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Sonstige beteiligte Institutionen
Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht.
Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten.
Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen.
Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden. Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten.
Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in höheren Tieren, die viele Vorgänge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen über absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt über promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabhängig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranständigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegenüber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg über Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war.
In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellulären Domäne von hBambi anhand der gelösten Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualitätskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekundärstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinität zu annähernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodomänen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur fälschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird überdies nicht über die extrazelluläre Domäne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabhängige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich bestätigten.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chimäre Konstrukte aus für Bambi- und BR1A-Domänen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgeführt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, höhere Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chimären Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellulären Domäne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antikörper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellulären BR1A-Domäne mit zugehöriger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor.
Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, nämlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein für die Strukturaufklärung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalität dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verständnis der ICD aufklärende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament für weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden.
Synthese und Relevanz von Oxylipinen in Blättern, Wurzeln und Samen von \(Arabidopsis\) \(thaliana\)
(2016)
Die Lipidoxidation kann sowohl enzymatisch als auch nicht enzymatisch erfolgen. Der erste Schritt der enzymatischen Oxidation wird durch Lipoxygenasen katalysiert, von welchen es in Arabidopsis thaliana sechs verschiedene Isoformen gibt. Dabei werden die Lipoxygenasen nach dem Kohlenstoffatom klassifiziert, welches sie oxidieren. Somit gehören die LOX1 und LOX5 zu den 9-Lipoxygenasen, während LOX2, LOX3, LOX4 und LOX6 zu den 13 Lipoxygenasen zählen. Während der Samenalterung findet vermehrt eine Lipidperoxidation statt, welche mit einem Verfall des Samens sowie einer verringerten Keimrate korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst erfolgreich ein System zur künstlichen Samenalterung von Arabidopsis thaliana etabliert. Bei der künstlichen Alterung stiegen ähnlich wie bei der natürlichen Samenalterung oxidierte Lipide an und die Keimrate fiel ab. Nach Alterung konnte ein Anstieg von sechs verschiedenen oxidierten Triacylglycerolen detektiert werden. Es konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Mutanten mit Defekten in mehreren der Lipoxygenase Gene gezeigt werden, dass die Oxidation dieser veresterten Fettsäuren zum größten Teil nicht enzymatisch erfolgt. Bei der Alterung stiegen zudem enzymatisch gebildete 9 Lipoxygenase Produkte wie freie Hydroxy- und Ketofettsäuren an. Bei einer Analyse der freien oxidierten Fettsäuren konnte ebenfalls mit Lipoxygenase Mutanten ermittelt werden, dass diese hauptsächlich via LOX1 oxidiert werden. Die Untersuchung der Keimraten der Lipoxygenase Mutanten nach Alterung zeigte in mehreren Versuchen eine leicht erhöhte Keimrate der lox1 im Vergleich zum Wildtyp. Eine exogene Behandlung von Wildtyp Samen mit verschiedenen 9-Lipoxygenase Produkten, welche bei der Alterung ansteigen, führte allerdings nicht zu einer Keimungshemmung. Somit scheinen Produkte wie Hydroxy- und Ketofettsäuren der 9-Lipoxygenase LOX1 nicht die Hauptursache für die Keimungshemmung nach Alterung zu sein.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Behandlung der Blüten des Wildtyps mit Methyljasmonat zu einer signifikant höheren Keimrate der Samen im Vergleich zu Samen von unbehandelten Pflanzen nach Alterung führt. Ein „Lipidprofiling“ der Samen von mit Methyljasmonat behandelten Pflanzen wies signifikant geringere Gehalte sowohl an freien als auch veresterten oxidierten Fettsäuren auf, was mit einer erhöhten Lebensfähigkeit korrelierte. Diese Erkenntnisse könnten von großer Relevanz für die Landwirtschaft sein, falls eine Übertragung auf Nutzpflanzen möglich ist.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war eine eingehende Untersuchung der Rolle und Funktion der LOX6. Mit Hilfe von GUS Färbungen konnte eine Lokalisation der LOX6 in Blättern und Wurzeln nachgewiesen werden.
Zudem wurde ein 35SLOX6GFP Konstrukt erstellt und in Arabidopsis thaliana Pflanzen stabil transformiert. Mit den selektionierten Linien könnte in Zukunft auch die intrazelluläre Lokalisation der LOX6 untersucht werden. Außerdem wurden Konstrukte mit dem Reportergen GFP und AOS sowie LOX2 hinter dem 35S Promotor kloniert, welche ebenfalls für weitere Lokalisations- und Kolokalisationsstudien genutzt werden können. Zudem wurde mit der Klonierung eines Konstruktes begonnen, um in Zukunft einen spezifischen LOX6 Antikörper herstellen und auch die endogene LOX6 Lokalisation in dem Wildtyp analysieren zu können. Um die Produkte der LOX6 zu untersuchen, wurden 35SLOX6 Linien sowie die lox6 Mutante verwendet. Obwohl Hydroxyfettsäuren und Jasmonate Folgeprodukte der LOX6 sind, wiesen die 35SLOX6 Linien weder basal, noch nach Stress erhöhte Gehalte dieser im Vergleich zum Wildtyp auf. Somit geben die 35SLOX6 Linien einen Hinweis darauf, dass LOX6 im Wildtyp nicht limitierend für die Produktion von Hydroxyfettsäuren und Jasmonaten sein könnte. Um zu untersuchen, ob das Substrat der LOX6 der limitierende Faktor sein könnte, wurde eine Behandlung mit α Linolensäure durchgeführt. Dabei entstanden allerdings nicht mehr Folgeprodukte der LOX6, sondern es fand sowohl in den 35SLOX6 Linien als auch in dem Wildtyp eine massive nicht enzymatische radikalische Oxidation der Fettsäuren statt. Um festzustellen, ob sich durch eine LOX6 Überexpression das Metabolom ändert, wurde eine „untargeted Analyse“ mit 35SLOX6 Linien durchgeführt. Diese zeigte vier Metabolite, welche in den 35SLOX6 Linien im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich stark vorhanden waren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Physiologie und Stressresistenz in den Überexpressionslinien im Vergleich zum Wildtyp unterscheiden. Dabei zeichneten sich die 35SLOX6 Linien durch kleinere, hellere und rundere Blätter aus. Zudem wurden die Wurzeln der 35SLOX6 Linien bei Fraßversuchen mit Pocellio scaber im Vergleich zum Wildtyp weniger bevorzugt gefressen. Diese Erkenntnisse sowie die generierten Konstrukte und Pflanzenlinien können in der Zukunft einen weiteren Einblick in die vielfältigen Funktionen und Produkte der LOX6 gewähren.
Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden.
Die zunehmende Versalzung des Bodens führt weltweit zu starken Ernteeinbußen. Ob- wohl die Wurzeln der Pflanzen als erstes mit dem Salzstress in Berührung kommen, ist noch nicht viel über Signaltransduktionswege in Wurzeln zur Anpassung der Pflanze an Salzstress bekannt. Die bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1, bZIP1 und bZIP53, werden gewebespezifisch in der Wurzel nach Salzstress aktiviert. In dieser Arbeit werden diese bZIPs in ein Netzwerk eingeordnet, von der Aktivierung der Tran- skriptionsfaktoren bis zur Funktion in der Regulation des Stoffwechsels in der salzgest- ressten Pflanze.
Die Aktivierung von bZIP1 kann über verschiedene sowohl ionische als auch osmotische Stimuli erfolgen und ist abhängig von Calcium, der HEXOKINASE 1 und SnRK1- Kinasen (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Die dunkelinduzierte Expression von bZIP1 wird HXK1-abhängig durch Glucose inhibiert, bei Energiemangelbedingungen ist die Aktivierung von bZIP1 SnRK1-abhängig. Beide Enzyme spielen auch in der salzinduzierten Expression von bZIP1 eine Rolle. Über Transkriptom- und Me- tabolomanalysen kann gezeigt werden, dass bZIP1 und bZIP53 an der Umprogram- mierung des Kohlenhydrat- und Aminosäuremetabolismus teilhaben. Besonders Gene der Glukoneogenese (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE und FRUCTOSE- 1,6-BISPHOS- PHATASE) bzw. des Aminosäurekatabolismus (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A und HOMOGENTISATE 1,2-DIOXYGENASE ) werden von den Transkriptionsfaktoren reguliert. Das spricht für eine Umprogrammierung des Metabolismus und der Mobilisierung von Energie aus Aminosäuren zur Anpassung an die Stressbedingungen. Die Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1 bilden vorzugsweise Heterodimere mit der Gruppe C. Mit Mutantenanalysen, die zum einen die Transkriptionsfaktoren des C/S1-Netzwerks und zum anderen Komponenten der Abscisinsäure (ABA) abhängigen Signaltransduktion beinhalten, konnte ein Signaltransduktionsnetzwerk aufgestellt werden, das die Antwort auf abiotischen Stress mittels des Signalwegs über ABA, SnRK2 und AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) mit der SnRK1-vermittelten Antwort auf Energiemangelbedingungen in der Pflanze verknüpft. Die gefundenen stress- bzw. energieresponsiven Gene konnten nach den Mutantenana- lysen auf Grund ihrer unterschiedlichen Regulation in vier Klassen eingeteilt werden, wovon nur eine, die Klasse 4, von dem C/S1 Netzwerk reguliert wird. Die Klassen 1- 3 sind unabhängig von den bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C. Die Klasse 1 bilden typische ABA-responsive Gene, die von den Gruppe A-bZIPs reguliert werden. Faktoren der Gruppe A sind auch an der Expression der Gene der Klasse 2 beteiligt, diese werden aber auch durch bZIP1 und bZIP53 induziert. Dieser Klasse konnten Gene zugeordnet werden, die im Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren eine Rolle spielen. Am Aminosäureabbau sind außerdem die Gene der Klasse 2 beteiligt. Für diese Gene konnte eine Expressionsregulation durch bZIP1 und bZIP53 gezeigt werden. Für die Bestimmung möglicher Heterodimerisierungspartner bedarf es noch weiterer Analysen. Dieses Model, das den abitoschen Stress abhängigen ABA-Signalweg mit dem ener- gieabhängigen SnRK1-Signaltransduktionsweg verknüpft, zeigt die präzise Regulation von mindestens 4 Gen-Klassen, deren Expression durch die Kombination verschiedener bZIP-Transkriptionsfaktoren aktiviert wird.
Regulation Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor assoziierter Signalwege durch das Adapterprotein TRAF1
(2015)
TWEAK ist ein zu der TNF-Superfamilie (Tumor Necrosis Factor) zugehöriges Zytokin, welches in Form löslicher und membranständiger Moleküle vorkommt. Beide Formen des Liganden können an den Rezeptor (Fn14) binden. Viele verschiedene intrazelluläre Signalwege werden durch den Fn14 aktiviert, beispielweise Erk1/2, JNK, Jun und STAT3, vor allem jedoch das NFkB. Lösliches und membranständiges TWEAK zeigen eine ähnliche Aktivierungseffizienz bezüglich des alternativen NFkB-Signalwegs, wohingegen membranständiges TWEAK weit besser als lösliches TWEAK den klassischen NFkB-Signalweg aktiviert. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die TWEAK-vermittelte Induzierbarkeit von verschiedenen Zielgenen des NFkB-Systems untersucht. Lösliches TWEAK zeigte einen weit schwächeren aktivierenden Effekt auf den klassischen NFkB-Signalweg als TNF, das ein sehr guter Aktivator des klassischen NFkB-Systems ist (Abb. 5, 6). Nichtsdestotrotz war TWEAK imstande eine stärkere TRAF1-Induktion als TNF herbeizuführen (Abbildung 7, 8). TRAF1 ist ein durch NFkB-System stark reguliertes Gen. Um posttranskriptionelle TRAF1-Modifikationen als Ursache für die unerwartet gute TRAF1-Induktion durch lösliches TWEAK auszuschließen, wurde die TRAF1-Expression nach Proteasom- und Caspasen-Inhibition untersucht (Abbildung 9). Dies ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss dieser Prozessen auf der TRAF1-Expression.
Mittels des IKK2-spezifischen Inhibitor TPCA-1 wurde die TWEAK-vermittelte TRAF1-Induktion Zelltyp-abhängig gehemmt, wohingegen die TNF-vermittelte Induktion von TRAF1 in allen Zelllinien vollständig inhibiert wurde (Abbildung 13). Versuche mit dem NEDD8-aktivierenden Enzym (NAE) Inhibitor MLN4924, resultierten in einer totalen Inhibition der TRAF1-Expression in allen TWEAK- und TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 14). Diese Befunde sprechen dafür, dass bei der TWEAK-vermittelten TRAF1-Expression beide Zweige des NFkB-Signalwegs Zelltyp-abhängig beteiligt sind.
