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- Center for Interdisciplinary Clinical Research, Würzburg University, Würzburg, Germany (1)
- Department of Paediatric Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology, Josef-Schneider-Straße 2, Wuerzburg 97080, Germany (1)
- IZKF Nachwuchsgruppe Geweberegeneration für muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Regeneration Muskuloskelettaler Gewebe (1)
- Muskuloskelettales Centrum Würzburg (MCW) (1)
The role of the thymus in the pathogenesis of simian acquired immunodeficiency syndrome was investigated in 18 juvenile rhesus monkeys (Macaca mulatta). The thymus was infected from the first week post-SIVmac inoculation, but the amount of virus-positive cells was very low « 1 in 1 04 T cells) as demonstrated by polymerase chain reaction and in situ hybridization. First morphological alteration was a narrowing of the cortex at 12 and 24 wpi. Morphometry revealed no increase of pyknotic T cells but a decrease of the proliferation rate andflow cytometry showed a reduction of the immature \(CD4^+/CD8^+\) double-positive T cells. Ultrastructural analysis revealed vacuolization, shrinkage, andfinally cytolysis of the cortical epithelial cells and the interdigitating dendritic cells. Immunofluorescence staining exhibited a widespread loss of cortical epithelial cells. This damage to the thymic microenvironment could explain the breakdown of the intrathymic T cell proliferation. It preceded fully developed simian acquired immunodeficiency syndrome and is therefore considered to play a major role in its pathogenesis.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
B-cells of the rheumatoid synovial tissue are a constant part of and, in some histopathological subtypes, the dominant population of the inflammatory infiltrate, located in the region of tissue destruction. The pattern of B-cell distribution and the relationship to the corresponding antigen-presenting cells (follicular dendritic reticulum cells: FDCs) show a great variety. B-cells may exhibit (i) a follicular organization forming secondary follicles; (ii) follicle-like patterns with irregularly formed FDC networks, and (iii) a diffuse pattern of isolated FDCs. Molecular analysis of immunoglobulin VH and VL genes from human synovial B-cell hybridomas and synovial tissue demonstrates somatic mutations due to antigen activation. The FDC formations in the synovial tissue may therefore serve as an environment for B-cell maturation, which is involved in the generation of autoantibodies. An autoantibody is defined as "pathogenic" if it fulfills the Witebsky-Rose-Koch criteria for classical autoimmune diseases: definition of the autoantibody; induction of the disease by transfer of the autoantibody; and isolation of the autoantibody from the disease-specific lesion. B-cells from rheumatoid synovial tissue show specificity for FcIgG, type II collagen, COMP, sDNA, tetanus toxoid, mitochondrial antigens (M2), filaggrin and bacterial HSPs. The contributions of these antigens to the pathogenesis of RA are still hypothetical. A possible contribution could derive from crossreactivity and epitope mimicry: due to crossreaction, an antibody directed originally against a foreign infectious agent could react with epitopes from articular tissues, perpetuating the local inflammatory process. The characteristic distribution pattern, the localisation within the area of tissue destruction, the hypermutated IgVH and IgVL genes, and their exclusive function to recognize conformation-dependent antigens suggest a central role for B-cells in the inflammatory process of rheumatoid arthritis. Therefore, the analysis of synovial B-cell hybridomas and experimental expression of synovial IgVH and IgVL genes will help to characterise the antigens responsible for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. In the present study 55 IgVH genes amplified from 3 different anatomical regions of a RA patient were analysed adding further information on synovial B-cell maturation and recirculation in RA. This analysis demonstrated somatically mutated IgVh genes in all different regions with amino acid deletions and mixed IgVh molecules, suggesting the existence of a novel pathway to generate (auto)antibody specificities. The comparison of amino acid sequences of amplified genes belonging to the VH1 family (with predominantly the same germline counterpart) exhibited a strong homology, indicating an apparently conserved mutational pattern. This suggests that the number of antigens activating B-cells in the different locations is restricted. The most striking result was the finding of clonally related sequences in different anatomical regions indicating a recirculation of activated B-cells between the different affected joints. Also in the present study a synovial B-cell hybridoma was analyzed for its specific recognition of cartilage antigens. A heptameric peptide of cartilage oligomeric protein (COMP) could be defined as the target structure. The IgVH-gene (IgHV4-59*01) of the IgG2l hybridoma has somatically mutated genes with high R/S values in the CDR regions (9:2). Thus, indicating that this hybridoma originates from a synovial B-cell which has been antigen activated/selected for its affinity. To analyse the presence of the clonotypic IgHV4-59*01 sequences in other cases of RA and osteoarthritis (OA) synovitis, primers specific for the CDR3 rearrangement of this hybridoma were used. The clonotypic and clone related sequences (98 per cent ± 1 per cent homology) could only be detected in synovitis of RA cases but not in OA cases indicating that this B-cell is specific to RA synovitis. The identified heptameric peptide of COMP was used in a peptide ELISA to analyse whether there is a specific binding in RA serum samples. Serum samples (IgG) from RA patients (n=22) showed a significant higher efficiency to the COMP heptamer than the OA sera (n=24) and the age matched healthy controls (n=20) (for both p<1x10-4, Students t-test). The specificity of this B-cell hybridoma may therefore be defined as RA specific. Since COMP is restricted to cartilage and tendons which are organs specifically affected in RA this COMP specific autoantibody represents the first organ specific autoantibody in RA. The IgG2 COMP specific autoantibody with somatically mutated IgVH genes is different from germline encoded, antigen clearing IgM autoantibodies and may therefore be directly involved as an "arthritogenic autoantibody" in cartilage and tendons destruction by complement activation.
