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Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Studie war es, Unterschiede im Einheilverhalten der Werkstoffe Titan und VA-Stahl (316L) anhand der Matrixproteine Kollagen Typ I (C1), Kollagen Typ III (C3) und Fibronektin im implantatumgebenden Interface zu untersuchen und darzustellen. Hierzu wurden die Einheilkapseln der Implantate nach subkutaner, intramuskulärer und intraossärer Implantation nach den Bewertungskriterien Kapselqualität, Kapseldicke und Verteilungsmuster der Matrixproteine mittels konventioneller Mikroskopie und Konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM) analysiert. Nach subkutaner Implantation zeigten beide Werkstoffe in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von SHANNON et al. (1997) vermehrt locker angeordnete, teils parallel orientierte Kollagenfasern mit erhöhtem Zellaufkommen an Fibroblasten und Makrophagen. Nach intramuskulärer Implantation jedoch fanden sich vorwiegend parallel angeordnete, teils dicht gepackte Kollagenfasern mit nur mäßig erhöhtem Zellaufkommen. Intramuskulär eingebrachte Implantate heilten in dünneren Kapseln ein, als subkutan eingebrachte Implantate. Es ergab sich keine Korrelation zu den ermittelten Kapselqualitäten. Dies erstaunt umso mehr, da unter der fortwährenden funktionellen Beanspruchung der intramuskulären Implantate im Bereich der Bauchmuskulatur gegenüber der statischeren Platzierung im subkutanen Rückenfett eine erhöhte Zell- und Matrixreaktion erwartet worden war. Im Lokalisationsvergleich zeigte sich intramuskulär für beide Werkstoffe ein erhöhtes Aufkommen an Fibronektin. Dies könnte auf die erhöhte Stoffwechselaktivität und funktionelle Belastung im Muskelgewebe zurückgeführt werden (ROSENGREN et al. 1994). Nach intraossärer Implantation konnten dünnere Kallusformationen für VA-Stahl gegenüber Titan in allen Proteinfluoreszenzen nachgewiesen werden. Die Qualität der Kallusformation und die histologische Kallusstruktur glichen sich mit zunehmender Implantationsdauer der regulären Knochenstruktur an. Die semiquantitativ beurteilte Verteilung der Matrixproteine mittels CLSM zeigte bei deutlichen Standardabweichungen für beide Werkstoffe erhöhte Fluoreszenz-Intensitäten nur in den implantatnahen Kapselanteilen. In den mittleren und den implantatfernen Kapselabschnitten waren für beide Werkstoffe inkonstant höhere Fluoreszenzwerte gegenüber den Vergleichskollektiven messbar. Der intraossäre Materialvergleich ergab implantatnahe und implantatferne Fluoreszenzmaxima für alle Matrixproteine, die mit zunehmender Implantationsdauer abfielen. Reproduzierbare, materialspezifische Unterschiede waren in Analogie zu BERGER-GORBET et al. (1996) nicht zu finden. In den mittleren Kallusabschnitten konnten reproduzierbare Fluoreszenzunterschiede nur bei Detektion von Kollagen Typ I (C1) in allen Zeitintervallen gesehen werden. Im Vergleich zur Literatur konnte die von VIROLAINEN et al. (1997) beschriebene biphasische Proteinanhäufung, wie auch ein wechselndes Proteinaufkommen (LINDHOLM et al. 1996) nach intraossärer Implantation nicht nachvollzogen werden. Ergänzende Beobachtungen der hier vorgestellten Studie verdeutlichen, dass die lokale, intraossäre Anreicherung von Matrixproteinen, unabhängig von Implantatinsertion oder gar Werkstoffeigenschaften, nach jeglicher Traumatisierung von Knochengewebe den knöchernen Reparationsprozess begleitet. Unter dem Aspekt der Restitutio ad Integrum von Knochenwunden können diese Beobachtungen auf das implantatnahe und das implantatferne Restitutionszentrum übertragen werden. Die Aktivität dieser Restitutionszentren hält bis zum Abschluss der knöchernen Remodellierung über 12 Wochen hinaus an. Dies deckt sich mit Aussagen von STEFLIK et al. (1998), wonach der periimplantäre Knochenumbau langfristig dynamisch bestehen bleibt. Um der zunehmenden Verbreitung nicht nur dentaler Implantate gerecht zu werden, muss auch zukünftig ein besseres Verständnis der Komunikationswege zwischen Implantaten und Biosystemen gewonnen werden. Dies bedeutet für die Herstellung und Weiterentwicklung von Implantaten, dass nicht nur die Werkstoff- und Oberflächenauswahl wichtig ist, sondern auch die funktionell erforderliche Oberflächenstrukturierung auf die gewünschte Wechselwirkung mit Bestandteilen der EZM und den Zellen angepasst sein sollte (THULL 2005). Die CLSM kann hierbei aufgrund der Möglichkeit der 3-dimensionalen in-situ-Darstellung des Implantatinterface biologisch-strukturelle und molekularbiologisch-immunologische Fragestellungen beantworten.
Nowadays, computational-aided investigations become an essential part in the chemical, biochemical or pharmaceutical research. With increasing computing power, the calculation of larger biological systems becomes feasible. In this work molecular mechanical (MM) and quantum mechanical approaches (QM) and the combination of both (QM/MM) have been applied to study several questions which arose from different working groups. Thus, this work comprises eight different subjects which deals with chemical reactions or proton transfer in enzymes, conformational changes of ligands or proteins and verification of experimental data.
This work firstly deals with reaction mechanisms of aromatic inhibitors of cysteine proteases which can be found in many organisms. These enzymes are responsible for various cancer or diseases as for example Human African Trypanosomiasis (HAT) or the Chagas disease. Aromatic SNAr-type electrophiles might offer a new possibility to covalently modify these proteases. Quantum mechanical calculations have been performed to gain insights into the energetics and possible mechanisms.
The next chapter also deals with Trypanosomiasis but the focus was set on a different enzyme. The particularity of Trypanosomiasis is the thiol metabolism which can also be modified by covalent inhibitors. In this context, the wild type and point mutations of the enzyme tryparedoxin have been investigated via molecular dynamic (MD) simulations to examine the influence of specific amino acids in regard to the inhibitor. Experimental data showed that a dimerization of the enzyme occurs if the inhibitor is present. Simulations revealed that the stability of the dimer decreases in absence of the inhibitor and thus confirms these experiments.
Further investigations concerning cysteine proteases such as cruzain and rhodesain have been conducted with respect to experimental kinetic data of covalent vinylsulfone inhibitors. Several approaches such as QM or QM/MM calculations and docking, MD or MMPBSA/MMGBSA simulations have been applied to reproduce these data. The utilization of force field approaches resulted in a qualitatively accurate prediction.
The kinase AKT is involved in a range of diseases and plays an important role in the formation of cancer. Novel covalent-allosteric inhibitors have been developed and crystallized in complex with AKT. It was shown that depending on the inhibitor a different cysteine residue is modified. To investigate these differences in covalent modification computational simulations have been applied.
Enoyl-(acyl carrier) (ENR) proteins are essential in the last step of the fatty acid biosynthesis II (FAS) and represent a good target for inhibition. The diphenylether inhibitor SKTS1 which was originally designed to target the ENR’s of Staphylococcus aureus was also crystallized in InhA, the ENR of Mycobacterium tuberculosis (TB). Crystal structures indicate a change of the inhibitor's tautomeric form. This subject was investigated via MD simulations. Results of these simulations confirmed the tautomerization of the inhibitor.
This work also deals with the development of a covalent inhibitor originating from a non-covalent ligand. The target FadA5 is an essential enzyme for the degradation of steroids in TB and is responsible for chronic tuberculosis. This enzyme was crystallized in complex with a non-covalent ligand which served as starting point for this study. Computations on QM or QM/MM level and docking and MD simulations have been applied to evaluate potential candidates.
The next chapter focuses on the modification of the product spectrum of Bacillus megaterium levansucrase, a polymerase which catalyzes the biosynthesis of fructans. The covalent modification of the wild type or mutants of the enzyme lead to an accumulation of oligosaccharides but also to polymers with higher polymerization degree. To understand these changes in product spectra MD simulations have been performed.
Finally, the proton transfer in catalytic cysteine histidine dyads was investigated. The focus was set on the influence of the relaxation of the protein environment to the reaction. Calculations of the enzymes FadA5 and rhodesain revealed that the preferred protonation state of the dyade depends on the protein environment and has an impact on the reaction barrier. Furthermore, the adaptation of the environment to a fixed protonation state was analyzed via MD simulations.
Die Initiation der DNA-Replikation in Eukaryonten ist ein hochkonservierter Prozess, der in drei Stufen unterteilt werden kann. Im ersten Schritt bindet der „origin recognition complex“ (ORC) an Replikationsorigins innerhalb chromosomaler DNA, wodurch eine Assemblierung des präreplikativen Komplexes an diesen Startpunkten ausgelöst wird. An den ORC lagern sich anschließend die Proteine CDC6 und RLF-B/CDT1 an, die beide schließlich für die Rekrutierung des heterohexameren MCM-Komplexes verantwortlich sind. Durch die Aktivität der Kinase CDC7/DBF4 wird der Origin für den Start der DNA-Replikation lizenziert, sobald die finale Anlagerung des Initiationsfaktors CDC45 den präreplikativen Komplex vervollständigt hat. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das komplexe Netzwerk von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den verschiedenen Initiationsfaktoren durch FRET-Studien aufzuklären. Es konnten Interaktionen zwischen MCM5 und MCM3, MCM5 und MCM7, ORC5 und MCM7, sowie CDT1 und MCM6 in vivo nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit hatte weiterhin die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der sechs murinen MCM-Proteine in Fibroblasten-Zellen der Maus zum Ziel.Lokalisationsstudien der EGFP-gekoppelten MCM-Proteine zeigten, dass die Proteine EGFP-MCM4, MCM4-EGFP, MCM4-NLS-EGFP, EGFP-MCM5, MCM5-EGFP, MCM5-NLS-EGFP, und EGFP-MCM7 u.a. am Centrosom lokalisiert sind. Durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörpern gegen eine konservierte Domäne aller sechs MCM-Untereinheiten sowie mit spezifischen MCM3- und MCM6-Antikörpern konnte eine centrosomale Lokalisation auch für die endogenen Proteine nachgewiesen werden. Zusätzlich zu den Lokalisationsanalysen konnte über Immunpräzipitationsstudien gezeigt werden, dass MCM3 und MCM6 mit dem centrosomalen Protein g-Tubulin präzipitierbar sind. Die Tatsache, dass alle Untereinheiten des MCM-Komplexes mit dem Centrosom assoziiert sind, deutet darauf hin, dass die MCM-Proteine am Centrosom als Multiproteinkomplex gebunden sind. Da MCM3 und MCM6 auch in allen Mitose-Stadien an das Centrosom gebunden sind, kann von einer funktionellen Aufgabe dieser Proteine während der Zellteilung ausgegangen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit sollte die Funktion der MCM-Proteine am Centrosom durch „knock-down“ des Proteins MCM3 mittels RNA-Interferenz-Studien untersucht werden. Ziel war, ein induzierbares MCM3-siRNA-exprimierendes System zu etablieren. Das gezielte An- und Abschalten der MCM3siRNA-Transkription sollte durch das TetOn-System ermöglicht werden. Bei diesem System wird durch Zugabe von Doxycyclin die Transkription aktiviert, bei Abwesenheit von Doxycyclin wird sie abgeschaltet. Auf dieser Basis wurde der Einfluss von Doxycyclin auf das Wachstumsverhalten der MCM3siRNA-exprimierenden Zelllinie untersucht. Im Vergleich zu NIH/3T3-Zellen und NIH/3T3-TetOn-Zellen konnte eine deutlich reduzierte Proliferation bei Behandlung der Zellen mit Doxycyclin beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine durch Produktion von MCM3siRNA verursachte Störung des Zellwachstums hin. Zusätzlich beeinflusst die durch Doxycyclin induzierte Synthese von MCM3siRNA die Zellzyklusverteilung. So befinden sich nach Doxycyclinbehandlung mehr Zellen in der G2/M-Phase als in unbehandelten, asynchronen NIH/3T3-Zellen. Die MCM3-Proteinmenge wurde nach 19 Tagen Doxycyclinbehandlung fast vollständig durch die produzierte MCM3siRNA herunterreguliert. Um einen möglichen Einfluss der MCM3siRNA auf andere MCM-Proteine zu untersuchen, wurde der Protein-Level von MCM6 analysiert. Dabei wurde eine vermehrte MCM6-Expression nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass durch Bildung von MCM3siRNA der Expressions-Level von MCM6 beeinflusst wird. Auffällig häufig lagen in MCM3-„knock-down“-Zellen mehrere Zellkerne vor. Neben Zellen mit zwei Zellkernen finden sich auch Zellen mit einer ungeraden Anzahl an Zellkernen. Demnach durchlaufen die Zellkerne in einer Zelle unterschiedliche Zellzyklusstadien. Die Phänotypen, die nach Transkription der MCM3siRNA beobachtet wurden, sind komplex und zeigen Defekte in zahlreichen Mitose-Stadien. Das Auftreten multinukleärer Zellen ist auf eine fehlende Cytokinese zurückzuführen. Die Mikrotubuli waren in den MCM3-„knock-down“-Zellen nur unzureichend organisiert, wobei sie kaum mit der Zellperipherie verankert waren. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die MCM-Proteine neben ihrer essentiellen Rolle in der Ausbildung des präreplikativen Komplexes eine zusätzliche Funktion in der Mitose ausüben.