Die Oligomerisierung der Liganden der TNF-Familie verstärkt oft ihre Aktivität. Oligomerisiertes TWEAK imitiert die biologische Aktivität von membranständigem TWEAK. Lösliches TWEAK wurde mit einem anti-Flag Antikörper oligomerisiert und die TRAF1-Induktion durch den alternativen NFkB-Signalweg wurde analysiert
Oligomerisiertes TWEAK aktivierte Zelltyp-unabhängig den klassischen NFkB-Signalweg stärker als lösliches TWEAK, wohingegen kein Effekt auf die TRAF1-Induktion oder auf die Aktivierung den alternativen NFkB-Signalweg festgestellt wurde (Abbildung 11, 12). TWEAK ist imstande die TRAF2-vermittelte CD40-Induktion des klassischen NFkB-Signalwegs zu hemmen (Abbildung 16, 17). Um den Beitrag von TWEAK-Induziertem TRAF1 zur CD40-Inhibition zu herauszufinden, wurden TRAF1-stabil transfizierte 786O- und U2OS-Zellen hergestellt (Abbildung 19). Die CD40-Induzierte IkBa-Degradation und IL8/6 Produktion war in den TRAF1-Transfektanten als auch in mit löslichem TWEAK vorbehandelte Zellen stark inhibiert (Abbildung 21, 22), wobei die CD40-Expression und CD40/CD40L-Interaktion unverändert blieb (Abbildung 20). Diese Ergebnisse sprechen für einen wichtigen Beitrag des Adaptorprotein TRAF1 in der TWEAK-vermittelte Inhibition der CD40-induzierte Aktivierung des klassischen NFkB-Signalwegs.
Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden.
Die Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, weckte aufgrund ihrer karnivoren Lebensweise schon sehr früh das Interesse vieler Wissenschaftler. Für karnivore Pflanzen, die auf Nährstoff-armen Böden wachsen, spielen Insekten als Beute und somit als Nährstofflieferant eine entscheidende Rolle. So können die Pflanzen durch die Verdauung der Beute mit wichtigen Makro- und Mikronährstoffen, wie Stickstoff, Phosphat, Kalium oder Natrium versorgt werden. Aus diesem Grund sollte im Rahmen meiner Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die molekularen Mechanismen der Kationenaufnahme während der Nährstoffresorption gerichtet werden. Insbesondere die aus dem Insekt stammenden Nährstoffe Kalium und Natrium waren dabei von großem Interesse.
Im Allgemeinen sind Kaliumionen für Pflanzen eine essentielle anorganische Substanz und von großer physiologischer Bedeutung für die Entwicklung, den Metabolismus, die Osmoregulation, das Membranpotential und viele zelluläre Prozesse. Analysen der Kaliumaufnahme an Wurzeln von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana und Reis zeigten, dass die Aufnahme von K+ ein Zusammenspiel von hoch-affinen K+-Transportern der HAK5-Familie und nieder-affinen Kaliumkanälen (AKT1/AtKC1) erfordert, die in ein komplexes
(De-)Phosphorylierungsnetzwerk eingebunden sind. In der vorliegenden Arbeit war es mir möglich das Netzwerk zur Kaliumaufnahme in den Drüsen der Venusfliegenfalle zu entschlüsseln. Es konnten Orthologe zum Kaliumtransporter HAK5 aus Arabidopsis (DmHAK5) und zum Kaliumkanal AKT1 (DmKT1) identifiziert und im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, das DmKT1 durch einen Ca2+-Sensor/Kinase-Komplex aus der CBL/CIPK-Familie phosphoryliert und somit aktiviert wird. Phylogenetische Analysen von DmKT1 bestätigten die Eingruppierung dieses Kaliumkanals in die Gruppe der pflanzlichen Shaker-Kaliumkanäle des AKT1-Typs. Die Transporteigenschaften zeigten zudem, dass DmKT1 bei hyperpolarisierenden Membranpotentialen aktiviert wird und einen K+-selektiven Einwärtsstrom vermittelt. In Oozyten konnte eine Kaliumaufnahme bis zu einer externen Konzentration von ≥1 mM beobachtet werden. DmKT1 repräsentiert also einen Kaliumkanal mit einer hohen Transportkapazität, der die nieder-affine Kaliumaufnahme in die Drüsenzellen der Venusfliegenfalle vermitteln kann.
