum responsive element (1)
- seven-helix receptor (1)
- shear stress (1)
- signal transduction pathway (1)
- signalling pathways (1)
- small interfering RNAs (1)
- soluble guanylyl cyclase (1)
- spatial navigation (1)
- spontaneous network activity (1)
- stress (1)
- structure-function relationships (1)
- structured illumination microscopy (1)
- substratal idiothetic navigation (1)
- surface potential recording (1)
- synapse formation (1)
- synaptic delay (1)
- synaptic inhibition (1)
- synaptic transmission (1)
- synaptic ultrastructure (1)
- synaptic vesicles (1)
- synaptische Plastizität (1)
- synaptotagmin (1)
- teeth (1)
- tooth eruption (1)
- transactivation (1)
- transfection (1)
- transgenic mouse (1)
- transient bursting (1)
- transmission (1)
- transmission electron microscopy (1)
- transporter (1)
- traumatic brain injury (1)
- two-electrode-voltage clamp (1)
- two-pore domain potassium channels (1)
- ultrasound vocalizations (1)
- unterer Harntrakt (1)
- voltage-gated Na\(^+\) channel (1)
- weight drop (1)
- white (1)
- white blood cells (1)
- wistar rats (1)
- xenopus oocytes (1)
- Östrogene (1)
- Östrogenrezeptor (1)
- Überexpression (1)
- β-cells (1)
Institute
- Physiologisches Institut (122) (remove)
Sonstige beteiligte Institutionen
Introduction
Structural plasticity with synapse formation and elimination is a key component of memory capacity and may be critical for functional recovery after brain injury. Here we describe in detail two surgical techniques to create a cranial window in mice and show crucial points in the procedure for long-term repeated in vivo imaging of synaptic structural plasticity in the mouse neocortex.
Methods
Transgenic Thy1-YFP(H) mice expressing yellow-fluorescent protein (YFP) in layer-5 pyramidal neurons were prepared under anesthesia for in vivo imaging of dendritic spines in the parietal cortex either with an open-skull glass or thinned skull window. After a recovery period of 14 days, imaging sessions of 45–60 min in duration were started under fluothane anesthesia. To reduce respiration-induced movement artifacts, the skull was glued to a stainless steel plate fixed to metal base. The animals were set under a two-photon microscope with multifocal scanhead splitter (TriMScope, LaVision BioTec) and the Ti-sapphire laser was tuned to the optimal excitation wavelength for YFP (890 nm). Images were acquired by using a 20×, 0.95 NA, water-immersion objective (Olympus) in imaging depth of 100–200 μm from the pial surface. Two-dimensional projections of three-dimensional image stacks containing dendritic segments of interest were saved for further analysis. At the end of the last imaging session, the mice were decapitated and the brains removed for histological analysis.
Results
Repeated in vivo imaging of dendritic spines of the layer-5 pyramidal neurons was successful using both open-skull glass and thinned skull windows. Both window techniques were associated with low phototoxicity after repeated sessions of imaging.
Conclusions
Repeated imaging of dendritic spines in vivo allows monitoring of long-term structural dynamics of synapses. When carefully controlled for influence of repeated anesthesia and phototoxicity, the method will be suitable to study changes in synaptic structural plasticity after brain injury.
Based on recent findings that show that depletion of factor XII (FXII) leads to better posttraumatic neurological recovery, we studied the effect of FXII-deficiency on post-traumatic cognitive and behavioral outcomes in female and male mice. In agreement with our previous findings, neurological deficits on day 7 after weight-drop traumatic brain injury (TBI) were significantly reduced in FXII\(^{−/−}\) mice compared to wild type (WT) mice. Also, glycoprotein Ib (GPIb)-positive platelet aggregates were more frequent in brain microvasculature of WT than FXII\(^{−/−}\) mice 3 months after TBI. Six weeks after TBI, memory for novel object was significantly reduced in both female and male WT but not in FXII\(^{−/−}\) mice compared to sham-operated mice. In the setting of automated home-cage monitoring of socially housed mice in IntelliCages, female WT mice but not FXII\(^{−/−}\) mice showed decreased exploration and reacted negatively to reward extinction one month after TBI. Since neuroendocrine stress after TBI might contribute to trauma-induced cognitive dysfunction and negative emotional contrast reactions, we measured peripheral corticosterone levels and the ration of heart, lung, and spleen weight to bodyweight. Three months after TBI, plasma corticosterone levels were significantly suppressed in both female and male WT but not in FXII\(^{−/−}\) mice, while the relative heart weight increased in males but not in females of both phenotypes when compared to sham-operated mice. Our results indicate that FXII deficiency is associated with efficient post-traumatic behavioral and neuroendocrine recovery.
