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Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization.
Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS.
Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites.
miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed.
In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices).
Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen.
Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation.
Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden.
A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ...
Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice
(2014)
Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells.
In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro.
The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals.
Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo.
Maintenance of tumor vasculature integrity is indispensable for tumor growth and thus affects tumor progression. Previous studies have identified platelets as major regulators of tumor vascular integrity, as their depletion selectively renders tumor vessels highly permeable, causing massive intratumoral hemorrhage. While these results establish platelets as potential targets for anti-tumor therapy, depletion is not a treatment option due to the essential role of platelets for hemostasis. This thesis demonstrates for the first time that functional inhibition of glycoprotein (GP) VI on the platelet surface rapidly induces tumor hemorrhage and diminishes tumor growth similar to complete platelet depletion but without inducing systemic bleeding complications. Both, the intratumoral bleeding and tumor growth arrest could be reverted by depletion of Ly6G+ cells confirming them to be responsible for the induction of bleeding and necrosis within the tumor. In addition, GPVI inhibition increased intra-tumoral accumulation of co-administered chemotherapeutic agents, thereby resulting in a profound anti-tumor effect. In summary, this thesis manifests platelet GPVI as a key regulator of vascular integrity specifically in growing tumors, serving as a potential basis for the development of anti-tumor strategies.
In the second part of this thesis, light is shed on the modulating role of bridging integrator 2 (BIN2) in platelet Ca2+ signaling. Stromal interaction molecule 1 (STIM1) mediated store-operated calcium entry (SOCE) is the major route of Ca2+ influx in platelets, triggered by inositol trisphosphate receptor (IP3R)-dependent Ca2+ store release. In this thesis, the BAR domain superfamily member BIN2 was identified as the first Ca2+ signaling modulator, interacting with both, STIM1 and IP3R in platelets. Deletion of BIN2 resulted in reduced Ca2+ store release and Ca2+ influx in response to all tested platelet agonists. These defects were a consequence of impaired IP3R function in combination with defective STIM1-mediated SOC channel activation, while Ca2+ store content and agonist-induced IP3 production were unaltered. These results establish BIN2 as a central regulator of platelet Ca2+ signaling.
The third part of this thesis focuses on the effect of the soluble neuronal guidance protein Sema7A on platelet function. Rosenberger et al. discovered that Sema7A cleavage from red blood cells increases the formation of platelet-neutrophil complexes, thereby reinforcing thrombo-inflammation in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). This thesis establishes soluble Sema7A as a stimulator of platelet thrombus formation via its interaction with platelet GPIbα, thereby reinforcing PNC formation. Thus, interfering with the GPIb-Sema7A interaction during MIRI represents a potential strategy to reduce cardiac damage and improve clinical outcome following MI.
Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden.
Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice
(2014)
Summary
Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches.
In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy.
Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke.
After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity.
Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden.
Platelets are continuously produced from megakaryocytes (MK) in the bone marrow by a cytoskeleton-driven process of which the molecular regulation is not fully understood.
As revealed in this thesis, MK/ platelet-specific Profilin1 (Pfn1) deficiency results in micro- thrombocytopenia, a hallmark of the Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) in humans, due to accelerated platelet turnover and premature platelet release into the bone marrow. Both Pfn1-deficient mouse platelets and platelets isolated from WAS patients contained abnormally organized and hyper-stable microtubules. These results reveal an unexpected function of Pfn1 as a regulator of microtubule organization and point to a previously unrecognized mechanism underlying the platelet formation defect in WAS patients.
In contrast, Twinfilin2a (Twf2a) was established as a central regulator of platelet reactivity and turnover. Twf2a-deficient mice revealed an age-dependent macrothrombocytopenia that could be explained by a markedly decreased platelet half-life, likely due to the pronounced hyper-reactivity of \(Twf2a^{-/-}\) platelets. The latter was characterized by sustained integrin acti- vation and thrombin generation in vitro that translated into accelerated thrombus formation in vivo. To further elucidate mechanisms of integrin activation, Rap1-GTP-interacting adaptor molecule (RIAM)-null mice were generated. Despite the proposed critical role of RIAM for platelet integrin activation, no alterations in this process could be found and it was concluded that RIAM is dispensable for the activation of β1 and β3 integrins, at least in platelets. These findings change the current mechanistic understanding of platelet integrin activation.
