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Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht.
Der Vernetzungsgrad von Klebstoffen und strahlenvernetzter Kunststoffformteile beeinflusst zahlreiche Materialeigenschaften und ist von essenzieller Bedeutung für die Funktionalität von Klebeverbindungen und die Beständigkeit medizinischer Implantate.
Die zerstörungsfreie Prüfung dieser Qualitätsgröße ist von großem industriellem Interesse, aber noch nicht Stand der Technik. Die unilaterale Kernspinresonanz (uNMR) ist ein vielversprechendes Verfahren zur Lösung dieser Problematik.
In diesem Buch wird die nicht-invasive Vernetzungsgradprüfung von strahlenvernetztem UHMWPE und verschiedenen Klebstoffen mittels uNMR demonstriert. Auf Basis der guten Korrelation mit praxisrelevanten Referenzmethoden (thermisch, rheologisch, dielektrisch) wurden Vergleichsmodelle entwickelt, welche Anwendern von Klebstoffen und vernetzten Kunststoffformteilen den Einsatz der uNMR zur zerstörungsfreien Qualitätssicherung ermöglichen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein prinzipieller Zugang zur Mikroverkapselung anorganischer Latentwärmespeichermaterialien (LWS) erarbeitet. Dazu wurden zwei basische, kristallwasserreiche Salzhydrate mit Schmelztemperaturen im Umgebungstemperaturbereich als Kernmaterialien und anorganisch-organische Hybridpolymere mit kovalent verbundenen anorganischen und organischen Struktureinheiten (ORMOCER®e) als Verkapselungsmaterial verwendet. Der Prozess verläuft grenzflächenselektiv in der flüssigen Phase, initiiert durch die basischen LWS, in Form einer auch bei milden Temperaturen ablaufenden Michael-Typ-Addition zwischen Acrylat- (Acr) und Thiolmonomeren (SH). Optimierte Verkapselungsergebnisse wurden mit Hybridmonomeren erreicht, deren funktionelle Gruppen in einem unstöchiometrischen Verhältnis von Acr:SH ≈ 5:1 vorlagen und über das anorganische Rückgrat vorverknüpft waren. Bei Verwendung eines Mikrodosiersystems wurden gleichmäßige, geschlossene Mikrokapseln mit Durchmessern von etwa 40–50 µm bei Schichtdicken von < 5 µm erhalten. Aufgrund einer zu geringen inhärenten Barrierewirkung der verwendeten Hybridpolymere gegenüber Wasserdampf konnten jedoch erhebliche Kristallwasserverluste nicht verhindert werden, sodass die erhaltenen Mikrokapseln noch nicht zur Anwendung als LWS geeignet sind. Da die beobachtete Tolerierung und sogar Bevorzugung für das deutliche Missverhältnis zwischen den polymerisierenden Gruppen für eine Stufenpolymerisation sehr ungewöhnlich ist, wurden an Modellsystemen Untersuchungen zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus vorgenommen. Dazu wurde zunächst ein Mercaptosiloxan (MS) hergestellt, dessen Ringgrößen- bzw. Funktionalitätsverteilung mittels 29Si-NMR- und GPC-Messungen sehr gut aufgeklärt werden konnte. Dieses wurde für Verkapselungsversuche mit Trimethylolpropantriacrylat (TMPTA) kombiniert und das Verhältnis funktioneller Gruppen Acr:SH systematisch variiert. An den erhaltenen Proben konnte via µ-Raman-Tiefenscan-Untersuchungen der Einfluss der Harzzusammensetzung auf die Kapselschichten aufgeklärt werden. Während bei Acr:SH = 1:1 maximale Schichtdicken erhalten wurden, ergaben sich bei Acrylatüberschuss von 4:1 bis 6:1 optimierte Schichten im Sinne der Vorgaben, die gleichmäßig dünn und vollständig waren. Bei Thiolüberschuss wurden dagegen keine vollständig ausgebildeten Schichten erhalten. Das für die LWS-Verkapselungen verwendete Modellsystem TMPTA/MS wurde zusätzlich in Volumenpolymerisationen in homogener organischer Phase untersucht, die mit der Base Triethylamin initiiert wurden. Dabei wurden die stöchiometriebezogenen Vergelungsgrenzen bestimmt. Die detektierte Grenze bei Acr:SH < 5:1 für Acrylatüberschuss lag signifikant unterhalb von Verhältnissen funktioneller Gruppen, für die in Verkapselungsversuchen noch geschlossene Schichten erhalten wurden. Entlang der flüssig-flüssig-Grenzfläche wird somit der Gelpunkt lokal innerhalb eines breiteren Bereichs des Verhältnisses funktioneller Gruppen in der Harzmischung erreicht, als bei einer Polymerisation im gesamten Volumen. Durch weitergehende Untersuchungen zum Vernetzungsverhalten in Abhängigkeit vom Verhältnis funktioneller Gruppen weiterer Acrylat- und Thiolmonomere mit anderen (durchschnittlichen) Funktionalitäten konnte das grundsätzliche Vorliegen eines Stufenmechanismus untermauert werden. Aus einer Kombination der Flory-Stockmayer-Theorie mit der Carothers’schen Gleichung konnten theoretische Vergelungsgrenzintervalle hergeleitet werden. Die experimentell bestimmten Vergelungsgrenzen standen in vollständiger Übereinstimmung mit den theoretisch errechneten Intervallen. Innerhalb des Modellsystems TMPTA/MS konnten zudem weitere Materialeigenschaften bestimmt und zusätzliche Erkenntnisse zum Vernetzungsverhalten gewonnen werden. Durch In-situ-Messungen mittels µ-Raman-Spektroskopie wurde die Entwicklung der Umsetzungsgrade N(C=C) und N(S–H) von Acrylat und Thiol im Verlauf der Reaktionszeit untersucht. Dabei wurden einige Einschränkungen der verwendeten Messmethode identifiziert und beschrieben. Mittels in-situ-mechanischer Spektroskopie nach Chambon und Winter konnte weiterhin das Vergelungsverhalten des Systems in Abhängigkeit von Monomerzusammensetzung, Initiatorkonzentration und Temperatur und Unterschiede innerhalb der kritischen Gele systematisch charakterisiert werden. Die stabilsten kritischen Gele und kürzesten Gelzeiten wurden für hohe Basenkonzentrationen und bei stöchiometrischem Monomerverhältnis, aber auch für Acrylatüberschuss bis Acr:SH = 3:1, erhalten. Damit konnte auch innerhalb der Volumenpolymerisationen eine Bevorzugung des untersuchten Monomersystems für Acrylatüberschuss nachgewiesen werden. Weiterhin wurde das Geschwindigkeitsgesetz der Reaktion aufgeklärt. Es ergab sich bis zum Gelpunkt, zu je erster Ordnung in den beiden Monomeren und der Initiatorbase. Außerdem wurde die Aktivierungsenthalpie der Polymerisation in homogener Phase mittels einer Arrhenius-Auftragung bestimmt.