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Dies ist ein Lehrbuch über die HIV-1 Replikation, Pathogenese und Therapie. Es richtet sich an Studenten der Biologie und der Medizin, die etwas mehr über HIV erfahren wollen und stellt neben virologischen Themen auch die zellulären Grundlagen dar. Es umfasst den Viruseintritt, die reverse Transkription, Genom-Integration, Transkriptionsregualtion, die Kotrolle des Spleißens, der Polyadenylierung und des RNA-Exportes. Die Darstellung wird abgerundet mit Kapiteln zum intrazellulärem Transport, zu Nef und zum Virusassembly. In zwei weiteren Kapitel wird die HIV-1 Pathogenese und die Therapie besprochen. Zur Lernkontrolle sind den Kapiteln Fragen und auch Klausurfragen angefügt.
Der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1) als neues potenzielles Ziel im Multiplen Myelom
(2013)
Die evolutionär hoch konservierte Hitzeschock-Antwort (heat shock stress response, HSR) ermöglicht Zellen sich an Stresssituationen anzupassen und so dem programmierten Zelltod zu entgehen. Die Regulation der HSR unterliegt dem Hitzeschock-Transkriptionsfaktor 1 (HSF1), der nach einem Stress-Impuls umgehend die Synthese der Hitzeschock-Proteine (HSP) initiiert. Als molekulare Chaperone assistieren die HSP bei der Faltung und den intrazellulären Transport ihrer Klientenproteine und erhalten so die lebensnotwendigen zellulären Funktionen aufrecht. Während das HSF1/HSP-System vorteilhaft für normale Zellen ist, kann es aber auch den Prozess der malignen Transformation unterstützen. In verschiedenen Tumorentitäten wurde eine Abhängigkeit der malignen Zellen von HSP, vereinzelt auch von HSF1, beschrieben. Im multiplen Myelom (MM) stabilisieren HSP u.a. Klientenproteine in einem komplexen onkogenen Signalnetzwerk und erhalten so eine aberrante Signalweiterleitung aufrecht. Wegen dieser wichtigen Funktion ist die Inhibition der HSP (insbesondere HSP90) bereits ein therapeutischer Ansatzpunkt, der jedoch im MM noch nicht zu dem erhofften Erfolg führte. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass es zu einer Induktion der HSP nach einer Behandlung mit neuen, antitumoralen Medikamenten (Proteasom-, HDAC- und HSP90-Inhibitoren) kommt. Diese kompensatorische Hochregulation der HSP ist assoziiert mit einem Resistenzverhalten gegenüber der Therapie und ist somit unerwünscht. Die bisherigen Untersuchungen legen aber auch nahe, dass HSF1 selbst eine wichtige Funktion bei der malignen Transformation einnimmt. So wurde gezeigt, dass der funktionelle Verlust von HSF1 vor der onkogenen Ras oder mutierten Trp53 getriebenen Tumorigenese schützt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Expression von HSF1, seine Rolle in der HSP-Regulierung und den Beitrag zum Überleben und Resistenzen in MM-Zellen analysiert. Untersuchungen der HSF1-Expression in Knochenmarkbiopsien von Myelompatienten und in Myelomzelllinien zeigten, dass in ca. 50 % der untersuchten Biopsien und Zelllinien eine hohe HSF1-Expression vorhanden ist. Sowohl der shRNA-vermitteltem Knockdown von HSF1 als auch die pharmakologische Inhibition mit Triptolid induzierten Apoptose in MM-Zellen. Durch Microarrayanalysen nach shRNA-vermitteltem Knockdown und der anschließenden Verifikation über Western Blot konnte gezeigt werden, dass nach der HSF1-Depletion zahlreiche HSP (HSP90, HSP70, HSP40 and HSP27) vermindert exprimiert wurden. Einzelne Knockdown Experimente der HSP40 und HSP27 führten zu moderaten Zellsterben, so dass geschlussfolgert werden kann, dass die gleichzeitige Minderung multipler HSP, durch die Depletion von HSF1, zu einem summierten starken apoptotischen Effekt führt. In weiteren Studien stellte sich heraus, dass in MM-Zellen, trotz des deregulierten Systems und der aberrant hohen Expression der HSP, eine Stressantwort ausgelöst werden kann. Dies konnte durch den „klassischen“ Hitzschock und durch die Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren von HSP90 und des Proteasoms erreicht werden. Diese unerwünschte Reaktion auf Therapeutika wird vermutlich durch einen kompensatorischen Zellrettungsmechanismus ausgelöst, der zu Resistenzen gegenüber der Behandlung führen kann. Durch die Inhibition von HSF1 mit Triptolid und durch shRNA-vermitteltem Knockdown, konnte diese zelluläre Antwort unterbunden werden. Darüber hinaus führte die pharmakologische Inhibition von HSF1 in Kombination mit HSP90 (mit NVP-AUY922) oder Proteasom-Inhibition (mit Bortezomib) zu einem verstärkten apoptotischen Effekt in MM-Zellen. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HSF1 essenziell für die Regulation der HSP im MM ist. Darüber hinaus kann die Inhibition von HSF1, besonders in Kombination mit HSP90- oder Proteasom-Inhibition, eine neue hoffnungsvolle Therapieoption für Myelompatienten darstellen.