The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently.
Die von Proffit und Vig (1981) als Primary Failure of Eruption (PFE, Primäre Durchbruchstörung) klassifizierte Zahndurchbruchstörung resultiert klinisch häufig in schwergradigen Auswirkungen. Hierbei handelt es sich um Beeinträchtigungen des Wachstums des Alveolarfortsatzes, ebenso wie Dilazerationen, große vertikale Defekte und schwergradige lateral offene Bisse.
Die eindeutige Diagnostik und Abgrenzung der PFE von anderen Zahndurchbruchstörungen gestaltete sich bis zur Bestimmung der zugrunde liegenden Ursachen als sehr schwierig. Aufgrund von Fehldiagnosen kam es häufig zu Behandlungsmisserfolgen.
Um die PFE schneller und spezifischer diagnostizieren zu können, ist das Wissen über die zugrunde liegenden Mutationen des Parathormonrezeptor 1- Genes (PTHR1-Genes), welche bei PFE-Patienten isoliert wurden, von großer Bedeutung.
Im Zuge vorangegangener Studien wurden bereits einige Mutationen des PTHR1 als pathogen klassifiziert, hierzu zählt die PTHR1-Mutante W339*, eine Abbruchmutante, welche auf einem Basenaustausch beruht. Darüber hinaus liegen Daten zu potenziell pathogenen Genvariationen, wie die PTHR1-Mutante G452E, eine Aminosäureaustausch-Mutante, vor. Der Nachweis ihrer Pathogenität würde die Diagnosestellung sichern.
Um die Pathogenität der PTHR1-Variationen nachweisen zu können, wurde ihre RNA in X. laevis Oozyten injiziert. Der PTHR1 wurde zusammen mit mTRESK, einem Kaliumkanal, exprimiert und im Anschluss auf sein Verhalten bei Zugabe von 100 nM Parathormon (PTH) mit elektrophysiolgischen Messungen untersucht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bei nicht an PFE erkrankten Menschen vorkommende Variante des PTHR1 (PTHR1-WT) eine Aktivierung von 260,47% im Vergleich zu den Ausgangswerten unter einer physiologischen Lösung (ND96) zeigte. Im Gegensatz dazu konnte bei der bereits als pathogen klassifizierten PTHR1-Variation W339* kein signifikanter Anstieg der Aktivität unter PTH-Zugabe nachgewiesen werden. Für die potenziell pathogene PTHR1-Mutante G452E konnte ebenfalls keine signifikante Aktivitätssteigerung als Reaktion auf die Zugabe des Agonisten PTH nachzuweisen ermittelt werden.
Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der PTHR1-Mutante G452E ebenfalls um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt, genauso wie bei der als pathogen klassifizierten Variation W339* des PTHR1, da beide in den durchgeführten Messungen dasselbe Verhalten zeigen.
Die als Kontrollgruppe künstlich erzeugte Mutante G452A des PTHR1 zeigte hingegen eine signifikante Aktivierung von 91,02% im Vergleich zu den gemessenen Ausgangswerten unter physiolgischem ND96. Durch einen einfachen Aminosäureaustausch wurde die Basensequenz des Rezeptors so verändert, dass die Funktion trotz der Mutation wieder hergestellt werden konnte. Dies geschah durch den Einbau eines Alanins anstelle des natürlich vorkommenden Glycins. Im Gegensatz zu dem Einbau von Glutamat, bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E, bei welcher die Funktionsfähigkeit nicht mehr vorliegt.
Die gemessene Aktivität ist zwar geringer als beim WT, legt aber nahe, dass es im Falle dieser künstlichen Mutation nicht zu einer Krankheitsausprägung kommt, da die Reaktion in ihrer Gesamtheit der des PTHR1-WT entspricht. Dies wird auch durch die signifikante Erhöhung des auswärts-gerichteten K+-Stromes deutlich, der sich analog zum gesunden PTHR1 verhält. . Es konnte somit die Funktionsfähigkeit der künstlichen PTHR1-Mutante G452A nachgewiesen werden. Die gesamten erzielten Ergebnisse waren durch die Abbildung von klinischen Befunden auf molekularer Ebene in Oozyten möglich. Durch die Kombination eines Kalium-Kanales mit dem krankheitsspezifischen Rezeptor konnte das Verhalten des Rezeptors anhand des mittels TEVC-Messungen ermittelten Verhaltens des Kalium-Kanales abgebildet werden.
Bei dem verwendeten Kalium-Kanal handelte es sich um mTRESK, welcher mit dem Parathormonrezeptor 1 zusammen exprimiert wurde. Durch die Zugabe des spezifischen Rezeptoragonisten PTH kam es bei den funktionsfähigen Variationen des Rezeptors zu einer Konformationsänderung des G-Proteins. Diese resultierte im weiteren Verlauf in einem Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels und einer Aktivierung von Calcineurin. Die Dephosphorilierung des Kalium-Kanales mTRESK, welche zu einer Aktivitätssteigerung des Kanals führte, war die Folge.
Dies verdeutlicht, wie auch zukünftig durch die Kooexpression von krankheitsspezifischen Rezeptoren und elektrophysiologisch ableitbaren Strömen, die Bedeutungen und Auswirkungen von Mutationen auf molekularer Ebene funktionell nachgewiesen werden können.
Die vorliegende Arbeit erbringt somit unter Verwendung dieses Expressionssystems den Nachweis dafür, dass es sich bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt. Zudem konnten die vorangegangenen Ergebnisse, wonach es sich bei der ebenfalls im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante W339* um eine pathogene Mutation handelt bestätigt werden.
Patienten mit diesen Genvariationen können somit eindeutig die Diagnose PFE erhalten und entsprechend zielführend therapiert werden.
PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling
(2016)
Aim
Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet.
Materials and Methods
In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes.
Results
In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished.
Conclusions
PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement.
Die kardialen Hormone Atriales (ANP) und B-Typ (BNP) Natriuretisches Peptid üben bekannte renale und kardiovaskuläre Effekte aus, welche durch ihren gemeinsamen, cGMP-bildenden Guanylatzyklase-Rezeptor A (GC-A) vermittelt werden. Diese Effekte sind entscheidend an der physiologischen Aufrechterhaltung des arteriellen Blutdrucks sowie des intravaskulären Blutvolumens beteiligt. Darüber hinaus zeigen aktuelle Studien, dass NPs die Mobilisierung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe und deren Oxidation durch die Skelettmuskulatur steigern sowie die Thermogenese in braunem und weißem Fettgewebe aktivieren können. Dadurch können NPs den Energieverbrauch erhöhen und die Insulinsensitivität verbessern. Desweiteren ist Übergewicht mit einer gestörten NP/GC-A/cGMP-Signalübertragung verbunden, die möglicherweise zur Entwicklung von Diabetes Typ 2 und dessen kardio-metabolischen Folgeerkrankungen beiträgt. In vitro stimuliert synthetisches ANP über GC-A die Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus kultivierten pankreatischen Inseln und die β-Zellproliferation. Die Bedeutung für die systemische Insulin/Glukosehomöostase in vivo ist jedoch unklar. Um zu untersuchen, ob die endogenen Herzhormone die sekretorische Funktion und/oder die Proliferation von β-Zellen unter (patho)physiologischen Bedingungen in vivo modulieren, haben wir ein neues genetisches Mausmodell mit selektiver Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen (ß GC-A KO) generiert.
In kultivierten Inseln von β GC-A KO-Mäusen waren die insulinotropen und proliferativen Effekte von ANP aufgehoben. Übereinstimmend damit führte die Infusion von BNP bei Kontroll-Tieren in vivo zu leicht erhöhten basalen Plasma-Insulinspiegeln und verbesserter Glukose-induzierter Insulinsekretion. Dieser Effekt von exogenem BNP konnte bei β GC-A KO-Mäusen nicht beobachtet werden, was die effiziente Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen bestätigt.
Interessanterweise hatte die Ablation des GC-A-Rezeptors auf ß-Zellen unter basalen Bedingungen keinen Einfluss auf physiologische und metabolische Parameter in vivo. Sowohl männliche als auch weibliche ß GC-A KO-Tiere zeigten keine Unterschiede in der basalen Insulin- und Glukosehomöostase, da sie ähnliche Nüchtern-Blutzucker- und Insulinspiegel (nach Fasten über Nacht) aufwiesen wie die Kontroll-Mäuse. Allerdings zeigten die mit HFD gefütterten β GC-A KO-Tiere frühzeitiger Glukose-Intoleranz sowie eine verminderte adaptive β-Zellproliferation. Abgesehen davon war das konsistenteste Ergebnis der in vivo-Studien der geschlechtsabhängige Unterschied in der Auswirkung der ß-Zellspezifischen GC-A-Deletion auf die Glukose-stimulierte Insulinsekretion. Weibliche, aber nicht männliche ß GC-A KO-Mäuse zeigten erhöhte Nüchtern-Insulinspiegel und eine signifikant erhöhte Glukose-stimulierte Insulinsekretion, was zu einer deutlich verbesserten Glukosetoleranz führte. Der postulierte und untersuchte Mechanismus beinhaltet eine Interaktion von Östrogenen und NPs, welche die Expression des mitochondrialen Uncoupling Protein 2 beeinflussen.
Diese Arbeit erweitert das derzeitige Wissen über die metabolischen Effekte des NP/GC-A-Systems. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Natriuretische Peptide zu einer gesteigerten ß-Zellfunktion und Vitalität in frühen Stadien eines erhöhten Insulinbedarfs, d.h. bei Diabetes Typ 2, beitragen. Da die Studien eine wesentliche Rolle dieser kardialen Hormone im endokrinen Pankreas aufdecken, ist es umso wichtiger die pleiotropen Eigenschaften von NPs und ihre möglichen therapeutischen Anwendungen bei kardio-metabolischen Erkrankungen weiter zu untersuchen.
Background:
The cardiac hormones atrial (ANP) and B-type natriuretic peptides (BNP) moderate arterial blood pressure and improve energy metabolism as well as insulin sensitivity via their shared cGMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. Obesity is associated with impaired NP/GC-A/cGMP signaling, which possibly contributes to the development of type 2 diabetes and its cardiometabolic complications. In vitro, synthetic ANP, via GC-A, stimulates glucose-dependent insulin release from cultured pancreatic islets and β-cell proliferation. However, the relevance for systemic glucose homeostasis in vivo is not known. To dissect whether the endogenous cardiac hormones modulate the secretory function and/or proliferation of β-cells under (patho)physiological conditions in vivo, here we generated a novel genetic mouse model with selective disruption of the GC-A receptor in β-cells.
Methods:
Mice with a floxed GC-A gene were bred to Rip-CreTG mice, thereby deleting GC-A selectively in β-cells (β GC-A KO). Weight gain, glucose tolerance, insulin sensitivity, and glucose-stimulated insulin secretion were monitored in normal diet (ND)- and high-fat diet (HFD)-fed mice. β-cell size and number were measured by immunofluorescence-based islet morphometry.
Results:
In vitro, the insulinotropic and proliferative actions of ANP were abolished in islets isolated from β GC-A KO mice. Concordantly, in vivo, infusion of BNP mildly enhanced baseline plasma insulin levels and glucose-induced insulin secretion in control mice. This effect of exogenous BNP was abolished in β GC-A KO mice, corroborating the efficient inactivation of the GC-A receptor in β-cells. Despite this under physiological, ND conditions, fasted and fed insulin levels, glucose-induced insulin secretion, glucose tolerance and β-cell morphology were similar in β GC-A KO mice and control littermates. However, HFD-fed β GC-A KO animals had accelerated glucose intolerance and diminished adaptative β-cell proliferation.