Die DNA-Durchflusszytometrie ist eine anerkannte Methode zur Erfassung genetischer Abweichungen und Änderungen der Proliferationsfraktion von Tumorzellen. Die Aufarbeitung von Tumorzellen mit vorhandenen Begleitpopulationen bewirkt allerdings bei der Einfachfärbung der DNA eine Ungenauigkeit der Zellzyklusanalyse. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Begleitpopulationen auf die Analyse von Ploidie und Zellzyklus mit Hilfe der DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung am Mammakarzinom untersucht. Zum anderen wird auf Zusammenhänge zwischen p53, Proliferation und Ploidie von Mammakarzinomen eingegangen. Von 28 untersuchten Fällen waren 26 für die DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung komplett auswertbar. Bei 9 dieser 26 ausgewerteten Fälle konnte immunhistochemisch p53 nachgewiesen werden. Die Zellen wurden aus Gefriermaterial mechanisch vereinzelt und mit Propidium Jodid und FITC-konjugiertem anti-Zytokeratin-Antikörper bzw. anti-p53-Antikörper gefärbt. Die Messungen wurden mit einem FACScan durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Multicycle Software AV. Die Auswertung der Zytokeratin-Doppelfärbung ergab im Vergleich zur Einfachfärbung einen Anstieg sowohl des Anteiles aneuploider Tumoren als auch des mittleren DNA-Index. Die Proliferationsrate, insbesondere die S-Phasen-Fraktion erhöhte sich ebenfalls signifikant. Die vergleichenden Zellzyklusanalysen der Zytokeratin-positiven und der p53-positiven Tumorzellen zeigte eine geringere Proliferationsfraktion der p53-positiven Zellen, verglichen mit den p53-negativen Tumorzellen. Der überwiegende Anteil der p53-positiven Zellen zeigte eine Aneuploidie. Weiterhin ergaben sich in dieser Untersuchung Hinweise auf eine Zellzyklusabhängige Expression des p53-Proteins. Durch die Nutzung der Doppelfärbung für DNA und Zytokeratin in der Durchflusszytometrie gelingt die exaktere Wiedergabe der Biologie von Tumoren. Es ist zu erwarten, dass dies die prognostische Aussagekraft der DNA-flowzytometrischen Parameter Ploidie und Proliferationsfraktion erhöht.
Das duktale Carcinoma in situ (DCIS) der Mamma stellt eine Neoplasie mit sowohl heterogener Morphologie als auch variierendem biologischen Verhaltens dar. Dies führte in der Vergangenheit zur Etablierung zahlreicher pathohistologischer Klassifikationssysteme mit dem Ziel, das Risiko einer malignen Transformation in ein invasives Carcinom und die Wahrscheinlichkeit eines Lokalrezidivs nach Tumorektomie anhand histologischer Kriterien abzuschätzen. Zur Untersuchung solcher Klassifikationsparameter auf ihre Wichtigkeit sollte der genetische Hintergrund am Beispiel der chromosomalen Trisomie untersucht werden und mit diesen korreliert werden. Die Ergebnisse einer DNA-in situ-Hybridisierung an Paraffin-Material mit spezifischen Proben für die Chromosomen 1, 7, 8 und 18 zeigen, daß Trisomien in dieser Neoplasie ein häufiges Ereignis darstellen (56 Prozent aller Fälle) und daß diese mit den histologischen Parametern der Nekrose und einem hohen Kernatypiegrad korrelieren. Dieser Befund wird durch die Tatsache untermauert, daß solche Beziehungen sogar im gleichen Tumor gefunden werden, wenn dieser eine heterogene Morphologie aufwies. So läßt sich die große Bedeutung der Klassifikationsparameter Nekrose und Kern-Atypie auch durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstreichen. Eine Trisomie des Chromosoms 18 konnte nur in Fällen von einer Koinzidenz mit mikroinvasiven Herden detektiert werden. Dies deckt sich mit sämtlichen Angaben der Literatur, bei denen eine Trisomie 18 nie bei streng intraduktalem DCIS, sondern nur bei mikroinvasiven oder invasiven Mamma-Karzinomen gefunden wurde. Folglich wäre es wichtig, mit weiteren Untersuchungen die Bedeutung dieser Aberration im Invasionsgeschehen und in der Diagnosestellung einer Mikroinvasion des DCIS zu analysieren.
Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert
Die Abschätzung des individuellen Rezidiv- und Progressrisikos eines Patienten mit einem Nierenzellkarzinom gelingt durch Bestimmung von Staging und Grading nur unzureichend. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es neben etablierten Prognoseparametern wie Staging und Grading eines Nierentumors die VEGF-Immunreaktivität zu untersuchen und auf seine Tauglichkeit als Prognoseparameter zu überprüfen. Hierzu wurden parafin-fixierte Präparate von 200 Patienten, die an der Urologischen Universitätsklinik Würzburg zwischen 1985 und 1994 tumornephrektomiert wurden, immunhistochemisch untersucht. Zu allen Patienten ist ein postoperativer Verlauf bekannt. Die Präparate wurden zunächst nach der Avidin-Biotin-Methode gefärbt und zur Auswertung vorbereitet. Für jedes Präparat wurde nun der prozentuale Anteil der VEGF-positiven Zellen im Tumor durch zwei unabhängige Untersucher bestimmt. Als Mass der Prognose (abhängige Variable) wurden Überlebenszeit und rezidivfreie Zeit nach Tumornephrektomie gewählt. Als prognostische Parameter (unabhängige Variable) dienten die etablierten Faktoren wie Staging und Grading sowie der potentiell relevante Faktor VEGF. VEGF erwies sich, im Präparat immunhostochemisch gemessen, als statistisch signifikanter Prognosefaktor, der aber den klassischen Faktoren unterlegen ist. In einer multivariaten Prognoseanalyse und in einer Berechnung von Prognoseindizes sowie Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven konnte gezeigt werden, dass eine Kombination der etablierten Prognosefaktoren mit VEGF eine statistisch signifikante Steigerung der Vorhersagegenauigkeit erreicht
Das Ausmaß und die Bedeutung molekulargenetischer Veränderungen in der Pathogenese gastraler Marginalzonen B-Zell Lymphome (MZBCL) vom MALT-Typ ist derzeit noch unklar. Ein unbekannter Teil dieser niedrig-malignen Lymphome transformiert zu hoch-malignen gastralen „diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen“ (DLBCL), jedoch besitzen diese DLBCL nicht die Translokation t(11;18)(q21;q21), die sich dagegen in den gastralen MZBCL vom MALT-Typ als die häufigste Translokation mit noch unklarer Konsequenz etablierte. Um die Pathogenese dieser Tumoren genauer zu analysieren, wurden in dieser Studie 24 gastrale MZBCL vom MALT-Typ mit 39 Mikrosatellitenmarkern auf genomische Aberrationen untersucht. Die gastralen MZBCL vom MALT-Typ können nach unseren Ergebnissen in zwei Gruppen eingeteilt werden, die in ihrer Pathogenese zwei unterschiedliche Wege gehen. Die erste Gruppe beinhaltet die Translokation t(11;18)(q21;q21)–positiven MZBCL vom MALT-Typ. Diese erwerben signifikant weniger genomische Aberrationen als die Translokation t(11;18)(q21;q21)–negativen und transformieren nicht zu DLBCL. Die zweite Gruppe bilden die Translokation t(11;18)(q21;q21)–negativen MZBCL vom MALT-Typ. Diese erlangen im Verlauf ihrer Entwicklung signifikant mehr genomische Aberrationen als die Translokation t(11;18)(q21;q21)–positiven und scheinen ein potenzieller Ursprung für sekundäre hoch-maligne DLBCL zu sein. Der „mutator-pathway“ mit dem Kennzeichen der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) spielt nach unseren Erkenntnissen bei den gastralen MZBCL vom MALT-Typ nur eine untergeordnete Rolle, vielmehr ist die chromosomale Instabilität in Form von Deletionen (loss of heterozygosity, LOH) oder Amplifikationen von Bedeutung. Die mit 20,8% der untersuchten Fälle am häufigsten gefundene Aberration war die Amplifikation der Region 3q26.2-27, welche den BCL-6- bzw. den PIK3CA-Genlocus beinhaltet. Auch wurden Amplifikationen des MLL-Genlocus auf 11q23-24 und der Region 18q21 und LOH der Regionen 6q23.3-25.3 und 7q31 gefunden. Beim Vergleich mit den DLBCL stellte sich außerdem heraus, dass Allelverluste auf 6q und 7q frühe Ereignisse in der Progression zu DLBCL zu sein scheinen.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.
