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In dieser Arbeit wird die intraoperative Boost-Bestrahlung mit 9 oder 20 Gy bei Mammakarzinompatientinnen evaluiert. Es werden das onkologische Ergebnis, die bestrahlungsassoziierte Toxizität, das kosmetische Therapieergebnis und die Lebensqualität ausgewertet. Die Analyse bezieht sich auf 124 Fälle im frühen Brustkrebsstadium.
Brustkrebs ist die häufigste maligne Erkrankung der Frau. Die Therapie setzt sich in der Regel individuell aus den Bausteinen der chirurgischen Tumorexzision, der Bestrahlung und der systemischen Therapie zusammen. Daneben gewinnt die ketogene Diät als supportiver Therapieansatz immer mehr an Aufmerksamkeit und Forschungsinteresse. Diese Ernährungsform imitiert durch starke Restriktion der Kohlenhydratzufuhr den Fastenstoffwechsel, da Blutzucker- und konsekutiv auch Insulinspitzen im Blut vermieden werden. Eine tragende Rolle kommt dabei der Bildung von Ketonkörpern, allen voran Betahydroxybutyrat, zu, die sowohl in den Tumorstoffwechsel als auch in immunologische Prozesse eingreifen können. In dieser Arbeit wurde ausgewählten Brustkrebszellen 3 mM Betahydroxybutyrat zugesetzt und ihr Wachstumsverhalten, ihre Chemo- und Radiosensitivität im Vergleich zu Kontrollzellen erfasst. Die Kontrollzellen wurden identisch behandelt, jedoch wurde Ihnen kein Betahydroxybutyrat zugefügt. Es zeigte sich dabei kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zellgruppen.
Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen.
Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein.
Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen.
Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen.
Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten.
Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden.
Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern.
Das Mammakarzinom ist die häufigste Neoplasie bei Frauen und jede 11. Frau in Deutschland erkrankt im Lauf ihres Lebens an Brustkrebs. Die Überlebensaussichten haben sich in den letzten Jahrzehnten deutlich verbessert, was auf sensiblere Untersuchungsmethoden und die Therapieoptimierung zurückzuführen ist. Eine große Rolle spielt auch der Einsatz verschiedener Prognosefaktoren. Insbesondere Alter, Lymphknotenstatus, Tumorgröße, Histologie, Hormonrezeptor- und Her2-neu-Status kommen heute routinemäßig zum Einsatz. Trotz allen Fortschritts ist Brustkrebs weiterhin die führende Todesursache unter den Krebserkrankungen bei Frauen. Große Hoffnung wird in neue Therapiemethoden gesetzt, die in den Glukosestoffwechsel eingreifen. In letzter Zeit erlangten Glykolysemarker, die als Indikatoren für den veränderten Kohlenhydratstoffwechsel in Tumorzellen dienen, wachsendes Interesse. Obwohl Brustkrebs eine bereits häufig untersuchte Tumorentität ist, ist der Einfluss des Glukosestoffwechsels auf die Fähigkeit zur Metastasierung und die Überlebenszeit unbekannt. Für diese Studie wurde eine Gruppe von 160 Patientinnen ausgewählt, die vor mehr als 13 Jahren wegen einer Brustkrebsneuerkrankung behandelt wurden. Das bei der Operation entnommene Gewebe des primären Mammakarzinoms wurde immunhistochemisch auf die Expression von Tumor-M2-PK und pAkt, zweier ausgewählter Schlüsselenzyme der Tumorglykolyse, untersucht. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper, die spezifisch an die dimere Isoform der M2-PK und das pAkt binden, wurden von jeder Probe der Expressionsgrad dieser beiden Marker sowie der immunreaktive Score bestimmt. Die Ergebnisse der Färbungen wurden mit klinisch-pathologischen- und Überlebensdaten der Patientinnen abgeglichen, um Informationen über die prognostische Relevanz dieser Marker zu erhalten. Eine Überexpression konnte in 58% der Fälle für M2-PK- und in 70% für pAkt nachgewiesen werden. Die übermäßig starke Expression der dimeren M2-Pyruvatkinase konnte als unabhängiger Prognosefaktor für das Langzeitüberleben beim Mammakarzinom identifiziert werden und die Mortalitätsrate bei Patientinnen mit positivem M2-PK/cut-off war deutlich geringer. Bei Frauen unter 52 Jahren und im Zusammenhang mit negativem Östrogenrezeptorstatus wurde häufiger die konstitutive Akt-Aktivierung beobachtet. Die routinemäßige Bestimmung der M2-PK könnte in Zukunft bei der Entwicklung individueller Behandlungskonzepte zum Einsatz kommen und die pAkt könnte als prädiktiver Faktor für die adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms dienen.
Angiopoetin-like 4 (ANGPTL-4) ist ein Adipokin, das in der extrazellulären Matrix lokalisiert ist und das neben seinen Aufgaben im Fettstoffwechsel auch die Zellmigration, Zellinvasion und die Angioneogenese reguliert. Da es zusätzlich auch den Knochenabbau fördert, wirkt es als Tumorpromotor speziell für Knochentumore. Aufgrund der gesteigerten Expression in Tumorgewebe ist es potenzielles Ziel für molekulare Bildgebung. Mittels Expressionsanalysen auf mRNA- und Proteinebene sollte ein besseres Verständnis der Regulation von ANGPTL-4 erreicht werden. Dexamethason und die 9-cis-Retinsäure beeinflussten die Expression von ANGPTL-4 in MDA Zellen im positiven Sinne, wohingegen der Adenylatcyclase Aktivator Forskolin die Expression supprimierte. In MCF-7 Zellen wurde ANGPTL-4 durch den Phorbolester PMA und durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) induziert. Eine Modulation von ANGPTL-4 könnte von klinischem Nutzen sein, speziell bei der Behandlung von Knochentumoren. Zusätzlich könnte die Trennschärfe von molekularen bildgebenden Verfahren gesteigert werden.
Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde.
Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden.
In der vorliegenden Studie wurde ein Präventionskonzept zur Verhinderung von Osteonekrosen bei Patienten, die zur adjuvanten Therapie Bisphosphonate erhalten, entwickelt. Untersucht wurden 8 Patienten männlichen und weiblichen Geschlechts, die alle an einem Plasmozytom erkrankt waren (100%). Ein Patient (12,5%) von 8 entwickelte im Verlauf der Studie eine BRONJ. Vor Beginn der Bisphosphonattherapie sollten alle 8 Studienteilnehmer eine zahnärztliche Untersuchung erhalten. Anschließend wurde ein halbjährliches Recall durchgeführt, welches im Zeitraum von zwei Jahren insgesamt vier Mal erfolgte. Alle anamnestischen Daten und der Befund wurden dabei kontinuierlich aktualisiert. Im Rahmen der vorliegenden Studie konnte ein Prophylaxeprogramm etabliert werden, das nun in Form einer Bisphosphonatsprechstunde an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie des Universitätsklinikums Würzburg Anwendung findet. Die innerhalb des Prophylaxeprotokolls verwendeten Untersuchungs- und Präventionsmaßnahmen schenken den Risikofaktoren für eine Osteonekrose, insbesondere zahnärztlichen Interventionen wie Extraktionen, besondere Aufmerksamkeit.
LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen
(2016)
Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden.
Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle.
Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert.
Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig.
Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate.
Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen.
Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
Die Voraussetzung für die genomische Integrität einer Zelle ist eine funktionierende DNA-Reparatur. Bei deren Zusammenbruch kommt es zur Tumorgenese. In dieser Arbeit wurde literarisch untersucht, welchen Einfluss DNA-Reparaturgene auf das Risiko für die Entwicklung von familiärem Brustkrebs nehmen. Basis für die Brusttumorgenese ist eine defekte Rekombinations-Reparatur. Zunehmend treten auch andere, teilweise weniger erforschte, Reparaturwege in den Vordergrund. Diese könnten miteinander sogar ein komplexes DNA-Reparatur-Netzwerk bilden. Sind deren Komponenten defekt, kommt es zur Brusttumorgenese. Heterozygote Träger einer Mutation in den zentralen Genen haben dabei ein erhöhtes Risiko für familiäre Mammakarzinome. Biallele Träger entwickeln teilweise sehr spezifische hereditäre Brustkrebssyndrome oder Brustkrebs-assoziierte hereditäre Krebssyndrome. Trägerinnen von Mutationen in den DNA-Reparaturgenen mit hoher Penetranz, BRCA1, BRCA2 und TP53, haben ein zwischen 3- und 22-fach erhöhtes Brustkrebsrisiko. Mutationsträgerinnen von Genen mit niedriger Penetranz wie CHEK2, ATM, NBS1 und die FA-Gene BRIP1 und PALB2 haben ein etwa 2- bis 5-faches Risiko. Normvarianten der DNA-Reparaturgene können sogar für ein noch höheres Risiko prädisponieren. Die Polymorphismen üben einen additiven oder dominant negativen Effekt aus und modifizieren so das familiäre Brustkrebsrisiko kumulativ. Weiterhin wird dieses polygene Modell durch Umweltfaktoren moduliert, die das Risiko zusätzlich erhöhen können. Die modulierenden Einflüsse aller bislang detektierten Risikofaktoren müssen jedoch immer wieder durch neue genetische Modelle evaluiert werden. Die DNA-Reparaturgene sind für etwa 30% aller familiären Brustkrebsfälle verantwortlich, der große Rest ist weiterhin unerforscht. Viele, bislang noch wenig beachtete oder unbekannte DNA-Reparaturgene und Gene, die nicht als solche klassifiziert sind, haben das Potential zum Risikogen für Brustkrebs. Nach heutigem Kenntnisstand handelt es sich bei der Entstehung von familiärem Brustkrebs um ein multifaktorielles Geschehen auf der Basis polygenetischer Veränderungen in den DNA-Reparaturgenen.