Conclusions:
Our studies of β GC-A KO mice demonstrate that the cardiac hormones ANP and BNP do not modulate β-cell's growth and secretory functions under physiological, normal dietary conditions. However, endogenous NP/GC-A signaling improves the initial adaptative response of β-cells to HFD-induced obesity. Impaired β-cell NP/GC-A signaling in obese individuals might contribute to the development of type 2 diabetes.
Recent studies show that combinations of defined key developmental transcription factors (TFs) can reprogram somatic cells to pluripotency or induce cell conversion of one somatic cell type to another. However, it is not clear if single genes can define a cells identity and if the cell fate defining potential of TFs is also operative in pluripotent stem cells in vitro. Here, we show that ectopic expression of the neural TF Neurogenin2 (Ngn2) is sufficient to induce rapid and efficient differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into mature glutamatergic neurons. Ngn2-induced neuronal differentiation did not require any additional external or internal factors and occurred even under pluripotency-promoting conditions. Differentiated cells displayed neuron-specific morphology, protein expression, and functional features, most importantly the generation of action potentials and contacts with hippocampal neurons. Gene expression analyses revealed that Ngn2-induced in vitro differentiation partially resembled neurogenesis in vivo, as it included specific activation of Ngn2 target genes and interaction partners. These findings demonstrate that a single gene is sufficient to determine cell fate decisions of uncommitted stem cells thus giving insights into the role of key developmental genes during lineage commitment. Furthermore, we present a promising tool to improve directed differentiation strategies for applications in both stem cell research and regenerative medicine.
The second messengers, cyclic adenosine 3′-5′-monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine 3′-5′-monophosphate (cGMP), play important roles in many animal cells by regulating intracellular signaling pathways and modulating cell physiology. Environmental cues like temperature, light, and chemical compounds can stimulate cell surface receptors and trigger the generation of second messengers and the following regulations. The spread of cAMP and cGMP is further shaped by cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) for orchestration of intracellular microdomain signaling. However, localized intracellular cAMP and cGMP signaling requires further investigation. Optogenetic manipulation of cAMP and cGMP offers new opportunities for spatio-temporally precise study of their signaling mechanism. Light-gated nucleotide cyclases are well developed and applied for cAMP/cGMP manipulation. Recently discovered rhodopsin phosphodiesterase genes from protists established a new and direct biological connection between light and PDEs. Light-regulated PDEs are under development, and of demand to complete the toolkit for cAMP/cGMP manipulation. In this review, we summarize the state of the art, pros and cons of artificial and natural light-regulated PDEs, and discuss potential new strategies of developing light-gated PDEs for optogenetic manipulation.
Characterization and modification of light-sensitive phosphodiesterases from choanoflagellates
(2022)
Enzyme rhodopsins, including cyclase opsins (Cyclops) and rhodopsin phosphodiesterases (RhoPDEs), were recently discovered in fungi, algae and protists. In contrast to the well-developed light-gated guanylyl/adenylyl cyclases as optogenetic tools, ideal light-regulated phosphodiesterases are still in demand. Here, we investigated and engineered the RhoPDEs from Salpingoeca rosetta, Choanoeca flexa and three other protists. All the RhoPDEs (fused with a cytosolic N-terminal YFP tag) can be expressed in Xenopus oocytes, except the AsRhoPDE that lacks the retinal-binding lysine residue in the last (8th) transmembrane helix. An N296K mutation of YFP::AsRhoPDE enabled its expression in oocytes, but this mutant still has no cGMP hydrolysis activity. Among the RhoPDEs tested, SrRhoPDE, CfRhoPDE1, 4 and MrRhoPDE exhibited light-enhanced cGMP hydrolysis activity. Engineering SrRhoPDE, we obtained two single point mutants, L623F and E657Q, in the C-terminal catalytic domain, which showed ~40 times decreased cGMP hydrolysis activity without affecting the light activation ratio. The molecular characterization and modification will aid in developing ideal light-regulated phosphodiesterase tools in the future.
SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype.
The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1.
Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage.
Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis.
To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress.
