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Das Verfahren der intracytoplasmatischen Spermainjektion (ICSI) wird seit 1995 an der Universitäts-Frauenklinik Würzburg angewandt. Diese Studie untersuchte die physische und psychische Entwicklung von 73 ICSI-Kindern sowie die Lebenszufriedenheit ihrer Mütter. Anhand des Enzephalopathie-Fragebogens von Meyer-Probst, des Mann-Zeichen-Tests nach Ziler sowie einiger demographischer Variablen konstatierten wir eine durchschnittliche Entwicklung der ICSI-Kinder. Bei den Risikokindern (Mehrlinge, Frühgeborene und Kinder mit zu geringem Geburtsgewicht) zeichnete sich ein Trend zu schlechteren Ergebnissen ab. Ein signifikanter Unterschied errechnete sich nur zwischen Einlingen und Mehrlingen (Irrtumswahrscheinlichkeit < 5 %). Eine erhöhte Fehlbildungsrate, wie in der Literatur häufig beschrieben, konnten wir nicht verzeichnen. Die Lebenszufriedenheit der ICSI-Mütter entsprach dem Vergleichskollektiv, die höchste Zufriedenheit konstatierten wir bezüglich der Freude mit ihren Kindern. Mehrlingsmütter zeigten sich trotz der erhöhten Belastung nicht unzufriedener. Frauen, die sich mehreren Zyklen unterziehen mussten, bis es zu einer erfolgreichen Schwangerschaft kam, weisen immer noch eine geringere Selbstzufriedenheit auf.
Epimutations in Germ-Cell and Embryo Development: Possible Consequences for Assisted Reproduction
(2011)
Assisted reproductive technologies (ART) emerged in the late 1970’s as a therapy for human infertility. Up till now more than 3 million babies have been conceived through ART, demonstrating the safety and efficiency of the technique. Published reports showed an increase in the rate of imprinting disorders (Beckwith Wiedemann Syndrome, Angelman Syndrome, etc.) in babies born after ART. What are the effects imposed through ART and should researchers reassess its safety and implications on the future offspring? Throughout this thesis, I analyzed the methylation patterns of germ cells and embryos to determine whether in vitro maturation and in vitro fertilization have a negative impact on the epigenetic patterns. Furthermore, DNA methylation was compared between sperm of infertile and presumably fertile controls in order to understand whether epigenetic disturbances lead to infertility at the first place. The occurrence of methylation aberrations in germ cells of infertile patients could be transmitted to new-borns and then cause epigenetic disorders. In order to elucidate the imprinting status within single cells, I developed a new technique based on limiting dilution where bisulfite treated DNA is distributed across several wells before amplification. This allowed methylation measurement at the single allele level as well parent of origin detection. In a total of 141 sperm samples from couples undergoing in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) including 106 with male factor or combined infertility and 28 with female infertility, I detected a significant correlation between lower quality of semen parameters (sperm count, percentage of abnormal sperm, and percentage of motile sperm) and the rate of imprinting errors. ALU repeats displayed a higher methylation in sperm DNA of patients leading to a pregnancy and live birth, compared to patients in which pregnancy was not achieved or a spontaneous abortion occurred. A discriminant analysis based on ALU methylation allowed correct classification of >70% of cases. Preliminary data from illumina methylation arrays where more than 27,000 CpGs were analyzed determined that only a single CpG site from the open reading frame C14orf93 was significantly different between the infertile and presumably fertile control group. However, further improvements on data normalization might permit detection of other differentially methylated regions. Comparison of embryos after natural conception, in vitro fertilized embryos from superovulated oocytes, and embryos achieved through fertilization of in vitro cultured oocytes revealed no dramatic effect on the imprinting patterns of Igf2r, H19, and Snrpn. Oocyte cryotop vitrification did not result in a dramatic increase of imprinting mutations in oocytes even though the rate of sporadic methylation errors in single Snrpn CpGs were higher within the in-vitrified group. Collectively, the results I will present within this thesis suggest an increase in the rate of imprinting errors within the germ cells of infertile patients, in addition to a decrease in genome wide methylation of ALU repetitive elements. I did not observe a detrimental effect on the methylation patterns of oocytes and the resulting embryos using in vitro maturation of oocytes and/or standard IVF with in vivo grown superovulated oocytes.
