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Im ersten Teil dieser Arbeit wurden humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (mhMSCs) und aus trabekulären Knochenfragmenten (bhMSCs) isoliert und in einem neurogenen Prädifferenzierungsmedium mit BME gefolgt von einem Differenzierungsmedium mit BHA und DMSO kultiviert. Anschließend wurden die differenzierten hMSCs mit den jeweiligen undifferenzierten, im normalen Wachstumsmedium kultivierten, mhMSCs bzw. bhMSCs verglichen. Im Verlauf der 6-tägigen neurogenen Differenzierung zeigte sich eine deutliche Veränderung der Zellmorphologie. Die meisten differenzierten Zellen erschienen kleiner und bildeten lange, für Nervenzellen typische Zellfortsätze aus, die sich teilweise mehrfach verzweigten. Weiterhin fand sich bei den differenzierten mhMSCs und bhMSCs eine Expressionszunahme bzw. eine de novo Expression der neuronalen Marker NSE und tau auf Gen- bzw. Protein-Ebene. Es konnte jedoch keiner Expressionsänderung von NF-M auf Protein-Ebene und in mehr als der Hälfte der Fälle sogar einer Expressionsabnahme auf RNA-Ebene gefunden werden. Die Differenzierung zeigte keinen reproduzierbaren Effekt auf die Expression des Astrozyten-Markers GFAP. Diese Ergebnisse zeigten sich sowohl bei den mhMSCs als auch bei den bhMSCs und lassen vermuten, dass bhMSCs ein ähnliches Potential besitzen wie mhMSCs und nicht wie ursprünglich vermutet, auf die Differenzierung in Zellen mesenchymalen Ursprungs beschränkt sind. Die Tatsache, dass bereits undifferenzierte hMSCs neurogliale Marker (NF-M, NSE, GFAP) exprimieren konnte in dieser Arbeit für mhMSCs bestätigt und erstmals auch für bhMSC beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es sich bei mhMSCs und bhMSCs um Neuroglia-Vorläuferzellen handelt, die in der Lage sind in neuronale Zellen (Nerven- und Gliazellen) zu differenzieren, und dass die neurogene Differenzierung eher eine quantitative Modulation der Genexpression als ein einfaches An-/Abschalten Neuronen-spezifischer Gene bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst Zellen vom peripheren Nerven isoliert und anschließend charakterisiert. Die aus dem peripheren Nerven herausgewachsenen spindelförmigen bzw. multipolaren Zellen bildeten mit ihren zahlreichen langen Fortsätzen ein regelrechtes Netzwerk und zeigten eine Expression der für Myelinmarker MPZ und PMP 22 sowie des Schwann-Zell-Markers S 100. Abschließend wurden mhMSCs und bhMSCs für 6 Tage in einem Schwann-Zell-Differenzierungsmedium mit Forskolin kultiviert. Die differenzierten spindelförmigen Zellen zeigten eine für Schwann-Zellen typischen fischzugartige Ausrichtung. Es fand sich eine starke Expressionszunahme der von den undifferenzierten Zellen nur schwach exprimierten Myelinmarker MPZ und PMP 22 auf RNA-Ebene sowie eine kräftige Expressionszunahme bzw. de novo Expression des Schwann-Zell-Markers S 100. Diese Ergebnisse zeigen, dass bhMSCs ebenso wie mhMSCS unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, eine für Schwann-Zellen typische Morphologie zu entwickeln und die Expression einzelner Schwann-Zell-Marker zu steigern. In wie weit sie auch funktionell Schwann-Zellen gleichen und damit entscheidend zur peripheren Nervenregeneration beitragen können, bleibt jedoch noch zu klären.
