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To study the activation of HIV by human spumaretrovirus (HSRV) the long terminal repeats (LTRs) of HSRV, HIVl and HIV2 were examined with respect to their ability to function as transcriptional promoters in virus infected and uninfected cells. Transient transfections using plasmids in which the L TRs of the three viruses were coupled to the bacterial chloramphenicol acetyltransferase (CA T) gene revealed (i) the level of cat gene expression directed by the HSRV LTR was markedly increased in HSRV infected cells compared to uninfected cells, (ii) cat gene expression driven by the HIV1 LTR, but not by the HIV2 LTR could be enhanced upon HSRV infection, whereas (iii) neither in HIV1 nor in HIV2 infected cells an effect on HSRV LTR driven cat geneexpression was detected.
HIV infection of CD4+ peripheral blood lymphocytes leads to a loss of MHC dass I molecules on the surface of the infected cells as detectable by monodonal antibody staining and flow cytometry. Incubation of the infected cells at 26 oe or treatment at 37 oe with peptides leads to upregulation of MHC dass I to levels equal to those found on uninfected cells cultured und er the same conditions. The data suggest that, after HIV infection, the mechanisms responsible for peptide generation, peptide transport and thus stable association between peptides and MHC dass I molecules are severely affected.
Aufgrund ihrer Charakteristika stellen die Lentiviren besonders gut geeignete Vektoren für den Gentransfer in eukaryotische Zellen dar. Lentivirale Vektoren sind in der Lage ruhende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und ihr genetisches Material in das Zielzellgenom zu integrieren. Dies führt zu einer stabilen Expression des Zielgens in den infizierten Zellen und deren Tochterzellen. In den vergangenen Jahren wurden eine Reihe replikationsinkompetenter lentiviraler Vektoren für verschiedene Studien, meist für gentherapeutische Ansätze, hergestellt. Replikationsinkompetente Vektoren sind in der Lage Zielzellen einmalig zu infizieren, können aber in den Zielzellen nicht weiter replizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf HIV-1 basierendes replikationsinkompetentes Vektorsystem etabliert. Mit Hilfe des replikationsinkompetenten Vektorsystems wurde eine rasch durchführbare phänotypische Resistenztestung etabliert, welche für die Messung der Sensitivität von HIV gegen antivirale Inhibitoren geeignet ist. Die Transduktionseffizienz wurde durch den Einbau eines Markergens in das Vektorsystem untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass mit dem Vektorsystem Zielzellen mit hoher Effizienz transduziert werden können. Inhibitoren gegen die virale Protease, Reverse Transkriptase und Integrase waren in der Lage die Transduktion auf konzentrationsabhängige Weise zu reduzieren. In das Vektorsystem konnten PR- und RT-Sequenzen sowohl von viralen Isolaten als auch von Patienten eingesetzt werden und deren Sensitivität bzw. Resistenz gegen die zur Zeit zur Verfügung stehenden Medikamente konnten nachgewiesen werden. Da das hergestellte Vektorsystem den wichtigen Sicherheitsmaßnahmen entspricht, stellt dieses eine sichere Alternative zur Testung der Wirksamkeit von antiviralen Substanzen bei HIV-infizierten Patienten dar. Unter Verwendung des replikationsinkompetenten Vektorsystems konnte die Testung unter biologischer Sicherheitstufe 2 innerhalb von zwei Wochen ausgeführt werden. Damit wurden die bislang zur Verfügung stehenden phänotypischen Resistenztestungen deutlich verbessert. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob das Foamyvirus (FV) Hüllprotein (Env) in der Lage ist, lentivirale Partikel zu pseudotypisieren und welche Bereiche des Hüllproteins für die Pseudotypisierung notwendig sind. Es wurde festgestellt, dass HIV-Kapside mit dem Hüllprotein des Felinen Foamyvirus (FFV) mit sehr hoher Effizienz pseudotypisiert werden können. Das Hüllprotein der Primaten Foamyviren konnte die Pseudotypisierung von lentiviralen Partikel nicht unterstützen. Mit Hilfe verschiedener Mutanten wurde gezeigt, dass bei der Pseudotypisierung das Signalpeptid (SP) eine wichtige Rolle spielt. Die Unterschiede in der Effizienz der Pseudotypisierung zwischen Hüllproteinen von FV verschiedener Spezies wurden primär durch das jeweilige SP bedingt. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrum und der Konzentrierbarkeit bietet das FFV-Env eine attraktive Alternative zu herkömmlich verwendeten Hüllproteinen bei der Produktion und Anwendung von HIV-Vektoren.
Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungeklärt. Diese Arbeit zeigt, dass primäre, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufklärung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antikörpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber für den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.
A CD8+ cell-mediated host defense relies on cognate killing of infected target cells and on local inflammation induced by the secretion of IFN-g. Using assays of single cell resolution, it was studied to what extent these two effector function of CD8+ cells are linked. Granzyme B (GzB) is stored in cytolytic granules of CD8+ cells and its secretion is induced by antigen recognition of these cells. Following entry into the cytosol GzB induces apoptosis in the target cells. It was measured whether GzB release by individual CD8+ cells is accompanied by the secretion of IFN-gƒnƒnand of other cytokines. HIV peptide libraries were tested on bulk peripheral blood mononuclear cells and on purified CD4+ and CD8+ cells obtained from HIV infected individuals. The library included a panel of previously defined HLA class I restricted HIV peptides and an overlapping 20-mer peptide-series that covered the entire gp120 molecule. To characterize the in vivo differentiation state of the T-cells, freshly isolated lymphocytes were tested in assays of 24h duration. The data showed that only ~20% of the peptides triggered the release of both GzB and IFN-g from CD8+ cells. The majority of the HIV peptides induced either GzB or IFN-g, ~40% in each category. The GzB positive, IFN-g negative CD8+ cells did not produce IL-4 or IL-5, which suggests that they do not correspond to Tc2 cells but represent a novel Tc1 subclass, which was termed Tc1c. Also the IFN-g positive, GzB negative CD8+ cell subpopulation represents a yet undefined CD8+ effector cell lineage that was termed Tc1b. Tc1b and Tc1c cells are likely to make different, possibly antagonistic contributions to the control of HIV infection. Since IFN-g activates HIV replication in latently infected macrophages, the secretion of this cytokine by Tc1b cells in the absence of killing may have adverse effects on the host defense. In contrast, cytolysis by Tc1c cells in the absence of IFN-g production might represent the protective class of response. Further studies in the field of Tc1 effector cell diversity should lead to valuable insights for management of infections and developing rationales for vaccine design.
Nevirapin ist ein Nicht-Nukleosidaler Reverse Transkriptase Inhibitor, welcher seit 1996 in der Therapie der HIV-Infektion eingesetzt wird. Im wissenschaftlichen Labor des Schwerpunktes Hepatologie/Infektiologie der Medizinischen Klinik und Poliklinik II des Universitätsklinikums Würzburg werden im Rahmen der therapiebegleitenden Diagnostik bei Patienten mit HIV-Infektion regelmäßig Nevirapin-Plasmakonzentrationen bestimmt. Anhand einer statistischen Auswertung der von 1996 bis 7/2002 gemesssenen Nevirapinspiegel werden in der vorliegenden Arbeit zunächst Einflussgrößen auf inter- und intraindividuelle Variabilität der Plasmakonzentrationen identifiziert. Den stärksten Einfluss auf die interindividuelle Streuung hat dabei das Patientengewicht, weitere Einflussfaktoren sind Rauchen und Compliance der Patienten. Auf Grundlage der Ergebnisse werden Kriterien für eine Dosisanpassung in bestimmten klinischen Situationen erarbeitet. Im zweiten Teil der Arbeit werden akute und langfristige Nebenwirkungen der Nevirapintherapie untersucht. Hautausschlag und Leberwerterhöhung treten vor allem in den ersten Wochen der Therapie auf. Weibliches Geschlecht und hohe CD 4-Zellzahl am Therapiebeginn können als Risikofaktoren für das Auftreten dieser Nebenwirkungen identifiziert werden. Eine Steroidtherapie erscheint aufgrund der vorliegenden Einzelfalldarstellungen vorteilhaft und damit indiziert. Im langfristigen Verlauf steigt die GGT-Aktivität auf etwa das doppelte des Ausgangswertes an, GOT- und GPT-Aktivitäten ändern sich kaum und bei der LDH und der AP kann ein Anstieg in den ersten acht Therapiewochen beobachtet werden. Hepatitis B- und C-Koinfetion haben in dieser Auswertung keinen Einfluss auf nevirapinbedingte Leberwerterhöhung. In Übereinstimmung mit Daten aus der Literatur wird ein deutlicher Anstieg des HDL unter der Nevirapintherapie gefunden. Schließlich wird im dritten Teil dieser Untersuchung die Wirksamkeit der NVP-Therapie anhand von Viruslast- und CD4-Veränderungen analysiert. Bei der Mehrzahl der Patienten kann eine gute Wirksamkeit mit anhaltender Suppression der Viruslast und kontinuierlichem Anstieg der CD4-Zellzahl beobachtet werden.
Forschungsthema: Das Verstaendnis von Sexualitaet und das sexuelle Verhalten verschiedener sich hinsichtlich ihres Abstammungssystems und ihrer kulturellen Herkunft unterscheidender Bevoelkerungsgruppen im Einzugsbereich eines laendlichen Krankenhauses im Sueden Malawis. Ziel: Erarbeiten einer Grundlage für die Planung unter lokalen Bedingungen durchfuehrbarer Interventionsmaßnahmen bezueglich der Ausbreitung von HIV/AIDS. Methoden: Standardisierte Interviews an 1077 Personen dienten der Erhebung von Daten zum Sexualverhalten. Problemzentrierte Interviews mit Repraesentanten von 38 Doerfern wurden dazu genutzt, das derzeitige Sexualitaetsverstaendnis der lokalen Bevoelkerung und die Aktualitaet traditioneller Praktiken im Zusammenhang mit Sexualitaet zu eruieren. Ergebnisse: Diese zeigten ein allgemein niedriges Einstiegsalter in sexuelle Aktivitaeten bei Frauen (im Mittel 17,0 J., beginnend mit 9 J.). Bei Maennern wurde der Beginn des Sexuallebens mit zunehmend niedrigerem Alter angegeben, je juenger sie waren (im Mittel 14,7 J. bei <20jaehrigen vs. 23,9 J. bei >40jaehrigen). Das Sexualverhalten d. Maenner unterschied sich von dem d. Frauen durch eine hoehere voreheliche (67% vs. 22%) und außereheliche (27% vs. 4%) sexuelle Aktivitaet und eine groeßere Zahl von Sexualpartnern. Die Gesamtzahl der Sexualpartner betrug bei ueber 1/4 der Maenner 5 oder mehr, waehrend Frauen nur in 13% mehr als 2 angaben. Eine hoehere Schulbildung fuehrte vor allem bei Maennern zu risikoreicherem Sexualverhalten aber auch zu einer hoeheren Bereitschaft, Praeventionsmaßnahmen zu ergreifen. Gebildetere Frauen hatten zwar ebenfalls vermehrt voreheliche Sexualkontakte, verschoben den Beginn ihres Sexuallebens aber ins spaetere Lebensalter. Auch bei ihnen ging eine hoehere Bildung mit haeufigerer Kondombenutzung einher, die aber im Allgemeinen niedrig war. Insgesamt zeigte sich eine große Differenz zwischen der Anzahl sexuell aktiver Personen und der verheirateter Personen in den juengeren Altersgruppen, wie sie typisch ist fuer Laender mit hoher HIV-Praevalenz. Traditionellen Praktiken, die riskantes Sexualverhalten beguenstigen oder involvieren wie Reinigungsrituale nach dem Tod eines Menschen (kupita kufa) und andere Uebergangsriten, wurde eine hohe Aktualitaet zugeschrieben. 8,7% der Frauen und 3,3% der Männer gaben an, ein solches Ritual mit einem anderen als ihrem Ehepartner durchgefuehrt zu haben. Matrilinearitaet foerderte bei Frauen einen frueheren Beginn sexueller Aktivitaet (16,1 vs. 17,7 J.). Patrilinearitaet dagegen beguenstigte den Einsatz fremder Sexualpartner bei sexualitaetsassoziierten Ritualen. Die Befragten machten deutlich, dass die Einhaltung sexueller Normen durch eine Reihe von Tabus geregelt werde und ihre Transgression eine mdulo genannte Krankheit (keine Krankheitsentitaet im westlichen Sinne) zur Folge haben koenne. Die Aehnlichkeit der Symptome und die Verursachung durch sexuelles Verhalten fuehren offenbar trotz einer generell hohen Aufgeklaertheit zum Thema HIV zu einer Verwechslung von AIDS mit mdulo. Symptome des letzteren wurden in der Befragung im gleichen Atemzug mit AIDS genannt. Verleugnungs- und Externalisierungstendenzen im Zusammenhang mit AIDS zeigten sich darin, dass AIDS kein einziges Mal als Todesursache eines Angehoerigen genannt wurde. Schlussfolgerungen: Generell sollte eine Verschiebung des Beginns sexueller Aktivitaet in ein hoeheres Lebensalter bei Maennern und bei Frauen angestrebt werden. Bei Maennern scheint es außerdem sinnvoll, auf eine Reduktion der Partnerzahl hinzuarbeiten. Die Position von Maedchen und jungen Frauen sollte gestaerkt werden, um ihnen eigenverantwortliche Entscheidungen hinsichtlich ihres Sexuallebens zu ermoeglichen. Kondome sollten verstaerkt propagiert werden, sowohl als Protektivum bei Gelegenheitssex als auch zum Schutz eines moeglicherweise nicht infizierten Partners innerhalb einer ehelichen Beziehung. Traditionelle Praktiken, die riskanten Sex involvieren, sollten nach Moeglichkeit zugunsten alternativer Methoden verlassen werden. Und schließlich sollte eine bessere Akzeptanz der Diagnose AIDS angestrebt werden bei gleichzeitiger Abgrenzung von AIDS gegen traditionelle Konzepte von mdulo. Maßnahmen auf lokaler Ebene: 1. Arbeit mit vulnerablen Personen: junge Maedchen und Frauen mit eher niedrigem Bildungsstatus, junge Maenner mit hoeherer Bildung, Gesundheitspersonal, Sexarbeiterinnen. 2. Arbeit mit Personen, die als Mediatoren sexueller Normen fungieren und Verhaltensaenderungen bewirken können. 3. Foerderung der Akzeptanz der Diagnose AIDS und Vorbeugung von Verleugnungs- und Externalisierungstendenzen durch Einrichtung von VCT, regelmaeßiges diagnostisches Testen und Propagieren sowie Ausgabe von Kondomen.
Immunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das Grün fluoreszierende Protein (GFP)-Transgen enthalten. Die Infektion mit dem VSV-G pseudotypisierten HIV-1-Vektor pGJ2 führte in allen getesteten Zelllinien und auch in primären humanen und murinen Zellen zur Transgenexpression. Ebenfalls konnte eine direkte Expression des Transgens in vivo nachgewiesen werden. Balb/c-Mäuse wurden in einem Vektoren- oder DNA-Prime und Vektoren-Boost-Verfahren immunisiert und die humorale und zelluläre Immunantwort wurde untersucht. Die Primärimmunisierung mit DNA und Boosting mit den lentiviralen Vektoren induzierte eine Gag-spezifische humorale Immunantwort, hohe Titer von VSV-G-neutralisierenden Antikörpern und eine Gag- und EGFP-spezifische zytotoxische T-Zell-Antwort. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl Strukturbestandteile des lentiviralen Vektors als auch die Transgenexpression zur Aktivierung der Immunantwort beitrugen. So machen die einzigartigen biologischen und immunologischen Eigenschaften der replikationsdefizienten HIV-Vektoren aus diesen Konstrukten wertvolle Werkzeuge, um weiter die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen HIV-Infektion und Krankheit bedeutsam sind, zu studieren. Im Rahmen der hierzu durchgeführten Arbeiten wurden außerdem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektoren hergestellt und analysiert. Um die Transkription der lentiviralen Vektor-Kassette durch das Vacciniavirus zu ermöglichen, wurde vor den Transkriptionsstart ein Vaccinia-Promotor gesetzt und an das 3’-Ende das Transkription-Stoppsignal angehängt. Obwohl die genomische Analyse eine erfolgreiche Herstellung der Hybridvektoren bestätigen konnte, muss die Produktion der lentiviralen Vektoren nach der Vaccinia-Infektion weiter optimiert werden. Nichtsdestotrotz könnte die Kombination von replizierenden Vacciniaviren und replikationsinkompetenten HIV-Vektoren ein neuartiges Impfkonzept darstellen. Die Expression von HIV-Strukturgenen würde in der ersten Phase der Infektion mit dem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektor zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen. Die Bildung von lentiviralen Vektoren würde diese Immunantwort weiter boosten, und falls die lentivirale Vektorkassette dann ein entsprechendes Transgen enthalten würde, würde dies weiter die Immunantwort verstärken und vor allem könnte diese Art des Impfstoffes eine langzeitige falls nicht dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort erzeugen.
In dieser Untersuchung wurde die praktische Bedeutung des Therapeutischen Drug Monitorings (TDM) in der HIV-Therapie an 2634 Plasmaproben von 1929 Patienten in mehrfacher Hinsicht gezeigt. Unterschiedliche Therapieumstände erfordern im Einzelfall sowohl für die Proteaseinhibitoren LPV, RTV, APV, SQV, NFV, IDV und ATV, als auch für die Nicht-Nukleosidalen Reverse-Transkriptase-Hemmer EFV und NVP ein Therapeutisches Drug Monitoring. Bei Begleitmedikation mit nicht-antiretroviralen Präparaten konnten die pharmakologischen Interaktionen größtenteils bestätigt werden. Als Beispiel sei die Komedikation mit Carbamazepin genannt, wodurch mit 5733,1±1768,9 ng/ml ein erniedrigter LPV-Plasmaspiegel im Vergleich zum Referenzwert von 6207,3±4110,0 ng/ml resultierte und die Wirkung von Carbamazepin als Induktor des Enzymsystems gezeigt werden konnte. Ein ähnliches Verhalten ergab sich bei Kombination von Carbamazepin mit RTV und mit NFV. Zum Erreichen optimaler Plasmaspiegel, die für die Therapie ausreichend effizient sind und die Toxizität nicht erhöhen, ist ein TDM für alle PI und NNRTI notwendig. Weiter konnte gezeigt werden, dass ein Therapeutisches Drug Monitoring ein wichtiges Instrument zum Aufdecken von Complianceproblemen sein kann, insbesondere gilt dies für LPV, RTV, SQV, IDV, EFV und NVP. Bei Therapieversagen ist die Interpretation des TDM häufig schwierig. Erniedrigte Spiegel konnten für LPV, APV, SQV, NFV, ATV und EFV gezeigt werden. Die Bedeutung des TDM liegt in der Vermeidung suboptimaler Konzentrationen. Die Notwendigkeit eines TDM bei Vorliegen von chronischen Lebererkrankungen konnte anhand von 301 Patienten gezeigt werden. Insbesondere für LPV, APV, SQV, NFV, IDV, EFV und NVP waren erhöhte Plasmaspiegel nachweisbar. Auch das Auftreten von Nebenwirkungen lässt ein TDM und eine darauf beruhende Dosisanpassung für alle untersuchten PI und NNRTI empfehlen. Bei ART-Kombinationen von PI und NNRTI ist ein TDM unbedingt erforderlich, da das Ausmaß der Interaktionen, die durch die antiretroviralen Medikamente verursacht werden, großen individuellen Veränderungen unterliegt. Die Notwendigkeit eines TDM konnte für alle untersuchten PI und NNRTI bestätigt werden. Insgesamt wurden in dieser retrospektiven Untersuchung die möglichen pharmakologischen Interaktionen der PI und NNRTI größtenteils bestätigt. Unterstrichen wird dadurch die Bedeutung des TDM bei der Betreuung HIV infizierter Patienten im klinischen Alltag.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abhängigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie geprüft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das natürlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgewählt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gefärbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gezählt, während Zellen die für AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranstörungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien über unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits für die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-ähnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine stärkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angehören: A3.01 Zellen und PBMC könnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die für die Durchführung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen könnten Typ 2 Zellen verkörpern, die zusätzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation könnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus könnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem früheren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antikörper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch für die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen führte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, ähnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringfügiger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivität von CAPE erklärbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. Könnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgelöst werden, so wäre das ein Schritt mehr in Richtung der vollständigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode könnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und wären so einer effizienten Therapie mit HAART zugänglich. Als nächster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.
Machbarkeitsstudie bezüglich der Einführung Hochaktiver Antiretroviraler Therapie (HAART) in Namibia/Afrika. 1) Es erfolgt eine Dokumentation des Projektes(Therapieregime, örtliche Gegebenheiten, Personal, Einschluss-und Ausschlusskriterien) und 2) eine statistische Auswertung verschiedener Laborparameter (Leukozyten, Hb, Gewicht/BMI, CD4) unter der Therapie. 3) Untersuchung der Todesfälle mit der Frage nach prognostischer Vorhersagekraft verschiedener Parameter. 4) Ergebniss: Verbesserung von Lebensqualität und Lebensdauer betroffener Patienten durch die Therapie. Die weitere Einführung von HAART in afrikanischen Ländern wird ausdrücklich empfohlen.
HINTERGRUND: Langzeitnebenwirkungen der antiretroviralen Therapie werden u.a. auf mitochondriale Toxizität von NRTIs zurückgeführt, wobei es zu einer Dysfunktion der Atmungskette und nachgeschalteter Stoffwechselwege wie der de-novo-Pyrimidinsynthese kommen kann. Experimentell konnte gezeigt werden, dass das Pyrimidinnukleosid Uridin einige dieser Toxizitätseffekte reduzieren konnte. METHODIK: Nach Etablierung einer HPLC-Methodik zur Evaluation von Uridin im menschlichen Serum wurden Uridinspiegel von HIV-positiven Patienten mit Uridinspiegeln einer HIV-negativen Kontrollgruppe verglichen sowie mit Demografie, Nebenwirkungen bzw. Koerkrankungen, antiretroviraler Therapie und Therapiedauer korreliert. ERGEBNISSE: Die 182 HIV-Patienten wiesen signifikant niedrigere Uridinspiegel als die 30 Kontrollpersonen auf, blieben aber noch im physiologischen Normbereich gesunder Erwachsener. Demografische Faktoren sowie Marker der HIV-Infektion zeigten keine signifikante Korrelation mit Uridin. HIV-Patienten mit Begleiterkrankungen boten im Vergleich zu HIV-Patienten ohne Begleiterkrankungen signifikant verminderte Uridinspiegel. Bei Differenzierung nach den einzelnen Befunden zeigte sich, dass nur Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und chronischen Lebererkrankungen wie Steatosis Hepatis signifikant erniedrigte Spiegel aufwiesen. Im Vergleich von 4 HIV-Patientengruppen mit unterschiedlicher antiretroviraler Therapie verhielten sich die Uridinspiegel analog zur potenziellen mitochondrialen Toxizität des jeweiligen Therapieregimes. Die Patientengruppe mit dideoxy-NRTI-haltiger Therapie wies die niedrigsten Uridinplasmaspiegel auf und zeigte im Vergleich zur Patientenguppe ohne antiretrovirale Therapie signifikant erniedrigte Uridinplasmaspiegel. Mit zunehmender Therapiedauer zeigte sich bei der Therapiegruppe mit dideoxy-haltiger HAART abfallende, bei den anderen 3 Therapiegruppen konstante bis leicht ansteigende Spiegel. SCHLUSSFOLGERUNG: Bei HIV-positiven Patienten scheint die Einnahme von (di)deoxy-NRTIs sowie Koerkrankungen wie Fettleber und Diabetes mellitus Typ 2 mit signifikant niedrigeren Uridinspiegeln assoziiert zu sein. Ob eine Uridinsubstitution zur Vermeidung von NRTI-assoziierten Langzeitnebenwirkungen sinnvoll ist, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
Nachdem im Rahmen einer engen Zusammenarbeit zwischen dem Missionsärztlichen Institut in Würzburg und dem Centre de Santé in Gikonko, Ruanda bereits im Vorfeld dieser Arbeit erhebliche Probleme mit falsch positiven HIV-Schnelltestergebnissen aufgefallen waren, wurden 162 Patienten bezüglich ihres HIV-Status untersucht und bei einer kleineren Gruppe (46 Patienten) eine eingehende serologische Analyse durchgeführt. Dabei waren Ziele dieser Arbeit (1) den HIV-Status aller in Gikonko als HIV-positiv geführten Patienten zu überprüfen, um so das diagnostische Problem genauer einschätzen zu können; (2) die Reaktionsmuster der Tests zu analysieren, um mögliche Schwachpunkte der einzelnen Schnelltests zu finden; (3) nach Ursachen sowie potentiellen Kreuzreaktivitäten für uneindeutige oder falsch positive Testergebnisse zu suchen; (4) Risikogruppen zu definieren, in denen HIV-Schnelltests weniger aussagekräftig sind und (5) die angepasste HIV-Diagnostik in einigen ausgewählten Fällen mit genaueren Verfahren in Deutschland zu überprüfen und nach weiteren serologischen Auffälligkeiten zu suchen. Hierfür wurden Blutproben mithilfe der im ruandischen Testalgorithmus verwendeten Schnelltests (DetermineTM, UnigoldTM, CapillusTM, First ResponseTM) vor Ort auf HIV getestet. Von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. wider-sprüchlichen Ergebnissen wurden Serumproben nach Deutschland zu genaueren serologischen Analyse transportiert. Diese umfasste die virologische Untersuchung auf HIV mittels ELISA, Western Blot (im positiven Fall zur Bestätigung) sowie PCR, eine immunologische und autoimmunologische Untersuchung (Bestimmung von IgG, IgM, Rheumafaktor sowie ANCA), sowie eine parasitologische Untersuchung (Bestimmung von Malaria-Antikörper) und die Messung von Werten der klinischen Chemie (Kreatinin, GOT, GPT). Ergänzt wurde die serologische Analyse durch die Erhebung von Daten aus der Kartei des Krankenhauses sowie der Schwangerenambulanz in Gikonko. Es zeigte sich, dass unter Verwendung von HIV-Schnelltests bei nur 79% der Patienten (n = 112) der HIV-positive Status bestätigt werden konnte, 15% (n = 21) erhielten ein klar negatives Ergebnis und in 6% (n = 8) führten die HIV-Schnelltests zu keinem eindeutigen Ergebnis. Bei der virologischen Untersuchung in Deutschland wurden alle negativen Ergebnisse bestätigt; unter den acht uneindeutig getesteten Seren wurde in zwei Fällen eine HIV-Infektion nachgewiesen. Um Schwachpunkte oder Anfälligkeiten einzelner Tests auf Störfaktoren aufzeigen, wurden die Reaktionsmuster der HIV-Schnelltests entsprechend der genaueren serologischen Untersuchungen dargestellt und analysiert. Es zeigte sich, dass besonders DetermineTM und CapillusTM ursächlich für uneindeutige Testergebnisse waren. Bei der genaueren Analyse von Seren von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. widersprüchlichen Ergebnissen wurden bei 7% (n = 3) Rheumafaktoren und bei 16% (n = 5) ANCAs nachgewiesen. Außerdem zeigten 48% der Proben (n = 22) stark erhöhte IgM-Werte. Es waren wiederum vornehmlich die Tests DetermineTM und CapillusTM, welche Probleme bei der Testung der entsprechenden Seren aufwiesen. Der Einfluss zweier äußerer Faktoren hingegen war evident: Zum einen führte die Interpretationsvorschrift der Hersteller, jegliche Reaktion als positiv zu werten, zu vielen falsch positiven Ergebnissen und zum anderen genügten die zur Verfügung stehenden HIV-Schnelltests im ländlich gelegenen Gikonko, mit einer HIV-Prävalenz von 4%, den biomathematischen Anforderungen nicht. Die erhobenen Daten aus der Kartei des Centre de Santé erhärteten die Annahme, dass die Neutralität der interpretierenden Person durch eine verdächtige Familien- oder Eigenanamnese bzw. eine entsprechende Klinik gefährdet wird. Die Analyse der Kartei der Schwangerenambulanz zeigte eine signifikante Häufung falsch positiver Testergebnisse im letzten Trimenon.
Die HIV-Infektion des Gehirns induzierte eine Vielzahl neurologischer und neuropsychiatrischer Veränderungen, die gemeinsam als HIV-assoziierte Demenz bezeichnet werden. Insbesondere eine Beteiligung der glutamate-vermittelten Toxizität wird im Rahmen der HIV-Demenz diskutiert. Die vorliegende Arbeit verwendete das wichtigste Tiermodell der HIV-Infektion, mit simianen Immundefizienzviren (SIV) infizierte Rhesusaffen, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Immunaktivierung und adaptiven Veränderungen der glutamatergen Synapse und ihrer Umgebung zu untersuchen. Mittels einer Microarrayanalyse wurden allgemein Unterscheide im Genexpressionsprofil der Basalganglien von Rhesusaffen während dem Fortschreiten der Infektion erfasst. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede in der transkriptionalen Regulation zwischen Chinesischen und Indischen Makakkensubspezies, sowie ein einzigartig differenziertes Genexpressionsmuster als Antwort auf die SIV-Infektion selbst. Um adaptive Veränderungen in den funktionalen Elementen der glutamatergen Synapse weiter zu charakterisieren, wurde die Expression der N-methyl-D-aspartat-Rezeptoruntereinheiten gemessen, wobei ein progressiver Verlust der Untereinheitenexpression im Putamen sowie ein differenziellen Expressionsmuster in Abhängigkeit sowohl von der Makakkensubspezies sowie von der Hirnregion im Nucleus accumbens SIV-infizierter Rhesusaffen festgestellt wurde. Außerdem konnte die vorliegende Arbeite zum ersten Mal eine Störung der exzitatorischen Aminosäuretransporter, dem wichtigsten Glutamatwiederaufnahmesystem, im Putamen, aber nicht im Nucleus accumbens, während der SIV-Infektion nachweisen. Zuvor durchgeführte Arbeiten wiesen darauf hin, dass neurochemischen Dysfunktionen unter Umständen das Ergebnis einer indirekten Toxizität vermittelt durch aktivierte Mikroglia und der daraus resultierenden Ausschüttung schädlicher Faktoren sein könnten. Entsprechend zeigten unsere Daten einen Anstieg in der MHC-II- und TNF-alpha-Expression bereits während der asymptomatischen Phase, und eine noch deutlichere Heraufregulierung in AIDS-Tieren. Zusammenfassend weist die vorliegen Arbeit auf komplexe und kombinierte Mechanismen von einem Anstieg in der Glutamatkonzentration mit einer Dysregulation der NMDA-Rezeptorfunktion sowie der Glutamatwiederaufnahmesysteme verursacht durch eine Immunaktivierung hin. Außerdem konnte in Versuchen zur pharmakologischen Beeinflussung der glutamatergen Synapse mittels dopaminerger Substanzen, NMDAR-Antagonisten und Antioxidantien eine Verbesse-rung der neurochemischen Funktion durch den nichtkompetitiven Antagonisten Memantin und die Antioxidantien Melatonin sowie N-Acetylcystein gezeigt werden. Hingegen trugen die Ergebnisse mit dem MAO-B-Inhibitor Selegilin weiter zu Bedenken zur Sicherheit und Effizienz dopaminerger Substanzen in der Behandlung von HIV-Patienten bei. Außerdem zeigte die vorliegende Arbeit, dass Memantin spezifisch die mRNA- und Proteinexpression des Neurotrophins BNDF heraufregulierte und weist somit auf eine neuartige pharmakologische Wirkung Antidementivums hin. In einer ergänzenden Studie wurden Schritte zur Entwicklung und Verbesserung adeno-assoziierten viraler und foamyviraler Vektoren, die shRNAs für die effiziente Ausschaltung der Expression des murinen und humanen Dopamintransporters, durchgeführt. Es wurden verschieden virale Vektorplasmide kloniert, Effektormoleküle mit einer hohen Knockdown-Aktivität identifiziert, und infektiöse rekombinante Viren hergestellt. Zudem konnte die Expression des humanen Dopamintransporters auf Lymphozyten bestätigt werden. Diese Ergebnisse werden die Entwicklung transgener Tiere und Zelllinien erleichtern und tragen so zur Analyse der natürlichen dopaminergen Neurotransmission in der psychiatrischen Forschung bei, wobei die durch endogene Anpassungen der dopaminerge Systeme in klassischen Knockout-Systemen hervorgerufenen Schwierigkeiten umgangen werden können.
Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-γ-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-γ Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-γ Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INFγ und TNFα, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich.
