Refine
Has Fulltext
- yes (11)
Is part of the Bibliography
- yes (11)
Document Type
- Doctoral Thesis (11) (remove)
Keywords
- CRISPR/Cas-Methode (11) (remove)
Institute
- Graduate School of Life Sciences (5)
- Lehrstuhl für Orthopädie (2)
- Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie (2)
- Deutsches Zentrum für Herzinsuffizienz (DZHI) (1)
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (1)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (1)
- Medizinische Klinik und Poliklinik I (1)
- Pathologisches Institut (1)
- Physiologisches Institut (1)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (1)
IRAK2 besitzt eine Schlüsselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs führen zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen fördern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit über die grundsätzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist für IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminosäure in der Kinase-Domäne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend geklärt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Veränderung eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht.
Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminosäure 333) wieder zur Asparaginsäure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivität zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung über CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung über die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abhängige NF-κB-Aktivierung über den TLR4 Signalweg schlechter ermöglicht als IRAK2.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Veränderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abhängigen NF-κB-Aktivität führte und somit eine erhöhte und länger anhaltende Signalleitung ermöglichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verständnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer möglichen zukünftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden.
Neisseria meningitidis, a commensal β-proteobacterium residing exclusively in the human nasopharynx, is a leading cause of sepsis and epidemic meningitis worldwide. While comparative genome analysis was able to define hyperinvasive lineages that are responsible for most of the cases of invasive meningococcal disease (IMD), the genetic basis of their virulence remains unclear. Recent studies demonstrate that the type II C CRISPR/Cas system of meningococci is associated with carriage and less invasive lineages. CRISPR/Cas, an adaptive defence system against foreign DNA, was shown to be involved in gene regulation in Francisella novicida. This study shows that knockout strains of N. meningitidis lacking the Cas9 protein are impaired in the adhesion to human nasopharyngeal cells in a strain-dependant manner, which constitutes a central step in the pathogenesis of IMD. Consequently, this study indicates that the meningococcal CRISPR/Cas system fulfils functions beyond the defence of foreign DNA and is involved in the regulation of meningococcal virulence.
Die Rolle von Connexinen und Gap Junction-vermittelter Kommunikation in pluripotenten Stammzellen sowie der frühen Embryonalentwicklung sind bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Mutationen in humanen Connexinen verursachen eine Vielzahl von Krankheiten. Connexin-defiziente iPS Zellen stellen eine gute Basis für die Erforschung der Rolle von Connexinen während der Embryonalentwicklung und bei der Krankheitsentstehung dar.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das CRISPR/Cas9-System in pluripotenten Stammzellen erfolgreich anzuwenden und ein Protokoll zur Erstellung verschiedener Cx43-Defektmutanten zu entwerfen. Nach der Etablierung der CRSIPR/Cas9-Methode in HEK293T-Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit darüber hinaus erfolgreich eine Cx43-Defizienz in FSiPS-Zellen erzeugt werden. Weiterhin wurden mehrere Cx43-Mutanten geschaffen und initial auf Pluripotenzmarker und ihr Differenzierungspotential untersucht.
Diese Arbeit bildet die Basis für weitere Untersuchungen des Cx43 in iPS-Zellklonen und davon abgeleiteten Zelltypen sowie artifiziellen 3D-Gewebekulturen. Darüber hinaus bildet sie die Grundlage für die Bildung weiterer Connexin-Defektmutanten sowie von iPS-Zellen mit krankheitsrelevanten Mutationen.
Morbus Cushing ist die häufigste Ursache für endogenes Cushing-Syndrom und führt auf Grund eines kortikotropen Hypophysenadenoms zu einem Glucocorticoid Überschuss und wiederum zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Die Ursache hierfür sind unter anderem somatische Mutationen in den Deubiquitinasen USP8 und USP48. Das Ziel dieser Arbeit war es mittels der CRISPR/Cas9-Methode, die Mutationen USP8 und USP48 in Zelllinien zu etablieren und diese für Cushing-Syndrom Analysen zu verwenden. Hierfür wurden in dieser Arbeit gRNAs für USP8 und USP48 designt, welche anschließend in die humane embryonale Zelllinie HEK293AD Zellen transfiziert wurden. Diese Zellen wurden zu monoklonalen Zellen vereinzelt. Ziel war einen Knock-out von USP8 bzw. USP48 zu generieren. Es konnte ein erfolgreicher Zellklon generiert werden mit einem Knock-out von USP48. Ebenfalls konnte ein Genomediting von USP8 in Exon 20 durchgeführt werden. Zusammenfassend konnte die CRISPR/Cas9 Methode für ein M. Cushing-Zellmodells etabliert und eine gute Ausgangsbasis für weitere Experimente (z.B. ein gezielter Knock-in von USP8- und USP48- Mutationen) generiert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen.
Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) führt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsstörungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Ausprägungsformen die Zähne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchzähne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend fünf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivitätsmessungen (CSPD Assay) und TNAP Färbungen zeigten einen signifikanten Rückgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivität und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Phänotyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdrückt. Mögliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabhängiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenhänge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergründen und daraus gegebenenfalls neue Therapieansätze abzuleiten.
CRISPR-Cas systems are highly diverse and canonically function as prokaryotic adaptive immune systems. The canonical resistance mechanism relies on spacers that are complementary to the invaders' nucleic acids. By accidental incorporation or other mechanisms, prokaryotes can also acquire self-targeting spacers that are complementary to their own genome. As self-targeting commonly leads to lethal autoimmunity, the existence of self-targeting spacers poses a paradox. In Chapter 1, we provide an overview of the prevalence of self-targeting spacers, summarize how they can be incorporated, and which means can be employed by the host to evade lethal self-targeting. In addition, we outline alternative functions of CRISPR-Cas systems that are associated with self-targeting spacers. Whether CRISPR-Cas systems can efficiently target their own genome depends heavily on the presence of protospacer adjacent motifs (PAMs) next to the target region. In Chapter 2, we developed a method to determine PAM requirements. Thereby, we specifically focused on type I systems that engage multi-protein complexes, which are challenging to assess. Using the cell-free transcription-translation (TXTL) system, we developed an enrichment-based binding assay and validated its reliability by examining the well-known PAM requirements of the E. coli type I-E system. In Chapter 3, we applied the TXTL-based PAM assay to assess 16 additional CRISPR-Cas systems. These 16 systems included three CRISPR-Cas associated transposons (CASTs). CASTs are recently discovered transposons that employ CRISPR-Cas systems in a non-canonical function for the directed integration of the transposon. To further characterize CASTs in TXTL outside their PAM requirements, we reconstituted the transposition of CASTs in TXTL. In Chapter 4, we turned to non-canonical self-targeting CRISPR-Cas systems, which were already discussed in Chapter 1. While investigating how the plant pathogen Xanthomonas albilineans survives self-targeting by its two endogenous CRISPR-Cas systems, we identified multiple putative anti-CRISPR proteins (Acrs) in the genome of X. albilineans. Two of the Acrs, named AcrIC11 and AcrIF12Xal, inhibited degradation by their respective CRISPR-Cas systems but still retained Cascade-binding ability, and appear responsible for the lack of autoimmunity in X. albilineans. In summary, we developed new technologies that eased the investigation of non-canonical multi-component systems and, if applied to additional systems, might reveal unique properties that could be implemented in new CRISPR-Cas based tools.
Allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) is a curative therapy for the treatment of malignant and non-malignant bone marrow diseases. The major complication of this treatment is a highly inflammatory reaction known as Graft-versus-Host Disease (GvHD). Cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are used to treat GvHD which limits inflammation but also interferes with the anticipated Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. These drugs repress conventional T cells (Tcon) along with regulatory T cells (Treg), which are important for both limiting GvHD and supporting GvL. Both of these drugs inhibit calcineurin (CN), which dephosphorylates and activates the nuclear factor of activated T-cells (NFAT) family of transcription factors. Here, we make use of our Cd4cre.Cas9+ mice and developed a highly efficient non-viral CRISPR/Cas9 gene editing method by gRNA-only nucleofection. Utilizing this technique, we demonstrated that unstimulated mouse T cells upon NFATc1 or NFATc2 ablation ameliorated GvHD in a major mismatch mouse model. However, in vitro pre-stimulated mouse T cells could not achieve long-term protection from GvHD upon NFAT single-deficiency. This highlights the necessity of gene editing and transferring unstimulated human T cells during allo-HCT. Indeed, we established a highly efficient ribonucleoprotein (RNP)-mediated CRISPR/Cas9 gene editing for NFATC1 and/or NFATC2 in pre-stimulated as well as unstimulated primary human T cells. In contrast to mouse T cells, not NFATC1 but NFATC2 deficiency in human T cells predominantly affected proinflammatory cytokine production. However, either NFAT single-knockout kept cytotoxicity of human CD3+ T cells untouched against tumor cells in vitro. Furthermore, mouse and human Treg were unaffected upon the loss of a single NFAT member. Lastly, NFATC1 or NFATC2-deficient anti-CD19 CAR T cells, generated with our non-viral ‘one-step nucleofection’ method validated our observations in mouse and human T cells. Proinflammatory cytokine production was majorly dependent on NFATC2 expression, whereas, in vitro cytotoxicity against CD19+ tumor cells was undisturbed in the absence of either of the NFAT members. Our findings emphasize that NFAT single-deficiency in donor T cells is superior to CN-inhibitors as therapy during allo-HCT to prevent GvHD while preserving GvL in patients.
The emergence of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) and the rise of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) gene editing technology innovated the research platform for scientists based on living human pluripotent cells. The revolutionary combination of both Nobel Prize-honored techniques enables direct disease modeling especially for research focused on genetic diseases. To allow the study on mutation-associated pathomechanisms, we established robust human in vitro systems of three inherited cardiomyopathies: arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM), dilated cardiomyopathy with juvenile cataract (DCMJC) and dilated cardiomyopathy with ataxia (DCMA).
Sendai virus vectors encoding OCT3/4, SOX2, KLF4, and c-MYC were used to reprogram human healthy control or mutation-bearing dermal fibroblasts from patients to an embryonic state thereby allowing the robust and efficient generation of in total five transgene-free iPSC lines. The nucleofection-mediated CRISPR/Cas9 plasmid delivery in healthy control iPSCs enabled precise and efficient genome editing by mutating the respective disease genes to create isogenic mutant control iPSCs. Here, a PKP2 knock-out and a DSG2 knock-out iPSC line were established to serve as a model of ACM. Moreover, a DNAJC19 C-terminal truncated variant (DNAJC19tv) was established to mimic a splice acceptor site mutation in DNAJC19 of two patients with the potential of recapitulating DCMA-associated phenotypes. In total eight self-generated iPSC lines were assessed matching internationally defined quality control criteria. The cells retained their ability to differentiate into cells of all three germ layers in vitro and maintained a stable karyotype. All iPSC lines exhibited a typical stem cell-like morphology as well as expression of characteristic pluripotency markers with high population purities, thus validating the further usage of all iPSC lines in in vitro systems of ACM, DCMA and DCMJC.
Furthermore, cardiac-specific disease mechanisms underlying DCMA were investigated using in vitro generated iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs). DCMA is an autosomal recessive disorder characterized by life threatening early onset cardiomyopathy associated with a metabolic syndrome. Causal mutations were identified in the DNAJC19 gene encoding an inner mitochondrial membrane (IMM) protein with a presumed function in mitochondrial biogenesis and cardiolipin (CL) remodeling. In total, two DCMA patient-derived iPSC lines (DCMAP1, DCMAP2) of siblings with discordant cardiac phenotypes, a third isogenic mutant control iPSC line (DNAJC19tv) as well as two control lines (NC6M and NC47F) were directed towards the cardiovascular lineage upon response to extracellular specification cues. The monolayer cardiac differentiation approach was successfully adapted for all five iPSC lines and optimized towards ventricular subtype identity, higher population purities and enhanced maturity states to fulfill all DCMA-specific requirements prior to phenotypic investigations. To provide a solid basis for the study of DCMA, the combination of lactate-based metabolic enrichment, magnetic-activated cell sorting, mattress-based cultivation and prolonged cultivation time was performed in an approach-dependent manner. The application of the designated strategies was sufficient to ensure adult-like characteristics, which included at least 60-day-old iPSC-CMs. Therefore, the novel human DCMA platform was established to enable the study of the pathogenesis underlying DCMA with respect to structural, morphological and functional changes.
The disease-associated protein, DNAJC19, is constituent of the TIM23 import machinery and can directly interact with PHB2, a component of the membrane bound hetero-oligomeric prohibitin ring complexes that are crucial for phospholipid and protein clustering in the IMM. DNAJC19 mutations were predicted to cause a loss of the DnaJ interaction domain, which was confirmed by loss of full-length DNAJC19 protein in all mutant cell lines. The subcellular investigation of DNAJC19 demonstrated a nuclear restriction in mutant iPSC-CMs. The loss of DNAJC19 co-localization with mitochondrial structures was accompanied by enhanced fragmentation, an overall reduction of mitochondrial mass and smaller cardiomyocytes. Ultrastructural analysis yielded decreased mitochondria sizes and abnormal cristae providing a link to defects in mitochondrial biogenesis and CL remodeling. Preliminary data on CL profiles revealed longer acyl chains and a more unsaturated acyl chain composition highlighting abnormities in the phospholipid maturation in DCMA.
However, the assessment of mitochondrial function in iPSCs and dermal fibroblasts revealed an overall higher oxygen consumption that was even more enhanced in iPSC-CMs when comparing all three mutants to healthy controls. Excess oxygen consumption rates indicated a higher electron transport chain (ETC) activity to meet cellular ATP demands that probably result from proton leakage or the decoupling of the ETC complexes provoked by abnormal CL embedding in the IMM.
Moreover, in particular iPSC-CMs presented increased extracellular acidification rates that indicated a shift towards the utilization of other substrates than fatty acids, such as glucose, pyruvate or glutamine. The examination of metabolic features via double radioactive tracer uptakes (18F-FDG, 125I-BMIPP) displayed significantly decreased fatty acid uptake in all mutants that was accompanied by increased glucose uptake in one patient cell line only, underlining a highly dynamic preference of substrates between mutant iPSC-CMs.
To connect molecular changes directly to physiological processes, insights on calcium kinetics, contractility and arrhythmic potential were assessed and unraveled significantly increased beating frequencies, elevated diastolic calcium concentrations and a shared trend towards reduced cell shortenings in all mutant cell lines basally and upon isoproterenol stimulation. Extended speed of recovery was seen in all mutant iPSC-CMs but most striking in one patient-derived iPSC-CM model, that additionally showed significantly prolonged relaxation times. The investigations of calcium transient shapes pointed towards enhanced arrhythmic features in mutant cells comprised by both the occurrence of DADs/EADs and fibrillation-like events with discordant preferences.
Taken together, new insights into a novel in vitro model system of DCMA were gained to study a genetically determined cardiomyopathy in a patient-specific manner upon incorporation of an isogenic mutant control. Based on our results, we suggest that loss of full-length DNAJC19 impedes PHB2-complex stabilization within the IMM, thus hindering PHB-rings from building IMM-specific phospholipid clusters. These clusters are essential to enable normal CL remodeling during cristae morphogenesis. Disturbed cristae and mitochondrial fragmentation were observed and refer to an essential role of DNAJC19 in mitochondrial morphogenesis and biogenesis. Alterations in mitochondrial morphology are generally linked to reduced ATP yields and aberrant reactive oxygen species production thereby having fundamental downstream effects on the cardiomyocytes` functionality. DCMA-associated cellular dysfunctions were in particular manifested in excess oxygen consumption, altered substrate utilization and abnormal calcium kinetics. The summarized data highlight the usage of human iPSC-derived CMs as a powerful tool to recapitulate DCMA-associated phenotypes that offers an unique potential to identify therapeutic strategies in order to reverse the pathological process and to pave the way towards clinical applications for a personalized therapy of DCMA in the future.
Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese führen zu einer verminderten Aktivität der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gestörte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig verstanden.
In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend mögliche Therapiestrategien für die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-Färbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Präsenz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivität (CSPD-Assay) ermittelt.
Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom völligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellulären ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das hauptsächlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, während die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in-vitro hin, die in-vivo noch bestätigt werden müssen. Die Sequenzierung bestätigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazität darstellen können.
Die Stimulation mit PTH führte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivität in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis für weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung für die Odonto-HPP beitragen können.
In 2020, cancer was the leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths. Lung cancer was the most common cancer, with 2.21 million cases per year in both sexes. This non-homogeneous disease is further subdivided into small cell lung cancer (SCLC, 15%) and non-small cell lung cancer (NSCLC, 85%). By 2023, the American Cancer Society estimates that NSCLC will account for 13% of all new cancer cases and 21% of all estimated cancer deaths. In recent years, the treatment of patients with NSCLC has improved with the development of new therapeutic interventions and the advent of targeted and personalised therapies. However, these advances have only marginally improved the five-year survival rate, which remains alarmingly low for patients with NSCLC. This observation highlights the importance of having more appropriate experimental and preclinical models to recapitulate, identify and test novel susceptibilities in NSCLC. In recent years, the Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mouse model developed by Tuveson, Jacks and Berns has been the main in vivo model used to study NSCLC. This model mimics ADC and SCC to a certain extent. However, it is limited in its ability to reflect the genetic complexity of NSCLC. In this work, we use CRISPR/Cas9 genome editing with targeted mutagenesis and gene deletions to recapitulate the conditional model. By comparing the Trp53fl/fl KRaslsl- G12D/wt with the CRISPR-mediated Trp53mut KRasG12D, we demonstrated that both showed no differences in histopathological features, morphology, and marker expression. Furthermore, next-generation sequencing revealed a very high similarity in their transcriptional profile. Adeno-associated virus-mediated tumour induction and the modular design of the viral vector allow us to introduce additional mutations in a timely manner. CRISPR-mediated mutation of commonly mutated tumour suppressors in NSCLC reliably recapitulated the phenotypes described in patients in the animal model. Lastly, the dual viral approach could induce the formation of lung tumours not only in constitutive Cas9 expressing animals, but also in wildtype animals. Thus, the implementation of CRISPR genome editing can rapidly advance the repertoire of in vivo models for NSCLC research. Furthermore, it can reduce the necessity of extensive breeding.