In dieser Arbeit wurde in humanen CD34-positiven Stammzellen die PK-G, PK-A sowie ihr Substratprotein VASP nachgewiesen. Dabei liegt VASP in unstimulierten Zellen in nicht-phosphorylierter Form vor. Die VASP-Phosphorylierung kann durch die aus anderen Zellsystemen bekannten cAMP- und cGMP- abhängigen Signalkaskaden auch im Zellkultursystem von humanen CD34-positiven Stammzellen reguliert werden. Ein weiterer Teilaspekt war der Einfluss des cGMP-erhöhenden Stickstoffmonoxyd-Donors DEA/NO auf das Proliferations,- und Differenzierungsverhalten humaner CD34-positiver Stammzellen. Hierbei fand sich ein dualer konzentrationsabhängiger Effekt von cGMP: niedrige Konzentrationen zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Proliferation undgleichzeitig einen aktivierenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopeotischen Zellen zu CD41-positiven Megakaryozyten. Die höhere Konzentration von DEA/NO beinflusst zwar das Zellwachstum positiv, die Differenzierung der CD34-positiven Zellen hingegen wird gehemmt. Eine Zelldifferenzierung von humanen CD34-positiven Stammzellen zu CD15-positiven Granulozyten /Monozyten unter DEA/NO war nicht zu beobachten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Signalwege, die über zyklische Nukleotide reguliert werden, eine wichtige Rolle in Proliferations- und Differenzierungsvorgängen humaner hämatopoetischer Progenitorzellen spielen. Damit stehen diese Signalwege prinzipiell als Grundlage für neue pharmakologische Therapieoptionen zu Verfügung.
HMG-Proteine sind nach den Histonen die zweithäufigste Superfamilie nukleärer Proteine. Sie binden an DNA und Nukleosomen und induzieren strukturelle Veränderungen im Chromatin. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Dynamik des Chromatins und beeinflussen dadurch DNA-abhängige Prozesse, wie Transkription und Replikation. Proteine der HMGA-Familie sind charakterisiert durch konservierte DNA-Bindungsmotive, den AT-Hooks, welche eine Bindung an AT-reiche DNA-Sequenzen vermitteln und durch einen sauren C-Terminus. HMGA-Proteine sind verstärkt im Heterochromatin konzentriert und stehen in Verbindung mit der Expressionsregulation spezifischer Gene aufgrund der Stabilisierung von Nukleoproteinkomplexen, so genannten Enhanceosomen. HMGA-Proteine spielen des Weiteren eine entscheidende Rolle in verschiedenen Entwicklungsprozessen und bei der Tumorprogression . Um den Einfluss von HMGA1 auf die zelluläre Differenzierung und die Chromatinmodulation zu untersuchen, wurden C2C12 Maus-Myoblastenzellen verwendet. Die Induktion der Myogenese in diesen Zellen geht mit der Herunterregulierung von HMGA1 einher. Durch die Etablierung einer C2C12-Zelllinie, welche ein EGFP-markiertes HMGA1a stabil exprimierte, konnte gezeigt werden, dass eine anhaltende HMGA1-Expression spezifisch die Myogeneseprozess inhibierte, während die Osteogenese davon unbeeinflusst zu bleiben schien. Dieser hemmende Effekt kann durch die HMGA1-abhängige Fehlexpression verschiedener Gene, welche für eine einwandfreie Muskeldifferenzierung nötig sind und in die Zellzyklusregulation eingreifen, erklärt werden. Unter der Verwendung von RNAi konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulierung von HMGA1-Proteinen für eine korrekte Genexpression und den Muskeldifferenzierungsprozess notwendig ist. Während der terminalen Differenzierung wird die Umorganisation des Chromatins durch die Fusion der Chromozentren offensichtlich. Fotobleichtechniken, wie „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) zeigten, dass HMGA1-Proteine mit dem Methyl-CpG-bindenden Protein 2 (MeCP2), welches eine wichtige Rolle in der Chromozentrenfusion spielt, um DNA-Bindungsstellen konkurriert und dieses vom Chromatin verdrängt. Diese dynamische Konkurrenz zwischen einem anhaltend exprimierten HMGA1 und MeCP2 trägt somit zur Inhibition der differenzierungsabhängigen Modulation des Chromatins während der späten Myogenese bei. Die Untersuchungen in C2A1a-Zellen lieferten weitere Hinweise dafür, dass der wesentlichste Umbau des Chromatins in einem Zeitfenster um den dritten Tag nach Induktion der Myogenese stattfindet, an welchem HMGA1 natürlicherweise nahezu vollständig herunterreguliert sind. In diesem Zeitraum kommt es zur Dissoziation der Chromozentren, zu veränderten Expressionsmustern in bestimmten Genen, zu Modulationen in Histonmodifikationen (H3K4me2, H3K4me3, H3K27me3), zur Replikations-unabhängigen Akkumulation von Histon H3 in den Chromozentren über ungefähr einen Zellzyklus hinweg und zu eine signifikanten Erhöhung der HP1-Dynamik. Durch den Einsatz von Bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung (BiFC), die es erlaubt Protein-Protein-Interaktionen in vivo zu visualisieren, konnte gezeigt werden, dass der saure C-Terminus des HMGA mit der Chromodomäne (CD) des HP1 interagiert. Zusätzlich ist für diese Interaktion die korrekte DNA-Bindung des HMGA nötig. FRAP-Messungen mit HP1-EGFP-Fusionsproteinen in Zellen die wildtypisches oder ein mutiertes HMGA koexprimierten, bestätigten diese Daten und wiesen darauf hin, dass die HP1-Verweildauer im Heterochromatin maßgeblich von der Gegenwart eines funktionellen HMGA1 abhängig ist. Des Weiteren zeigten C2C12-Myoblasten, die HMGA1 natürlicherweise exprimieren, eine hohe HP1-Verweildauer, die nach HMGA1-knock down drastisch verringert ist. Umgekehrt ist die HP1-Verweildauer nach einer Herunterregulierung von HMGA1 an Tag 3 der Myogenese gering und steigt durch die Koexpression von HMGA1 auf das in Myoblasten gemessene Niveau an. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die differenzielle Expression von HMGA1 und ihre Fähigkeit mit HP1 zu interagieren, sowie ihre Konkurrenz mit MeCP2 um DNA-Bindungsstellen einen entscheidende Rolle in der Regulation der Aufrechterhaltung und Plastizität des Heterochromatins während der Differenzierung spielen. Daher ist eine zeitlich festgelegte Herunterregulierung von HMGA1 notwendig, um die Modulation des Chromatins und dadurch den Differenzierungsprozess zu ermöglichen
Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) sind aufgrund ihrer Selbsterneuerung- und ihrer Multiliniendifferenzierungs-Fähigkeiten interessante Zelltypen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die regenerative Medizin. Uniparentale Zygoten mit zwei väterlichen (androgenetisch: AG) oder zwei mütterlichen (gynogenetisch: GG; parthenogenetisch: PG) Genomen sind nicht in der Lage, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln. Sie entwickeln sich jedoch erfolgreich bis zu Blastozysten, aus denen pluripotente ES Zellen abgeleitet werden können. Mit uniparentalen ES Zellen können zum Einen parent-of-origin-spezifische Einflüsse auf die Gewebeentwicklung untersucht und zum Anderen histokompatible und somit therapeutisch relevante Zellpopulationen generiert werden. Obwohl viele Aspekte des in vitro und in vivo Differenzierungspotenzials von PG ES Zellen aus mehreren Spezies in den zurückliegenden Jahren untersucht worden sind, ist das volle Differenzierungspotenzial von AG ES Zellen bisher nicht erschöpfend analysiert worden. Zellen der Inneren Zellmasse (ICM) von PG und AG Embryonen zeigten nach Blastozysteninjektion ortsspezifische Kontribution zur Gehirnentwicklung, wobei PG Zellen bevorzugt im Cortex und im Striatum lokalisierten, während sich AG Zellen verstärkt im Hypothalamus nachzuweisen waren. Aus AG und GG ES Zellen konnten zudem in vitro hämatopoetische Stammzellen differenziert werden, die nach Transplantation im Mausmodell tumorfrei das gesamte hämatopoetische System repopulierten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AG ES Zellen ein mit N ES Zellen vergleichbares in vitro und in vivo Differenzierungspotential in der frühen neuralen Entwicklung besitzen. Das Ziel meiner Arbeit war es zu untersuchen, ob murine AG ES Zellen sich zu verschiedenen neuronalen Subtypen entwickeln können und ob sie tumorfrei neurale Zelltypen nach Transplantation bilden können. In dieser Studie wurden AG ES Zellen im Vergleich zu biparentalen (N) ES Zellen in vitro über Embryoid Bodies (EBs) zunächst zu pan-neuronalen Vorläuferzellen (pNPCs) und weiter zu Neuron- und Glialzell-Marker (ß-III Tubulin (Tuj-1), NeuN, TH und GFAP) positiven Zellen differenziert.. Weiterhin wurde das dopaminerge (DA) Differenzierungspotential von AG ES Zellen näher untersucht, indem sie in einem Ko-Kultursystem mit Stromazellen gerichtet differenziert wurden. Diese DA Neurone wurden durch semiquantitative RT-PCR Analysen und immunhistochemische Färbungen für DA Neuronen-spezifische Marker (TH, PITX3, Nurr1) charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Imprinting-Status von neun ausgesuchten Loci in AG und N ES, pNPC und DA Zellkulturen durch real-time RT-PCR Analysen untersucht. Die hier analysierten Gene, die im Gehirn allelspezifisch exprimiert werden, zeigten in pNPCs eine parent-of-origin-spezifische Genexpression mit Ausnahme von Ube3a. Nach Blastozysteninjektion wurde die Bildung von DA Neuronen in AG und N fötalen chimären Gehirnen untersucht. Hier zeigte sich, dass TH- and PITX3-positive AG DA Neurone abgeleitet aus ES Zellen im Mittelhirn von E12.5 und E16.5 Chimären detektiert werden konnten. Diese fötalen chimären Gehirne zeigten eine verbreitete und gleichmäßige Verteilung der AG Donorzellen in den Arealen Cortex, Striatum und Hypothalamus. Stereotaktische Transplantationen von AG und N pNPCs in ein „Traumatic Brain Injury (TBI) Model“ zeigten zudem, dass frühe Differenzierungsstufen von AG und N pNPC-Kulturen häufig Teratome generierten. Durch die Transplantation von langzeitdifferenzierten AG oder N pNPC-Kulturen konnte jedoch ein tumorfreies Anwachsen neuronaler und glialer Zellen erreicht werden. Die immunhistochemische Auswertung von Transplantaten bezüglich der Donorzellkontribution im Gehirn erfolgten bis zu drei Monaten nach der Injektion. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass AG ES Zellen neurales Differenzierungspotential, speziell zur Bildung von DA Neuronen, besitzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass langzeitdifferenzierte AG und N pNPCs nach Transplantation im traumatisierte Mausgehirnmodell tumorfrei anwachsen und anschließend zu neuralen Zellen differenzieren können. Trotz unbalancierter Genexpression von imprinted Genen lässt sich feststellen, dass AG ES Zellen therapeutisch relevant für zukünftige zelluläre Ersatzstrategien von Nervengewebe sein können.
Zahlreiche Studien schreiben Histondeacetylase-Inhibitoren einen Anti-Tumor-Effekt auf verschiedene hämatologische und solide Tumoren durch Apoptoseinduktion, vermehrte Zelldifferenzierung und verminderte Zellproliferation zu. Als Mechanismus wird eine Einflussnahme auf die Genexpression durch Modulation von Histondeacetylasen und deren Auswirkung auf den Acetylierungsstatus von Histonen und Nicht-Histon-Proteinen angenommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des Histondeacetylase-Inhibitors LBH589 auf Proliferation und Differenzierung von Kolonkarzinomzellen und dessen Metastasenzellen in Zellkulturexperimenten zu untersuchen. Die Untersuchungen wurden an Zellen der Zellkulturlinien SW480 (kolorektales Karzinom) und SW620 (Metastase des kolorektalen Karzinoms) durchgeführt. Für die Zellproliferation wurden die Zellen nach entsprechender Vorbehandlung in einer Neubauer-Zellzählkammer ausgezählt. Zur Feststellung des Verlaufs der Zelldifferenzierung diente die Bestimmung der Intestinalen Alkalischen Phosphatase als Marker. Unter LBH589-Inkubation kam es zu einer Hemmung der Zellproliferation sowohl bei SW480-Zellen als auch bei SW620-Zellen. Allerdings ergab sich kein signifikanter Unterschied bei der Auswertung der Kontrolllösungen mit jeweils äquimolaren Mengen DMSO. Daher konnte dem HDAC-Inhibitor LBH589 im Rahmen dieser Arbeit kein sicherer Effekt auf die Inhibition der Zellproliferation zugeschrieben werden. LBH589 hatte keinen nachweisbaren relevanten Einfluss auf die Differenzierung von Zellen der beiden Zelllinien. Allenfalls konnte ein leicht hemmender Einfluss auf die Zelldifferenzierung gezeigt werden, der jedoch nicht signifikant ausfiel. Weitere Untersuchungen sind anzustreben, um den Verlauf der Zellproliferation und weiterer Differenzierungsmarker unter dem Einfluss von LBH589 sowie äquimolaren Mengen DMSO detaillierter zu charakterisieren. Zukünftige Arbeiten zu Histondeacetylase-Inhibitoren und deren Effekt auf Zellen des kolorektalen Karzinoms, sowie Histondeacetylase-Inhibitoren in der Kombinationstherapie von kolorektalen Tumoren sind sicher sinnvoll.
Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen.
Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenwärtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierfür verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard zählt LTE (4G).
Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endgeräte existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelmäßig einer Exposition gegenüber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen Körper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgeführt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu können. Ein vollständiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum schädlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder können empfindlicher auf Umwelteinflüsse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise höher gegenüber EMF exponiert. Dies gilt vor allem für Kopfregionen, in denen sich das aktive, für die Hämatopoese verantwortliche Knochenmark befindet.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane hämatopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils über einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensitäten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. Mögliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und –Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder für die hämatopoetischen Stammzellen, noch für die Zelllinie HL-60. Die einzige Veränderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Schäden beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Schäden verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft.
Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane hämatopoetische Stammzellen für derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als hämatopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem ermöglichen.
Um über die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die hämatopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu können, sowie die Sensitivität von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegenübergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die hämatopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Schäden beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus möglich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu können, müssten noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
Um der ungehinderten Vermehrung maligne entarteter Zellen vorzubeugen, besitzt der Organismus Tumorsuppressorgene. Die Blockade von tumorsuppressiven Signalwegen ist Voraussetzung für die neoplastische Transformation von Zellen. Während die tumorsuppressive Funktion von p53 bestens untersucht ist, war die Bedeutung des p53-Familienmitglieds p73 als Tumorsuppressor umstritten. Komplizierend war hierbei, dass das p73-Gen sowohl ein p53-ähnliches, putativ tumorsuppressives Protein (TAp73) als auch ein funktionell antagonistisches, potentiell onkogenes Protein (ΔNp73) exprimiert. Die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen zeigen, dass TAp73 tatsächlich tumorsuppressiv agiert: zum einen verhindert es zusammen mit p53 und TAp63 durch Induktion von myogener Differenzierung die Entstehung von Rhabdomyosarkomen - zum anderen unterdrückt es substratunabhängiges Wachstum als Charakteristikum von Tumorzellen und bildet so eine Barriere auf dem Weg der malignen Transformation. Eine Inaktivierung der tumorsuppressiven Aktivitäten von TAp73 erfolgt bei Tumorpatienten – anders als bei p53 – entweder durch eine Reduktion der p73-Expression aufgrund von Gendeletion bzw. Promotormethylierung oder durch eine verstärkte Expression von Inhibitoren wie ΔNp73. Eine reduzierte p73-Expression wird z.B. bei einigen hämatologischen Neoplasien beobachet. Entsprechend beobachteten wir in einem Myc-induzierten Lymphommodell der Maus eine geringfügig aber signifikant beschleunigte Lymphomentstehung nach Deletion eines p73-Allels. Eine verstärkte Expression von ΔNp73 ist dagegen die charakteristische Expressionsveränderung von p73 in soliden Tumoren. Entsprechend beobachteten wir in >85% aller Rhabdomyosarkome stark erhöhte ΔNp73-Spiegel, die sich als essentiell für Tumorentstehung und Tumorprogression erwiesen. Diese Ergebnisse in unterschiedlichen in vitro und in vivo Modellen belegen mechanistisch, dass TAp73 als Tumorsuppressor wirkt, dessen Funktion in Tumoren häufig inaktiviert ist. Proof-of-principle Experimente in dieser Arbeit unterstreichen ferner, dass eine Reaktivierung der Tumorsuppressorfunktion von TAp73, z.B. durch Blockade von ΔNp73, eine Möglichkeit darstellt, um Tumore auf molekularer Ebene zu therapieren.
Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen.
Technische Neuerungen und steigende Ansprüche an die Gesundheit stellen die moderne Medizin immer wieder vor neue Herausforderungen und führen zur Entwicklung von neuen Therapiekonzepten wie dem Tissue Engineering. Vielfach kommen dabei adulte pluripotente Stammzellen zum Einsatz. Bei der Regeneration mesenchymalen Gewebes wie Knochen, Knorpel und Muskulatur leisten Mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen entscheidenden Beitrag. Diese lassen sich aus allen mesenchymalen Geweben des Körpers gewinnen und stellen daher zwar keine homogene Zellpopulation dar, doch sie lassen sich aufgrund phänotypischer und molekularbiologischer Gemeinsamkeiten charakterisieren.
In großer Zahl lassen sich MSCs aus dem Knochenmark gewinnen und werden als stromale MSCs bzw. mhMSCs (marrow-derived human MSCs) bezeichnet. Auf der Suche nach homogenen Subpopulationen von MSCs wurde in dieser Arbeit eine Zellpopulation aus Knochentrabekeln gewonnen, sogenannte bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), und anhand ihrer Genexpression mit mhMSCs verglichen. Dafür wurde RNA aus beiden Populationen in einem Microarray mit anschließender SAM (significance analysis of microarrays) analysiert um unterschiedliche Expressionsmuster zwischen mhMSCs und bhMSCs aufzuzeigen. Diese Ergebnisse wurden durch konventionelle Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) bestätigt, wobei das Augenmerk vor allem auf solche Gene gerichtet wurde, die differentiell exprimiert waren und zudem als Markergene ein Differenzierungspotential in bestimmte Gewebe wie Muskel und Knochen vorhersagen. Dabei konnte sowohl eine gute Übereinstimmung zwischen Microarray und RT-PCR demonstriert als auch die Hoffnung auf eine homogene (trabekuläre) MSC-Population mit anderen Differenzierungseigenschaften geweckt werden.
Im Verlauf weitergehender Untersuchungen der SAM fiel eine unerklärlich hohe Expression von Immunglobulinketten in der mhMSC-Kultur (Passage 0) auf, die letztlich auf eine Kontamination der Zellkultur mit Plasmazellen schließen ließ.
Da die Ergebnisse des Microarrays (Passage 0 Kultur) somit zu hinterfragen waren, wurde die Kontamination der Plasmazellen durch Passagieren der mhMSC-Zellkultur (Passage 1) beseitigt und erneut ein Microarray mit SAM durchgeführt. Dabei relativierten sich fast alle Expressionsunterschiede, die somit auf die Kontamination der Plasmazellen zurückgeführt werden mussten.
Einzig drei Gene (CD24, TRIB2, AHNAK) wurden in diesem zweiten Array differentiell exprimiert, was sich bei CD24 und TRIB2 auch durch RT-PCR untermauern ließ.
Es lässt sich also schlussfolgern, dass bhMSCs wahrscheinlich in der Zukunft des Tissue Engineering keinen Stellenwert haben werden, zumal ihre Gewinnung im Vergleich zu mhMSC deutlich aufwendiger ist.
Aus dem Knochenmark isolierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) sind als Vorläuferzellen der Osteoblasten an der Knochenformation sowie an der Knochenremodellierung beteiligt und aufgrund ihrer Multipotenz in der Lage, in mesenchymales Gewebe (Knochen, Knorpel, Fett) zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften gelten sie als Quelle der Regeneration und der Heilung im Hinblick auf zellbasierte Therapien zur Behandlung degenerativer Erkrankungen (Arthrose, Osteoporose) des muskuloskelettalen Systems. Die besondere Situation der Geweberegeneration beim älteren Menschen ist gekennzeichnet durch den Anstieg der Produktion von Hemmstoffen der Geweberegeneration und durch verschiedene häufige Mangelzustände wie z.B. den Vitamin D-Mangel. In der vorliegenden Arbeit wurden Modulatoren (Morphogene) untersucht, die in der Lage sind, die hMSC in vitro in ihrem proliferativen, undifferenzierten Zustand (transient amplifying pool) und am Übergang in die Differenzierung und Reifung zu beeinflussen. Ziel war es, durch die Charakterisierung solcher Modulatoren, Verfahren zu etablieren, die zu einer verbesserten Zellqualität bei regenerativen Therapiestrategien führen, sei es in situ oder beim Tissue Engineering. Der Fokus lag auf der Geweberegeneration beim älteren Menschen. Dafür wurden als Morphogene 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25D3), Aktivin A (AA), Myostatin (MSTN) und Low Oxygen (LO) ausgewählt und hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf Stemness, Differenzierung und Seneszenzentwicklung in der Zellkultur getestet. Alle 4 Kandidaten nehmen im menschlichen Organismus wichtige regulatorische Aufgaben ein. 1,25D3 wirkt nicht nur lokal auf Zellen und Gewebe, sondern mit der Mineralisierung des Knochens und der Regulierung des Kalzium- und Phosphatspiegels im Serum auch systemisch. AA und MSTN werden als Mitglieder der TGFβ-Familie mit dem muskuloskelettalen System in Verbindung gebracht, da eine Inaktivierung von MSTN bei Mensch und Tier zu einem deutlichen Anstieg der Skelettmuskelmasse führt. Gleichzeitig fördert ein Aktivin Antagonist, der neue Wirkstoff Sotatercept (ACE-011), die Knochenbildung im Menschen. Mit der Kultivierung der hMSC unter reduzierter Sauerstoffspannung (2,5 % Sauerstoff, LO) sollten Bedingungen in der Zellkultur geschaffen werden, die - im Vergleich zur traditionellen Kultivierung mit einem atmosphärischen Sauerstoffgehalt von 21 % - näher an den physiologischen Gegebenheiten bei der Geweberegeneration sind. Zu Beginn wurde sichergestellt, dass alle 4 Modulatoren die Expression typischer mesenchymaler Oberflächenmarker nicht beeinflussten und die klonogene Kapazität der stimulierten hMSC erhielten. Im Rahmen weiterer Untersuchungen zeigte sich, dass eine permanente 1,25D3 Supplementierung die chondrogene, adipogene und osteogene Differenzierungskapazität der hMSC erhielt und somit den Stammzellcharakter der hMSC nicht beeinträchtigte. Die verstärkte Expression der Quieszenz-assoziierten Gene in 1,25D3 stimulierten hMSC deutete darauf hin, dass sich die hMSC aufgrund der 1,25D3 Supplementation in Richtung Quieszenz verändern. Die permanente 1,25D3 Supplementation übt somit eine vor Alterungsprozessen schützende Wirkung in der Zellkultur aus, indem die Entwicklung replikativer Seneszenz verzögert wird und das multipotente Potential der hMSC erhalten wird. Im Bezug auf die Differenzierungsfähigkeit der Zellen verhielten sich rh AA und rh MSTN konträr. Während eine rh MSTN Stimulation keine Wirkung auf die adipogene und osteogene Differenzierung hatte, schränkte rh AA das adipogene und osteogene Differenzierungspotential der hMSC nahezu vollständig ein und die Zellen wurden in einem Zustand des Prä-Kommittments festgehalten. Da die LO Expandierung die Stemness erhöhte bzw. die Seneszenz reduzierte und die hMSC in einem proliferativen Zustand bei gleichzeitiger Hemmung der Differenzierung arretierte, scheint diese Art der Kultivierung ein besonderer Schutz für die hMSC zu sein. Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, wirksame Morphogene (1,25D3, rh AA, LO) zu finden, die in der Lage sind, modulatorisch auf die hMSC einzuwirken ohne dabei den Stammzellcharakter zu verändern. Durch ihre Modulation kann nicht nur die Qualität der hMSC verbessert werden, sondern je nach Bedarf können auch die verschiedenen Phasen der Geweberegeneration insbesondere beim Übergang vom „transient amplifying pool“ zur Differenzierung gesteuert werden. Diese Ergebnisse können Konsequenzen für die Anwendung haben, bei der in situ Geweberegeneration ebenso wie für das ex vivo Tissue Engineering.
Osteoporose ist einer der häufigsten Knochenerkrankungen im fortschreitenden Alter und zählt, aufgrund der damit verbundenen hohen direkten und indirekten Behandlungskosten, zu einer der zehn wichtigsten volkswirtschaftlichen Krankheiten. Die Behandlung der Osteoporose ist langjährig und umfasst eine medikamentöse Therapie auf der Basis einer „knochengesunden“ Lebensweise hinsichtlich Ernährung und Bewegung. Im Rahmen von Untersuchungen zur Linderung von postmenopausalen Beschwerden, zeigte ein Extrakt der Pflanze Cimicifuga racemosa Potential zu osteoprotektiver Wirksamkeit und rückte somit in den Fokus für eine mögliche Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Osteoporose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, in enger Zusammenarbeit mit der Bionorica SE, welche für die Aufreinigung und Fraktionierung des Pflanzenextraktes zuständig war, und mit der Arbeitsgruppe um Prof. Wuttke, welche parallele Rattenstudien durchführte, Methoden anzuwenden, mit denen osteoprotektive Wirksamkeiten nachgewiesen und auf einzelne Fraktionen des Extraktes limitiert werden können. ...
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.