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In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert.
Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Verteilungsmuster von PG-Donorzellen in Gehirnen von Mäusechimären, die nach dem Aggregations- und dem ESC-Verfahren generiert wurden, im Embryonalstadium E14.5 untersucht und miteinander verglichen. Während in Aggregations-Chimären eine Präferenz von PG-Donorzellen für eine Besiedelung des Cortex und des Striatum zu beobachten ist, zeigen Gehirnbereiche in ESC-Chimären eine gleichmäßige Verteilung der PG-Donorzellen.
Um die unterschiedliche Besiedelung von PG-Stammzellen in den Chimären erklären zu können, wurden neuronale und gliale Zellfrequenzanalysen durchgeführt. Sowohl bei der relativen Neuronen- als auch bei der relativen Astrozytenhäufigkeit ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Aggregations- und den ESC-Chimären festzustellen. Beide Chimärtypen unterscheiden sich nicht in der Zahl der aus PG-Donorzellen differenzierten Nerven- und Stützzellen.
Das Potenzial von PG-Stammzellen, funktionsfähige dopaminerge Neuronen zu bilden, wurde in den beiden Chimärtypen vergleichend analysiert. In beiden Chimärtypen wurden von PG-Donorzellen abstammende dopaminerge Neuronen nachgewiesen. Sowie für die Neuronen- und die Astrozytenzahl konnte auch für die Anzahl dopaminerger Neuronen kein signifikanter Unterschied zwischen Aggregations- und ESC-Chimären beobachtet werden.
Pluripotente Zellen sind sowohl in der Stammzellforschung als auch für regenerative Therapieansätze von großer Bedeutung. Erste Stammzelltherapien sind bereits erfolgreich am Menschen durchgeführt worden. Besonders wichtig ist die Sicherheit der Therapie, um Risiken, wie die „Entartung“ von Stammzellen zu Tumorzellen, zu minimieren. Als Ansatzpunkt für einheitliche Therapie-Standards, sind z.B. genaue Angaben zur Anzahl injizierter Zellen, dem Injektionsort und Biomarker (wie Pluripotenz- und Differenzierungs-Marker) zur Kategorisierung der Stammzellen zu nennen. Während der Embryonalentwicklung spielen die Polycomb-Proteinkomplexe PCR1 und PCR2 eine maßgebliche Rolle beim Aufrechterhalten der Pluripotenz, weil sie Chromatin-Modifikationen, wie z.B. Histonmethylierungen vermitteln und so die Genexpression kontrollieren können. Lange Zeit wurde angenommen, dass Histon-Methylierungen irreversibel sind, doch mit Entdeckung der Lysin-spezifischen Demethylase 1 (LSD1) wurde diese Sichtweise revidiert. Ein Mitglied der derzeit bekannten 32 Histon-Demethylasen ist Kdm6a (UTX), die die Histon-Demethylierung des Lysins an der Aminosäure-Position 27 von Histon H3 (H3K27me2/3) katalysiert. Kdm6a spielt eine wichtige Rolle bei der Embryogenese und wurde in der hier vorgestellten Arbeit am Teratommodell, einem benignen Keimzelltumor, untersucht.
In dieser Arbeit wurden Teratome von Mäusen untersucht, die aus embryonalen Stammzellen (ESC) mit Wildtyp- und shRNA vermittelter reduzierter Expression oder durch genetisch kontrollierten Knockdown sowie Knockout entstand sind. Diese wurden anschließend nach histologischen (H&E-Färbungen), histochemischen (PCNA-, SSEA-1- und TUNEL-Färbungen) sowie Analyse der Genexpressionsmuster aller drei Keimblätter mittels RT-PCR untersucht und ausgewertet.
