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Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen.
Die Myokardhypertrophie ist eine Anpassungsreaktion des Herzens auf verschiedene pathologische Stimuli wie der arteriellen Hypertonie, Herzklappen-Vitien, Myokardinfarkt, endokrine Stoffwechselstörungen sowie Mutationen von Genen kontraktiler Proteine. Die Antwort der Herzmuskelzelle auf einen hypertrophen Reiz ist gekennzeichnet durch ein verstärktes Zellwachstum ohne Zellteilung und auf molekularer Ebene durch die Induktion fetaler kardialer Gene kontraktiler Proteine. Auch wenn über den klinischen Aspekt der Myokardhypertrophie bereits ein umfangreiches Wissen vorliegt, wurden Details über die bei der Hypertrophie ablaufenden intrazellulären Signalwege erst in den letzten Jahren entdeckt. Der Calcineurin/NFAT Signalweg ist bei der Entstehung der Herzhypertrophie von großer Bedeutung. Die Aktivierung der Ca²+-Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin führt zur einer Dephosphorylierung des Transkriptionsfaktors NFAT. Dies erlaubt die nukleäre Translokation, was zur einer Induktion von Genen führt, welche an der Entstehung der Myokardhypertrophie beteiligt sind. Nach dem heutigen Verständnis benötigt die Aktivierung des Calcineurin/NFAT-Signalweges die Bindung von Calmodulin sowie dauerhaft erhöhte Ca²+-Spiegel. Die Folge der Calcineurinaktivierung ist eine strukturelle Veränderung mit einem Shift der C-terminalen Autoinhibitorischen Domäne, so dass das aktive Phosphatase-Zentrum freigegeben wird. In dieser Arbeit untersuchen wir einen Mechanismus der gezielten proteolytischen Abspaltung der Autoinhibitorischen Domäne, welcher ebenfalls zu einer Enzymaktivierung führt. Die Stimulation von Ratten-Kardiomyozyten mit Angiotensin II führte zu einer Erhöhung der Calpain-Aktivität, was eine proteolytische Abspaltung der autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin bedingte. Durch die Blockierung von Calpain konnte die Proteolyse verhindert werden. Die Calcineurin-Aktivität war nach Angiotensin II-Stimulation erhöht (310±29%) und bleib auch nach Wegnahme des Stimulus auf erhöhtem Niveau (214±17%). Wurde dem Medium während der Stimulation Calpain-Inhibitor hinzu gegeben, kam es nach Wegnahme des Angiotensin II-Stimulus zu einem deutlichen Absinken (110±19%) der Calcineurin-Aktivität. An Hand von immunhistochemischen Färbungen und von Transfektionsversuchen mit einem GFP-fusionierten Calcineurin konnte gezeigt werden, dass die Angiotensin II-Stimulation eine nukleäre Translokation von Calcineurin bewirkt. Die Calpain-Blockierung und somit die Unterdrückung des Calpain vermittelten Verdaus von Calcineurin erlaubt es diesem, den Zellkern wieder zu verlassen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Angiotensin II-Stimulation der Kardiomyozyten zu einer Erhöhung der Calpain-Aktivität führt. Diese wiederum bedingt eine proteolytische Abspaltung der Autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin. Die Folge ist eine erhöhte Calcineurin-Aktivität, was eine nukleäre Translokation von Calcineurin auslöst. Nach dem Verlust der Autoinhibitorischen Domäne ist Calcineurin dauerhaft aktiv und nukleär lokalisiert, sogar nach Wegnahme des Hypertrophie-auslösenden Stimulus.