Voltage-gated sodium (Na\(^+\)) channels respond to short membrane depolarization with conformational changes leading to pore opening, Na\(^+\) influx, and action potential (AP) upstroke. In the present study, we coupled channelrhodopsin-2 (ChR2), the key ion channel in optogenetics, directly to the cardiac voltage-gated Na\(^+\) channel (Na\(_v\)1.5). Fusion constructs were expressed in Xenopus laevis oocytes, and electrophysiological recordings were performed by the two-microelectrode technique. Heteromeric channels retained both typical Na\(_v\)1.5 kinetics and light-sensitive ChR2 properties. Switching to the current-clamp mode and applying short blue-light pulses resulted either in subthreshold depolarization or in a rapid change of membrane polarity typically seen in APs of excitable cells. To study the effect of individual K\(^+\) channels on the AP shape, we co-expressed either K\(_v\)1.2 or hERG with one of the Na\(_v\)1.5-ChR2 fusions. As expected, both delayed rectifier K\(^+\) channels shortened AP duration significantly. K\(_v\)1.2 currents remarkably accelerated initial repolarization, whereas hERG channel activity efficiently restored the resting membrane potential. Finally, we investigated the effect of the LQT3 deletion mutant ΔKPQ on the AP shape and noticed an extremely prolonged AP duration that was directly correlated to the size of the non-inactivating Na\(^+\) current fraction. In conclusion, coupling of ChR2 to a voltage-gated Na\(^+\) channel generates optical switches that are useful for studying the effect of individual ion channels on the AP shape. Moreover, our novel optogenetic approach provides the potential for an application in pharmacology and optogenetic tissue-engineering.
Der erste klonierte Hitzerezeptor in Säugetieren ist der TRPV1. Er wird durch noxische Hitzereize ab 43° C und durch chemische Substanzen wie das Vanilloid Capsaicin aktiviert. Die Expression des TRPV1 wird durch das Neurotrophin „Nerve Growth Factor“ (NGF) gesteuert, welches in nichtneuronalen Zellen im Innervationsgebiet der Nozizeptoren gebildet und von dort retrograd zu den Somata der Neurone transportiert wird. Im Gegensatz zu Säugern reagieren Vögel nicht auf Capsaicin, aber auf Hitze ab 42° C. Der hierfür zuständige Rezeptor im Küken wurde kloniert und cTRPV1 genannt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Expression des TRPV1 von Küken ebenso wie bei Säugern von NGF reguliert wird. Hierfür erfolgte (i) eine Isolation von Spinalganglienneurone aus Ratten und Küken und deren Zellkultur für bis zu drei Tagen mit und ohne NGF und (ii) eine Ligation des Nervus ischiadicus des Kükens und die anschließende Isolation der korrespondierenden Spinalganglienneurone. Anschließend erfolgte die Stimulation mit 44 °C und der Anteil capsaicin- bzw. hitzesensitiver Neurone wurde mit Hilfe der Cobalt-Uptake-Methode ermittelt. Es zeigte sich, dass sowohl der Anteil der capsaicinsensitiven als auch der hitzesensitiven Spinalganglienneurone der Ratte bei Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur abnimmt. Im Unterschied dazu nimmt in Küken der Anteil hitzesensitiver Spinalganglienneurone unabhängig von der An- oder Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur zu. Auch unter in vivo-Bedingungen nach Ligation des Nervus ischiadicus zeigte sich beim Küken ein Anstieg der Proportion hitzesensitiver Spinalganglienneurone. Somit konnte gezeigt werden, dass der Küken-TRPV1 im Gegensatz zum TRPV1 der Ratten unabhängig von NGF reguliert wird. Die vorliegenden Ergebnisse tragen zur weiteren Charakterisierung des Küken-TRPV1 und zur Klärung pathologisch veränderter Hitzeempfindungen im Rahmen von Erkrankungen, die mit einer Änderung des NGF-Gehaltes im Innervationsgebiet von Nozizeptoren einhergehen, bei.
Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt hauptsächlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im täglichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl möglicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivität und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten angesät wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung bestätigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von homöostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abhängig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. für H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, während NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten überwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabhänigig.
Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkanälen und Transportproteinen ist für die normale Epithelfunktion unerlässlich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellkörper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkanäle und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- geführt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kanälen in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kanälen die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es für 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazelluläre Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt.
