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Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zelllinien aus dem Pankreas des Menschen nicht verfügbar sind. Es ist jedoch bekannt, dass signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der Genexpression in unterschiedlichen Spezies existieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die spezifische Untersuchung der Regulation des humanen Insulingenpromotors hochsensitiv in primären humanen ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen möglich ist. Dazu wurde ein Vektor kloniert, der das SEAP (secreted alkaline phosphatase)-Reportergen unter der Kontrolle des -336 bp langen humanen Insulingenpromotors enthält. Im Laufe verschiedener Transfektionsexperimente mit dem Vektor p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (Positivkontrolle) und pSEAP2-Basic (Negativkontrolle) sowohl in INS-1-ß-Zellen, in beta-TC3-Zellen als auch in primären humanen ß-Zellen, zeigten sich in den luminometrisch bestimmten SEAP-Aktivitäten, die als Maß für die Aktivität des humanen Insulingenpromotors dienen, deutliche Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der einzelnen Vektoren. Dieses System eignet sich also ausgezeichnet für die hochsensitive Analyse der Insulingenpromotoraktiviät. Zur detaillierteren Analyse wurden 5’-Deletionskonstrukte des Vektors p-336hInsP-SEAP konstruiert und damit INS-1- und beta-TC3-Zellen transient transfiziert. In beiden Zelllinien wurden Experimente bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen durchgeführt, um daraus Rückschlüsse auf die Glukoseresponsivität des humanen Insulingenpromotors ziehen zu können. Dabei zeigte der humane Insulingenpromotor die aus Versuchen mit dem RattenInsulingenpromotor 1 erwartete Glukoseresponsivität. Allerdings ließ sich keine Abnahme der transkriptionellen Aktivität des Promotors bei Abnahme der Länge der Konstrukte beobachten. Unter Verwendung von Effectene® als Transfektionsreagenz eignet sich das SEAP-System zur Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in primären insulinproduzierenden Zellen aus dem menschlichen Pankreas.
Verluste der Heterozygosität (LOH=loss of heterocygosity)in den chromosomalen Abschnitten 2p16.3 und 5q22.2 von Kolonkarzinomen treten gehäuft auf und sind ein indirekter Hinweis auf dort lokalisierte Tumorsupressorgene mit zum Teil prognostischer Relevanz für den Patienten. In einer früheren Publikation konnte gezeigt werden, dass ein LOH im Bereich 2p16.3 mit einer signifikant schlechteren Patientenüberlebensprognose assoziiert ist. In der Nähe der Region 5q.22 befindet sich das bei der Kolonkarzinogenes beteiligte APC-Tumorsupressorgen, welches bei einer Deletion in diesem Bereich mit großer Wahrscheinlich von einem Ausfall betroffen ist, und die Patientenüberlebensprognose beeinflussen kann. Ziel dieser Arbeit war es diese Hypothese anhand zweier für die Regionen 2p16.3 und 5q22.2 spezifischer Mikrosatellitenmarker zu überprüfen. Als Untersuchungskollektiv wurden 165 DNA-Probenpaare jeweils von korrespondierendem Tumor- und Normalschleimhautgewebe herangezogen. Es wurde eine Korrelation der allelischen Verluste mit der Patientenprognose und mehreren klinischen Parametern durchgeführt. Dabei ließ sich in Bezug auf einen Heterozygositätsverlust weder für die Region 2p16.2 noch für die Region 5q22.2 ein signifikanter Einfluss auf die Patientenprognose feststellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit können deshalb keinen Hinweis auf ein in den Regionen 2p16.3 und 5q22.2 lokalisiertes Tumorsupressorgen geben.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte geprüft werden ob durch Reduktion der Glutamatdecarboxylase (GAD) Expression eine Reduktion des autoimmunogenen Potenzials in insulinproduzierenden Beta-Zellen des endokrinen Pankreas erreicht werden kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass GAD als Autoantigen eine zentrale Stellung bei der Induktion der T-Zell vermittelten Insulitis einnimmt. Der Prozess, welcher zur Beta-Zell-Apoptose des Typ 1 Diabetes führt, ist ein bislang wenig verstandener komplexer Vorgang. Ein besseres Verständnis dieses Prozesses könnte zur Prävention der Beta-Zell-Zerstörung in der frühen Phase des Typ 1 Diabetes beitragen. In den für die Untersuchungen verwendeten INS-1 Zellen werden die beiden Isoformen der GAD exprimiert. Durch einen antisense Ansatz sollte in INS-1 Zellen die GAD Expression beider Isoformen supprimiert werden. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur gezielten Suppression der Expression des Autoantigens GAD65 etabliert. Es konnte ein antisense Klon identifiziert werden, bei dem die endogene GAD65 mRNA fast nicht mehr detektierbar war. Auf Protein Ebene, im Westernblot konnte dieses Ergebnis jedoch nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktion der INS-1 Zellen mit supprimierter GAD65 Expression charakterisiert. Dieser Punkt beinhaltet die Analyse der Expression von Genen, welche die Beta-Zell-Funktion definieren, die Glukose-abhängige Insulinsekretion sowie die Regulation der Zytokin-induzierten Apoptose. Dabei zeigte sich aus Daten der RT-PCR, dass die mRNAs von anderen Beta-Zell-spezifischen Genen wie GLUT2, Glukokinase, Proinsulin, IDX1 und Nkx6.1 in unveränderter Menge nachweisbar sind. Also bleibt die Funktion der INS-1 Beta-Zellen erhalten, da selbst durch forcierte Reduktion der Expression des Autoantigens GAD65 die Glukose-induzierte Insulinsekretionskapazität im Wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. In vitro Untersuchungen zeigten eine unveränderte Sensitivität der Zytokin-induzierten Apoptose nach GAD65 Suppression in INS-1 Zellen. Die zuvor genannten Resultate und die Tatsache, dass die GAD wohl eines der wichtigsten Autoantigene im Rahmen der Immunpathogenese des Typ 1 Diabetes ist, stellen die Grundlage für die Generierung GAD-supprimierter transplantierbarer Beta-Zellen mit guter Transplantatfunktion dar. Im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung bei der Behandlung dieser humanen Autoimmunerkrankung demonstrieren die vorliegenden Daten, dass im Rahmen einer Inselzelltransplantation die Verwendung von GAD-supprimierten Beta-Zellen bei der Transplantation in das endokrine Pankreas des Menschen zu einer Verminderung von Autoimmunreaktionen führen könnte.
Etablierung und spektrale Karyotypisierung von primären Kolonadenom- und Kolonkarzinomzelllinien
(2008)
Die in-vitro Kultivierung von epithelialen Tumorzellen ist schwierig und die Metaphasengewinnung an primärem Material nicht in ausreichender Menge und Qualität möglich. Bislang werden meist kommerzielle Kolonkarzinomzelllinien für Studien zur Kolonkarzinogenese verwendet. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Kolonkarzinomzelllinien und eine Adenomzelllinie etabliert. Der native Primärtumor und die korrespondierende Normalschleimhaut sind verfügbar. Damit steht nun ein Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz zur Verfügung und Ergebnisse. Die neuetablierten Kolonkarzinomzelllinien Geki-3 und -4 und die Adenomzelllinie Geki-2 wurden mit den kommerziellen Zelllinien Colo206F und Colo678 verglichen. Dazu wurde eine Charakterisierung mittels der spektralen Karyotypisierung (SKY) sowie einer Mikrosatellitenanalyse durchgeführt. Im Gegensatz zu der Adenomzelllinie finden sich in allen untersuchten Kolonkarzinomzelllinien multiple chromosomale Aberrationen. Dabei zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den kommerziell erhältlichen Zelllinien, die schon Jahre in Kultur sind und den neuetablierten Linien. Obwohl die chromosomale Instabilität in-vivo wichtig für die Karzinomentstehung und -metastasierung ist, kommt es unter Kulturbedingungen offenbar nicht zu einer Progression der chromosomalen Instabilität. Neben Adenom- und Karzinomzelllinien wären normale Kolonepithelzelllinien für Studien zur Kolonkarzinogenese ebenfalls von großer Wichtigkeit. Die Etablierung von normalen Epithelzelllinien ist allerdings noch schwieriger als die Etablierung von Adenomzelllinien. Aus normalen Kolonepithelzellen wurde bisher nur die Etablierung einer Epithelzelllinie, der NCOL-1, beschrieben. Ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zelllinie der mikrosatelliteninstabilen Kolonkarzinomzelllinie Lovo entspricht, so dass zurzeit keine normale Kolonepithelzelllinie verfügbar ist.
In CHO-FucTVI- Zellen wurde hLysII/IV stabil transfiziert, mit Puromycin selektioniert und hLysII/IV-FucTVI von den stabil transfizierten CHO-FucTVI- Zelle überexprimiert. Durch Immunaffinitätschromatographie und Ultrafiltration wurde das überexprimierte hLysII/IV-FucTVI aufgereinigt und aufkonzentriert. Durch den Lysozymtest nach Osserman und Lawlor und einen ELISA konnte die Lysozymmenge in den unterschiedlichen Schritten bestimmt werden. Im anschließenden Zelladhäsionsassay konnten bei Konzentrationen von 1 ng/ml, 10 ng/ml und 100 ng/ml hLysII/IV-FucTVI signifikante Reduktionen der Zelladhäsion von U937- Zellen an HUVEC- Zellen festgestellt werden. Die ermittelte mittlere Hemmkonzentration (IC50) von hLysII/IV-FucTVI liegt bei 7*10-12 M. Dies entspricht bei einem Molekulargewicht von 30 kDa der Menge von 0,21 ng/ml und hLysII/IV-FucTVI wäre damit der stärkste bisher bekannte E-Selektin-Antagonist. In dieser Funktion könnte hLysII/IV-FucTVI im Rahmen einer antiinflammatischen oder antineoplastischen Therapie eingesetzt werden.
Gastrointestinale Lymphome des MALT sind heute als eigenständige Entität anerkannt. Sie zeichnen sich durch morphologische, molekularbiologische, ätiopathogenetische und biologische Besonderheiten aus, die sie von den nodalen Lymphomen abgrenzen lassen. Im Rahmen der Würzburger Multicenterstudie „Gastrointestinale Lymphome II“ soll die Frage geklärt werden, ob in den lokalisierten Stadien I und II primärer Magenlymphome unter Berücksichtigung der posttherapeutischen Lebensqualität der operativen oder einer primär konservativen Therapie (Chemo- oder Radiotherapie) Vorzug gegeben werden soll. Von 1998 bis 2002 wurden dazu 49 Patienten mit neu diagnostiziertem niedrig- (n=19) oder hochmalignen (n=30) NHL des Magens in die Studie eingeschlossen. Nach zentraler Randomisierung wurden die Patienten mit low grade NHL der Operation (n=10) oder der Radiotherapie (n=9) zugeteilt. Die Patienten mit high grade NHL erhielten Operation plus Chemotherapie (n=16) oder alleinige Chemotherapie (n=14). Das mediane follow up betrug 74 Monate. Sowohl das operative als auch das konservative Vorgehen zeigten bei beiden Lymphomhistologien überaus hohe Remissionsraten in den Stadien EI und EII (CR um 90%). Unterschiede zwischen den Behandlungsmethoden konnten, evtl. auch bedingt durch die kleinen Gruppengrößen, nicht nachgewiesen werden. Insgesamt verstarben sechs Patienten, die sich in etwa gleichmäßig auf die Gruppen verteilten. Die Auswertung der Fragebögen zur Lebensqualität ergab gemäß SF-36 durchaus hohe Werte zur posttherapeutischen Lebensqualität. Eine Differenzierung der Patienten nach Behandlungsmethode oder Malignitätsgrad (low, high grade) war nicht möglich. Der Lebensqualitätsindex nach Troidl ließ einen prä-post-therapeutischen Vergleich zu: Betrachtet man die Kombination von Therapie und Malignitätsgrad, so fallen konservativ therapierte Patienten (unabhängig vom Malignitätsgrad) durch deutlich ansteigende Lebensqualität auf. Es lässt sich festhalten, dass bei primär gastrointestinalen Lymphomen sowohl mit operativem als auch konservativem Vorgehen hohe Remissionsraten erzielt werden können. Jedoch sind im Hinblick auf Organerhalt und die höhere post-therapeutische Lebensqualität die primäre Radio- und/oder Chemotherapie dem operativen Vorgehen vorzuziehen.
Die zentrale Rolle von B- Zellen in der Pathogenese und Therapie von Autoimmunerkrankungen hat in den letzten Jahren zu unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen geführt, B- Zellen direkt oder indirekt zu targetieren. Der bisher effektivste Ansatz stellt der monoklonale anti- CD20 Antikörper Rituximab dar. Nach Gabe von Rituximab kommt es zu einer passageren, in der Regel sechs bis neun Monate anhaltenden peripheren B- Zelldepletion. Die anti- CD20 vermittelte B- Zelldepletion stellt zwar ein vielversprechendes Therapieverfahren in der Behandlung der Rheumatoiden Arthritis dar, derzeit ist noch wenig über das Regenerationsverhalten von B- Zellen nach Therapie mit Rituximab bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit die B-Zellrepopulation insbesondere hinsichtlich der Modulation des Mutationsmusters des B- Zellrezeptors untersucht. Dazu wurde die VH4- Familie des Immunglobulinrezeptors- prospektiv vor und nach anti- CD20 vermittelter B- Zelldepletion analysiert. Bei drei Patienten (A-C) wurden die Ig-VH4 Gene aus genomischer DNA peripherer B- Zellen amplifiziert, subkloniert und sequenziert. Die Analyse erfolgte zu drei verschiedenen Zeitpunkten: Vor Therapie, in der frühen Regenerationsphase mit einem B- Zellanteil von 1% bis 1,3% im peripheren Blut und in der späten Regenerationsphase, zwei bis drei Monate nach der frühen Regenerationsphase Mini Gene wie VH4-34 und VH4-39, die in Verbindung mit Autoimmunität stehen, waren vor Einleitung der Therapie relativ überexprimiert. Die Behandlung mit Rituximab führte bei allen drei Patienten zu einer Veränderung des Repertoires der regenerierenden B- Zellen mit einer reduzierten Benutzung der VH4-39 Gene, außerdem bei Patient A zusätzlich der VH4-34 Gene. Tief greifende Veränderungen fanden sich während der frühen Regenerationsphase durch den Nachweis einer rezirkulierenden Population hochmutierter B- Zellen, die in einer durchgeführten Immunophänotypisierung mit spezifischen Oberflächenmarkdern als Plasmazellen identifiziert wurden. Da Plasmazellen kein CD20 Molekül exprimieren, werden sie durch eine anti-CD20 vermittelte Therapie nicht direkt eliminiert. Sie zirkulieren während der Phase der B- Zelldepletion aber auch nicht im peripheren Blut. Interessanterweise sind sie in der frühen Regenerationsphase in der Peripherie als erste mit hohem relativem Anteil nachweisbar. Daher wurde untersucht, ob auch Plasmazellen durch die Therapie moduliert werden, obwohl sie durch Rituximab nicht direkt targetiert werden. Hierfür wurden die Sequenzen mit hochmutiertem Ig- Rezeptor (>9 Mutationen/Sequenz) im Verlauf einer detaillierten Analyse zugeführt. Dabei wurde insbesondere das Mutationsmuster in RGYW/WRCY Hotspot Motiven und in den CDR- Regionen untersucht. Die Analyse der Mutationshäufigkeit in RGYW/WRCY Hotspot Motiven erlaubt eine Abschätzung, in wieweit die somatische Hypermutation der B- Zellen durch T- Zell abhängige Differenzierung erfolgte. Die als Plasmazellen identifizierten hochmutierten Sequenzen zeigten vor der Therapie Charakteristika einer aktiven Erkrankung mit einem verminderten Targeting der RGYW/WRCY Motive. Dagegen zeigte sich in den rezirkulierenden Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase ein zunehmendes Targeting der RGYW/WRCY Motive. Dies spricht für einen Repertoire Shift zu mehr T- Zell abhängigen B- Zell Mutationen. Ein Zustand, wie er bei Gesunden beobachtet wird. Um die Hypothese einer Rituximab- induzierten Modulation des Plasmazellkompartimentes weiter zu untermauern, wurde der R/S Quotient, d.h. das Verhältnis von Silent zu Replacement Mutationen in den hypervariablen Regionen (CDRs) der hochmutierten Plasmazell-Ig Sequenzen bestimmt. Interessanterweise fanden sich in der Regenerationsphase signifikant erhöhte R/S Ratios in den rezirkulierenden Plasmazellen.. Die signifikante Zunahme an Replacement Mutationen in den CDR- Regionen, welche sich in einer Zunahme des R/S Verhältnisses wiederspiegelt, kann als Entwicklung des Ig- Repertoires durch positive Antigenselektion interpretiert werden und weist somit eine Rituximab- induzierte Veränderung auf, wie man sie sonst bei gesunden Individuen findet. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass die transiente anti- CD20 vermittelte B- Zelldepletion auch zu einer indirekten Modulation des Plasmazellkompartimentes führt. Insbesondere werden postrekombinatorische Imprints des B- Zell Rezeptors, wie somatische Hypermutation und Antigen Selektion, verändert, die mit hoher Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von Autoimmunität bei der Rheumatoiden Arthritis eine Rolle spielen. Zusätzlich kann die Modulation des genetischen Imprints der Ig Rezeptoren bei der Rheumatoiden Arthritis eventuell als möglicher Biomarker entwickelt werden, um ein Ansprechen auf die Therapie vorherzusagen. Dies bedarf weiterer Untersuchungen, um tiefer greifende Einblicke in Prozesse zu erlangen, die durch zukünftige Therapien beeinflussbar werden.
HINTERGRUND: Langzeitnebenwirkungen der antiretroviralen Therapie werden u.a. auf mitochondriale Toxizität von NRTIs zurückgeführt, wobei es zu einer Dysfunktion der Atmungskette und nachgeschalteter Stoffwechselwege wie der de-novo-Pyrimidinsynthese kommen kann. Experimentell konnte gezeigt werden, dass das Pyrimidinnukleosid Uridin einige dieser Toxizitätseffekte reduzieren konnte. METHODIK: Nach Etablierung einer HPLC-Methodik zur Evaluation von Uridin im menschlichen Serum wurden Uridinspiegel von HIV-positiven Patienten mit Uridinspiegeln einer HIV-negativen Kontrollgruppe verglichen sowie mit Demografie, Nebenwirkungen bzw. Koerkrankungen, antiretroviraler Therapie und Therapiedauer korreliert. ERGEBNISSE: Die 182 HIV-Patienten wiesen signifikant niedrigere Uridinspiegel als die 30 Kontrollpersonen auf, blieben aber noch im physiologischen Normbereich gesunder Erwachsener. Demografische Faktoren sowie Marker der HIV-Infektion zeigten keine signifikante Korrelation mit Uridin. HIV-Patienten mit Begleiterkrankungen boten im Vergleich zu HIV-Patienten ohne Begleiterkrankungen signifikant verminderte Uridinspiegel. Bei Differenzierung nach den einzelnen Befunden zeigte sich, dass nur Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und chronischen Lebererkrankungen wie Steatosis Hepatis signifikant erniedrigte Spiegel aufwiesen. Im Vergleich von 4 HIV-Patientengruppen mit unterschiedlicher antiretroviraler Therapie verhielten sich die Uridinspiegel analog zur potenziellen mitochondrialen Toxizität des jeweiligen Therapieregimes. Die Patientengruppe mit dideoxy-NRTI-haltiger Therapie wies die niedrigsten Uridinplasmaspiegel auf und zeigte im Vergleich zur Patientenguppe ohne antiretrovirale Therapie signifikant erniedrigte Uridinplasmaspiegel. Mit zunehmender Therapiedauer zeigte sich bei der Therapiegruppe mit dideoxy-haltiger HAART abfallende, bei den anderen 3 Therapiegruppen konstante bis leicht ansteigende Spiegel. SCHLUSSFOLGERUNG: Bei HIV-positiven Patienten scheint die Einnahme von (di)deoxy-NRTIs sowie Koerkrankungen wie Fettleber und Diabetes mellitus Typ 2 mit signifikant niedrigeren Uridinspiegeln assoziiert zu sein. Ob eine Uridinsubstitution zur Vermeidung von NRTI-assoziierten Langzeitnebenwirkungen sinnvoll ist, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
Der vorliegenden retrospektiven Untersuchung zum Stellenwert der strukturierten am-bulanten Nachsorge in der Rezidiverkennung von aggressiven B-NHL liegen Patientendaten der Medizinischen Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg aus den Jahren 1991- 2003 zugrunde. Bei den eingeschlossenen 141 Patienten wurde im Zeitraum vom 01.01.1991 bis zum 31.12.2001 die Primärdiagnose eines aggressiven B-NHL ge-stellt und nach Erstlinientherapie mit Erreichen einer kompletten Remission die ambu-lante Nachsorge begonnen. Von den 35 ambulant diagnostizierten Rezidiven traten 46% innerhalb des ersten Jahres nach Beendigung der Therapie auf. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach Therapieende waren 92% der ambulant diagnostizierten Wiedererkrankungen aufgetreten. Auffallend ist, dass nur 51% der Rezidive anlässlich eines vereinbarten Termins im Rahmen des Nachsorgeschemas entdeckt wurden. Die übrigen Patienten erschienen aufgrund von Symptomen außerhalb des empfohlenen Schemas. Das Wahrnehmen von Symptomen durch den Patienten zählt somit zu den Bestandteilen einer erfolgreichen Nachsorge. In der vorliegenden Untersuchung wurde dies signifikant bestätigt. 72% der Rezidivpatien-ten berichteten über mindestens eines der Symptome: B-Symptomatik, Lymphknoten-schwellung, Infekten, Schmerzen an Lymphknotenstationen oder Juckreiz. Bei den ge-sunden Patienten fanden sich diese Symptome nur in 20% der Fälle. Die Patientenschu-lung sollte daher neben der Anamnese einen Schwerpunkt der Nachsorge darstellen. Bei Auftreten der oben genannten Symptome sollen sich die Patienten außerhalb der emp-fohlenen Nachsorgeintervalle vorstellen. Ebenso nahm die körperliche Untersuchung einen hohen Stellenwert in der Rezidiver-kennung ein. 20 der 35 Rezidivpatienten hatten einen auffälligen Untersuchungsbefund, davon in 15 Fällen (43%) vergrößert tastbare Lymphknoten. Eine Erhöhung der Laktatdehydrogenase (LDH) trat bei 10 der 35 Rezidivpatienten (29%) auf. Durch die Kombination aus Anamnese, körperlicher Untersuchung und LDH-Bestimmung wurden 34 von 35 Rezidivpatienten erkannt. Empfohlen werden kann aufgrund der analysierten Daten eine Nachsorgestruktur mit engmaschigen Kontrollen im Abstand von drei Monaten innerhalb des ersten Jahres nach Therapieende und darauf folgende halbjährliche Kontrollen für weitere vier Jahre. Die Sonographie, ein Routineverfahren der Nachsorge, zeigte sich in der vorliegenden Untersuchung als geeignetes Verfahren zur Bestätigung eines Rezidivs. Bei 28 von 30 untersuchten Rezidivpatienten wurde ein pathologischer Befund im Sinne eines Rezi-divs erhoben. Von der routinemäßigen Bildgebung mithilfe der Schnittbildverfahren CT oder MRT profitierte nur ein Patient, welcher ausschließlich durch die Bildgebung auf-fiel. Diese Verfahren sollten nicht routinemäßig, sondern erst bei Vorliegen auffälliger Befunde durchgeführt werden. Der Nutzen der strukturierten ambulanten Nachsorge scheint aufgrund der vorliegenden Arbeit nur begrenzt geeignet Rezidive zu erkennen, da 49% der Rezidive außerhalb der strukturierten Nachsorge diagnostiziert wurden. Sie bietet aber zugleich ein notwendi-ges Raster für die systematische Nachbetreuung der Patienten und sollte durch eine gründliche Patientenschulung ergänzt werden, um die Patienten frühzeitig auf suspekte Symptome aufmerksam zu machen. Ein weiteres Argument für die strukturierte Nach-sorge stellt die psychische Belastungssituation dar, in der sich die meisten Patienten nach der Therapie eines Lymphoms befinden. Die Patienten bekommen nicht nur früh-zeitig Gewissheit, wenn sie erneut erkranken, sondern erfahren auch Beruhigung und Bestätigung, wenn die Erkrankung nicht wieder aufgetreten ist.
1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Auftreten von Clostridium difficile Infektionen bei AML-Patienten in der medizinischen Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg zwischen Januar 2000 und Juni 2005 untersucht. Es wurden retrospektiv die Akten von 116 Patienten ausgewertet. Davon entwickelten 36 Patienten, als 31% mindestens einmal eine Infektion mit Clostridium difficile. Bei 329 verabreichten Zyklen Polychemotherapie kam es in 53 Fällen, also in 16% zu einer Infektion mit Clostridium difficile. In allen Fällen ging der Clostridium difficile Infektion zusätzlich zur Polychemotherpie auch eine Antibiotikatherapie voraus. Clostridium difficile Infektionen unabhängig von einer Antibiotikatherapie wurden nicht beobachtet. Insbesondere beim zweiten verabreichten Zyklus einer Chemotherapie kam es gehäuft zu Clostridium difficile Infektionen. Bei Patienten unter 60 Jahren kam es in 39% aller verabreichten Zyklen zu einer Clostridium difficile Infektion, bei Patienten, die älter waren als 60 Jahre, nur in 11%. Möglicherweise sind hier die intensiveren Chemotherapieschemata verantwortlich, die jüngeren Patienten verabreicht wird. Es konnten Schwankungen in der Inzidenz von Clostridium difficile in Abhängigkeit vom verwendeten Chemotherapieprotokoll festgestellt werden. Besonders deutlich zeigte sich dies beim Vergleich der Doppel-Induktion nach dem DA-Protokoll und der Induktion nach dem MAV-MAMAC Protokoll. Bei der Doppelinduktion nach dem DA-Protokolle kam es bei 15% der Patienten zu einer Clostridium difficile induzierten Diarrhö, bei Doppelinduktion nach dem MAV- MAMAC- Protokoll in 60% der Fälle. Rückfälle der Clostridium difficile Infektion stellen ein häufiges Problem dar. Bei einem Drittel der Patienten mit Clostridium difficile Infektion, die mehr als einen Zyklus Chemotherapie erhielten kam es zu einem erneuten Auftreten der Erkrankung. Die Inzidenz der Clostridium difficile Infektionen in den verschiedenen Jahren schwankte erheblich zwischen 4% und 32% der Fälle. Besonders auffällig war eine hohe Inzidenz im Jahr 2000. Dabei kann retrospektiv nicht mehr festgestellt werden, was die Ursache war. Möglicherweise handelte es sich hier um einen besonders virulenten Stamm. Eine weitere Ursache könnte sein, dass es im Jahr 2000 Probleme bei der Einhaltung der Hygienemaßnahmen gab.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Nachsorge von Patienten in erster kompletter Remission (CR) einer akuten myeloischen Leukämie (AML) Parameter gibt, deren Veränderung ein Rezidiv ankündigen und ob die Struktur des Nachsorgeprogramms geeignet ist, ein Rezidiv frühzeitig zu erkennen. Bei 29 Patienten der 52 analysierten Patienten kam es zu einem Rezidiv. Bei 48% dieser Patienten war der Rezidivverdacht bereits aufgrund klinischer Beschwerden wie Leistungsabfall und Dyspnoe oder durch ein pathologisches Blutbild bei der hausärztlichen Kontrolle zu stellen. Am Rezidivtermin zeigten alle Rezidivpatienten pathologische Veränderungen von LDH, Hämoglobin, Leuko- oder Thrombozyten. Der Rezidivverdacht wurde also nicht erst durch eine Knochenmarkpunktion gestellt. Für viele AML Patienten in erster CR sind regelmäßige Kontrolluntersuchungen beim Hausarzt ausreichend, eine Knochenmarkpunktion ist nicht routinemäßig erforderlich.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.
In dieser Arbeit sollen die funktionellen Zusammenhänge zwischen Integrinrezeptoren und myokardialer Hypertrophieentwicklung am Maus-Model nach aortic-banding untersucht werden. Durch den Einsatz eines Integrin-alphaV/Beta3 und alphaV/beta5-Inhibitors (EMD 270179 der Fa. Merck) konnten gezielt diese Integrinrezeptoren gehemmt werden. Mittels morphologischen, histologischen, immunhistochemischen, biochemischen und bildgebenden Verfahren konnten bekannte Signalwegskaskaden reproduziert und eben auch eine mangelhaft einsetzende Hypertrophieentwicklung unter Integrin-Blockade nachgewiesen werden. Innerhalb von 2-7 Tagen (Untersuchungszeitraum) setzte in der Gruppe der behandelten Tiere eine myokardiale Dilatation ein, die mit einer deulich eingeschränkten linksventrikulären Funktion einherging. Nahezu die Hälfte der Tiere verstarben konsekutiv, während die unbehandelten Tiere deutlich bessere Überlebenschancen zeigten. Ein zur transthorakalen Aortenkonstriktion vergleichbares Ereignis beim Menschen wäre eine langjährig bestehende, unbehandelte arterielle Hypertonie oder eine Aortenstenose. Beides sind jedoch Ereignisse, die in der Regel nicht derart akut einsetzen, sondern sich entwickeln. Demnach wäre ein möglicher Einsatz beim Menschen nach entsprechenden Studien zur Ermittlung des optimalen Therapie-Fensters zu diskutieren.