Unterhalb einer externen Kaliumkonzentration von 1 mM würde der anliegende elektrochemische Kaliumgradient einen Kaliumausstrom und somit einen Verlust von Kalium favorisieren. Hoch-affine K+/H+-Symporter können durch die Ausnutzung des Protonengradienten eine Kaliumaufnahme im mikromolaren Bereich gewährleisten. In Wurzelhaaren von Arabidopsis vermittelt der Transporter AtHAK5 die Kaliumaufnahme unter Kaliummangelbedingungen. DmHAK5, ein Ortholog zu AtHAK5, ist in Dionaea Drüsen exprimiert und konnte zum ersten Mal im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten im Detail charakterisiert werden. Interessanterweise zeigte sich, dass DmHAK5 wie der K+-Kanal DmKT1 durch denselben CBL/CIPK-Komplex posttranslational reguliert und aktiviert wird. Die Transporteigenschaften von DmHAK5 wiesen auf einen Transporter mit einer breiten Substratspezifität hin, sodass sich DmHAK5 neben Kalium auch für Ammonium permeabel zeigte. Affinitätsuntersuchungen von DmHAK5 zu seinem Substrat Kalium klassifizierten das Protein als einen hoch-affinen Kaliumtransporter, der im Symport mit Protonen die Kaliumaufnahme im mikromolaren Konzentrationsbereich vermitteln kann.
Das Kaliumtransportmodul besteht also aus dem K+-selektiven Kanal DmKT1 und dem
K+/H+-Symporter DmHAK5, die die hoch- und nieder-affine Kaliumaufnahme in den Drüsenzellen während der Beuteverdauung in Dionaea muscipula Fallen ermöglichen. Beide Transportmodule werden Kalzium-abhängig durch die Kinase CIPK23 und den Ca2+-Sensor CBL9 auf posttranslationaler Ebene reguliert.
Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit Einblicke in die Kationenaufnahme während der Nährstoffresorptionsphase der Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, zu gewinnen. Dabei wurde klar, dass Dionaea muscipula im Laufe ihrer Evolution zu einer karnivoren Pflanze, nicht neue Transportmodule zur Nährstoffresorption aus der Beute entwickelte, sondern bekannte aus Wurzeln stammende Transportmodule umfunktionierte. Auf molekularer Ebene konnten die biophysikalischen Charakteristika der K+- und Na+-Transportproteine, sowie ihre Regulation entschlüsselt werden. Diese Erkenntnisse wurden schließlich in den Kontext des Beutefangs der Venusfliegenfalle gebracht und diskutiert.
In der vorliegenden Arbeit wurden extraflorale Nektarien (EFN) von Populus trichocarpa (Ptr) und Populus tremula x Populus tremuloides (Ptt) hinsichtlich ihrer funktionellen Eigenschaften bei der indirekten Herbivoren-Abwehr untersucht. Die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Nektarien-Funktion und -Regulation:
Beide untersuchten EFN-Arten sind in der Lage, die jeweilige Pappel indirekt vor Schädigung durch Herbivoren zu schützen. Dies zeigte nicht zuletzt der jeweils beobachtete kontinuierliche Besuch verschiedenster Insektenarten. Vor allem Ameisen aber auch Bienen zählten zu Besuchern sowohl von Ptr als auch Ptt. Die Effektivität so angelockter Besucher konnte durch Interaktionsversuche mit Bienen bestätigt werden und belegte, dass allein die Anwesenheit von Bienen zu einer eindeutigen Reduktion des herbivoren Blattschadens führt (Ptr und Ptt).