Die Synovialmembran zeigt bei Osteoarthrose, einer primär degenerativen Erkrankung, ein sekundäres entzündliches Geschehen. Histopathologisch existiert das entzündliche Infiltrat in zwei unterschiedlichen Mustern, die jedoch eine sekundäre, durch Knorpelalteration bedingte Synovialitis gemeinsam haben: (1) Detritus Synovialitis und (2) lympho-plasmazelluläre Synovialitis, beide mit leicht ausgeprägter entzündlicher Infiltration durch Lymphozyten und Plasmazellen. Ziel dieser Studie war es, ein genaueres Verständnis von der B-Zell-Aktivierung in der Synovialmembran der OA zu eruieren. Denn es ist immer noch ungeklärt, ob die B-Lymphozyten im synovialen Infiltrat Antigen-aktiviert sind, als solche möglicherweise schon einwandern, oder ob sie auch lokal expandieren (im Sinne einer antigenabhängigen Affinitätsmaturation), wie bei der RA. Bei dieser ist inzwischen eine lokale Affinitätsmaturation in synovialen Keimzentren bewiesen. Dazu wurden IgVH-Gene der synovialen B-Lymphozyten analysiert und immunhistochemische Färbungen durchgeführt, da bis dato noch wenige morphologische, als auch molekularbiologische Daten über die synovialen B-Zellen bzw. Plasmazellen in der OA vorliegen. Ein Fokus wurde auf die Antigen-Aktivierung der synovialen B-Lymphozyten (charakterisiert durch hohe R/S-Ratios) gerichtet. Um der Herkunft des Entzündungsgeschehens nachzugehen, wurde die Histologie verschiedener Differenzierungsstufen von B-Lymphozyten im entzündlichen Infiltrat von nicht-follikulären und follikelähnlichen B-Zell-Ansammlugen analysiert. Durch CD27/CD20– und CD27/Syndekan-Doppelfärbungen konnte die bevorzugte Lokalisation von Memory-und Plasma-Zellen identifiziert werden. Diese gab nähere Hinweise auf den Ort der Antigen-Aktivierung bei Osteoarthrose. Die Resultate der hohen R/S-Ratios (17/24 Klonen), gerade in den CDR-Regionen, stehen im Einklang mit der gängigen Meinung, dass die CDR-Regionen mehr mutieren als die FR-Regionen, da in diesen eher ein konstantes Antikörpermerkmal erhalten wird, wohingegen die CDR´s auf eine Affinitätsanpassung (durch höhere Mutationsraten) ausgerichtet sind. Die Mutationsrate weist auf eine stattgefundene Antigenaktivierung dieser B-Lymphozyten hin. Aus den histologischen Schnittbildern mit den oben genannten Doppelfärbungen war v.a. perivaskulär ein Vorkommen von vielen CD27+/CD20+ Memory-B-Zellen (PMZ/IaM), sowie Plasmazellen zu erkennen, dahingegen relativ betrachtet wenige CD27-CD20+ B-Lymphozyten. Dies deutet darauf hin, dass bei der OA vermehrt bereits aktivierte Memory-Zellen ins Synovialgewebe einwandern. Allerdings zeigte sich eine unerwartete Anhäufung von Follikelähnlichen Formationen ohne Keimzentrumscharakter, die Anlaß zu weiteren Überlegungen geben. Die Diskussion findet im Rahmen des generellen Pathogenese-Konzepts der OA statt, mit besonderem Augenmerk auf die unterschiedlichen Entzündungstypen und -muster, sowie die dominierenden Zelltypen in der osteoarthrotischen Synovialmembran. Da in dem Entzündungsinfiltrat der osteoarthrotischen Synovialmembran keine Keimzentren zu finden sind, nur Follikelähnliche Formationen, muss von einer Antigen-Aktivierung und Affinitätsreifung außerhalb des Gelenkes ausgegangen werden. Bei nahezu allen morphologischen Betrachtungen der osteoarthrotischen Synovia fiel eine deutlich hohe Anzahl von CD27+/CD20+ Memory-B-Lymphozyten perivaskulär auf. Daher kann davon ausgegangen werden, dass wir es beim arthrotischen Entzündungsinfiltrat mit einer Sekundär-Antwort zu tun haben, die auf Antigene reagiert, an die sich das Immunsystem „erinnert“ und bereits aktivierte B-Zellen einwandern. Zusammenfassend legt die Datenlage nahe, dass man offensichtlich von einer immunologischen Bekanntheit es körpereigenen Immunsystems mit freigesetzten Antigenen in der OA spechen kann. Hierdurch wurde ein Beitrag zum immunpathogenetischen Verständnis der sekundären Begleitsynovialitis dahingehend gefunden, dass die geringer ausgeprägte Entzündung in der Arthrose -im Gegensatz zur RA- ein Ausdruck der Reaktivität auf „dem Immunsystem in Erinnerung gebliebener“ Antigene ist. Der Vergleich der potentiellen Antigene bei den Krankheitsbildern RA und OA weist einige Gemeinsamkeiten auf, wodurch sich die Frage einer genetischen Prädisposition für das Ausmaß des Entzündungsgrades in den Gelenken ergibt.