Das Implantationsversagen stellt die häufigste Ursache für den Misserfolg der menschlichen Reproduktion dar und spielt wahrscheinlich eine bedeutende Rolle bei wiederholt erfolgloser assistierter Reproduktion (IVF/ICSI und ET). Die hormonell eingeleitete Regulation der Implantation beinhaltet eine komplexe Folge von Signalen zwischen Embryo und Endometrium, deren regelrechter Ablauf für die erfolgreiche Einrichtung einer Schwangerschaft entscheidend ist. Eine Fülle von Faktoren wie Zytokine und Wachstumsfaktoren spielen hier eine bedeutende Rolle. Unter diesen Mediatoren ist auch Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) am Implantationsvorgang beteiligt. Bei weiblichen Mäusen mit einer homozygoten Inaktivierung des LIF-Gens bleibt nach erfolgreicher Befruchtung ihrer Oozyten die Implantation aus, obwohl ihre Blastozysten lebensfähig sind. Die mütterliche LIF-Produktion ist also essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft bei Mäusen. Für die Beteiligung LIFs an der Kontrolle des Implantationsvorgangs auch beim Menschen gibt es eine Reihe von Hinweisen. Das LIF-Protein wird im menschlichen Endometrium zyklusabhängig mit einem Maximum zum Zeitpunkt der Implantation produziert. Menschliche Blastozysten exprimieren zum Zeitpunkt der Implantation mRNA für LIF-Rezeptoren, so dass sie als Ziel der Zytokinwirkung gelten. Ein Mangel an LIF könnte im Zusammenhang mit einigen Formen von Infertilität stehen. In uteriner Spülflüssigkeit idiopathisch infertiler Frauen wurden reduzierte LIF-Konzentrationen nachgewiesen, endometriale Zellen infertiler Frauen, sezernierten signifikant weniger LIF als die fertiler Frauen. Als Grundlage dieser Veränderungen werden Mutationen im LIF-Gen vermutet, die zu reduzierter endometrialer Produktion oder verminderter biologischer Aktivität des Zytokins führen und eine gestörte Implantation der Blastozyste im menschlichen Endometrium zur Folge haben. Im Vorfeld konnte bereits eine signifikant erhöhte Prävalenz von heterozygoten Mutationen im menschlichen LIF-Gen in einer Population von Frauen mit unterschiedlichen Infertilitätsursachen nachgewiesen werden. Bislang liegen nur unzureichende Daten zur Prävalenz von Mutationen im LIF-Gen als mögliche Ursache für ein Implantationsversagen vor. Der Nachweis von Mutationen im LIF-Gen könnte einerseits diagnostisch zur Beurteilung der endometrialen Rezeptivität und der Prognose eines IVF/ICSI-Behandlungsversuches genutzt werden. Andererseits hätte der Nachweis eines LIF-Mangels auf dem Boden einer LIF-Gen-Mutation auch therapeutische Konsequenzen, wenn in Zukunft die Substitution LIFs möglich wäre. Ziel dieser Arbeit war es, die Häufigkeit und Art der Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholt erfolgloser IVF/ICSI-Behandlung zu untersuchen, um ihre Bedeutung für das Implantationsversagen bei der assistierten Reproduktion beurteilen zu können, und zu prüfen, ob der Einsatz eines geeigneten Screeningverfahrens auf LIF-Gen-Mutationen bei diesen Patientinnen sinnvoll erscheint. Zu diesem Zweck wurden 50 Patientinnen mit wiederholtem IVF/ICSI-Versagen und 105 fertile Frauen als Kontrollgruppe auf das Vorliegen von Mutationen im LIF-Gen untersucht. Zum diesem Screening dienten die standardisierte DNA-Extraktion, deren Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Single-Strand Conformation Polymorphism-Analyse (SSCP). Zeigte sich bei der SSCP-Analyse ein abnormes Laufverhalten in den Elektrophoresebanden, erfolgte anschließend die Sequenzierung des DNA-Abschnittes zur Bestätigung und Identifizierung der genetischen Alteration als Mutation oder Polymorphismus. Eine Patientin wies im Exon 3 des LIF-Gens eine heterozygote Transversion (G3453T) auf, welche die Struktur und Funktion des LIF-Proteins jedoch nicht beeinflusst, so dass es sich nicht um eine Mutation, sondern um einen funktionell unbedeutenden Polymorphismus handelt. In einem Fall der Kontrollgruppe fand sich ebenfalls ein Polymorphismus, eine Transition (C3235T) im Intron zwischen Exon 2 und 3. Mutationen mit Auswirkungen auf das Expressionsniveau oder die Bioaktivität LIFs konnten nicht aufgedeckt werden. Die Mutationsrate bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach IVF/ICSI-Therapie ist demnach sehr niedrig und gegenüber fertilen Frauen nicht signifikant erhöht. Damit stehen die Resultate dieser Arbeit im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, wonach LIF beim Menschen zwar eine wichtige Teilfunktion bei der Steuerung des komplexen Implantationsvorganges einnimmt, aber nicht essentiell für seinen Erfolg ist. Aufgrund der niedrigen Prävalenz funktioneller Mutationen im LIF-Gen bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen nach einer IFV/ICSI-Behandlung erscheint ein Screening der betroffenen Patientinnen als Routinemaßnahme zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken nicht gerechtfertigt.