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Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.
Als Hilfsstoffe in der Arzneimittelentwicklung können Cyclodextrine und ihre Derivate aufgrund der Fähigkeit zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit organischen Molekülen zu unterschiedlichsten Zwecken verwendet werden. Ein Verständnis aller Einflussfaktoren auf die Komplexbildung wäre von großem Wert, weil man so gegebenenfalls vorab entscheiden könnte, ob ein Einsatz von Cyclodextrinen überhaupt in Betracht käme, und wenn ja, welches Cyclodextrin den beabsichtigten Effekt brächte. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe verschiedener Methoden Informationen zu den Einschlusskomplexen gesammelt, die natürliche Cyclodextrine mit einer Reihe typischer Arzneistoffmoleküle bilden. Als Modellsubstanzen wurden die Sulfonamide Sulfadiazin, Sulfadimidin, Sulfafurazol, Sulfaguanidin, Sulfamerazin, Sulfameter, Sulfamethoxazol, Sulfanilamid und Sulfathiazol gewählt. Aufgrund ihrer Molekülgröße bilden die gewählten Gäste in wässriger Lösung bevorzugt mit dem siebengliedrigen β-Cyclodextrin Komplexe, die Wechselwirkungen sind im Vergleich mit anderen Gastmolekülen jedoch relativ schwach. Im Rahmen von Löslichkeitsstudien wurden verschiedene Einflüsse (pH, Temperatur) auf die Komplexbildung in Lösung untersucht. Mit Hilfe von Van’t Hoff Plots wurden die thermodynamischen Größen der Komplexbildung bestimmt, wo das Phänomen der Enthalpie-Entropie-Kompensation beobachtet werden konnte. Die Stöchiometrie der Komplexe wurde unter anderem in Job’s Plots mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Komplexbildung geht im Fall der Sulfonamide meist nicht nur mit einer Löslichkeitssteigerung des Gastes, sondern auch des nur eingeschränkt wasserlöslichen β-Cyclodextrins einher. Dieser Effekt wurde bei verschiedenen pH-Werten quantifiziert und tritt bei allen Gastmolekülen, mit Ausnahme von Sulfathiazol, in vergleichbarem Umfang auf. Unter Ausnutzung dieses Phänomens kann je nach Gast eine Konzentration des Wirtes in Lösung erreicht werden, die ein Vielfaches seiner intrinsischen Löslichkeit beträgt. Sowohl in Lösung als auch im Feststoff wurde die Struktur der Einschlusskomplexe mit spektroskopischen Verfahren untersucht. ROESY-Spektren zeigten, dass die chemisch sehr ähnlichen Gastmoleküle teilweise erheblich von einander abweichende Positionen und Orientierungen in der Kavität des Cyclodextrins einnehmen. FTIR-Spektren fester Komplexzubereitungen unterstützen die detaillierteren NMR-Ergebnisse für die meisten Gäste. Ergänzend wurden mit Hilfe von molekularmechanischen Methoden theoretisch plausible Komplexstrukturen erstellt. Dabei wurde die Flexibilität der Cyclodextrinmoleküle und das mögliche Auftreten eines induced-fit durch die Generierung verschiedenartiger Konformere des β-Cyclodextrins in einer Molekulardynamikstudie berücksichtigt. In Dockingstudien (Autodock 3.0) wurde nach dem Bindungsmodus gesucht. Unter den Versuchsbedingungen dominieren Orientierungen, bei denen die aromatische Aminogruppe und die schwefelgebundenen Sauerstoffatome mit den Hydroxylgruppen des Wirtes Wasserstoffbrückenbindungen aufbauen können. Die resultierende Störung der intra- und intermolekularen Wechselwirkungen des Cyclodextrins stellt eine mögliche Erklärung der synergistischen Löslichkeitseffekte zwischen Wirt und Gast dar. Die gewonnenen Daten stellen eine Grundlage zur Charakterisierung der Komplexbildung von Sulfonamiden mit natürlichen Cyclodextrinen dar. Alle Modellsubstanzen wurden mit denselben Methoden untersucht, was eine vergleichende Betrachtung ermöglicht. Insgesamt wurde durch die Betrachtung einer so großen Gruppe an Modellsubstanzen ähnlicher chemischer Eigenschaften und Molekülstruktur ein Eindruck gewonnen, wie stark die Vorgänge bei der Komplexbildung mit Cyclodextrinen schon innerhalb einer relativ homogenen Gruppe variieren können. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist zu folgern, dass Vorhersagen zur Komplexbildung mit Cyclodextrinen anhand von Untersuchungen mit vergleichbaren Modellsubstanzen nicht endgültig zu treffen sind, sondern immer von einem vom Gastmolekül abhängigen Einzelfall auszugehen ist.
Die Wasserlöslichkeit von Wirkstoffen ist von elementarer Bedeutung für deren pharmazeutische Verwendung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Ansatz der thermodynamischen Betrachtung des Lösungsprozesses von einfachen Modellsubstanzen auf pharmazeutisch relevante Substanzen aus der Gruppe der Phenylethylamine übertragen und entsprechend erweitert. Der Lösungsprozess wurde auf Grundlage des Satzes von Hess in Ersatzschritte aufgeteilt, die dann mittels kalorimetrischer Bestimmung, quantenchemischen Rechnungen und MD-Simulation bestimmt wurden, um die limitierenden Faktoren der Löslichkeit zu beschreiben und so gezielte Ansätze für die Löslichkeitsverbesserung finden zu können. Der Lösungsprozess wurde zum einen durch die Schritte Sublimation und Solvatation und zum anderen durch Schmelzen und Mischen beschrieben. Für die einzelnen Schritte sind die thermodynamischen Größen Enthalpie, Entropie und Freie Enthalpie bestimmt worden. Dies war zum Teil experimentell mithilfe von kalorimetrischen Messungen möglich, andere Größen sind mit dem semiempirischen Solvatationsprogramm AMSOL oder mit COSMOtherm berechnet worden. Die so gewonnenen thermodynamischen Größen geben Aufschluss über das Lösungsverhalten der untersuchten Substanzen, die zum Teil trotz augenscheinlich hydrophilen Merkmalen schlecht löslich in Wasser sind. Zusätzlich wurden mit Hilfe von MD-Simulationen mit dem Programm AMBER die inter- und intramolekularen Wechselwirkungsmöglichkeiten untersucht. Die Ausbildung intermolekularer Wasserstoffbrückenbindungen mit Wasser wurde mit Radialen-Dichteverteilungs-Funktionen (RDF) analysiert. Die Möglichkeit der Ausbildung von intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen und deren Einfluss auf das Lösungsverhalten wurde über die Bindungsabstände und der Darstellung der polaren Oberflächen bestimmt.
The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs.
Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.
Die Fließfähigkeit eines pharmazeutischen Schüttguts spielt insbesondere bei der Herstellung von volumendosierten Arzneiformen, wie beispielsweise Tabletten, eine große Rolle. Häufig kommen deshalb sogenannte Fließregulierungsmittel zum Einsatz, um eine ausreichende Fließfähigkeit zu gewährleisten. Der Prozess der Fließregulierung kann mit einer Abnahme der van der Waals Kräfte zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln beschrieben werden. Diese Reduktion der Haftkraft beruht auf der Anlagerung von Adsorbaten des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Trägerpartikel. Im Rahmen der Arbeit sollten sowohl die Einflussfaktoren des Schüttguts als auch die des Fließregulierungsmittels auf den Prozess der Fließregulierung geprüft werden. Es wurde gezeigt, dass die Morphologie eines Schüttguts großen Einfluss auf den Prozess der Fließregulierung besitzt. Je glatter die Oberfläche eines Schüttguts ist, desto weniger Fließregulierungsmittel wird ungenutzt eingelagert. Es steht demzufolge mehr Fließregulierungsmittel als Abstandshalter zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln zur Verfügung, was wiederum zu einer Reduktion der van der Waals Kräfte und somit zur Fließverbesserung führt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Beurteilung des Einflusses der Primärpartikelgröße eines Fließregulierungsmittels auf seine fließregulierende Potenz. Hierzu wurden Kieselsäurenanopartikel synthetisiert, die sich lediglich in ihren Primärpartikelgrößen unterscheiden. Mit Hilfe des Sol-Gel-Prozesses innerhalb einer Mikroemulsion wurden prozesssicher diskrete, sphärische und einheitliche Kieselsäurenanopartikel in einem Größenbereich von 8 nm bis 100 nm erhalten. Um den Einfluss der Primärpartikelgröße zu prüfen, wurden die Schüttgüter Maisstärke und Lactose mit den synthetisierten Kieselsäuren versetzt und in einem Turbula-Mischer gemischt. Die Beurteilung der Potenz der Fließregulierungsmittel in Kombination mit dem jeweiligen Schüttgut erfolgte mittels Messungen am Zugspannungstester. Für beide Schüttgüter wurde eine eindeutige Korrelation zwischen der Primärpartikelgröße und der Potenz des Fließregulierungsmittels festgestellt, wobei je nach Schüttgutmorphologie unterschiedliche Ergebnisse für die optimale Primärpartikelgröße des Fließregulierungsmittels erhalten wurden. Die Auswahl eines Fließregulierungsmittels sollte demnach unter Beachtung seiner Primärpartikelgröße in Anpassung an die Schüttgutbeschaffenheit erfolgen. Somit kann der Fließregulierungsprozess zukünftig systematischer gestaltet werden.
Stachys officinalis galt von der Antike bis zur frühen Neuzeit als wichtiges Phy-topharmakon. Zu den bedeutendsten Indikationen zählen die Anwendung bei Er-krankungen der Atemwege, des Gastrointestinaltrakts, der Harnwege und der Ein-satz als Analgetikum bei Schmerzen verschiedenster Art. Über den Zeitraum von fast 1800 Jahren zählte die Pflanze fest zum Arzneischatz. Erst Ende des 18. Jahrhunderts nahm ihre Bedeutung als Arzneimittel ab. Mit dem Beginn des 20. Jahrhundert verschwand sie fast vollständig aus der Phytotherapie. Heute wird sie nur noch selten im Bereich der homöopathischen Medizin oder volksheilkundlich eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird Stachys officinalis durch ihre 2000 jährige Ge-schichte als Arzneipflanze begleitet. Dabei werden die Indikationen verschiedener Quellen mit aktuellem pharmazeutischem Wissen verglichen und beurteilt. Durch diese Auswertung wird geklärt, ob die jeweiligen Indikationsnennungen pharma-zeutisch nachvollziehbar sind oder nicht. Als Vergleichsweke dienen Hagers En-zyklopädie der Arzneistoffe und Drogen´ und Dr. Duke´s Phytochemical and Ethnobotanical Databases´. , Die inhaltsstoffbezogenen Angaben dieser Wer-ke werden durch weitere aktuelle pharmazeutische Erkenntnisse über die phar-makologischen Eigenschaften der Pflanzeninhaltsstoffe von Stachys officinalis ergänzt. Auf Grundlage der zugeordneten Pflanzeninhaltsstoffe und ihrer individu-ellen Wirkungen wird die Plausibilität der Indikationsangaben der Quellen unter-sucht. Im Rahmen dieser Arbeit werden die Indikationsnennungen von 34 Kräuterbü-chern, Lexika und anderer Quellen betrachtet. Dabei werden die vielfältigen Indi-kationsnennungen zu 142 normierten Indikationen zusammengefasst und ausge-wertet. Unter Berücksichtigung der Angaben beider oben genannter Vergleichs-werke erscheinen 59% der 142 normierten Indikationen für Stachys officinalis plausibel und sind mit der Anwesenheit definierter Pflanzeninhaltsstoffe zu erklä-ren. Es wird deutlich, dass viele Nennungen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Atemwege und der Leber betreffen. Die analgetischen Indikationsangaben sind wenig einheitlich, betreffen aber häufig Schmerzen des Kopfes und des Be-wegungsapparats. Zusammengefasst haben die verschiedenen analgetischen Indikationsangaben allerdings einen bemerkenswert hohen Anteil von 11% an den insgesamt 801 Indikationsnennungen. Die vorliegende Arbeit gibt 13 Hauptindikationen für Stachys officinalis an. Diese sind mit Ausnahme der Indikationen Bei Milzerkrankungen´ und Bei Epilepsie´ durch die Wirkungen benannter Pflanzeninhaltsstoffe nachzuvollziehen und phar-mazeutisch plausibel. Es gelingt, aus der Fülle der Indikationsnennungen der his-torischen Quellen die meistgenannten belegbaren Anwendungen hervorzuheben. Die Untersuchung der Überlieferungsgeschichte macht deutlich, dass die antiken Autoren, wie zum Beispiel Dioskurides und Plinius, einen großen Einfluss auf die Indikationsangaben von Stachys officinalis haben. Viele spätere Werke orientieren sich an diesen antiken Quellen und nehmen deren Indikationsangaben auf. Ab dem 18. Jahrhundert nimmt der Umfang der Beschreibungen von Stachys officina-lis und ihre Bedeutung als Phytopharmakon deutlich ab. Auf Grund der hohen Plausibilität der 13 Hauptindikationen sowie der analgeti-schen Anwendungen scheint es nicht gerechtfertigt, dass Stachys officinalis voll-ständig aus dem Arzneischatz verschwunden ist.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Suche nach neuen Leitstrukturen im Bereich der 4-Chinolone mit dem Verfahren der Random Chemistry. Die zugrunde liegende Idee hinter diesem Verfahren besteht darin, neue, potentiell wirksamere Strukturen durch die zufällige Erzeugung einer Substanzbibliothek zu erhalten. Die Substanzbibliothek entsteht dabei durch die Kombination bzw. Reaktion einer mäßig aktiven Ausgangsverbindung mit einem Initiator, der eine Zufallsreaktion in Gang setzt. Vorangegangene Untersuchungen dazu belegten, dass bei der Nutzung von γ-Strahlen als auslösende Spezies vornehmlich durch Radiolyse des Lösungsmittels erzeugte Radikale für die Bildung neuartiger Substanzen verantwortlich waren. Diese als Initiator dienenden Radikale können auch mit herkömmlichen Radikalstartern wie dem Fentons Reagenz erzeugt werden. Fentons Reagenz erweist sich dabei als deutlich kostengünstigere und einfacher zu handhabende Alternative, die ohne jeglichen technischen Aufwand genutzt werden kann. Durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid und Eisen(II)-Ionen entstehen Hydroxylradikale, die als hochreaktive Spezies durch die Addition an Doppelbindungen oder durch die Abstraktion von Wasserstoffradikalen und die dadurch ausgelösten Sekundärreaktionen eine Vielzahl neuer Verbindungen erzeugen. Zur Leitstruktursuche wurden als Ausgangssubstanzen zum einen ein Vertreter der 6-Fluor-7-(piperazin-1-yl)-chinolone (1) und zum anderen das 4-Chinolon-Grundgerüst (2) gewählt, um sowohl den Einfluss möglicher Strukturvariationen am Chinolongrundkörper als auch an möglichen Substituenten zu ermitteln. Aus den nach der Umsetzung mit Fentons Reagenz entstandenen Substanzbibliotheken konnten zunächst Fraktionen erhalten werden, die bei der Testung gegen Trypanosoma brucei brucei Aktivitäten mit geringeren IC50-Werten als die Ausgangschinolone zeigten. Die Strukturen der mittels HPLC isolierten Reinsubstanzen wurden aufgeklärt und ihre biologische Wirkung ermittelt. Auf diese Weise konnten ein Chinolonderivat mit N-(2-Aminoethyl)formamid-Rest in Position 7 (Frk1-2c) sowie ein Derivat mit (2-((Methyl-amino)methoxy)ethyl)amino-Rest in Position 7 und einer Hydroxylgruppe in Position 6 (Frk1-1c) identifiziert werden, die eine antitrypanosomale Aktivität mit einem IC50-Wert von 20.69 μM bzw. 17.29 μM aufweisen. Neusynthetisierte Chinolone mit einem amidofunktionalisiertem Piperazinring in Position 7 zeigten eine noch bessere Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei, welche durch Amidierung der Carbonsäure in 3-Stellung noch weiter gesteigert werden konnte. Die Suche nach neuen Leitstrukturen mit Hilfe von Fentons Reagenz offenbarte, dass ein Großteil der in den Substanzbibliotheken gebildeten neuen Strukturen literaturbekannten Metaboliten der Fluorchinolone ähnelt. Da annähernd 50% der möglichen Wirkstoffkandidaten an einer zu geringen Bioverfügbarkeit oder aufgrund ihrer toxischen Metabolite scheitern, ist es sinnvoll bereits in einem möglichst frühen Forschungsstadium auch Parameter wie Resorption, Distribution, Metabolismus, Elimination und Toxikologie (ADMET-Parameter) einer Substanz zu berücksichtigen bzw. zu ermitteln. Deshalb wurde in einem weiteren Teil dieser Arbeit untersucht, ob Fentons Reagenz zur Erzeugung des metabolischen Profils neuer biologisch aktiver Substanzen dienen kann, um damit frühzeitig auch auf mögliche Toxizitäten der Metabolite einer Substanz schließen zu können. Dazu wurden die drei bekannten Antiinfektiva, Cinoxacin, Ciprofloxacin und Linezolid mit Fentons Reagenz umgesetzt und die entstandenen Substanzbibliotheken nach literaturbekannten Metaboliten der jeweiligen Ausgangssubstanz gescreent. Bei einer ausreichenden Löslichkeit der Ausgangssubstanz konnten so vor allem die Metabolite erzeugt werden, die durch Hydroxylierung, Oxidation oder Hydrolyse auch bei der Verstoffwechslung durch Cytochrom-P450 erhalten werden. Da der Nachweis der Bildung literaturbekannter Metabolite durch Fentons Reagenz gelang, ist es nun möglich, einen Teil der potenziellen Metabolite neuer biologisch aktiver Substanzen bereits im Vorfeld, ohne die Nutzung von humanem Lebergewebe zu identifizieren.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen.
Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind.
Four new tetromycin derivatives, tetromycins 1-4 and a previously known one, tetromycin B (5) were isolated from Streptomyces axinellae Pol001(T) cultivated from the Mediterranean sponge Axinella polypoides. Structures were assigned using extensive 1D and 2D NMR spectroscopy as well as HRESIMS analysis. The compounds were tested for antiparasitic activities against Leishmania major and Trypanosoma brucei, and for protease inhibition against several cysteine proteases such as falcipain, rhodesain, cathepsin L, cathepsin B, and viral proteases SARS-CoV M(pro), and PL(pro). The compounds showed antiparasitic activities against T. brucei and time-dependent inhibition of cathepsin L-like proteases with K(i) values in the low micromolar range.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese von Liganden der Melatonin-Rezeptoren (MR). Die zwei humanen MR-Subtypen, MT1 und MT2, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Als „Schlafhormon“ wirkt es schlafinduzierend und vermittelt den circadianen Rhythmus. Zum genauen Verständnis der physiologischen Funktionen der MT1- und MT2-Rezeptoren ist die Verfügbarkeit von subtypselektiven MR-Liganden unentbehrlich. Zum Design von MT2-selektiven MR-Liganden modifizierte man die Melatonin-Grundstruktur durch formale Substitution in 2-Stellung, z.B. mit dem 2-Methylen-N-methyl-anilin- oder 2-Methylen-1´-indol-Rest. Weiterhin wurden trizyklische Derivate mit 1,2,3,4-Tetrahydro-pyrazino[1,2-a]indol- oder 2,3,4,5-Tetrahydro-1H-[1,4]diazepino[1,2-a]indol-Grundgerüst hergestellt. Das Synthesekonzept für dieses Teilprojekt basierte auf dem Synthesebaustein 3-Cyanomethyl-5-methoxy-1H-indol-2-carbonsäure. Da bislang nur wenige MT1-selektive MR-Liganden bekannt sind, wurde zur Untersuchung der Voraussetzung für MT1-Selektivität, die 5-Methoxygruppe von Melatonin formal durch Phenylalkyloxy-Reste verschiedener Kettenlängen substituiert. Die Synthese der Derivate erfolgte ausgehend von N-Acetylserotonin. Als Referenzverbindung wurde der bis heute MT1-selektivste MR-Antagonist (Descamps-Francois et al. 2003) hergestellt. Zu dessen Synthese benötigte man Agomelatin als Ausgangsverbindung. Eine neuartige vierstufige Route zu Agomelatin wurde daher entwickelt. Die Testung der Referenzverbindung ergab eine drastische Abweichung vom Literaturwert, da diese als nahezu unselektiv getestet wurde. Unter den O-Phenylalkyl-N-Acetylserotonin-Derivaten wurden zwei Verbindungen mit einer 11-fachen MT1-Selektivität getestet. Zur Absicherung der Reinheit wurden die Verbindungen mit RP-HPLC untersucht. Schließlich wurden noch melatoninerge Dimere mit einem 1-1´, 1-2´ und 5-5´ Verknüpfungsmuster hergestellt.
Die zunehmende Entstehung von Resistenzen macht die Entwicklung neuer potenter Wirkstoffe zur Therapie von Infektionskrankheiten immer wichtiger. Dieser Aufgabe stellt sich auch der interdisziplinär aufgebaute SFB 630, in den sich die vorliegende Arbeit eingliedert. Innerhalb des SFBs wurden Isochinolinalkaloid-Derivate (IQs) synthetisiert, die aktiv gegen verschiedene Mikroorganismen sind. Bioinformatische Modellierungen bilden die für den jeweiligen Mikroorganismus spezifischen Stoffwechselwege ab. In Netzwerkanalysen können Änderungen metabolischer Flüsse durch pharmakologisch aktive Substanzen vorhergesagt werden. Gemeinsam mit bioinformatischen Modellen liefern die Metabolommessungen Hinweise auf mögliche Wirkmechanismen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene analytische Methoden etabliert, um antiinfektive Wirkungen dieser verheißungsvollen Leitstrukturen auf das Metabolom verschiedener Mikroorganismen zu untersuchen. Die aus den Metabolommessungen erhaltenen Daten fließen in diese Modelle ein und tragen zu deren Optimierung bei. Die Mikroorganismen wurden für die Metabolomanalysen mit aktiven IQs (für S. aureus und C. albicans GB-AP-143, für L. major GB-AP-304) inkubiert. Bei C. albicans erfolgte die Probennahme zu unterschiedlichen Zeitpunkten (lag-, log-, stationäre Phase), um auch die Zeitabhängigkeit der Effekte zu untersuchen. Zusätzlich dienten bei C. albicans als Kontrollen neben parallel angesetzten Zellkulturen ohne Inhibitor, auch Zellkulturen, denen das Lösungsmittel DMSO zugegeben wurde. Es wurden Extraktionsmethoden für die betreffenden Metabolite der hier untersuchten Mikroorganismen (S. aureus, C. albicans, L. major) etabliert. Dabei lag der Fokus auf polaren Metaboliten, da bioinformatische Modellierungen für die Effekte der IQs Änderungen vor allem im Purin- und Pyrimidinstoffwechsel der Mikroorganismen vorhersagten. Zur Analyse des Nukleotidstoffwechsels wurde eine ionenpaarchromatographische HPLC-Methode entwickelt und optimiert. Mit dieser Methode konnten Nicotinamidderivate und Nukleotide des Purin- und Pyrimidinstoffwechsels in Zellextrakten von S. aureus, C. albicans und L. major quantifiziert werden. Für eine Analyse des Wirkmechanismus von GB-AP-143 wurde die Zusammensetzung des Metaboloms von C. albicans mittels einer GC/MS-Methode bestimmt. Nach einer Derivatisierung des Extrakts mit Methoxyamin-HCl und MSTFA konnten in einem Lauf zugleich Target- und Fingerprintanalytik durchgeführt werden. Die Auswertung der Targetanalytik fand unter Anwendung der NIST-Datenbank und Vermessung von Standards statt. Hierbei konnten vor allem Aminosäuren quantitativ erfasst werden. Der Fingerprint wurde durch Einsatz multivariater statistischer Verfahren ausgewertet. Die Daten für die mit GB AP 143 behandelten S. aureus und die mit GB AP 304 behandelten L. major-Promastigoten liefern Hinweise auf eine Wirkung der IQs auf den Komplex-I der mitochondrialen Atmungskette. Für die Behandlung der C. albicans-Kulturen mit GB-AP-143 konnten komplexe Änderungen im Nukleotid- und Aminosäurestoffwechsel gemessen werden. So beeinflusste bereits der Zeitpunkt der Probennahme (lag-, log- oder stationäre Wachstumsphase) die Zusammensetzung des Metaboloms und auch das Lösungsmittel, das für die IQs verwendet wurde, verursachte komplexe Änderungen im Metabolom von C. albicans. Zusätzlich wurden Nukleotid- und Aminosäurekonzentrationen Fluconazol-resistenter C. albicans-Mutanten (TAC, UPC und MRR) untersucht. Im Nukleotidstoffwechsel waren sowohl Konzentrationssteigerungen als auch ein Absinken der Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp zu verzeichnen. Der Aminosäurestoffwechsel zeigte insgesamt einen verminderten Gehalt an Aminosäuren der Mutanten gegenüber dem Wildtyp. Da GB-AP-143 auch Aktivität gegen diese Mutanten zeigte, wurde exemplarisch die MRR-Mutante mit GB-AP-143 inkubiert, um zu untersuchen, ob die durch GB-AP-143 hervorgerufenen Änderungen im Nukleotid- und Aminosäurestoffwechsel ähnlich zu denen des Wildtyps sind. Es konnten im Nukleotidstoffwechsel gegenläufige Effekte für die Inkubation von GB-AP-143 des Wildtyps und der Mutante verzeichnet werden. Die Daten aus den HPLC/UV- und GC/MS-Messungen werden von der Bioinformatik zur Optimierung der verwendeten Modelle genutzt, um auf diese Weise die Wirkmechanismen der IQs besser modellieren zu können. Da das Cytochrom-P-450-Enzymsystem am Metabolismus von etwa 95 % aller Arzneistoffe beteiligt ist, wurden die Effekte ausgewählter IQs auf die sechs wichtigsten arzneistoffmetabolisierenden Enzyme (CYP1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 und 3A4) mit Hilfe eines bereits etablierten CYP-Assays analysiert und näher charakterisiert. Im CYP-Assay zeigte sich für drei IQs eine CYP2D6-Hemmung. Die ausgeprägte CYP2D6-selektive Hemmung von GB-AP-110 ergab einen IC50-Wert von nur 109 nM. Die Charakterisierung der Hemmung ergab einen reversiblen, kompetitiven Inhibitionsmechanismus.
Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs
(2011)
Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.
Over the past decades, awareness has increased of multiple health-promoting effects of diets rich in anthocyanins and proanthocyanidins and, specifically, of these compounds’ potential for conferring neuroprotection. The present study compiles evidence obtained in vitro that expands our understanding of anthocyanin and proanthocyanidin functionalities at multiple levels. Firstly, anthocyanin and anthocyanidin bioavailability was addressed using a combination of ATPase assays, dye extrusion assays and vesicular transport assays. This approach highlights the contribution made by efflux transporters MDR1 and BCRP to the absorption of berry polyphenols and to their distribution to target tissues including the central nervous system. All test compounds interacted with the BCRP transporter in vitro, seven emerged as potential BCRP substrates and 12 as potential inhibitors of BCRP. Two anthocyanidins, malvidin and petunidin, exhibited bimodal activities, serving as BCRP substrates at low micromolar concentrations and, at higher concentrations, as BCRP inhibitors. Effects on MDR1, in contrast, were weak, as only aglycones exerted mild inhibitory activity in the high micromolar range. Distinct affinities of several anthocyanins and the respective aglycones for BCRP suggest that they may be actively transported out of endothelia. Agents that interfere with BCRP activity are therefore likely to facilitate crossing of the intestinal and blood-brain barriers and to augment anthocyanin bioavailability. Secondly, novel modes of action were sought to rationalize berry polyphenols’ direct modulation of neuronal transmission as opposed to their non-specific antioxidant activities. The candidate effectors include cellular monoamine oxidases (MAO) A and B, hypoxia inducible factor (HIF), the proteasome, and phospholipase A2 (PLA2). Elevated MAO activity has long been implicated in the etiology of depression, anxiety and neurodegenerative illness. MAO inhibiting compounds may thus hold promise in the prevention of behavioral symptoms and cognitive decline. For both MAO isoforms, inhibitory effects of anthocyanins and anthocyanidins are illustrated by IC50 values in the low micromolar range whereas proanthocyanidins and phenolic metabolites were less effective inhibitors. Kinetic analyses, performed with cyanidin and cyanidin-3-glucoside, indicated a competitive interaction of cyanidin in terms of MAO A, plus a mixed competitive and non-competitive mode of interaction of cyanidin in terms of MAO B as well as of cyanidin-3-glucoside with respect to both enzyme isoforms. Thus MAO inhibition by anthocyanins and their aglycones in vitro lends support to central nervous functionalities of diets rich in berry polyphenols and opens new opportunities in the prevention of neuronal pathologies. Effects on HIF expression were examined to assess candidate compounds’ role in enhancing cellular resistance to oxidative stress. By inducing a dose-dependent increase in HIF expression, delphinidin may initiate a variety of cellular survival processes that are inhibited by free iron. This finding argues in favor of iron-chelating properties as a further means of mediating neuroprotection. Other inducers of HIF expression in neuroblastoma cells included gallic acid, cyanidin and bilberry extract, all of which may modulate HIF-dependent transcription of downstream genes.
Schüttgüter in Form von Pulvern oder Granulaten stellen sowohl eigenständige Arzneiformen als auch häufige Zwischenprodukte bei der Arzneimittelherstellung dar. Um die Einheitlichkeit der Dosierung zu gewährleisten, ist die Fließfähigkeit als eines der zentralen Qualitätsmerkmale anzusehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Veränderung der fraktalen Dimension D der Partikeloberflächen in binären Mischungen von α-Lactose-Monohydrat (GranuLac® 200) und hydrophilem hochdispersem Sili-ciumdioxid (Aerosil® 200) in Abhängigkeit von der Mischzeit untersucht. Hierbei kamen sowohl die Ras-terkraftmikroskopie als auch verschiedene Adsorptionsmethoden zur Anwendung. Ziel war es, die prin-zipielle Durchführbarkeit der beschriebenen Techniken sowie deren Anwendbarkeit auf das vorliegende Modellsystem zu prüfen und die ggf. bestehende Korrelation zwischen D und den Ergebnissen der Zug-spannungstests aufzuzeigen.
Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom“) handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivität einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schlüsselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolekülen an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Moleküls pro Enzym-Monomer: überraschenderweise hatten bis zu vier Moleküle MH211A bzw. zwei Moleküle UK-VI-1g an ein Proteasemolekül gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminosäuren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der Nähe der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimtsäure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei mögliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer Röntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass früher veröffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal überdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und früheren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.