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Megakaryocyte localization in the bone marrow depending on the knock-out of small Rho GTPases
(2020)
This work focuses on megakaryocyte physiology with a special interest in the description of the localization of megakaryocytes in the bone marrow in mice single-deficient of the small Rho GTPase RhoA or double-deficient for RhoA and Cdc42. RhoA knock-out mice revealed intraluminal presence of megakaryocytes in bone marrow sinusoids. In a next step, potential aggravation, attenuation or preservation of this phenotype was studied in related mouse strains and also in the setting of platelet depletion and blockage of important megakaryocyte and platelet glycoprotein receptors in order to understand underlying singling pathways. A second part of this thesis studied the role of RhoF in filopodia formation and scrutinized RhoF deficient mice with regard to platelet activation and degranulation.
Eine intakte Darmbarriere ist überlebensnotwendig. Bei einigen Erkrankungen kann eine Störung der Darmbarriere zur Translokation von Bakterien aus dem Lumen des Darmes in den menschlichen Körper führen, die septische Entzündungsprozesse auslösen können. In dieser Arbeit untersuchten wir zum einen die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion für die Darmbarriere und zum anderen die Rolle der Rho-GTPasen in der Regulation der Darmbarriere. Für unsere Untersuchungen charakterisierten wir Caco2 Zellen, von denen wir nachweisen konnten, dass sie ein geeignetes Modell für die Darmbarriere sind. Wir konnten zeigen, dass Caco2 Zellen 14 Tage nach ihrer Konfluenz einen vollständigen Schlussleistenkomplex ausbilden und funktionell ähnlich Permeabilitäseigenschaften, wie die Mukosa von Ratten ex vivo aufweisen. Um die Bedeutung der desmosomalen Adhäsion zu klären, applizierten wir einen gegen die Extrazellulärdomäne von Dsg2 gerichteten Antikörper. Dieser Antikörper war spezifisch in der Lage Dsg2 vermittelte Adhäsion zu blockieren. Nach Applikation des Dsg2 ED konnten wir eine Fragmentierung der Occludensproteine, sowie eine gestörte Barrierefunktion mit erhöhter Permeabilität und erniedrigtem transepithelialen Widerstand nachweisen. Damit konnten wir zeigen, dass die Dsg2 vermittelte Adhäsion essentiell für die Aufrechterhaltung der Darmbarriere ist. Des Weiteren untersuchten wir die Rolle der Rho-GTPasen. Wir veränderten die Aktivität der Rho-GTPasen durch Applikation von bakteriellen Toxinen, wie CNF-1, CNF-y, Toxin B, C3-TF und LT sowie Mediatoren, wie Y27632 und quantifizierten die Änderung anschließend durch die Aktivitätsmessung der Rho-GTPasen mittels GLISA. In Immunfluoreszenzen konnten wir zeigen, dass sowohl eine Steigerung als auch eine Erniedrigung der Aktivität von RhoA mit einer Fragmentierung der Occludensproteine einhergeht, während die Adherens Junktionen unbeeinflusst bleiben. Diese morphologische Veränderung korreliert mit einer signifikant erhöhten Permeabilität und einem erniedrigtem transepithelialem elektrischen Widerstand. Im Gegensatz dazu, konnten wir zeigen, dass eine Erhöhung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 in der Immunfluoreszenz zu keinen sichtbaren Veränderungen führt, die funktionellen Ergebnisse, mit einem erhöhten transepithelialen elektischen Widerstand und einer erniedrigten Permeabilität auf eine Stabilisierung der Barriere hinweisen. Eine Erniedrigung der Aktivität von Rac1 und Cdc42 führt hingegen zu einer Destabilisierung der Barriere. Morphologisch führte die Verringerung der Aktivität von Rac1 durch LT zu einer Reduzierung der Occludensproteine an den Zellgrenzen und zu einer diffuseren Färbung des Adherens Junktionsprotein E- Cadherin. Zum anderen zeigte sich in diesem Fall eine deutliche Reduzierung der Barrierefunktion mit einem erniedrigten transepithelialen elektrischen Widerstand und einer erhöhten Permeabilität. Letzlich konnte diese Arbeit durch ihre Erkenntnisse einen Teil dazu beizutragen, dass die komplexe Regulation der Darmbarriere besser verstanden wird. Dieses bessere Verständnis soll künftig zur Entwicklung neuer Therapieoptionen für Patienten dienen, die unter den septischen Folgen einer Störung der Darmbarriere leiden.