Die Hälfte der Weltbevölkerung lebt mit dem Risiko, an einer schweren Malaria tropica zu erkranken. Zunehmende Resistenzen von Plasmodium falciparum gegen gängige Therapeutika erschweren eine Behandlung, und es existiert keine Möglichkeit frühzeitig die Wirksamkeit der angewandten Medikation festzustellen. Die Bestimmung der Parasitämie als einzig verfügbarer Parameter kann auch bei erfolgreicher Therapie noch über den ersten Tag ansteigen. Das Ziel dieser Studie war, lichtmikroskopische Parameter zu finden, mit denen der Erfolg einer Therapie frühzeitig festgestellt werden kann. So wurden im Rahmen einer Fallstudie die Plasmodien eines an einer schweren Malaria tropica erkrankten Patienten auf morphologische Veränderungen im Verlauf der Chinin-Therapie untersucht. Die Beurteilung der Plasmodien erfolgte durch eine Einteilung nach ihrer Lage im Erythrozyten und der Kern-Plasma-Relation der Ringformen, anschliessend wurden die Ergebnisse durch eine Vermessung der Plasmodien am Computer verifiziert. Es zeigte sich, dass ein Therapieerfolg anhand der Veränderung in der Morphologie der Ringformen bereits in den ersten Stunden nach Therapiebeginn festgestellt werden kann. So lässt sich innerhalb der ersten drei Stunden ein Wechsel von kleinen Ringformen mit dünnem, homogenem Zytoplasmaband zu vergrösserten Ringformen mit einem verbreiterten und inhomogenen Zytoplasma finden. Im weiteren konnten ab der 7. Therapiestunde eine zunehmende Lageveränderungen der Plasmodien im Erythrozyten aufgezeigt werden. So waren ab diesem Zeitpunkt zunehmend Plasmodien, die die Erythrozyten-Membran hervorwölben (Arbeitstitel „Accentué“-Formen), im peripheren Blutausstrich des Patienten zu sehen. Dass die Änderung der Kern-Plasma-Relation der Ringformen ursächlich einer direkten Medikamentenwirkung zuzuschreiben sind, konnte in einem abschliessenden „in vitro“-Studienteil gezeigt werden, in welchem Plasmodien-Kulturen unter Chinin-Einfluss mit Kontrollkulturen ohne Medikamenteneinfluss verglichen wurden.
Protection of healthy tissues from infection with systemically administered vaccinia virus strains
(2012)
Oncolytic virotherapy using recombinant vaccinia virus strains is a promising approach for the treatment of cancer. To further improve the safety of oncolytic vaccinia viruses, the cellular microRNA machinery can be applied as the host’s own security mechanism to avoid unwanted viral replication in healthy tissues. MicroRNAs are a class of small single-stranded RNAs which due to their ability to mediate post-transcriptional gene-silencing, play a crucial role in almost every regulatory process in cellular metabolism. Different cancers display unique microRNA expression patterns, showing significant up- or downregulation of endogenously expressed microRNAs. Furthermore, the behavior of cancer cells can be altered by either adding microRNAs known to inhibit cancer cell spread and proliferation or suppressing cancer promoting microRNAs (oncomirs) making microRNAs promising targets for cancer gene therapy. The cell’s own RNAi machinery can also be utilized to control viral replication due to the virus dependence on the host cell replication machinery, a process controlled by microRNAs. GLV-1h68 is a replication-competent recombinant oncolytic vaccinia virus constructed and generated by Genelux Corp., San Diego, CA, USA which carries insertions of three reporter gene cassettes for detection and attenuation purposes and is currently being evaluated for cancer treatment in clinical trials. Though there are hardly any side effects found in GLV-1h68 mediated oncolytic therapy an increased tropism for replication exclusively in cancer cells is desirable. Therefore it was investigated whether or not further cancer cell specificity of a recombinant vaccinia virus strain could be obtained without compromising its oncolytic activity using microRNA interference. Let-7a is a well characterized microRNA known to be expressed in high levels in healthy tissues and strongly downregulated in most cancers. To control vaccinia virus replication rates, four copies of the mature human microRNA let-7a target sequence were cloned behind the stop codon in the 3’end of the vaccinia virus D4R gene, using a GLV-1h68 derivative, GLV-1h190, as parental strain yielding the new recombinant virus strain GLV-1h250. The D4R gene belongs to the group of early transcribed vaccinia genes and encodes an essential enzyme, uracil DNA glycosylase, which catalyzes the removal of uracil residues from double-stranded DNA. A defect in D4R prevents vaccinia virus from entering into the intermediate and late phase of replication, leading to an aborted virus replication. After expression of the microRNA target sequence from the vaccinia virus genome, the endogenously expressed microRNA-let-7a should recognize its target structure within the viral mRNA transcript, thereby binding and degrading the viral mRNA which should lead to a strong inhibition of the virus replication in healthy cells. GLV-1h250 replication rates in cancerous A549 lung adenocarcinoma cells, which show a strong down-regulation of microRNA let-7a, was comparable to the replication rates of its parental strain GLV-1h190 and the control strain GLV-1h68. In contrast, GLV-1h250 displayed a 10-fold decrease in viral replication in non-cancerous ERC cells when compared to GLV-1h190 and GLV-1h68. In A549 tumor bearing nude mice GLV-1h250 replicated exclusively in the tumorous tissue and resulted in efficient tumor regression without adverse effects leading to the conclusion that GLV-1h250 replicates preferentially in cancerous cells and tissues, which display low endogenous let-7a expression levels.
Nach Einschätzung der Weltgesundheitsorganisation WHO wird Krebs im Jahr 2013 die weltweit häufigste Todesursache bei Menschen und Haustieren sein. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Hauptziel einer Tumortherapie ist es, sowohl den Primärtumor als auch die Metastasen möglichst vollständig zu entfernen. Dabei wird nach Methoden gesucht, die im Gegensatz zu den meisten gegenwärtigen therapeutischen Einsätzen, wie der chirurgischen Entfernung bösartiger Neubildungen, Chemotherapie und Strahlentherapie, selektiv die bösartigen Zellen erkennen und zerstören können. Eine faszinierende Möglichkeit in dieser Hinsicht ist die Verwendung von onkolytischen Viren, die die Fähigkeit besitzen, sich selektiv sowohl in Primärtumoren als auch in Metastasen anzusiedeln und die Krebszellen dort zu zerstören. Das Konzept, dass Viren nützlich für die Bekämpfung von Krebs sein könnten, ist nicht neu. Allerdings konnte erst in den letzten Jahren durch zahlreiche Studien bestätigt werden, dass verschiedene Viren in der Lage sind, eine signifikante Antitumorwirkung in vivo auszuüben. Zu den erfolgversprechenden onkolytischen Viren zählen insbesondere Adenovirus, Herpes simplex Virus, Reovirus und Vaccinia-Virus, die sich bereits in Phase III der klinischen Studien befinden oder kurz davor sind. Die therapeutische Nutzung von tumorspezifischen onkolytischen Viren beim Menschen hat bereits begonnen. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Wirkungsweise von Vaccinia-Virus-Stämmen bei der Therapie verschiedener Tumore aus Mensch und Hund im Xenotransplantat-Mausmodell bearbeitet: die Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums sowie die Effekte der Virusinfektion auf das Tumormikromilieu und die Mitwirkung des angeborenen Immunsystems bei der Virotherapie. Das Tumormikromilieu (Stroma) setzt sich aus einer Vielzahl verschiedener Zellen und Komponenten der extrazellulären Matrix zusammen. Die Krebszellen bilden unter anderem mit Endothelzellen des Blut- und Lymphsystems und verschiedenen Immunzellen eine komplexe Organ-ähnliche Struktur. Weitere wichtige Bestandteile des Stromas sind Wachstumsfaktoren, Chemokine und Zytokine und die Tumorvaskulatur. Diese ist durch zahlreiche strukturelle und funktionelle Abnormalitäten charakterisiert, wodurch die Effektivität von Strahlen- und Chemotherapie herabgesetzt wird. Weiterhin ist das Tumormikromilieu durch seine Ähnlichkeit mit einer chronischen Entzündungsreaktion gekennzeichnet und wirkt immunsupprimierend auf rekrutierte Leukozyten, die wiederum die Inflammation verstärken und die Angiogenese und das Tumorwachstum weiter fördern. Aufgrund dieser vielen Komponenten ist die Zusammensetzung jedes Tumors einzigartig, weswegen Standardtherapien häufig nicht zu einer Heilung führen. Die Wirkung der Viren bei der Virotherapie beruht vermutlich auf 4 Mechanismen, die einzeln oder in Kombination auftreten können: die direkte Onkolyse der Krebszellen, die Zerstörung des Tumorblutgefäßsystems, die Aktivierung des Immunsystems des Wirts und die Suppression der microRNA-Expression des Wirtes. Zusätzlich kann die Expression therapeutischer Gene die onkolytische Wirkung verstärken. Zum Nachweis der Onkolyse der Krebszellen und Inhibition des Tumorwachstums wurde zuerst das Virus GLV-1h68 in einem autologen humanen Melanomzellpaar, 888-MEL und 1936-MEL, eingesetzt. Das GLV-1h68-Virus wurde auf Basis des Wildtyp Vaccinia-Virus LIVP durch die Insertion von 3 Expressionskassetten in den drei Genloci F14.5L, J2R und A56 genetisch konstruiert. 888-MEL, eine zu einem frühen Zeitpunkt der Krebserkrankung aus einer Metastase isolierte Zelllinie, zeigt nach Infektion mit GLV-1h68 im Mausmodell Tumornekrose („Responder“), während 1936-MEL aus einer späten Metastasierungsphase kaum mit Onkolyse auf eine Virusinfektion reagiert („Poor-Responder“). Die onkolytische Wirkung konnte mittels Durchflusszytometrie in Tumoren beider Zelllinien zu einem frühen Zeitpunkt nach Virusinfektion nachgewiesen werden. In 888-MEL-Tumoren wurde hierbei eine große Zahl infizierter und toter Zellen nach Virusinfektion gefunden. Gleichzeitig wurde eine hohe Zahl an Immunzellen detektiert, die nach Virusinfektion reduziert war. In den schwächer reagierenden 1936-MEL-Tumoren konnte eine Onkolyse bei Infektion mit höherer Virusmenge und zu einem früheren Zeitpunkt demonstriert werden, wodurch mehr Zellen infiziert wurden. Zusätzlich wurde eine Steigerung der nur in geringer Zahl vorhandenen Immunzellen nachgewiesen. Trotz des unterschiedlichen Tumormikromilieus konnte somit ein onkolytischer Effekt in beiden Tumormodellen erzielt werden. ...
Die idiopathische Lungenfibrose ist eine seltene Form der interstitiellen Lungenerkrankung mit variablem Krankheitsverlauf und schlechter Prognose. Diese Arbeit untersucht den Effekt einer Kombinationstherapie aus Immunsuppressiva (Azathioprin / Cyclophosphamid) und Corticosteroiden auf den Verlauf der Erkrankung, v. a. im Hinblick auf eine mögliche Stabilisierung der Lungenfunktion.
Die Situation der Psychiatrie und die institutionelle Unterbringung der Geisteskranken am Ende des 18. Jahrhunderts sind gut erforscht. Doch was dem einzelnen Geisteskranken widerfuhr, unter welchen Sorgen und Nöten er als Kranker und Patient litt, welchen Problemen seine Familie und sein Umfeld ausgesetzt waren, wie es ihm außerhalb der Anstalt erging und welche Faktoren zur Unterbringung in eine Anstalt oder in einem Gefängnis oder auch zur Entlassung aus diesen beitrugen, ist bisher nur wenig erforscht. Der hier behandelte Aktenbestand des Nürnberger Stadtarchivs lässt Einblicke in den medizinischen, amtlichen und privaten Umgang mit den Irren am Ende des 18. Jahrhunderts zu. Die Irren in Nürnberg und Umgebung wurden zunächst meist von Angehörigen betreut und versorgt, wobei diese Aufgabe mit nicht wenigen Problemen behaftet war. Neben der finanziellen Belastung konnte ein Irrer auch zur Gefahr für Leib und Leben werden, wenn er in einem Anfall von Raserei gewalttätig gegen sich und andere wurde. In solchen Fällen ließ man bis zur Anzeige im Schöffenamt mit der Bitte, den Betroffenen internieren zu dürfen, keine Zeit verstreichen. Die Meinungen der Amtsärzte bzgl. der Internierungspraxis unterschieden sich hier ganz offensichtlich voneinander. Während die Betroffenen in den Akten bis etwa 1789 vorwiegend aufgrund von ‚Raserei‘, ‚Faulheit‘ oder ‚Blödheit‘ angezeigt und meist eine Bestrafung in Form von körperlicher Züchtigung oder Freiheitsberaubung gefordert wurde, so änderte der Umgang mit den Irren merklich. Internierungen gerieten mehr und mehr in die Kritik, wurden zu einer Übergangs- und später zu einer Art ‚Notlösung‘. Der mythisch-mystische Aspekt der Geisteskrankheiten geriet zunehmend in den Hintergrund. Viele Angehörige kümmerten sich auch ohne Weisung des Amtsarztes fürsorglich um ein irres Familienmitglied, bis es, z. B. aufgrund von Geldnöten, zur Internierung kam. Dr. Preu versuchte gerade die finanzielle Belastung der Familien, die ein wahnsinniges Familienmitglied betreuten, zu reduzieren. Seine Bemühungen für einen sozial-integrativen Umgang mit den Irren zeigten auch, dass man das Wegsperren der Wahnsinnigen zunehmend ablehnte und deren Reintegration förderte. Anhand von lebendigen Beispielen wird dieser Wandel in der Abhandlung anschaulich dargestellt.
Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy
(2010)
Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy.
Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-α-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden.
Das multiple Myelom, eine maligne Plasmazell-Dyskrasie, ist bis heute unheilbar. Eine Verbesserung des medianen Überlebens von weniger als 2 auf über 3 Jahre wurde erstmals 1996 durch eine prospektiv randomisierte Studie von Attal et al. gezeigt. Die retrospektive Analyse zweier zeitlich definierter Kohorten, Kohorte 1 (1990-1996) und Kohorte 2 (1997-2002), zur Überprüfung des Therapieerfolges am Universitätsklinikum Würzburg zeigt unter Berücksichtigung aller Patienten keinen Überlebensvorteil für Patienten der 2.Kohorte. Signifikant profitiert haben allerdings Patienten bis max. 65 Jahre der Kohorte 2, die durch die HD-Therapie ein 5-JÜL von 50% (Kohorte 2) vs.32% (Kohorte 1) erreichten, wohingegen sich für ältere Patienten keine signifikant messbaren Überlebensvorteile ergaben.
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine schwere, momentan noch unheilbare Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems, die weltweit ca. 1 Mio. Menschen betrifft. Da die zur Zeit verfügbaren, anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Therapieformen lediglich krankheitsverzögernd wirken, ist es Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen, Möglichkeiten zur spezifischen Interferenz mit bei der MS ablaufenden Pathomechanismen zu ergründen und im Tiermodell zu testen. Das von uns für diese Arbeit verwendete Mausmodell einer CD8+ T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) trägt dabei neuen Erkenntnissen Rechnung, die zeigen, dass zytotoxische T-Lymphozyten bei der Pathogenese der humanen MS von entscheidender Bedeutung sind. Es handelt sich um doppelt transgene Nachkommen von Mäusen, die das Modell-Antigen Ovalbumin (OVA) unter der Kontrolle eines Oligodendrozyten (ODC-)-spezifischen MBP-Promotors im ZNS exprimieren, und Mäusen, die Ovalbumin-spezifische CD8+ T-Zellen besitzen (OT-I Zellen). Es kommt in diesem Modell zur Autoantigenerkennung durch die CD8+ T-Zellen mit konsekutiver Ausbildung einer fulminanten, letal verlaufenden EAE. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, die therapeutische Potenz des monoklonalen Antikörpers 25-D1.16 zu evaluieren, der gegen das Autoantigen Ovalbumin in Kombination mit einem MHC-I-Molekül gerichtet ist. Mit Hilfe von FACS-Analysen und Fluoreszenz-Mikroskopie konnten wir zunächst bestätigen, dass 25-D1.16 spezifisch den Komplex aus dem Peptid SIINFEKL (antigenes Epitop von Ovalbumin) gebunden an ein MHC-I-Molekül (H-2Kb) erkennt. In nachfolgenden in vitro Versuchen wurde der Einfluss des Antikörpers auf Aktivierung und Proliferation von durch SIINFEKL:MHC-I-Komplex stimulierten OT-I Zellen untersucht. Es wurden hierfür Zellproliferation (Proliferations-Assays), Expression des Oberflächenmoleküls CD69 (FACS-Analysen) sowie IFN-γ-Sekretion (ELISA) gemessen. In Gegenwart von 25-D1.16 zeigte sich durchweg eine hochsignifikante Reduktion der jeweiligen Proliferations-/Aktivierungsmarker. Wir konnten somit in vitro zeigen, dass der gegen das Autoantigen Ovalbumin/H-2Kb gerichtete, monoklonale Antikörper 25-D1.16 kompetitiv die Aktivierung und Proliferation entsprechender T-Lymphozyten inhibieren kann. Um diese Daten in vivo zu validieren und die pathogenetische Relevanz zu überprüfen, haben wir ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Mäusen verschiedene Dosen von 25-D1.16 vor Auftreten erster EAE-Symptome einmalig intraperitoneal verabreicht. Anschließend wurde der Krankheitsverlauf klinisch beurteilt. Im EAE-Stadium 4 ohne Besserungstendenz oder bei Versuchsende wurden außerdem histologische Schnitte des Zentralnervensystems angefertigt, gefärbt (H.E., CD3, Mac-3, Luxol Fast Blue/PAS) und mit unbehandelten Tieren verglichen. Ein Teil der ODC-OVA/OT-I doppelt transgenen Tiere blieb nach Applikation des Antikörpers völlig gesund, während bei einem anderen Teil der Ausbruch der EAE zwar nicht vollständig verhindert, ihr Schweregrad aber deutlich gemildert wurde. Der Effekt der Antikörpertherapie war jedoch nicht nur klinisch, sondern auch histopathologisch überzeugend. So zeigte das Zentralnervensystem erfolgreich therapierter Mäuse eine weitgehend bis vollständig intakte Gewebsarchitektur (H.E.-Färbung) mit im Vergleich zu unbehandelten Mäusen drastisch reduzierter OT-I Zell- und Makrophagen/Mikroglia-Infiltration (Immunhistochemie CD3 und Mac-3). In der Luxol Fast Blue/PAS-Färbung fanden sich keinerlei Entmarkungsherde sondern durchgängig myelinisierte Axone. Es gelang uns somit durch hohe Antikörperdosen (500 μg pro ODC-OVA/OT-I doppelt transgener Maus) bei 83 % der behandelten Versuchstiere den Ausbruch der EAE ganz zu verhindern bzw. deren Verlauf deutlich abzumildern. Zusammenfassend beschreiben wir hier erstmals die antigen-spezifische Therapie einer CD8+ T-Zell mediierten EAE mittels eines gegen Peptid:MHC-I-Komplex gerichteten, monoklonalen Antikörpers. Durch Interferenz mit der Erkennung des Autoantigens durch die CD8+ T-Zellen waren wir in vivo in der Lage, den Pathomechanismus der EAE zu inhibieren. Hieraus ergibt sich ein vielversprechendes Behandlungskonzept für die Therapie der Multiplen Sklerose am Menschen.
Eine klassische HIV-Primärtherapie setzt sich aus einer Kombination von zwei Nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) mit Protease-Inhibitoren (PI) oder Nicht-Nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) zusammen. Vor allem aufgrund NRTI-assoziierter Nebenwirkungen durch mitochondriale Toxizität wird die Option eines Verzichts auf NRTI (NRTI-Sparing) untersucht. In der vorliegenden Langzeituntersuchung wurden drei therapienaive Patientenkollektive - (1) NRTI+PI [n=23], (2) NRTI+NNRTI [n=18] und (3) NNRTI+PI [n=19] - über 96 Wochen teilweise retrospektiv, teilweise prospektiv beobachtet. Die drei Kollektive wurden bezüglich Effektivität, Veränderungen von metabolischen und hämatologischen Laborparametern und kontinuierlichem Therapeutischen Drug Monitoring (TDM) anhand statistischer Auswertung verglichen. Dabei zeigten sich unter den NNRTI Efavirenz (EFV) und Nevirapin (NVP) geringere Plasmaspiegelschwankungen als unter PI. Im Vergleich der Therapiegruppen wurden für absolute und relative Plasmaspiegel keine signifikanten Unterschiede zwischen EFV, NVP und LPV (Lopinavir) beobachtet. Unabhängig des Krankheitsstadiums (CDC-Klassifikation) konnte in allen Gruppen eine maximale Suppression der Viruslast unter die Nachweisgrenze von <50 HIV-RNA-Kopien/ml und ein Anstieg der CD4-Zellzahlen beobachtet werden. Bezüglich virologischem und immunologischem Therapieerfolg gab es im Verlauf über 96 Wochen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Therapiekollektiven. Im Vergleich der Laborparameter von Fett- und Leberstoffwechsel kam es zwischen den Gruppen zu signifikanten Unterschieden, wobei deutliche Anstiege und höchste Werte im NRTI-freien Kollektiv gemessen wurden. Für Hämoglobin wurde dies nicht beobachtet. NRTI-Sparing kann bei HIV-therapienaiven Patienten eine Option für eine effektive Langzeittherapie mit maximaler Virussuppression und ansteigender CD4-Zellzahl darstellen, scheint aber mit einem erhöhten Risiko für ansteigende Fettstoff- und Leberparameter assoziiert zu sein.
Die Basis der vorliegenden retrospektiven Auswertung bilden die Krankenunterlagen von 90 Patienten, die im Zeitraum von 1995 bis 2004 in der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Universität Würzburg wegen einer follikulären Zyste im Ober- oder Unterkiefer ambulant und stationär behandelt wurden. In dieser statistischen Auswertung wird deutlich, dass follikuläre Zysten vermehrt bei dem männlichen Patientengut aufgetreten sind. Das Haupterkrankungsalter lag zwischen dem 31. und 50. Lebensjahr. Die retrospektive Analyse der Krankenakten zeigt, dass die follikulären Zysten vermehrt im Unterkiefer lokalisiert waren. Die unteren Weisheitszähne waren am häufigsten betroffen. Bezüglich des Therapiekonzeptes war die Zystektomie mit Zahnentfernung das am häufigsten durchgeführte. Für die Zystenhohlraumauffüllung werden diverse Möglichkeiten angesprochen. Intraoperative Komplikationen kamen nur selten vor. Bei den postoperativen Komplikationen wurden die entzündlichen postoperativen Komplikationen eigens betrachtet. Als relevante entzündliche Komplikation wurde die Infektion dokumentiert. Zusätzlich werden die Ergebnisse mit zahlreichen Publikationen verglichen.
Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110.
In einer Beobachtungsstudie an 20 Patienten mit fokal sklerosierender und membranöser Glomerulonephritis wurde der Effekt einer Therapie mit ACE- Hemmer, Methylprednisolon und Ciclosporin A über einen Zeitraum von bis zu 10 Jahren verfolgt. Die Effektivität der genannten Therapie ist in der Literatur gut dokumentiert. Die Studie beobachtet folgende neue, bislang nicht beschriebene Ergebnisse: 1. Das Ausmaß der Proteinurie beim nephrotischen Syndrom unterliegt einem 28-Tage-Zyklus. Als Arbeitshypothese nehmen wir zyklische Schwankungen in der Aktivität des Immunsystems an. 2. Die bislang gängige Praxis, das nephrotische Syndrom ein halbes Jahr lang oder allenfalls bis zur ersten Abnahme der Proteinurie zu therapieren bedarf einer Korrektur. Erst wenn die Periodizität der Proteinurie sistiert, kann die Therapie ausgeschlichen werden, ohne ein Rezidiv befürchten zu müssen. Auf jeden Fall muss wesentlich länger therapiert werden als gegenwärtig in der Literatur berichtet. 3. Vor allem Patienten der Kategorie mit sehr langem Intervall zwischen Erstmanifestation und Therapiebeginn bedürfen einer möglicherweise lebenslangen Therapie um kein Endstage Renal Failure zu erleiden. 4. Das bislang gültige therapeutische Fenster der Ciclosporin-A-Therapie von 80 – 120 ng/ml Talspiegel kann bei gutem Ansprechen auf 60 – 80 ng/ml reduziert werden ohne hohes Rezidivrisiko.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte eine retrospektive Analyse von 86 Patienten der Chirurgischen Universitätsklinik Würzburg die von 02/1995 bis 07/2002 aufgrund mesenterialer Ischämien therapiert werden mussten. Ziel der Untersuchung war eine Bewertung aktueller diagnostischer und therapeutischer Möglichkeiten und deren Einfluss auf die Erfolgsprognose der Erkrankung. Das klinische Erscheinungsbild der akuten Verschlussformen war gerade in der entscheidenden Frühphase sehr uncharakteristisch. Daher kommt der sorgfältigen Anamneseerhebung eine große Bedeutung zu. Bei der chronischen mesenterialen Ischämie kommt es zu postprandialen Schmerzen und Gewichtsverlust, meist als akute Verschlimmerung eines Dauerschmerzes etwa 10 - 30 Minuten nach einer Mahlzeit mit Regredienz innerhalb der nächsten Stunden. Als diagnostische Verfahren kamen Sonografie, Nativaufnahme, Duplex-, Farbduplexsonografie und Computertomografie zum Einsatz. Alleine mit Hilfe der intraarteriellen Subtraktionsangiografie gelang ein zuverlässiger Nachweis akuter oder chronischer viszeraler Ischämien. Ist die angiografische Abklärung aufgrund mangelnder apparativer Ausstattung nicht möglich, muss zügig eine diagnostische Laparoskopie durchgeführt werden. Eine typische Konstellation von Laborparametern konnte zu diesem Zeitpunkt nicht erhoben werden. Lediglich dem Serumlaktat kam eine Bedeutung zu, jedoch ließ die Höhe keine Rückschlüsse auf die Ausdehnung der ischämischen Bezirke zu. Operative Therapieverfahren haben die möglichst schnelle Strombahnwiederherstellung und Revaskularisiation der infarktbedrohten Darmabschnitte zum Ziel. Die alleinige Darmresektion ist angezeigt, wenn eine Gefäßrekonstruktion technisch nicht möglich erscheint. Arterielle Rekonstruktionsverfahren wie Embolektomie oder Methoden mit Gefäßersatz- bzw. Transplantatmaterial sind indiziert, wenn die Möglichkeit einer Restitutio nach Perfusionswiederherstellung besteht. Eine prophylaktische Rekonstruktion bei asymptomatischen Viszeralarterienverschluss scheint bei der chronischen Verlaufsform nicht sinnvoll. Die Indikation für eine second - look Operation sollte großzügig gestellt werden! Bei kurzstreckiger Verschlussmorphologie erscheinen Stenosen der Viszeralarterien auch für perkutane transluminale Angioplastie geeignet. Bei der nicht okklusiven Form der Mesenterialischämie haben kardiologisch - intensivmedizinische Maßnahmen als alleinige Therapie Vorrang. Der wichtigste prognostische Faktor für die erfolgreiche Behandlung und damit auch für die Gesamtprognose der akuten Verlaufsform ist die frühzeitige Diagnosestellung und Behandlung.
Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) spielt eine zentrale Rolle in entzündlichen Prozessen. Die Behandlung mit Antikörpern, die murines GM-CSF neutralisieren, zeigte signifikante Behandlungseffekte in Maus-Modellen für Rheumatoide Arthritis, Autoimmune Enzephalomyelitis, entzündliche Erkrankungen der Lunge und Psoriasis. Diese Arbeit beschreibt die Generierung des ersten vollständig humanen Einzelketten (scFv)-Antikörpers, der effektiv humanes GM-CSF (hGM-CSF) neutralisiert. Dieser humane scFv-Antikörper wurde mit Hilfe der Phage-Display-Technologie, ausgehend von einem monoklonalen Ratten-Antikörper mit hGM-CSF-neutralisierender Aktivität, konstruiert. In einem ersten Schritt wurde die VH-Domäne des parentalen Ratten-Antikörpers mit einem humanen leichte Ketten V-Repertoire kombiniert. Nach Phage-Display-Selektion wurde ein dominanter Klon identifiziert, der für ein chimäres Ratte/Human scFv-Fragment kodiert. Dieser scFv-Antikörper neutralisiert hGM-CSF mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) im nanomolaren Bereich. Die humane leichte Kette dieses Klons wurde dann mit einem humanen schwere Ketten V-Repertoire kombiniert. Um die Bindungsspezifität des Ursprungsantikörpers für den neutralisierenden Bereich auf dem Antigen zu erhalten, enthielt dieses Repertoire die Komplementaritäts-bestimmende Region 3 (CDR3) der parentalen VH-Domäne. Nach Phage-Display-Selektion wurden mehrere scFv-Antikörper identifiziert, die hGM-CSF im niedrig nanomolaren Konzentrationsbereich neutralisierten. Das scFv-Fragment mit der höchsten hGM-CSF-neutralisierenden Aktivität (3077) wurde in verschiedene therapeutisch relevante Antikörperformate überführt. Zum einen wurde das scFv-Fragment über einen zusätzlichen C-terminalen Cystein-Rest an ein verzweigtes, 40 kD-grosses Polyethylenglycol (PEG) –Polymer konjugiert. Zum anderen wurde das scFv-Fragment durch Fusion mit humanen konstanten Immunglobulin-Domänen zu einem ganzen IgG1/kappa-Antikörper vervollständigt. Die so generierten Konstrukte mit identischer Spezifität wurden dann in vitro im Hinblick auf Bindungsaffinität, Neutralisierungsaktivität und Stabilität untersucht. Die Konjugation des PEG-Polymers hatte einen vernachlässigbaren Effekt auf das Neutralisierungspotential des scFv-Fragments in vitro, obwohl sie aufgrund einer verlangsamten Assoziationsrate eine reduzierte Bindungsaffinität verursachte. Der humane IgG1-Antikörper zeigte sowohl eine verbesserte Bindungsaffinität als auch eine erhöhte Neutralisierungsaktivität im Vergleich zum nicht-PEGylierten wie auch zum PEGylierten scFv-Fragment. Wir konnten außerdem zeigen, dass die PEGylierung in der thermischen Stabilität des scFv-Antikörpers einen deutlichen Anstieg um 10°C vermittelte. Aufgrund der hohen Neutralisierungsaktivität und Stabilität des IgG1-Antikörpers 3077 wie auch des PEGylierten scFv-Fragments 3077 sind beide Moleküle - in unterschiedlichen klinischen Anwendungsbereichen - potentielle Kandidaten für eine Behandlung humaner entzündlicher Erkrankungen.
Onkologische Patienten sind während der Phase der Chemotherapie-bedingten Knochenmarkdepression besonders durch Infektionen bedroht. Da bisher keine Parameter bekannt sind, die eine schwerwiegende bakterielle Infektion zu Beginn einer Fieberepisode von anderen Fieberursachen sicher differenziert, werden diese Patienten bei Fieber und Neutropenie trotz der damit verbundenen Nachteile und Risiken, wie z.B. mögliche Resistenzbildung, Toxizität der Antibiotika, Risiko nosokomialer Infektionen, psychische Belastung der kleinen Patienten und deren Eltern, sofort stationär aufgenommen und intravenös mit Antibiotika behandelt. In der vorliegenden Studie wurde der diagnostische Wert der Interleukine 6 und –8 für die Früherkennung schwerer Infektionen bei pädiatrischen Patienten mit Fieber und Chemotherapie-bedingter Neutropenie untersucht und mit dem diagnostischen Wert des CrP verglichen. In einem Beobachtungszeitraum von 15 Monaten wurden in 128 Fieberepisoden bei 55 Patienten mit einem breiten Spektrum onkologischer Grunderkrankungen die Konzentrationen der Parameter an den ersten Fiebertagen bestimmt. Neben 95 FUO-Episoden wurden sechs bakterielle Infektionen mit gram-negativem Erreger, 19 bakterielle Infektionen mit gram-positivem Erreger, drei Pilzinfektionen und fünf klinisch dokumentierte Infektionen behandelt. Es zeigten sich signifikant höhere IL-6 und IL-8 Konzentrationen am ersten Fiebertag bei Infektionen mit gram-negativen Bakterien, S.aureus und Pilzen, also bei potentiell schwerer verlaufenden Infektionen als bei FUO, S.epidermidis- und klinisch dokumentierten Infektionen. Schwere Infektionen konnten mit einer deutlich höheren Sensitivität und Spezifität von anderen Fieberursachen durch die Interleukine als durch das CrP unterschieden werden. Die Interleukine-6 und –8 könnten im Gegensatz zum CrP eine wertvolle Hilfe in der Frühdiagnostik von schwerwiegenden Infektionen bei pädiatrischen Patienten mit chemotherapiebedingter Neutropenie und Fieber sein. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse müssen jedoch vor einem routinemäßigen Einsatz im Klinikalltag in großen, prospektiven Studien validiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Studie war, den Therapieerfolg einer initialen Monotherapie mit Imipenem/Cilastat zur Behandlung von Kindern mit Fieber und Chemotherapie-bedingter Neutropenie zu untersuchen und mit dem Therapieerfolg einer initialen Therapie mit einer Ceftazidim/Teicoplanin Kombination zu vergleichen. In insgesamt 106 auswertbaren Fieberepisoden wurde 54 mal initial mit der Monotherapie und 52 mal initial mit der Kombinationstherapie behandelt. Die antibiotische Therapie wurde nach einer Mindestdauer von 72 Stunden beendet, wenn der Patient 24 Stunden fieberfrei war und die Kriterien für FUO erfüllt waren, d.h., kein Erreger nachgewiesen werden konnte und keine weiteren klinischen Zeichen einer Infektion bestanden. Keiner der Patienten verstarb infolge einer Infektion. Rund die Hälfte der Patienten entfieberten in beiden Therapiegruppen innerhalb von drei Tagen unter der Initialtherapie. Beide Therapiegruppen unterschieden sich nicht signifikant hinsichtlich der Therapiedauer, der Fieberdauer und hinsichtlich der Rezidivhäufigkeit und waren damit gleich effektiv. Lediglich bei den Infektionen mit gram-positiven Eregern zeigte sich erwartungsgemäß, dass die initiale Kombinationstherapie aufgrund des Teicoplaninanteils zu einer rascheren Entfieberung führte. Alle Patienten, die initial mit der Imipenemmonotherapie behandelt wurden, konnten nach Eintreffen des Antibiogramms erfolgreich behandelt werden. Glykopeptide sind Reserveantibiotika, die möglichst gezielt und sparsam eingesetzt werden sollten, um einer Resistenzbildung vorzubeugen. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass auch der verzögerte Einsatz von Teicoplanin in der Folgetherapie bzw. in Kenntnis des Antibiogramms den Therapieerfolg nicht signifikant vermindert und dadurch keine bedrohliche Situation für einen Patienten entstand. Vorteile einer Monotherapie sind außerdem eine potentiell geringere Toxizitiät, und ein potentiell geringerer Kosten- und Personalaufwand. Wir ziehen aus den genannten Gründen eine initiale Monotherapie mit Imipenem einer initialen Therapie mit einer Ceftazidim/Teicoplanin Kombination vor. Nach frühzeitiger Beendigung der antibiotischen Therapie bei Patienten mit FUO unabhängig von der Granulozytenzahl im Blutbild kam es zu keiner Häufung von Rezidiven. Mit dieser Praxis könnte sich nicht nur das Risiko einer Resistenzbildung senken lassen. Ein verkürzter stationärer Aufenthalt verbessert die Lebensqualität der Patienten, nicht zuletzt bedeutet dies auch einen geringeren Kosten- und Personalaufwand.
Für diese retrospektive Studie wurden die Unterlagen von 490 Patienten, die im Zeitraum von 1990 bis 1999 wegen einer lateralen Mittelgesichtsfraktur in der Universitätsklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke in Würzburg operativ versorgt wurden, erfasst und nach verschiedenen Kriterien statistisch ausgewertet. 77,35% der Patienten waren männlich, 22,65% der Patienten weiblich. Der jüngste Verunfallte, der operativ versorgt wurde, war 4 Jahre, die älteste Patientin 87 Jahre alt. Frauen waren in diesem Krankengut um mehr als acht Jahre älter als die Männer. An erster Stelle der Unfallursachen stehen mit annähernd gleicher Anzahl die Verkehrsunfälle(25,51%) und Roheitsdelikte (24,28%), dicht gefolgt von den Unfällen des täglichen Lebens (22,22%) und den Sportunfällen (20,78%). Berufsunfälle sind mit 7,2% nur gering vertreten. Bei den Verkehrsunfällen stehen die PKW-Unfälle mit 58,43%, bei den Sportunfällen die Verletzungen beim Fußballspiel mit 76,4% im Vordergrund. Die häufigste Verletzung in dem untersuchten Zeitraum war die isolierte Orbitabodenfraktur, die zweithäufigste war die Jochbeinfraktur. An dritter Stelle folgte die Kombination aus Orbitaboden- und Orbitarahmenfraktur. Selten war die isolierte Jochbogenfraktur. Die mittlere Zeit bis zur operativen Versorgung nach einer Verletzung betrug 8,05 Tage, welche sich aber bei Visusbeeinträchtigung verlängerte und bei Alkoholkonsum verkürzte. Der häufigste operative Zugang war der subtarsale Zugang, weitere richtetet sich nach der Verletzung. Für die verwendeten Materialien für die Orbitabodenrekonstruktion zeigte sich eine Verschiebung weg von der konservierten Dura, hin zur konservierten Fascia lata und perforierter PDS-Folie.