Die Plastizität von Nozizeptoren kann eine der Ursachen für neuropathische Schmerzen sein. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Capsaicinempfindlichkeit und der Galaninexpression in einzelnen Spinalganglionneuronen unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Diese Eigenschaften wurden gewählt, weil beide nach experimentellen Nervenverletzungen starken Veränderungen unterliegen und weil beide über „nerve growth factor“ reguliert werden. Neurone von Ratten mit experimenteller Axotomie oder „chronic constriction injury“ des N. ischiadicus wurden mit entsprechenden Neuronen von unverletzten Ratten unter Kulturbedingungen verglichen. Der gleichzeitige Nachweis beider Eigenschaften erfolgte in isolierten Neuronen durch eine Doppelfärbung, bei der die Capsaicinempfindlichkeit mittels Kobaltaufnahme und die Galaninexpression immunzytochemisch nachgewiesen wurden. Mit zunehmender Dauer einer Axotomie und mit zunehmender Dauer in Kultur sank der Anteil capsaicinempfindlicher Neurone. Gleichzeitig kam es zu einer starken Hochregulation von Galanin. Diese Effekte waren in vitro durch die Zugabe von „nerve growth factor“ oder „glial cell line-derived neurotrophic factor“ reversibel. Mit zunehmender Dauer einer „chronic constriction injury“ hingegen veränderten sich diese Populationen nicht. Die Analyse doppeltgefärbter Neurone ergab, daß nach einer Axotomie kein einziges Neuron gleichzeitig capsaicinempfindlich und galaninerg war. Unter bestimmten Kulturbedingungen sah man jedoch vereinzelt eine Doppelfärbung. Die nach einer Axotomie de novo galaninergen Neurone hatten ein Größenverteilungsprofil, das demjenigen von unverletzten capsaicinempfindlichen Neuronen stark ähnelte. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Hochregulation von Galanin das Vorhandensein capsaicinempfindlicher Neurone voraussetzt. In dieser Arbeit wird daher die Hypothese aufgestellt, daß die nach einer Axotomie galaninergen Neurone zuvor capsaicinempfindlich gewesen sein müssen. Dies impliziert, daß im einzelnen Neuron die Hochregulation von Galanin erst nach einer Herabregulation der Capsaicinempfindlichkeit geschieht. Ob diese Sequenz eine funktionelle Bedeutung hat, bedarf weiterer Untersuchungen. Es liegt nahe, daß Galanin als Markerpeptid gelten kann, mit dem in künftigen Untersuchungen neuropathischer Zustände der Nozizeption diejenigen Neurone identifiziert werden können, die zuvor im unverletzten Zustand capsaicinempfindliche Nozizeptoren waren.
The cardiac hormone atrial natriuretic peptide (ANP) regulates systemic and pulmonary arterial blood pressure by activation of its cyclic GMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. In the lung, these hypotensive effects were mainly attributed to smooth muscle-mediated vasodilatation. It is unknown whether pulmonary endothelial cells participate in the homeostatic actions of ANP. Therefore, we analyzed GC-A/cGMP signalling in lung endothelial cells and the cause and functional impact of lung endothelial GC-A dysfunction. Western blot and cGMP determinations showed that cultured human and murine pulmonary endothelial cells exhibit prominent GC-A expression and activity which were markedly blunted by hypoxia, a condition known to trigger pulmonary hypertension (PH). To elucidate the consequences of impaired endothelial ANP signalling, we studied mice with genetic endothelial cell-restricted ablation of the GC-A receptor (EC GC-A KO). Notably, EC GC-A KO mice exhibit PH already under resting, normoxic conditions, with enhanced muscularization of small arteries and perivascular infiltration of inflammatory cells. These alterations were aggravated on exposure of mice to chronic hypoxia. Lung endothelial GC-A dysfunction was associated with enhanced expression of angiotensin converting enzyme (ACE) and increased pulmonary levels of Angiotensin II. Angiotensin II/AT(1)-blockade with losartan reversed pulmonary vascular remodelling and perivascular inflammation of EC GC-A KO mice, and prevented their increment by chronic hypoxia. This experimental study indicates that endothelial effects of ANP are critical to prevent pulmonary vascular remodelling and PH. Chronic endothelial ANP/GC-A dysfunction, e.g. provoked by hypoxia, is associated with activation of the ACE-angiotensin pathway in the lung and PH.
Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose.