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In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen einer 10-wöchigen Therapie mit dem 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-(HMG-CoA)-Reduktase-Inhibitor Rosuvasta-tin auf die endotheliale Funktion, die Stickstoffmonoxid (NO)-Bioverfügbarkeit und die Phosphorylierung des „vasodilator-stimulated phosphoprotein“ (VASP) in Thrombozy-ten im Rattenmodell der chronischen Herzinsuffizienz (CHF) nach Koronarligatur un-tersucht. Die Phenylephrin-induzierte Vasokonstriktion war in Gefäßringen von Versuchstieren mit CHF im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffizienz deutlich verstärkt, was sich auf eine Reduktion der tonischen NO-Freisetzung in Aortenringen von CHF-Ratten zurück-führen ließ. Die Behandlung mit Rosuvastatin erhöhte die NO-Freisetzung und normali-sierte die gesteigerte Kontraktionsantwort bei CHF-Tieren. Die durch Acetylcholin in-duzierte endothelabhängige Vasorelaxation war bei CHF signifikant beeinträchtigt und wurde durch die Behandlung mit Rosuvastatin ebenfalls deutlich verbessert. Da sich keine Unterschiede in der endothelunabhängigen Relaxation nach Gabe eines NO-Donors zwischen den Untersuchungsgruppen zeigten, ist die Reduktion der Acetylcho-lin-Antwort demnach eindeutig endothelial bedingt und lässt sich nicht auf eine vermin-derte NO-Sensitivität der Muskelzellen zurückführen. Diese endotheliale Dysfunktion scheinen Statine zumindest teilweise normalisieren zu können. Die Bildung von Super-oxidanionen in Aorten von CHF-Tieren war im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffi-zienz signifikant gesteigert. Durch chronische Therapie mit Rosuvastatin konnte dies signifikant reduziert werden. Passend hierzu war die intraluminale NO-Bioverfügbarkeit, gemessen als basale VASP-Phosphorylierung an Ser239 in Thrombo-zyten, bei CHF-Tieren erniedrigt und wurde durch die Rosuvastatin-Behandlung nor-malisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es durch chronische Therapie mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin zu einer Steigerung der NO-Bioverfügbarkeit und damit zu einer Verbesserung der Endothelfunktion bei Ratten mit Herzinsuffizienz kommt.
Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden.