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Neuste Studien haben ergeben, dass Asc-1 Knock-out Mäuse aufgrund einer verminderten intrazellulären Glycinkonzentration in synaptischen Boutons im Gehirn, einen Hyperekplexie-ähnlichen Phänotyp entwickeln. Aufgrund nicht vollständig geklärter Ursachen für die Entstehung des Krankheitsbildes der Hyperekplexie beim Menschen, wurde eine Kohorte von 51 Patienten zusammengetragen, um vor dem Hintergrund der Forschungsergebnisse zu Asc-1 im Tiermodell, das kodierende Gen beim Menschen SLC7A10 als mögliches Kandidatengen auf Sequenzalterationen zu untersuchen. Hierfür wurde aus Vollblut der an Hyperekplexie erkrankten Patienten genomische DNA isoliert, um mittels PCR und anschließendem Screening der Sequenzen, Mutationen innerhalb funktionell wichtiger Bereiche des Gens zu eruieren. Neben weiteren Sequenzunterschieden, die meist in Introns gefunden wurden, wurde die codierende Mutation G307R innerhalb von Exon 7 identifiziert, die letztendlich der Grund für eine Versuchsreihe war, um zu hinterfragen, ob dieser Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz funktionelle Konsequenzen zur Folge hat. HEK293-Zellen wurden mit dem zuvor hergestellten Klon G307R transfiziert, um über Biotinylierung, immuncytochemische Färbungen und funktionelle Untersuchungen die Aktivität des Transporters zu beurteilen. Hier zeigte sich ein Funktionsverlust von über 95 %, bei uneingeschränkter Oberflächenexpression. ASC-1 bestätigt sich damit als neue Ursache in der Ausprägung von Hyperekplexie. Ferner können Zusammenhänge mit geistiger Retardierung und eingeschränkter neuronaler Plastizität bestehen.
The purpose of the experiments reported is to provide an unambiguous demonstration that embryonie skeletal muscle contains factors that act directly on embryonie spinal motor neurons both to support their survival and to stimulate the outgrowth of neurites. Cells of lumbar and brachial ventral spinal cords from 6-day-old chick embryos were separated by centrifugation in a two-step metrizamide gradient, and a motor neuron enriched fraction was obtained. Motor neurons were identified by retrogradely labeling with rhodamine isothiocyanate, and were enriched fourfold in the motor neuron fraction relative to unfractionated cells. In culture, the isolated motor neurons died within 3-4 days unless they were supplemented with embryonie chick skeletal muscle extract. Two functionally distinct entities separable by ammonium sulfate precipitation were responsible for the effects of muscle extracts on motor neurons. The 0-25% ammonium sulfate precipitate contained molecules that alone bad no effect on neuronal survival but when bound to polyornithine-coated culture substrata, stimulated neurite outgrowth and potentiated the survival activity present in muscle. Most of this activity was due to a laminin-like molecule being immunoprecipitated with antisera against laminin, and immunoblotting demonstrated the presence of both the A and B chains of laminin. A long-term survival activity resided in the 25-70% ammonium sulfate fraction, and its apparent total and specific activities were strongly dependent on the culture substrate. In contrast to the motor neurons, the cells from the other metrizamide fraction (including neuronal cells) could be kept in culture for a prolonged time without addition of exogenous factor(s).
Bag-1 Defizienz in Mäusen führt in der embryonalen Entwicklung zu einem lethalen Phänotyp mit schweren Defekten in Nervensystem und Leber. Neben der Expression der Inhibitor of Apoptosis Proteinen (IAP), ist ein Komplex aus Akt, Hsp70, Bag-1 und B-Raf für die Phosphorylierung eines spezifischen AS-Restes des pro-apoptotischen Proteins Bad für das Überleben wichtig (Gotz und Wiese et al., 2005). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Funktionen der Maus Bag-1 Isoformen in der neuronalen Entwicklung anhand von in vitro Modellen näher zu charakterisieren. Überexpression von Bag-1S und Bag-1L in PC12 Zellen zeigte, dass Bag-1S im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert wird, Bag-1L nur im Zellkern. Eine eingeführte Punktmutation, die die Interaktion mit Hsp70 verhindert, führte zu einer zytoplasmatischen Expression von Bag-1Sm. Die Mutante Bag-1Lm blieb nukleär lokalisiert. Überexpression von Bag-1S führte zu einer Reduktion der Neuritenlänge. Bag-1L und die mutanten Isoformen zeigten diesen Effekt nicht. Der inhibierende Einfluss von Bag-1S auf das Neuritenwachstum ist bislang spekulativ. Die Regulation erfolgt vermutlich über den Komplex Bag-1, Hsp70, Akt und B-Raf. Die Analyse von Bag-1 - /- Neuralen Stammzellen zeigte im Vergleich zu Bag-1 +/+ Neuralen Stammzellen eine erhöhte Apoptose. Wurde durch Vireninfektion Bag-1S oder Bag-1L zurück in die Zellen gebracht, waren diese wieder in der Lage zu überleben. Die Mutanten zeigten diese Effekte nicht, so dass Hsp70 ein notwendiger Interaktionspartner für die überlebensfördernde Wirkung von Bag-1 ist. Bag-1 -/- Neurale Stammzellen zeigten außerdem gliale Differenzierungsdefekte, die nicht durch eine Rückführung der Isoformen gerettet werden konnten. Zusätzliche Experimente, die Neurale Stammzellen gezielt in die gliale Differenzierung durch Gabe von CNTF oder LIF leiten, zeigten, dass Bag-1 -/- Neurale Stammzellen durchaus in der Lage sind, gliale Zellen zu bilden. Bag-1 gilt auch als Modulator nukleärer Rezeptoren, wie dem Glucocorticoid-Rezeptor (GR). Die Kotransfektion der Bag-1 Isoformen mit GR-GFP, zeigte Änderungen des Expressionsmusters bei Bag-1L und Bag-1Lm, jedoch nicht bei Bag-1S und Bag-1Sm. Die Etablierung einer Methode zur in vivo Analyse von Glucocorticoid-Signalwegen in der Neuroneogenese von adulten Mäusen, war in ihren ersten Ansätzen erfolgreich, so dass diese nach einigen Optimierungen für weitere Analysen genutzt werden kann.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.