Outside-in signaling by integrins and other surface receptors was supposed to regulate MK migration, but also the temporal and spatial formation of proplatelet protrusions. In this the- sis, phospholipase D (PLD) was revealed as critical regulator of actin dynamics and podo- some formation in MKs. Hence, the unaltered platelet counts and production in \(Pld1/2^{-/-}\) mice and the absence of a premature platelet release in the bone marrow of \(Itga2^{-/-}\) mice question the role of podosomes in platelet production and raise the need to reconsider the proposed inhibitory signaling by α2β1 integrins on proplatelet formation.
Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) has been implicated as a downstream effector of the in- hibitory signals transmitted via α2β1 integrins. Besides Rho-GTPase signaling, also \(Mg^{2+}\) and transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) channel α-kinase are known regulators of NMMIIA activity. In this thesis, TRPM7 was identified as major regulator of \(Mg^{2+}\) homeostasis in MKs and platelets. Furthermore, decreased \([Mg^{2+}]_i\) led to deregulated NMMIIA activity and altered cytoskeletal dynamics that impaired thrombopoiesis and resulted in macrothrombocytopenia in humans and mice.
Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI.
This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF) immobilized on the exposed subendothelial extracellular matrix (ECM). The central importance of GPIb for platelet adhesion is well established, whereas GPV is generally considered to be of minor relevance for platelet physiology and thrombus formation. This study intended to clarify the relevance of this receptor during thrombus formation using Gp5-/- mice and mice with different double-deficiencies in GPV and in other platelet receptors. It was found that GPV and the collagen receptor integrin a2b1 have partially redundant functions in collagentriggered platelet aggregation. Further, it was revealed that GPV limits thrombus formation and impairs hemostasis in vivo. The data presented here demonstrate that the protective effect of GPVI-deficiency (another platelet collagen receptor) in arterial thrombosis and ischemic stroke depends on the expression of GPV. Moreover, it was demonstrated that lack of GPV restores the hemostatic function of mice lacking both GPVI and a2b1 or mice lacking GPVI and the C-type lectin receptor 2 (CLEC-2). Conclusively, GPV-depletion or blockade might have the potential to treat hemorrhagic disease states. ii) Platelets contain the two phospholipase (PL) D isoforms, PLD1 and PLD2, both of which presumably become activated upon platelet stimulation. However, the function of PLD in the process of platelet activation and aggregation has not been definitively explored. Thus, PLD-deficient mice were analyzed. Mice lacking PLD1 or PLD2 were viable, fertile and had normal platelet counts. PLD1 was found to be responsible for the inducible PLD-activity in platelets and to contribute to efficient integrin activation under static conditions. Moreover, flow adhesion experiments revealed that PLD1 is essential for efficient GPIb-mediated integrin activation. Consequently, Pld1-/- mice were protected from arterial thrombosis and ischemic brain infarction without affecting tail bleeding times. Hence, inhibition of PLD1 might be a novel approach for antithrombotic therapy. iii) Cellular activation of platelets or immune cells results in increased cytosolic calcium (Ca2+) levels. Store-operated calcium entry (SOCE) via the STIM1-Orai1 axis is the main route of Ca2+ entry downstream of immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) receptor stimulation in mast cells and T cells. However, the requirement of Ca2+-mobilization in Fcg receptor (FcgR)-signaling and the relevance of STIM2 for T cell SOCE have been unclear. To address these questions, genetically modified mice lacking central molecules of the SOCE machinery were analyzed. Ca2+-measurements revealed that both STIM isoforms contribute to Ca2+-mobilization downstream of T cell receptor activation. Additionally, it was found that FcgR stimulation results in SOCE and is mediated by STIM1 and probably Orai1. Animal models of immune thrombocytopenia (ITP) revealed that SOCE is essential for platelet clearance and that both STIM isoforms contribute to the pathology of ITP. Moreover, in this work it was also demonstrated that STIM1 and Orai1 are essential in IgG-mediated systemic anaphylaxis. STIM2 contributes to IgG-mediated, but not to IgE-mediated anaphylaxis. The data indicate that interference with SOCE might become a new strategy to prevent or treat IgG-dependent autoimmune diseases.
Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration serotonerger Antidepressiva und der Blutgerinnung
(2019)
Das Verordnungsvolumen von Antidepressiva in Deutschland hat sich in den letzten zehn Jahren etwa verdoppelt. Gleichzeitig liegen zahlreiche Untersuchungen über erhöhte Blutungstendenzen unter der Therapie mit serotonergen Antidepressiva vor. Die aktuelle Studienlage deutet darauf hin, dass es unter anderem über das serotonerge System zu Beeinflussungen der Thrombozyteneigenschaften und in Folge dessen zu Veränderungen der Blutgerinnung kommen könnte.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Zusammenhang zwischen der Serumkonzentration serotonerger Antidepressiva und der Blutgerinnung zu untersuchen. Im Gegensatz zur Dosis bietet die Serumkonzentration exakte Informationen über die tatsächlich wirkende Antidepressivamenge und berücksichtigt neben der Patientenadhärenz die interindividuelle Variabilität der pharmakokinetischen Eigenschaften. Die Beurteilung der Blutgerinnung erfolgte unter Zuhilfenahme von Gerinnungsparametern (Thrombozytenzahl, mittleres Plättchenvolumen, Quick, INR, partielle Thromboplastinzeit). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mit steigender Serumkonzentration Veränderungen der Blutgerinnung und in Folge dessen auch der Gerinnungsparameter entstehen können. Darüber hinaus sollte untersucht werden unter welchen Antidepressiva potentielle Veränderungen auftreten. Es wurden Antidepressiva unterschiedlicher Wirkungsgruppen analysiert: Amitriptylin, Doxepin, Es‑Citalopram, Mirtazapin und Venlafaxin. Besonders selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer standen auf Grund der aktuellen Studienlage im Verdacht Einfluss auf die Gerinnung zu nehmen. Um Antidepressiva spezifische Aussagen treffen zu können, war das Vorliegen einer antidepressiven Monotherapie grundlegendes Selektionskriterium. Alle potenziell gerinnungsbeeinflussenden sowie serotonerg wirkenden Arzneimittel wurden ausgeschlossen. Die Daten wurden retrospektiv erhoben und stammten von stationär therapierten Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie am Universitätsklinikum Würzburg.
Die Untersuchungen ergaben für das trizyklische Antidepressivum Amitriptylin signifikante Ergebnisse. Die interindividuelle Analyse zeigte signifikant positive Korrelationen zwischen der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) und dem Metabolitenspiegel (Nortriptylin‑Konzentration, rs=0,564; p=0,010, N=20) sowie dem Summenspiegel von Amitriptylin (Amitriptylin- und Nortriptylin‑Konzentration, rs=0,477; p=0,033, N=20). Darüber hinaus stellten sich im Rahmen der intraindividuellen Analyse signifikante Unterschiede zwischen der Thrombozytenzahl unter niedriger und hoher Amitriptylin‑Konzentration dar (Z= ‑2,867; p=0,004, N=45). Ergänzend wurde im Rahmen von explorativen Untersuchungen der Zusammenhang zwischen der verabreichten Dosis und der Serumkonzentration der Antidepressiva analysiert. Die Ergebnisse zeigten Schwankungen um den Faktor 3 bis 11, die im Vergleich zu anderen Studien geringer ausfielen.
Der Verdacht, dass besonders selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer einen erhöhten Einfluss auf die Gerinnungsparameter haben, wurde in der aktuellen Arbeit nicht bestätigt. Ebenso waren unter Doxepin, Mirtazapin und Venlafaxin keine Zusammenhänge zur Serumkonzentration zu beobachten. Die signifikanten Ergebnisse unter Amitriptylin lassen vermuten, dass nicht nur die Inhibition von Serotonintransportern, wie bei selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmern, sondern zusätzlich auch die Hemmung von Serotoninrezeptoren, wie dem 5‑HT2A‑Rezeptor, eine Rolle im Hinblick auf Veränderungen von Thrombozyteneigenschaften spielen. Dennoch lagen im Rahmen dieser Untersuchung 98% der Gerinnungsparameter aller analysierten Antidepressiva im Normbereich.
Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass das Risiko immer wieder berichteter Blutungskomplikationen unter der Behandlung mit Antidepressiva trotz zunehmender Verordnungszahlen überschaubar scheint. Entsprechend aktueller Publikationen ist vermutlich erst bei zusätzlicher Einnahme von nichtsteroidalen Antirheumatika sowie antikoagulativen Arzneimitteln von einem erhöhten Blutungsrisiko auszugehen. Besonders gastrointestinale Blutungen spielen bei Kombination dieser Medikamente auf Grund der gesteigerten Magensäuresekretion eine Rolle. Ob die Serumkonzentration der Antidepressiva bei entsprechender Komedikation ebenfalls eine Rolle im Hinblick auf Veränderungen der Gerinnungsparameter spielt, sollte im Rahmen weiterführender Längsschnittstudien genauer untersucht werden. Ergänzend wären Untersuchungen zur Klärung des Kausalzusammenhangs wünschenswert, um das Blutungsrisiko im Zusammenhang mit Antidepressiva in Zukunft weiter minimieren zu können.
Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis.
First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level.
Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice.
In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation.
Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation.
Der Einfluss der Proteasomhemmung durch Bortezomib auf die Aktivierbarkeit humaner Thrombozyten
(2023)
Bortezomib, ein selektiver und potenter Proteasominhibitor, wird experimentell in der Tumorzellforschung sowie therapeutisch in der Therapie des Multiplen Myeloms eingesetzt. Die Wirkung auf die Thrombozytenfunktion war bislang unzureichend untersucht. Daher evaluiert diese Studie die dosisabhängige Wirkung von Bortezomib auf die Viabilität, die Aggregation von gewaschenen Thrombozyten und auf aktivierende Signalwege in gewaschenen Thrombozyten.
Die Thrombozytenviabilität war bei hohen Bortezomibkonzentrationen von 100 - 200 µM vermindert. Passend dazu verminderten 100 - 200 µM Bortezomib die Phosphorylierung der ERK1/2 und der Akt/PKB in humanen Thrombozyten. Im Gegensatz dazu hatten diese hohen Bortezomibkonzentrationen keinen Einfluss auf das Niveau der p38 MAP Kinase-Phosphorylierung in aktivierten Thrombozyten. Die Thrombozytenaggregation, induziert durch hohe Konzentrationen von Kollagen oder TRAP-6, blieb unter 0,1 nM - 200 µM Bortezomib unverändert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Bortezomib weder die essenziellen, aktivierenden Signalwege noch die Initialisierung der Aggregation relevant beeinflusst. Das zeigt, dass diese Prozesse in Thrombozyten nicht abhängig von der Proteasomaktivität sind. Supramaximale Inhibierung des Proteasomsystems mit Bortezomibkonzentrationen von 100 µM oder mehr führen möglicherweise zu veränderter Thrombozytenreaktionsfähigkeit, welche unter Umständen durch unspezifische und potenziell toxische Effekte mit erniedrigter Zellviabilität verursacht werden.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.
Zum Nachweis einer interindividuellen Variabilität bei der Therapie mit Clopidogrel wurden in dieser Promotionsarbeit Patienten mit ausreichender Therapiedauer auf eine verbleibende Aktivierbarkeit der Thrombozyten untersucht. Hierfür wurde eine auf Phosphorylierung des Proteins VASP basierender Assay, der mittlerweile auch kommerziell verfügbar ist, eingesetzt. Dieser auf einer durchflusszytometrische Analyse beruhende Test zeigte bei 10 % der untersuchten Patienten eine Restaktivierbarkeit der Thrombozyten trotz ausreichender Thienopyridin-Einnahme. Die statistische Analyse erbrachte den Nachweis von zwei Untergruppen: Eine Untergruppe zeigte trotz Clopidogrel-Therapie eine fast normale Aktivierbarkeit der Thrombozyten („non-responder“), die andere zeigt eine teilweise Thrombozytenfunktionshemmung („low-responder“). In der statistischen Analyse wurde eine deutliche Signifikanz der Ergebnisse mittels Students-t-Test festgestellt. Aus zufällig ausgewählten Proben der „non-responder“ und der adäquat reagierenden Patienten konnte eine Veränderung intrazelluläre Signalwege nicht nachgewiesen werden. Nach Veröffentlichung der Gensequenz für den P2Y12 Rezeptor erfolgte die entsprechende Genanalyse bei diesen Patienten. Es konnten 2 stumme Polymophismen nachgewiesen werden, diese jedoch sowohl in der Gruppe der Responder als auch bei Low-/Non-Respondern. Somit wurde in dieser Promotionsarbeit das mittlerweile von verschiedenen Arbeitsgruppen diskutierte, bei etwa 10 % der Patienten auftretende Therapieversagen von Thienopyridinen bestätigt. Eine Genveränderung oder Änderungen intrazellulärer Signalwege konnte als molekulare Ursache nicht gezeigt werden.
Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury involves massive cytoskeletal re-organization, which is required for proper platelet function. Moreover, the cytoskeleton plays central roles in megakaryo- and thrombopoiesis. Thus, cytoskeletal protein aberrations can be the underlying reason for many pathological phenotypes. Although intensive research is carried out to identify the key players involved in cytoskeletal reorganization, the signaling cascades orchestrating these complex processes are still poorly understood. This thesis investigates the role of three actin-binding proteins, Coactosin-like (Cotl) 1, Profilin (Pfn) 1 and Thymosin (T) β4, in platelet formation and function using genetically modified mice.
ADF-H-containing proteins such as Twinfilin or Cofilin are well characterized as regulators of thrombopoesis and cytoskeletal reorganization. Although Cotl1 belongs to the ADF-H protein family, lack of Cotl1 did not affect platelet count or cytoskeletal dynamics. However, Cotl1-deficiency resulted in significant protection from arterial thrombus formation and ischemic stroke in vivo. Defective GPIb-vWF interactions and altered second wave mediator release present potential reasons for the beneficial effect of Cotl1-deficiency. These results reveal an unexpected function of Cotl1 as a regulator of thrombosis and hemostasis, establishing it as a potential target for a safe therapeutic therapy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke.
Recent studies showed that the organization of the circumferential actin cytoskeleton modulates calpain-mediated αIIbβ3 integrin closure, thereby also controlling αIIbβ3 integrin localization. The second part of this thesis identified the actin-sequestering protein Pfn1 as a central regulator of platelet integrin function as Pfn1-deficient platelets displayed almost abolished αIIbβ3 integrin signaling. This translated into a profound protection from arterial thrombus formation and prolonged tail bleeding times in vivo which was caused by enhanced calpain-dependent integrin closure. These findings further emphasize the importance of a functional actin cytoskeleton for intact platelet function in vitro and in vivo.
Tβ4 is a moonlighting protein, acting as one of the major actin-sequestering proteins in cells of higher eukaryotes and exerting various paracrine functions including anti-inflammatory, immunomodulatory and pro-angiogenic effects. Although excessively studied, its role for cytoskeletal dynamics, the distinction between endo- and exogenous protein function and its uptake and release mechanisms are still poorly understood. Constitutive Tβ4-deficiency resulted in thrombocytopenia accompanied by a largely diminished G-actin pool in platelets and divergent effects on platelet reactivity. Pre-incubation of platelets with recombinant Tβ4 will help to understand the function of endo- and exogenous protein, which is under current investigation.
Als Hämostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie lässt sich in die primäre (thrombozytäre) Hämostase, in die sekundäre (plasmatische) Hämostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Plättchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgefäßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und können mit anderen Immunzellen interagieren, über Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden können. Während diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, können sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, auslösen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerstörungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen könnten auf einer überhöhten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgefäße oder auf einer Änderung der lokalen Hämostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekundärmetabolite von A. fumigatus beruhen.
Um diese Änderung der Hämostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen), deren Überstände, sowie von proteolytisch aktivem Überstand und von verschiedenen Sekundärmetaboliten von A. fumigatus auf die sekundäre Hämostase und die Aggregation und Aktivität von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekundären Hämostase konnte für keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der primären Hämostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer Überstände konnte für Hyphen und ihren ankonzentrierten Überstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die möglicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zurückzuführen ist. Proteolytisch aktiver Überstand führte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abhängige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfläche, zum Teil aber auch auf GAG zurückzuführen sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte für Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivität nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivität der Thrombozyten, möglicherweise durch die Bildung von Disulfid-Brückenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht bestätigt, aber auch nicht vollständig wiederlegt werden konnte.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verstärkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erklären kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin könnten zudem für die beobachtete Gewebezerstörung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische Änderung der lokalen Hämostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu ermöglichen.
Das Verfahren der Hochdosischemotherapie mit nachfolgender autologer Stammzelltransplantation ist eine etablierte, gut untersuchte Therapieoption in der Behandlung hämatoonkologischer Erkrankungen. Die sich dabei entwickelnde Thrombozytopenie stellt einen der therapielimitierenden Faktoren dar, wobei sich hier große interindividuelle Unterschiede zeigen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche Einflussfaktoren auf die Regeneration der Thrombozytenzahlen nach Hochdosistherapie und autologer Transplantation zu untersuchen. Hierzu erfolgte eine retrospektive Untersuchung von 110 Patientendaten, die von 1994 bis 2003 an der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums behandelt wurden. Die Thrombozytenzahlen wurden vier Wochen, drei Monate und sechs Monate nach Transplantation dokumentiert, außerdem wurde die Dauer in Tagen bis zu dem Erreichen der beiden Thrombozytenschwellenwerte 10.000/µl und 20.000/µl untersucht. An potentiellen Einflussfaktoren gingen das Alter zum Zeitpunkt der Transplantation, der body mass index zum Zeitpunkt der Transplantation, das Geschlecht, das Vorhandensein einer vorausgegangenen Ganzkörperbestrahlung, das Vorhandensein einer Antibiotikagabe aufgrund einer transplantationsassoziierten Infektion, die Aplasiedauer, die Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, die Anzahl der transfundierten colony forming units (CFUs), die Anzahl der transfundierten blood forming units (BFUs), das Vorliegen eines Rezidivs und der Thrombozytenausgangswert vor Hochdosistherapie in die Analyse ein. An statistischen Testverfahren wurde der Mann-Whitney-U-Test, der Kruskal-Wallis-Test und der Korrelationskoeffizient nach Spearman verwendet, bei nachgewiesenem potentiellen Zusammenhang erfolgte eine Quantifizierung mittels multipler Regressionsanalysen. Anhand der beiden nichtparametrischen Testverfahren und der Bestimmung des Korrelationskoeffizienten nach Spearman konnte gezeigt werden, dass für die Parameter „Ausgangswert der Thrombozyten vor Hochdosistherapie“, „Dauer der Aplasie“ und „Vorliegen einer Ganzkörperbestrahlung“ ein systematischer Zusammenhang zu den Thrombozytenwerten nach vier Wochen, drei Monaten bzw. sechs Monaten vorliegt. An den beiden Schwellenwerten „Dauer bis Thrombozytenzahl 10.000/µl“ und „Dauer bis Thrombozytenzahl 20.000/µl“ galt das für die Variablen „Dauer der Aplasie“, „Vorhandensein einer Antibiotikatherapie“ und „Geschlecht“. Für die restlichen Parameter konnte keine signifikante Korrelation zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden, was insbesondere für Anzahl der transfundierten CD34+-Zellen, CFUs bzw. BFUs überraschte und anhand klinischer Vorüberlegungen nicht zu erwarten war. Mit Hilfe der oben genannten Parameter, für die ein nichtzufälliger Zusammenhang zu den Thrombozytenzahlen gezeigt werden konnte, erfolgten zu den drei Messpunkten und den zwei Schwellenwerten separate multiple Regressionsanalysen. Im Ergebnis konnten fünf Gleichungen formuliert werden, die, nach Einsetzen der Prädiktoren „Dauer der Aplasie“, „Thrombozytenausgangswert vor Transplantation“ und „Geschlecht“ eine Prognose der Thrombozytenzahlen zu den entsprechenden Zeitpunkten und Zielwerten ermöglichen. Ein möglicher klinischer Einsatz dieser Ergebnisse wäre die Identifikation von Risiko- und Hochrisikogruppen im Vorfeld einer Hochdosischemotherapie und autologer Stammzelltransplantation anhand prognostizierter Thrombozytenwerte. Dies würde ein angepasstes therapeutisches und diagnostisches Vorgehen ermöglichen, wodurch die Sicherheit des Verfahrens und der Krankheitsverlauf verbessert werden könnten.