Der Transkriptionsfaktor NF-ATc (Nuclear Factor of Activated T cells) kontrolliert die Genexpression in T-Lymphozyten. In dieser Arbeit, in der Jurkat-T-Zellen und embryonale 293-Zellen als Modellsysteme verwendet wurden, konnte gezeigt werden, daß die N-terminale transaktivierende Domäne TAD-A von NF-ATc in vivo induzierbar durch den Phorbolester TPA, in vitro durch die MAP-Kinase Erk2 phosphoryliert wird. In Transfektionsexperimenten mit einer TAD-A-Mutante, in der alle fünf Serinreste, die theoretisch durch MAP-Kinasen phosphoryliert werden können, durch Alaninreste ersetzt worden waren, konnte gezeigt werden, daß diese Phosphorylierung nicht notwendig für die Aktivierung von TAD-A ist. Vielmehr gelang der Nachweis, daß verschiedene MAP-Kinasen-Signalwege ihre Wirkung auf NF-ATc über die transkriptionellen Koaktivatoren CBP und p300 entfalten, die an die N-terminale transaktivierende Domäne TAD-A von NF-ATc binden und dessen Aktivität kontrollieren. Der Nachweis, daß konstitutiv aktive Mutanten von c-Raf und Rac synergistisch die CBP/p300-vermittelte TAD-A-Aktivierung verstärken, unterstreicht die wichtige Rolle, die CBP/p300 bei der Integration von T-Zell-Aktivierungssignalen spielt.
Genetische Veränderungen von Thymomen, insbesondere rekurrente Aberrationen, sind bislang unbekannt. In dieser Dissertation wurden 13 WHO Typ A Thymome, 23 WHO Typ B3 Thymome sowie 12 primäre Plattenepithelkarzinome (WHO Typ C Thymome) sowie einige seltene Primärtumoren des Thymus mittels Komparativer genomischer Hybridisierung untersucht. Mit Ausnahme eines einzigen Falles zeigten WHO Typ A Thymome keine chromosomalen Gewinne oder Verluste. Im Gegensatz dazu fanden sich bei allen Thymomen des Typs B3 genetische Aberrationen. Der Gewinn von 1q trat in 15 (65%), Gewinne von Chromosom 16 und Xq traten in jeweils 3 (13%) Fällen auf. Verluste fanden sich auf Chromosom 6 in 10 Fällen (43%) und an 13q in 6 Fällen (23%). Die häufigsten Gewinne bei primären Plattenepithelkarzinomen fanden sich auf 1q in 7 Fällen (58%), auf 17q in 4 Fällen (33%) und auf Chromosom 5 und 18 in jeweils 3 Fällen (25%). Rekurrente Verluste traten bei dieser Entität auf Chromosom 16q in 8 Fällen (67%), auf Chromosom 6 in 6 Fällen (50%), auf Chromosom 3 in 4 Fällen (33%) und auf den Chromosomen 13q sowie 17p in jeweils 3 Fällen (25%) auf. Die Dissertation zeigt, daß histologisch unterschiedliche Thymome mit unterschiedlichen, rekurrenten Aberrationen assoziiert sind. WHO Typ A Thymome weisen nur vereinzelt genetische Aberrationen auf. Thymome vom WHO Typ A und Typ B3 weisen verschiedene genetische Phänotypen auf, während Thymome vom Typ B3 sowie die primären Plattenepithelkarzinome des Thymus gemeinsame genetische Aberrationen zeigen. Neben den pathogenetischen Aspekten weist der beobachtete Verlust von Chromosom 6, auf dem sich die Genloci der HLA-Moleküle befinden, bei WHO Typ B3 Thymomen auch auf eine Rolle bei der Entstehung paraneoplastischer Autoimmunphänomene wie der Myasthenia Gravis hin.
Der Gewebe Mikroarray ist eine sehr effektive Methode eine große Anzahl von Lymphomen in kurzer Zeit und unter gleichen Färbebedinungen zu untersuchen. Es wurde eine hohe Übereinstimmung bei den homogen exprimierten Markern erzielt. Schwierigkeiten ergeben sich nur in der Erfassung von regional begrenzten Überexpressionen, hier am Beispiel der Maximalexpression des Proliferationsmarkers Ki67 untersucht. Ferner wurden ein Vergleich von verschiedenen Markern zwischen Frischmaterial und formalinfixiertem Paraffinmaterial erstellt, sowie ein Immunphänotyp für ausgewählte NHL Enitäten.
Elevation of intracellular cAMP in T lymphocytes, induced by agents such as IL-1α, prostaglandins or forskolin, inhibits Th1-type cytokine production but stimulates Th2-type cytokine production. The signaling pathway engaged in cAMP-mediated induction of Th2 lymphokines remains obscure and therefore my doctoral work was focused on the elucidation of cAMP pathway in primary Th lymphocytes. While forskolin treatment of EL-4 cells led both to an activation of Th2 lymphokines and inhibition of Th1 lymphokines, ectopic expression of catalytically active PKA stimulated Th2 lymphokines but failed to inhibit Th1 lymphokine expression. Thus, the PKA activity is selectively involved in the stimulation of Th2 lymphokine expression whereas other cAMP-dependent pathway(s) appears to downregulate Th1 lymphokines. By investigating different types of primary murine Th cells, it was found that active PKA enhanced IL-5 expression only in Th0 and Th2 but not in Th1 cells. This is likely due to the different levels of GATA-3 whose expression is high in Th2, moderate in Th0 and very low in Th1 cells. Ectopic expression of GATA-3 in Th1 cells induced Th2 lymphokine expression which could be further enhanced by increased cAMP levels or PKA activity. Investigations on the role of increased cAMP levels on Th2 lymphokines in D10 cells, a Th2-type cell line, led to the conclusion that elevated cAMP concentrations do not stimulate PKA but p38 activity which, through phosphorylation of GATA-3, appeared to induce IL-5 and IL-13 expression (Chen et al., 2000). While focusing on primary Th lymphocytes, it was observed that expression of the catalytic subunit α of PKA is sufficient for optimal IL-5 expression in primary Th0 cells. In addition, downregulation of IL-5 production in primary Th2 cells by the treatment with low concentrations of H-89, a PKA specific inhibitor, as well as by the ectopic expression of a negatively acting version of regulatory PKA subunit I demonstrates that active PKA plays an important role in IL-5 gene regulation. These findings using different types of primary CD4+ T lymphocytes, including Th2 cells, the one likely to represent the native IL-5 producers in vivo, demonstrates that the adenylyl cyclase/cAMP/PKA signaling pathway plays an important role in IL-5 gene expression in primary Th2 cells. Thus the importance of cAMP/PKA signaling pathway in Th2 effector function was established during this doctoral research work.
Die Synthese des Transkriptionsfaktors NF-ATc erfolgt in drei Isoformen, die sich vor allem in der Länge ihrer C-terminalen Peptide unterscheiden und individuelle transaktivierende Eigenschaften besitzen. NF-ATc spielt eine wesentliche Rolle bei der Induktion des IL-4 Promotors sowie bei der Th2-Zelldifferenzierung. Mit Hilfe eines murinen in vitro T-Zelldifferenzierungsmodells konnten wir zeigen, dass nur die Expression der kurzen Isoform NF-ATc/A induziert wird, während die der längeren Isoformen NF-ATc/B und NF-ATc/C nahezu konstitutiv verläuft. Naive CD4+T-Zellen exprimieren nach dem ersten Antigen-Kontakt ausschließlich die beiden Isoformen NF-ATc/B und NF-ATc/C. Im Zuge der T-Zelldifferenzierung erlangen Antigen-erfahrene Th1- und Th2-Zellen schließlich die Fähigkeit zur massiven und induzierbaren de novo Synthese der kurzen Isoform NF-ATc/A. Dies wird infolge alternativer Spleiss- und Polyadenylierungsvorgänge durch die Benutzung einer proximalen, gering-affinen poly A-"site", pA1, ermöglicht, die nur bei hohen Konzentrationen von poly A-Faktoren – wie sie in Effektor-T-Zellen vorliegen – erkannt wird und in naiven T-Zellen inaktiv bleibt. Die massive Induktion von NF-ATc/A mit einer konsekutiven Änderung der Zusammensetzung an nukleären NF-ATc-Isoformen mit individuellen transaktivierenden Eigenschaften ermöglicht offenbar das Erreichen kritischer Schwellenwerte für Transkriptionsfaktoren und die Induktion spezifischer Zielgene. In diesem Zusammenhang wiesen unsere Ergebnisse die induzierbare und zellspezifische Bindung von NF-ATc an das cis-regulatorische Element Pu-bB des IL-4 Promotors in Th2-Zellen nach und belegen im besonderen, dass unterschiedliche Bindungseigenschaften von NF-ATc zu einer selektiven Expression des IL-4 Gens in Th2-Zellen beitragen.