Obwohl beide Pflanzen derselben Gattung (Populus) angehören, konnte bestätigt werden, dass Ptr und Ptt unterschiedliche Herbivoren-Abwehrstrategien entwickelt haben. Während es sich bei Ptt-EFN um konstitutiv vorhandene Organe handelt, zeigten Ptr-Pflanzen eine gezielte Bildung von Nektarien/Nektar erst nach Herbivorenbefall. Dabei scheinen spezifische, durch Herbivoren erzeugte Signale für die Induktion verantwortlich zu sein. Die Freisetzung der nach Herbivorenbefall typischen, flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) in Ptr konnte zwar als Jasmonsäure-abhängig identifiziert, der Jasmonsäure-Signalweg, der schon als Auslöser für extraflorale Nektar-Produktion bei z.B. Limabohne gezeigt worden war, als alleiniges Steuerelement aber ausgeschlossen werden. Ein Zusammenspiel mehrerer Hormone bei der Regulation der indirekten Herbivoren-Abwehr in Ptr durch Nektarien/Nektar-Induktion ist deshalb sehr wahrscheinlich.
Dies bekräftigten auch die Transkriptomanalysen von Ptt-Nektarien. Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl Jasmonsäure als auch Auxin und Salicylsäure eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus lieferten verschiedene differentiell regulierte Gencluster, die in Zusammenhang mit Nektarien-Funktion, -Entwicklung und biotischem Stress stehen, deutliche Hinweise auf die entscheidende Rolle extrafloraler Nektarien bei der Herbivoren-Abwehr.
Nektar-Produktion:
Die Analyse extrafloraler Nektar-Proteine und zugehöriger Transkripte zeigte nicht nur, dass beide Pappelarten über eine ähnliche, von antimikrobiellen Proteinen dominierte Nektar-Proteinzusammensetzung verfügen, sondern auch, dass bei beiden die Produktion dieser Proteine hauptsächlich direkt in den Drüsenorganen stattfindet.
Es deutete außerdem alles darauf hin, dass der Zucker des Ptt-Nektars direkt im Nektarienparenchym produziert wird, und dass dafür ein apoplastischer Schritt notwendig ist, der gleichzeitig über das „Source und Sink“ Verhältnis den Nachschub von Saccharose ins Nektarienparenchym reguliert.
Nektar-Sekretion:
Die unterschiedlichen Hauptsekretionsarten der beiden Pappeln konnten ebenfalls gezeigt werden. Während Ptt-Nektar eindeutig granulokrin sekretiert wird, konnte dieser Weg für Ptr ausgeschlossen werden. Deshalb scheint Ptr holokrine Sekretion zu bevorzugen.
In Ptt fanden sich außerdem Belege für eine parallel ablaufende ekkrine Sekretion. Hierfür wird die initiale Abgabe osmotisch wirksamer Substanzen und nachfolgend Wasser vorausgesetzt. Der Anionenkanal PttSLAH3 zeigte sich, ausgehend von der Anionenzusammensetzung des Nektars und der Lokalisation des Proteins in den epidermalen Drüsenzellen als optimales Transportprotein für diesen Schritt. Die typischen Eigenschaften eines S-Typ-Anionenkanals vom Typ des Arabidopsis-SLAH3, wie Nitratabhängigkeit und spezifische Anionenpermeabilität wiesen darauf hin, dass PttSLAH3 für die finale „nasse“ Sekretion verantwortlich sein kann.
Im Unterschied zu AtSLAH3 scheint die Aktivierung von PttSLAH3 allerdings auf andere Weise zu erfolgen. Denn im Gegensatz zum Arabidopsis-Ortholog, zeigte PttSLAH3 in Xenopus-Oozyten bereits ohne koexprimierte Kinase Aktivität. Grundsätzlich konnte eine Aktivierung durch Phosphorylierung aber nicht ausgeschlossen werden. Es deutete vielmehr alles darauf hin, dass bereits Oozyten-endogene Kinasen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von PttSLAH3 spielen. Eine entsprechende Phosphorylierungsstelle konnte jedoch nicht ausgemacht werden. Allerdings deuteten die Ergebnisse im Weiteren darauf hin, dass die unterschiedliche Struktur der AtSLAH3- und PttSLAH3-Termini, im Besonderen die des N-Terminus, für die konstitutive Aktivität des Pappel-Kanals verantwortlich ist. Damit kommt PttSLAH3 eine Sonderstellung innerhalb der SLAC/SLAH-Familie zu, die weiterer Untersuchungen bedarf.
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar.
In Tumoren an Arabidopsis thaliana, induziert über Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58), ist von den 49 bekannten Lipidtransferproteinen (LTPs) nur die Expression von LTP2 stark erhöht (Deeken et al., 2006). Mutanten ohne LTP2-Transkripte (ltp2KO) entwickeln deutlich kleinere Tumore als der Wildtyp. Durch die permanenten Zellstreckungs- und Dehnungsprozesse besitzen Tumore keine intakte Epidermis (Efetova et al., 2007). Dies wiederum führt zum Verlust einer vollständigen Cuticula-Schicht, welche von der Epidermis produziert wird und dieser als Barriere zur Umwelt aufgelagert ist. Um den transpirationsbedingten Wasserverlust zu minimieren, werden in Tumoren langkettige Aliphaten in die äußeren Zellschichten eingelagert (Efetova et al., 2006). Ein ähnliches Szenario findet um Verwundungsareale statt (Kolattukudy et al., 2001). Die Gen-Expression von LTP2 wird nicht durch tumorinduzierende Agrobakterien ausgelöst. Faktoren wie Verwundung, sowie die Applikation des Trockenstress-Phytohormons Abscisinsäure (ABA) begünstigen die LTP2-Gen-Expression positiv. Außerdem ist der LTP2-Promotor in Gewebe aktiv, in welchem sekundäre Zellwandmodifikationen auftreten, sowie insbesondere in Abscissionsschichten von welkenden Organen. Ungerichtete Lipidanalysen der ltp2KO-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zeigten nur signifikante Veränderungen in der Menge definierter Sphingolipide – obwohl bislang eine Beteiligung von LTP2 am Transfer von Phospholipiden postuliert wurde. Allerdings kann das LTP2-Protein, wie Protein-Lipid-Overlay-Analysen demonstrierten, weder komplexen Sphingolipide noch Sphingobasen binden. Neben Sphingobasen sind auch langkettige Fettsäuren Bestandteile von Sphingolipiden und diese sind wiederum Bindepartner von LTP2. Um eine eventuelle Beteiligung von LTP2 an der Bildung von Suberin von Tumoren zu zeigen, wurde dieses analysiert. Die GC-MS-Analysen des Tumor-Suberins haben jedoch veranschaulicht, dass durch das Fehlen von LTP2-Transkripten das Lipidmuster nicht beeinträchtigt wird. Eine Überexpression von LTP2 im gesamten Kormophyten war trotz drei unabhängiger experimenteller Ansätze nicht möglich. Daher wurde das Protein ektopisch in epidermalen Zellen exprimiert (CER5Prom::LTP2). Die Transgenen CER5Prom::LTP2 wiesen einige morphologische Besonderheiten auf, wie verminderte Oberflächenhydrophobizität, aberrante Blüten- und Blattmorphologien etc., die typisch für Wachsmutanten sind. GC-MS-Analysen der cuticulären Wachse dieser transgenen Pflanzen zeigten, einen erhöhten Gehalt an C24- und C26-Fettsäuren, wohingegen die korrespondierenden Aliphaten wie Aldehyde und Alkane dezimiert waren. Unterstützend zeigten Lokalisationsanalysen, dass das LTP2-Protein an/in der Plasmamembran assoziiert ist.
Somit kann die These aufgestellt werden, dass LTP2 langkettigen, unverzweigten Aliphaten (Fettsäuren) an der Grenzfläche Plasmamembran/Zellwand transferiert, die zur Versieglung und Festigung von Zellwänden benötigt werden.
Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind.
Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert.
Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist.
Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist.
Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus.
AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandomänen als Plattformen für die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegenüber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten führen und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs“ bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandomänen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandomänen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten.
Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandomänen lokalisiert gelten können. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abhängige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranständigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abhängiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandomänen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabhängige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013).
Unter den in Nanodomänen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabhängig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandomänen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandomänenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandomänen geben könnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch womöglich auch unterschiedlich reguliert sein können. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 bestätigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandomänen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilität und kann somit als ein Marker für Membrandomänen etabliert werden. Somit bestätigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt.
Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu können. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von fünf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabhängigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abhängige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller fünf ausgewählten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD.
Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivität der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abhängige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden für die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (Nühse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor bestätigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die Fähigkeit diese Oxidase auch aktivieren zu können. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivität von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar.
Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abhängigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandomänen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandomänen. Auch zeigt sich, dass die Aktivität der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandomänen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandomänen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandomänen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen Fällen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivitäten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst.
Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren.
Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist.
Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium.
Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen.
Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines vaskularisierten, autologen Implantats zur Behandlung von schweren Verletzungen der Trachea im Umfeld der guten Herstellungspraxis. Die Matrix besteht aus einem circa 14 cm langen Stück porcinen, azellularisierten Dünndarm und BioVaSc (Biological Vascularized Scaffold) genannt wird. Dieses wird dann mit isolierten und kultivierten Zellen des Patienten besiedelt und reift für zwei Wochen in einem speziell hierfür entwickelten Bioreaktorsystem. Danach erfolgt die Analyse bzw. die Implantation in den Patienten.
Nach der Präparation und Überprüfung der Qualität, erfolgte die Azellularisierung der BioVaSc zur Entfernung der porcinen Zellen und der enzymatische Abbau der DNS, unter Erhalt des natürlichen Gefäßsystems. Hierfür ist Natriumdesoxycholat verwendet worden, wobei Rückstände davon das Ansiedeln der autologen Zellen negativ beeinflussen könnten. Deshalb wurde ein Test etabliert, mit dessen Hilfe, das Auswaschen der Azellularisierungsdetergenz bis zur Sterilisation nachweisbar war. Des Weiteren könnten in der BioVaSc natürlicherweise enthaltene Endotoxine Immunreaktionen im späteren Empfänger auslösen. Die gesetzlichen Grenzwerte konnten durch Modifikationen des Protokolls, unter Berücksichtigung der guten Herstellungspraxis, erreicht werden. Weiterhin konnte histologisch eine weitgehende DNS- und Zellfreiheit nachgewiesen werden, in der quantitativen Analyse ergab sich eine Abreicherung von 97% im Vergleich zum Ausgangsmaterial. Zur Bestimmung der funktionellen Stabilität der azellularisierten Matrix wurde die maximal tolerable Zugspannung bestimmt.
Zur Besiedlung der Gefäße der Matrix wurden mikrovaskuläre Endothelzellen und für das Lumen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen verwendet. Die Protokolle zur Isolation und Kultur sind hierzu unter den Bedingungen der guten Herstellungspraxis etabliert, optimiert und mit, soweit möglich, zertifizierten Reagenzien durchgeführt worden. Zur genauen Charakterisierung der Zellen wurden diese immunhistologisch über vier Passagen analysiert, wobei sich je nach Zelltyp und Differenzierungsstadium unterschiedliche Expressionsmuster ergaben.
Zur Herstellung des autologen Implantats wurden zunächst die mikrovaskulären Endothelzellen in das vorhandene Gefäßsystem der BioVaSc eingebracht und dann für sieben Tage im etablierten Bioreaktorsystem kultiviert. Danach erfolgte die Besiedlung des Lumens mit Skelettmuskelzellen und Fibroblasten und die weitere siebentägige Kultur im Bioreaktorsystem.
Die Besiedlung des Gefäßsystems musste optimiert werden, um sowohl die Besiedlungsdichte zu steigern als auch die Effizienz zu erhöhen. Das Lumen konnte mit der etablierten Methode vollständig besiedelt werden. Nach vierzehntägiger Kultur im Bioreaktorsystem erfolgte die Kontrolle der Zellvitalität, wobei sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen der BioVaSc vitale Zellen nachweisbar waren. Histologische Analysen zeigten, dass die mikrovaskulären Endothelzellen in den verbliebenen vaskulären Strukturen CD31 und den vWF exprimieren. Wohingegen die histologische Unterscheidung zwischen Fibroblasten und Skelettmuskelzellen nicht möglich ist.
Zusätzlich wurde die BioVaSc mit upcyte mvEC der Firma Medicyte besiedelt. Nach der vierzehntägigen Kultur im Bioreaktorsystem waren die Zellen sowohl in den Gefäßstrukturen als auch im Lumen und im Bindegewebe vital nachweisbar. In der histologischen Analyse konnte die Ausbildung von CD31, eNOS und vWF nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Matrix mit mesenchymalen Stammzellen besiedelt, um zu analysieren, ob die Scherkräfte die Ausbildung endothelialer Marker stimulieren können. Nach vierzehntägiger Kultur konnte in den histologischen Analysen keine Ausbildung von CD31 oder dem vWF gefunden, allerdings vitale Zellen nachgewiesen werden.