Die Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität gilt als einer der wichtigsten neuropathologischen Faktoren der HIV-Demenz: Während Glutamat in physiologischer Konzentration als exzitatorischer Neurotransmitter fungiert, wirkt es in zu hoher Konzentration neurotoxisch. In vorliegender Arbeit wurde mittels Western Blotting die Proteinexpression der exzitatorischen Aminosäuretransporter EAAT1 und EAAT2 gemessen, die vor allem für den Abtransport von Glutamat aus dem synaptischen Spalt sorgen. Hierzu wurden Gehirne von mit dem simianen Immundefizienz Virus (SIV) infizierten chinesischen und indischen Rhesusaffen verwendet. SIV verursacht im SIV-Rhesusaffenmodell ähnliche Schäden wie das humane Immundefizienz Virus (HIV) beim Menschen. Zur Entstehung der SIV-Enzephalitis tragen, wie auch bei der HIV-Demenz, aktivierte Monozyten und Mikroglia bei, die u.a. das Neurotoxin Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) sezernieren. Dessen Protein- und Genexpression wurde mittels ELISA und Real-Time-PCR ausgewertet. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei für die HIV-Demenz besonders relevante Gehirnregionen ausgewählt: das Putamen, das als Teil der Basalganglien für die extrapyramidale Steuerung der Motorik zuständig ist, und der Nucleus Accumbens, der affektives und motivationales Verhalten in Bewegungsabläufe integriert. Als potentielle Pharmaka wurden der MAO-B-Hemmer Selegilin, der NMDAR-Antagonist Memantin sowie die Antioxidantien N-Acetylcystein (NAC) und Melatonin getestet. Es gelang in vorliegender Arbeit erstmals, eine Störung der Proteinexpression der glutamatergen Transporter EAAT1 und EAAT2 im Putamen mit zunehmender Dauer der SIV-Infektion und ihren dramatischen Verlust bei Entwicklung von AIDS nachzuweisen. Im Nucleus Accumbens fand sich eine relativ konstante Proteinexpression des EAAT1 und EAAT2 im Verlauf der SIV-Infektion. Weiterhin konnte ein Anstieg des TNF-alpha mit fortschreitender Infektionsdauer hinsichtlich der Genexpression im Putamen und der Proteinexpression im Nucleus Accumbens nachgewiesen werden. Die fehlende Eignung von Selegilin als neuroprotektive Substanz im Rahmen der SIV-Enzephalitis wurde repliziert. Memantin, NAC und Melatonin hingegen verbesserten in weiten Teilen die Expression von EAAT1 und EAAT2 und wirkten immunstimulierend, was sie zu interessanten Kandidaten für eine neuroprotektive Medikation macht. In beiden Hirnregionen zeigte sich bei den indischen Rhesusaffen eine höhere TNF-alpha-Expression als bei den chinesischen Tieren. Dies entspricht der Beobachtung, dass die SIV-Infektion bei indischen Rhesusaffen meist schneller und schwerer verläuft.
In this thesis, computational structure-based design approaches were employed to target the HIV-1 integrase and the macrophage infectivity potentiator (MIP) of Legionella pneumophila. The thesis yields valuable information about the mechanism of action of a known class of integrase inhibitors and a novel approach towards enzyme inhibition, which still is mainly unaddressed in current integrase research. For the MIP enzyme, two small-molecule MIP inhibitors were discovered. The computational studies of HIV-1 integrase have provided valuable information for IN inhibitor design. Docking experiments supported the hypothesis that the well-known diketo acid inhibitors enter the IN active site not as free ligands, but rather as metal complexes. These results help to reveal the mechanism of action of this important class of IN inhibitors.To give an impulse for the development of a novel class of inhibitors, a new strategy towards IN inhibition was introduced: An alternative binding site, the dimerization interface of an IN catalytic core domain monomer, was explored for inhibitor design. The lack of structural data of the free monomer was overcome by extensive MD studies. Snapshots derived from the MD simulation were used as protein input structures in a docking study with the inhibitory peptide YFLLKL to reveal its potential binding mode. The docking procedure showed that the peptidic ligand binds to a dimerization interface conformation which shows a Y-shaped binding site.. The next step was to address this protein conformation with small, non-peptidic molecules. The first strategy towards finding small-molecule interface binders was to create a pharmacophore model with hydrophobic features and shape constraints, aiming to find molecules with a good complementarity to the Y-shaped dimerization interface. Virtual screening yielded a total of 10 compounds, which all displayed good shape complementarity and favorable hydrophobic interactions. Unfortunately, none of the compounds showed a reproducible inhibitory activity in biological assays. Some doubts remain about the validity of the assay results: The use of BSA was critical, since it is not unlikely that BSA “intercepted” the hydrophobic candidate compounds. The first strategy towards finding small-molecule dimerization inhibitors was reconsidered: In the second approach, the satisfaction of hydrogen bonding residues at the dimerization interface, was of major interest. Two pharmacophore models were employed, which retrieved several hundred hit molecules. However, docking of these molecules showed that still many hydrogen bonding groups of the protein remained unaddressed by the ligands. Eventually, after visual inspection, only eight molecules were selected as candidate compounds for further testing (results pending). This small “yield” underlines the difficulties in finding interface binders: The IN dimerization interface is a peculiar target with frequently alternating basic, acidic, and hydrophobic residues. It is not a well-ordered binding site with continuous hydrophobic areas and distinct hydrogen bond donors / acceptors. Other protein-protein interfaces show such well-ordered binding sites. Accordingly, the peculiarity of the IN dimerization interface, in addition to the delicate task of disrupting protein-protein interactions at all, makes the development of IN dimerization inhibitors very challenging. For MIP, the studies revealed two experimentally validated MIP inhibitors, which significantly reduce MIP enzymatic activity. To our knowledge, no small-molecule MIP inhibitor has been reported in the literature so far. A detailed analysis of the available structural data of MIP and a comparison to the human PPIase counterpart, FKBP12, pointed out a conformational diversity among the MIP structures and a crucial difference between the two PPIases, which could be traced to mainly one residue (Tyr109). The detailed comparison of FKBP12 and MIP complex structures made it possible to give an explanation, why a ketoacyl-substituted pipecoline derivative most probably does not bind to MIP, but a sulfone-substituted pipecoline derivative does bind to MIP. Knowledge of Legionella MIP inhibitors could be transferred also to other organisms (e.g. trypanosoms), where homologous MIP proteins are also pathological factors.