In der vorliegenden Arbeit wurden der klinische Verlauf der Tumorerkrankung von 40 Kindern, die an einem Ependymom erkrankten, erfasst und 58 Tumorproben mittels immunhistochemischer Methoden untersucht. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen standen die Überprüfung der p53-Akkumulation, der Proliferationsaktivität mit Hilfe des Antikörpers MIB-1 sowie der Expression von HLA-DR durch Tumorzellen und eine Einschätzung der prognostischen Aussagekraft dieser Faktoren. Weiterhin wurde die EMA-Expression untersucht und eine Schwerpunkt auf die Analyse von Verteilung und Proliferationsaktivität der Zellen des Mikroglia(MG)/Makrophagen-Systems in kindlichen Ependymomen gelegt. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung lag bei 61 Monaten (8 Monate bis 15 4/12 Jahre, Median: 41 Monate), eine Geschlechtspräferenz lag nicht vor. 22,5% der Primärtumoren waren supratentoriell, 60% infratentoriell und 17,5% spinal lokalisiert. 52,5% der Primärtumoren waren anaplastische Ependymome (WHO Grad III), 40% Ependymome (WHO Grad II), 7,5% myxopapilläre Ependymome (WHO Grad I). Eine totale Resektion konnte in 30,8% bei Primärtumoren und in 27,3% bei Rezidivtumoren erzielt werden. Das mittlere Nachbeochtungsintervall betrug 52 Monate (6-163 Monate), das mittlere progrssionsfreie Interval (PFS) 28 Monate und der mittlere Überlebenszeitraum (OS) 64 Monate. Tumorrezidive entwickelten sich mit einer Ausnahme eines Spätrezidives nach 84 Monaten innerhalb von 36 Monaten nach der operativen Tumorentfernung. Von den klinischen Variablen weist einzig das Resektionsausmaß eine prognostische Bedeutung auf (total vs. inkomplett: p=0.035 bezüglich des mittleren PFS, p=0.12 bezüglich des mittleren OS). Alle anderen klinischen Variablen, einschließlich des Tumorgrades nach WHO, zeigen keinen Einfluss auf den Verlauf der Tumorerkrankung. p53-Akkumulation kommt in 56,9% der untersuchten Tumorproben vor und korreliert mit dem Tumorgrad nach WHO, dem MIB-1 Labeling Index (LI) und der Lokalisation. Der MIB-1 LI zeigt eine große Streubreite (1,4% - 63,3%) und weist entsprechend des untersuchten Patientenkollektivs im Gegensatz zu Ependymomen des Erwachsenenalters einen hohen Mittelwert und Median auf (21,8% bzw. 19,8%). Der MIB-1 LI korreliert statistisch signifikant mit dem WHO-Graduierungssystem, der Lokalisation und wie bereits erwähnt mit der p53-Akkumulation. Unter den immunhistochemisch untersuchten Variablen kommt lediglich dem MIB-1 LI im untersuchten Patientenkollektiv eine gewisse prognostische Aussagekraft zu. Statistische Signifikanz wird allerdings nicht erreicht (MIB-1 LI <10% vs. MIB-1 LI >10%: p=0.17 bezüglich des mittleres PFS). Erstmals wurde in 80,4% der untersuchten ependymalen Tumoren auch eine Proliferation von Zellen des MG/Makrophagen-Systems nachgewiesen. Bei weitgehend konstant niedriger absoluter Anzahl proliferierender Zellen des MG/Makrophagen-Systems existiert kein Unterschied diesbezüglich zwischen den Tumorgraden wie kürzlich bei astrozytären Tumoren nachgewiesen. Die Verteilung der Zellen des MG/Makrophagen-Systems zeigte bei sehr heterogenem Verteilungsmuster häufig eine septale Anordnung insbesondere der amöboiden MG und der Makrophagen. Es existieren unterschiedliche Verteilungsmuster mikroglialer Zellen und Makrophagen, die sich aber anderen Parametern nicht zuordnen lassen mit der Ausnahme der MG/Makrophagen-Zelldichte in Primärtumoren. Obwohl eine HLA-DR Expression durch Tumorzellen auch in anderen Neoplasien des ZNS häufig vorkommt, wurden Ependymome diesbezüglich bisher nicht untersucht. In 52,6% aller Tumorproben finden sich in der vorliegenden Arbeit HLA-DR exprimierende Tumorzellen. Eine EMA-Expression zeigt sich in 84,5% der untersuchten Fälle und ist damit ein Charakteristikum ependymaler Neoplasien, das auch als differentialdiagnostisches Kriterium angesehen werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bekräftigen den hohen prognostischen Stellenwert einer totalen Resektion in der Therapie ependymaler Tumoren des Kindesalters. Weiterhin wird die Bedeutung der Proliferationsaktivität für den klinischen Verlauf der Tumorerkrankung unterstrichen. Von großem wissenschaftlichem Interesse ist weiterhin die Klärung der Ursache und Bedeutung der häufig anzutreffenden p53-Akkumulation sowie der immunologischen Bedeutung der Zellen des MG/Makrophagen-Systems im Rahmen der Tumorabwehr.