Sowohl Wildtyp als auch Kdm6a-Knockdown und Knockout-Teratome bildeten Gewebe der drei Keimblätter aus. In Teratomen mit supprimierter Kdm6a-Expression gab es jedoch Unterschiede in der Bildung mesodermaler und endodermaler Gewebe mit einer signifikanten Abnahme von Knorpel- und Muskelgewebe. Da sich Kdm6a-defiziente Teratome zu wesentlich größeren Tumoren als Wildtyp-Teratome entwickelten, wurde deren Proliferations-, Pluripotenz- und Apoptose-Verhalten mittels PCNA und SSEA-1 und TUNEL histochemischen Färbungen untersucht. Wir beobachteten in Knockout-Teratomen eine höhere Anzahl von PCNA- und SSEA-1-positiven Zellen. Daraus folgt, dass Kdm6a-defiziente ESCs - im Gegensatz zu Wildtyp ESCs - zur Bildung von Teratomen mit einer höheren Anzahl von proliferierenden und pluripotenten Zellen neigen. In der Fraktion apoptotischer Zellen (TUNEL positiver Zellen) der Kdm6a-defizienten Teratome gab es keinen signifikanten Unterschied zu Teratomen, die aus Wildtyp-ESCs entstanden.
Nach Analyse der Genexpressionsmuster fanden wir in Zellen, in denen Kdm6a reprimiert bzw. deaktiviert wurde, einen Verlust der Pluripotenz und folglich eine starke Reduzierung der Pluripotenzmarker Oct4, Sox2 und Nanog. Die Analyse des Genexpressionsmusters läßt vermuten, dass der Verlust bzw. die Abnahme der Kdm6a-Aktivität in direkten Zusammenhang mit einer Abnahme der Pluripotenz durch Methylierung von H3K27 steht. Weitere Analysen, z.B. durch ChIP (Chromatin Immun-Präzipitations-) Assays mit H3K27me2/3 spezifischen Antikörpern, sind nötig, um dies endgültig zu beweisen. Unsere Arbeiten zeigten, dass die Kdm6-Demethylase-Aktivität essentiell für den Erhalt der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen ist.
p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind multipotente adulte Stammzellen. Sie können aus einer Vielzahl verschiedener Gewebe isoliert werden, z.B. aus Knochenmark (BM), Fettgewebe (AT) und Nabelschnurblut (CB). Besondere Bedeutung haben MSCs als mögliche Zellquelle für neuartige klinische Stammzelltherapien, da sie relativ einfach aus adulten Patienten isoliert und in vitro expandiert werden können. Grundlage für die erforschten Therapieansätze ist häufig das Entwicklungspotential der MSCs. Es umfasst mesenchymale Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten, aber auch nicht-mesenchymale Zelltypen wie z.B. Hepatozyten oder Nervenzellen. Das Entwick-lungspotential von MSCs zu nicht-mesenchymalen Zelltypen ist jedoch umstritten und viele Differenzierungswege sind bisher nur in vitro gezeigt. Außerdem ist unklar, ob MSCs aus verschiedenen Ursprungsgeweben dasselbe Entwicklungspotential besitzen. Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb das in vivo Differenzierungspotential von CB-, AT- und BM-MSCs vergleichend zu untersuchen. Dazu wurden die MSCs in murine Tag-3-Blastozysten injiziert. Diese wurden dann in Foster-Mäuse transferiert und die daraus entstandenen Embryonen am Tag 16 der Embryonalentwicklung (E16.5) analysiert. Dazu wurde gDNA aus verschiedenen embryonalen Geweben isoliert und mittels humanspezifischer quantitativer real-time PCR (qPCR) die Verteilung sowie das Ausmaß der humanen Donorkontribution bestimmt. Außerdem sollte der Differenzierungsstatus der humanen Zellen mittels in situ Hybridisierung und Antikörperfärbung analysiert werden...
Der wesentliche Dosis limitierende Faktor einer Strahlentherapie thorakaler Malignome ist die Strahlenempfindlichkeit des Lungenparenchymes, da sich mit einer Häufigkeit von 25-75 % aller Patienten ein Strahlenschaden des Lungengewebes entwickeln kann. Die Inzidenz einer Lungenfibrose nach 6- 12 Monaten liegt bei 15-30%. Die Kombination zytostatischer Medikamente mit ionisierender Strahlung kann die Ansprechraten verbessern, kann andererseits die Inzidenz einer Pneumonitis erhöhen. Die konkreten Mechanismen, die zu einer Pneumonitis und einer strahleninduzierten Fibrose führen, sind bislang noch nicht vollständig bekannt. Es wird vermutet, daß die ortsständigen Zellen der Lunge eine aktivere Rolle in der Pathogenese als bisher angenommen, einnehmen. Tiermodelle der Strahlenschädiung der Lunge zeigten ein sehr frühe Expression von TGF-ß-mRNA and fibronectin-mRNA nach Bestrahlung. TGF-ß und Fibronectin sind in der BALF und Serum von an thorakalen Malignomen erkrankten, strahlentherapeutisch behandelten Patienten erhöht. Neben Makrophagen und Typ II Pneumocyten als zelluläre Quellen der genannten Cytokine, sind Fibroblasten in der Lage beide Agentien in erheblichem Umfang zu synthetisieren. Ziele Um die aktive Rolle von Fibroblasten in der Pathogenese der strahleninduzierten Lungenfibrose in Abwesenheit von Entzündungszellen zu untersuchen, bestrahlten wir Lungenfibroblasten in vitro und beobachteten folgende Parameter. 1. Zellwachstum 2. Synthese von Fibronectin 3. Synthese von Kollagen ( Procollagen-I-Peptid) 4. Synthese von TGF-ß1 Methoden Humane fetale Lungenfibroblasten (MRC-5 ,ICN Biochemicals Eschwege ,Deutschland) wurden in DME Medium kultiviert unter Zugabe von 10% FCS plus L-Glutamine, Penicillin G , Amphotericin B und Gentamycin; Luftfeuchtigkeit 100% , Temperatur 37°, CO2 5%, Medienwechsel erfolgten zweimal wöchentlich und 24 Stunden vor den Messungen. 24h nach der Aussaat der Zellen erfolgte die Strahlenapplikation (CO 60; 4.5, 7.5, 10.5 Gy ). Messungen erfolgten an den Tagen 3,6,9,12,15 nach Bestrahlung. Hierfür wurden folgende Materialien verwandt. Fibronectin (ELISA), Takara TGF beta (ELISA), DPC Biermann Procollagen-I-Peptide (ELISA), Takara LDH ( kinetischer Assay), Sigma Cell counts (Zählkammer) Alle Messungen wurden zweimal unternommen. Ergebnisse: 1. Das Zellwachstum wurde dosisabhängig gehemmt. 2. Beginnend am 3 Tag stieg die Syntheserate des Fibronectin dosisabhängig. 3. Ähnliche Beobachtungen wurde bzgl der Procollagen-I-Peptid Synthese beobachtet. 4. TGF-ß Spiegel fanden sich nach Bestrahlung ab Tag 6 bis zum 4-fachen über dem Ausgangswert erhöht und kehrten ziwschen den Tagen 9 und 15 auf das Ausgangsniveau zurück. 5. Eine Erhöhung des LDH wurde nicht beobachtet. Dies zeigte, dass eine Zytolyse kein wesentlichen Einfluß hatte. Disskusion: Bei Bestrahlung humaner fetaler Lungenfibroblasten wird das Zellwachstum dosisabhängig limitiert. Dies wurde nicht durch einen strahlenbedingt erhöhten Zelltod hervorgerufen , da das bestimmte LDH ( ein Marker der Zytolyse) in den Zellkulturüberständen nicht erhöht war. Wir vermuten, das durch Bestrahlung eine Differenzierung von Progenitor Fibroblasten zu postmitotischen Fibrocyten erfolgte, wie auch bereits von anderen Arbeitsgruppen berichtet. TGF-ß fand sich nach Bestrahlung in den Zellkulturüberständen deutlich erhöht. Es wird angenommen , daß TGF-ß eine Schlüsselrolle in der Pathogenese fibrosierender Erkrankungen der Lunge, der Leber, der Niere spielt und ebenso in die Enstehung der durch ionisierende Bestrahlung hervorgerufene Lungenfibrose eingebunden ist. Unsere Experimente haben gezeigt , daß Fibroblasten in der Lage sind große Mengen TGF-ß and Fibronectin - sogar in Abwesenheit von Entzündungszellen- zu erzeugen und sich vermutlich autokrin stimulieren können. Dieser Mechanismus wird als wichtiger Co-Faktor in der Pathobiologie verschiedener zur Fibrose führender Lungenerkrankungen angenommen. Schlussfolgerung Fibroblasten produzieren erhöhte Mengen TGF-ß und Fibronectin nach Applikation ionisierender Strahlung. Sie könnten in der Pathogenese der Strahlenschädigung der Lunge eine aktivere Rolle spielen als bisher angenommen.
Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken.
Das Projekt „Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a“ der AG Bakterielle Tumortherapie des MSZ zielt auf die Entwicklung eines Vakzinstammes, der in der humanen Krebstherapie zum Einsatz kommen soll. Ziel dieser Arbeit war das zuvor etablierte Balanced Lethal System in Salmonella typhi Ty21a zu optimieren.
Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus.
Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können.
Ziel der Arbeit ist unter anderem die Entwicklung von Vakzinen gegen maligne Neoplasien auf der Basis von attenuierten Bakterien. Sie dienen hierbei als Träger von tumorspezifischen Antigenen. Diese können mit Hilfe des E. coli Hämolysin-a-Sekretionssystems von Salmonella-Bakterienstämmen sezerniert werden und eine spezifische Immunreaktion induzieren. Sowohl die Gene, die für das Sekretionssystem kodieren als auch die Gensequenzen des tumorspezifische Antigens sind bei dem Projekt auf dem detailliert beschriebenen Antigendelivery Plasmid pMO kodiert. Die bis dato angewandte Methode der pMO-Plasmidstabilisierung mit Hilfe von Antibiotikaresistenzgenen beinhaltet jedoch zahlreiche, beschriebene Probleme und wird seitens der Behörden in Impfstämmen zunehmend restriktiv gehandhabt. Im Rahmen der Entwicklung eines bakteriellen Tumorimpfstoffes war es daher das Ziel dieser Arbeit ein System zur Stabilisierung des Antigendelivery Plasmids pMO zu etablieren, das auf den Einsatz von Antibiotikaresistenzgenen verzichtet.
Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden.
Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der Versorgungsstrukturen in der postoperativen Strahlentherapie des Prostatakarzinoms in Nordbayern, um für den Behandlungszeitraum von 1998 bis 2000 Patientenselektion, Behandlungskonzepte und Ergebnisse auf der Ebene eines regionalen Qualitätszirkels zu charakterisieren. Hierfür wurden die Daten von 134 in kurativer Absicht postoperativ perkutan bestrahlter Patienten aus den strahlentherapeutischen Abteilungen von vier fränkischen Kliniken ausgewertet. Als Endpunkte dieser Patterns of Care Studie wurden das Gesamtüberleben und die biochemische Kontrolle (ASTRO-Kriterien mit Rückdatierung) analysiert. Bei der Datenauswertung wurde evident, dass das untersuchte Patientenkollektiv eine ausgeprägte Heterogenität bezüglich der klinischen Eigenschaften aufweist. Diese Studie offenbart somit, dass die Zuweiser im Untersuchungszeitraum die Patienten anhand unterschiedlicher Kriterien sowohl zur Operation als auch zur postoperativen Strahlentherapie selektierten. So differierten Resektionsgrad sowie initialer PSA-Wert zwischen den beteiligten Zentren signifikant. Wesentlich homogener erschien das Patientengut im Hinblick auf Alter, Gleason-Score sowie den pT- und pN- Stadien. Die vorliegende Analyse dokumentiert darüber hinaus die unterschiedlichen strahlentherapeutischen Konzepte im Untersuchungszeitraum von 1998-2000. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Zentren im Behandlungsregime ergab sich in der Zielvolumendefinition, wohingegen die applizierten Gesamtdosen vergleichbar waren. Die mittlere Nachbeobachtungszeit lag insgesamt bei 4,8 Jahren. Die aktuarische biochemische Kontrolle nach 5 Jahren betrug 82,1%. Sie variierte zwischen den Zentren nicht signifikant von 63,8% bis 100%. Bei multivariater Analyse zeigte sich, dass die biochemische Kontrolle mit dem Alter und dem initialen PSA-Wert assoziiert war. Das 5-Jahres-Gesamtüberleben betrug 93,9% und variierte ebenfalls nicht signifikant zwischen 88,9% (Zentrum 3) und 94,7% (Zentrum 4). Die Erfassung von Akut- und Spättoxizitäten waren nicht Gegenstand der vorliegenden Untersuchung. Die von Zentrum zu Zentrum unterschiedliche Form der Dokumentation von Akutreaktionen während der Strahlentherapie sowie die nur in geringem Umfange vorliegenden Angaben zu Spätfolgen der Strahlentherapie ließen eine einheitliche Graduierung sowie eine Vergleichbarkeit von Toxizitätsdaten zwischen den Zentren als nicht realistisch erscheinen. Abschließend lässt sich festhalten, dass die Daten eine sehr heterogene Indikationsstellung und insbesondere im Hinblick auf die Zielvolumendefinition eine heterogene Durchführung der postoperativen Strahlentherapie dokumentieren. Dies mag darin mitbegründet sein, dass zum Untersuchungszeitraum keine einheitlichen Leitlinien für das Prostatakarzinom verfügbar waren. Ziele der evidenzbasierten Medizin könnten somit zukünftig sein, Kriterien für eine verbesserte Patientenselektion zu finden und therapeutische Richtlinien in die Praxis zu transferieren. Vielfältige Diskussionen, beispielsweise der Zielvolumendefinition sowie der Therapiealternativen sind gegenwärtig am Beginn. Weitere klinische Studien werden initiiert und deren Ergebnisse abgewartet werden müssen, bis validierte Empfehlungen als Standards etabliert werden können.
Formine der Cappuccino-Familie nukleieren lineare Aktinfilamente mittels der formin homolgy 2- (FH2-) Domäne, Spir-Proteine mittels des WASP-Homologie-Domäne 2- (WH2-) Clusters. spire- und cappuccino-Mutanten haben in Drosophila einen nahezu identischen Phänotyp. Zudem wurde ein überlappendes Expressionsmuster der Säugerhomologe von Drosophila spire- und cappuccino, spir-1 und formin 2, im sich entwickelnden und im adulten Zentralnervensystems von Mäusen beobachtet. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Interaktion von Spir-Proteinen mit Forminen der Cappuccino-Familie aus Drosophila und Maus in in vitro Bindungsstudien und in in vivo Kolokalisationsstudien untersucht. Eine direkte Interaktion wurde für Drosophila Spir und Cappuccino sowie für Säuger Spir-1 und Formin-2 nachgewiesen. Die Interaktionsdomänen sind konserviert und wurden auf die Kinase Non-catalytic C-lobe Domain (KIND-Domäne) der Spir-Proteine und auf die FH2-Domäne der Cappuccino-Proteine eingegrenzt. Diese Interaktion ist spezifisch für Spir- und Cappuccino-Proteine. So interagiert die FH2-Domäne des Formins Diaphanous-1 nicht mit Spir-1-KIND. Ebenso interagiert die KIND-Domäne des RasGEFs very-KIND (VKIND) nicht mit der FH2-Domäne von Formin-2.
Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abhängige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) führen und Wachstum und Überleben vermitteln. Frühere Untersuchungen des Mechanismus, über den C-Raf Apoptose unterdrückt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch Überexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdrücken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdrückung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abhängigen Signalwegen für das zelluläres Überleben untersucht. Wir nutzten für diese Untersuchungen überwiegend die Il-3 abhängige Zelllinie 23D. MEK war essentiell für das zelluläre Überleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verzögerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, während eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdrückte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, ähnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung lässt auf einen, das Überleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK führt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abhängige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abhängigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch für den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abhängigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen lässt, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeingültiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, während eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdrückung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zelluläres Überleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird.
Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen.
In Drosophila melanogaster wurde der p21-aktivierten Proteinkinase Mushroom bodies tiny (Mbt) eine wichtige Rolle als Regulator während der Differenzierung von Photorezeptorzellen zugeschrieben. Da morphologische Umgestaltungsprozesse der Photorezeptorzellen von dynamischen Zellbewegungen begleitet und die molekularen Details größtenteils noch ungeklärt sind, wurden in dieser Arbeit die Funktionen von Mbt in Bezug auf veränderte Zelladhäsionseigenschaften, Reorganisation des Aktincytoskeletts und die Beteiligung an weiteren Signalwegen analysiert. Im ersten Projekt wurde ein genetischer Interaktionsscreen mit Hilfe eines hypomorphen mbt- Allels (mbtP3) durchgeführt, um zu untersuchen, in welche zellulären Signalwege Mbt einzuordnen ist. Die Identifizierung des Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin (Drosophila: Twinstar) und der Phosphatase Slingshot bestätigte, daß Mbt in Prozesse involviert ist, die die Aktindynamik kontrollieren. In Vertebraten phosphoryliert und inaktiviert die Proteinkinase Pak4 (Drosophila Homolog zu Mbt) die Lim-Kinase (Limk), die wiederum Cofilin durch Phosphorylierung hemmt. Dieser Effekt kann nach Dephosphorylierung des Cofilin durch die Phosphatase Slingshot wieder aufgehoben werden. In Drosophila konnte gezeigt werden, daß aktiviertes Mbt mit Twinstar und Drosophila Limk (D-Limk) assoziiert ist und die Phosphorylierungen beider Moleküle induzieren kann. Zusammen mit genetischen Experimenten stellen die Ergebnisse entgegen der Situation in Vertebraten die Funktion von D-Limk als Vermittler zwischen Mbt und Twinstar in Frage und lassen vielmehr auf einen Verlauf des Signals von Mbt direkt an Twinstar, über Slingshot oder unbekannte Kinasen schließen. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Einfluß von Mbt auf die DE-Cadherin-beta- Catenin/Armadillo vermittelte Zelladhäsion. Dazu wurde ein Zellkultursystem in Drosophila Schneiderzellen etabliert, welches es erlaubte, den DE-Cadherin-beta-Catenin/Armadillo-alpha- Catenin Komplex vollständig zu rekonstituieren. Die Resultate zeigten, daß Mbt mit dem Komplex interagiert und beta-Catenin/Armadillo an den Aminosäuren S561 und S688 phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Destabilisierung der Bindung zwischen DE-Cadherin und beta- Catenin/Armadillo und vermindert die Adhäsion der Zellkontakte zwischen Zellen. Im dritten Projekt ging es um die Suche nach unbekannten Phosphorylierungspartnern und der Integration von Mbt in weitere Signalwege. Dazu wurde eine stringente, radioaktive in vitro Phosphorylierungsreaktion entwickelt, die die Detektion von Mbt-spezifischen Phosphorylierungssubstraten aus einem Extrakt von Drosophila Schneiderzellen ermöglichte. In einer Vorstufe wurde dieses Extrakt mit dem ATP-Analogon 5’-Fluorosulfonylbenzoyladenosin (5’FSBA) vorbehandelt, um sämtliche endogenen Kinasen irreversibel zu inhibieren und die nachfolgende Phosphorylierungsreaktion mit aufgereinigtem Mbt spezifisch für Mbt zu machen. Nach Auftrennung und Identifizierung der potentiellen Phosphoproteine durch Massenspektrometrie wurde das Drosophila Dynamitin als neuer Interaktions- und Phosphorylierungspartner von Mbt gefunden.
Die Identität von verschiedenen Stamm-und Vorläuferzellen wird durch zellspezifisches Genexpressionsmuster bestimmt128. Ähnlich einem Fingerabdruck ist eine Zelle durch ihr Expressionsprofil charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Expression der Transkritionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha und der Proteinkinase HPK 1 im murinen hämatopoetischen System mittels RT-PCR-Analysen betrachtet. Neben Gesamtknochenmark, hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen, ES-Zellen und NSZs wurden sowohl differenzierte Zellen des myeloischen Systems als auch des lymphatischen Systems analysiert. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren PU.1 und Gabp-alpha konnten dabei ubiquitär in den untersuchten hämatopoetischen Zellpopulationen nachgewiesen werden. In NSCs konnte Gabp-alpha, jedoch nicht PU.1 nachgewiesen werden. HPK 1 wurde im Einklang mit früheren Ergebnissen in Gesamtknochenmark in T-und B-Zellen in hämatopoetischen Vorläuferzellen und zu geringem Umfang in embryonalen Stammzellen gefunden. Tiefere Einblicke in Veränderung des Expressionsprofils während der Differenzierung von unreifen Vorläuferzellen zu reifen Effektorzellen würden die Kenntnisse über die molekularen Mechanismen der Differenzierung erweitern. Diese Erkenntnisse sind die Voraussetzung um in den Differenzierungsvorgang regulativ einzugreifen.