Die Entstehung maligner Zellen durch irreversible genetische Veränderungen ist ein allgegenwärtiger Prozess im menschlichen Organismus. Allein die spontane Mutationsrate genügt um in einem Organismus permanent transformierte Zellen entstehen zu lassen, welche den Körper in kürzester Zeit überschwemmen würden. Auch wenn bestimmte genetische Schäden frühzeitig durch Reparaturmechanismen beseitigt werden und sich nicht jede transformierte Zelle in einem Tumor manifestiert, so ist die eigentliche Frage nicht, warum Krebs entsteht, sondern warum er bei der hohen Mutationsrate so selten auftritt. Verantwortlich für die frühe Erkennung und Beseitigung transformierter Zellen ist das körpereigene Immunsystem, das in der Lage ist die meisten aberranten Zellen zu entfernen, sodass der manifeste Tumor die Ausnahme und nicht die Regel ist. Der menschliche Organismus verfügt über ein angeborenes und ein erworbenes Immunsystem. Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, ob maligne Zellen mit ihren veränderten Oberflächenstrukturen erst eine Immunantwort induzieren müssen oder ob, wie bei der Abwehr infektiöser Partikel, die angeborene Immunität für die Beseitigung von Tumorzellen verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit verwendete humane Hybridoma Technologie (Immortalisierung menschlicher Lymphozyten und Isolierung monoklonaler Antikörper) bietet die einzigartige Möglichkeit, sowohl aus an Krebs erkrankten Patienten als auch aus gesunden Probanden tumorspezifische Antikörper zu isolieren und durch deren genauere Charakterisierung Einblicke in die humorale Immunität gegen maligne Zellen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit werden fünf humane monoklonale Antikörper beschrieben, die aus verschiedenen Tumorpatienten gewonnen wurden, sowie zwei Antikörper, die aus gesunden Probanden isoliert werden konnten. In allen Fällen erwiesen sich die Antikörper als tumorspezifisch, d.h. sie reagieren nicht mit gesundem Gewebe und sind demnach keine Autoantikörper. Es handelt sich weiterhin in allen Fällen um Antikörper des IgM-Isotyps; es konnten keinen Antikörper anderer Ig-Klassen isoliert werden. Genetische Analysen ergaben, dass alle isolierten Antikörper gering oder gar nicht mutiert waren, was bedeutet, dass sie nicht durch Stimulation affinitätsgereift sind. Zudem konnte demonstriert werden, dass alle Antikörper Apoptose von Tumorzellen induzieren und dass sie an eine Zuckerkette ihrer Antigene binden oder solche Carbohydrate zumindest entscheidend in die Bindung involviert sind. Die Eigenschaften der in dieser Arbeit beschriebenen Antikörper wurden mit anderen bereits etablierten IgM-Antikörpern verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass alle Antikörper, welche sich als tumorspezifisch erwiesen, ähnliche Eigenschaften zeigen. Interessant ist zudem die Beobachtung, dass die Keuzreaktion der Antikörper, also ihre Reaktion mit anderen Tumorgeweben, reziprok mit dem Mutations-grad korreliert ist. Je mehr Mutationen ein Antikörper aufweist, desto eingeschränkter und spezifischer sind demnach seine Reaktionen mit anderen Tumoren. Dies deutet darauf hin, dass auch innerhalb der Keimbahn-kodierten Antikörper durch vereinzelte Mutationen eine höhere Variabilität erzeugt werden kann. Ähnlich wie bei der Affinitätsreifung der erworbenen Immunität scheint sich auch hier die Spezifität mit der Anzahl der Mutationen zu erhöhen. Zusammenfassend weisen die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass zumindest die humorale Immunität gegen maligne Zellen das Resultat der angeborenen Immunität ist und nicht von Tumorzellen induziert wird. Dies bedeutet zudem, dass Moleküle wie natürliche Antikörper in der Immunität eine viel größere Rolle spielen als bisher angenommen. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits bei der Untersuchung der Immunität gegen bakterielle Antigene erzielt, sodass hier vermutet werden kann, dass die gleichen Mechanismen zugrunde liegen wie bei der Abwehr transformierter Zellen. Darüber hinaus wird die Frage beantwortet, warum ein manifester Tumor eine Ausnahme bleibt. Die angeborene, primäre Immunität verfügt über ein existierendes Repertoire an Rezeptoren, welche eine ausreichende Variabilität aufweisen, und muss daher nicht erst über ein komplexes System von Erkennung und Stimulation, wie die adaptierte Immunität, induziert werden. Dieser logistische Vorsprung der natürlichen Immunität garantiert eine permanente Überwachung und eine schnelle Reaktion gegenüber veränderten Zellen und fremden Partikeln.