Ziel: Auswirkungen der strahlentherapeutischen Vorgehensweise, insbesondere der lokalen Dosisaufsättigung auf das kosmetische Langzeitergebnis und die Rezidivrate nach Brusterhaltender Therapie. Material und Methoden: In die Studie aufgenommen wurden 451 Patientinnen mit Mammakarzinom, die zwischen 1984-1994 in der Universitätsfrauenklinik und der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie der Universität Würzburg brusterhaltend therapiert wurden und bei denen Informationen zum kosmetischen Langzeitergebnis vorlagen. Behandlung: Alle Patientinnen unterzogen sich einer operativen Tumorentfernung und Axilladissektion, sowie einer Strahlenbehandlung. Die Strahlentherapie bestand aus einer homogenen Bestrahlug der betroffenen Brust (50Gy) und einer Tuorbettaufsättigung (20Gy), entweder als interstitieller Boost mit Ir-192 (77 Prozent) oder als Elektronenboost (16 Prozent). Ergebnisse: Die Überlebensrate betrug nach 5 und 10 Jahren 88 bzw. 73 Prozent. Die lokoregionäre Kontrollrate betrug nach 5 und 10 Jahren 90 und 75 Prozent. Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der Art der angewandten Tumorbettaufsättigung festgestellt werden. Ein gutes bis exzellentes kosmetisches Ergebnis konnte bei 61 Prozent der Patientinnen erreicht werden. Auch hier besteht kein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der gewählten Boostart.
Brustkrebs ist, verbunden mit einem Lebenszeitrisiko von 12.5 % daran zu erkranken, die häufigste maligne Erkrankung der Frau in der westlichen Welt. Das LIM- und SH3-Domänen Protein LASP-1 wurde erstmalig 1995 als spezifisch in fokalen Kontakten akkumulierendes Protein in humanen Brustkrebszellen beschrieben. Eine eigene Patientenstudie (n = 83) ergab, dass LASP-1 in 55.4 % der untersuchten invasiven Mammakarzinome eindeutig überexprimiert wird und die LASP-1-Expressionshöhe signifikant positiv mit der Tumorgröße (p < 0.05) und der Wahrscheinlichkeit für Nodalpositivität (p < 0.01) korreliert. Als Actin-bindendes Protein mit ubiquitärer Expression interagiert LASP-1 mittels seiner SH3-Domäne auch mit Zyxin. Zyxin ist ein Signalprotein, das zwischen fokalen Kontakten und dem Zellkern pendelt und an der Regulation von Transcription, Zellzyklus und Zellbewegung beteiligt ist. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich die Funktion von LASP-1 in verschiedenen humanen Brustkrebszelllinien und einer humanen Ovarkarzinomzelllinie unter Verwendung der RNA-Interferenz zum sequenzspezifischen knock-down von LASP-1. Die Transfektion der Zellen mit LASP-1-spezifischer small-interfering-RNA (siRNA) senkte die Proteinexpression um ca. 50 - 58 %, was zu einer Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase führte und die Proliferation der Brust- und Eierstockkrebszellen um 30 - 50 % reduzierte. Apoptotische und nekrotische Prozesse wurden dabei durch Caspase-3 Western-blots und Trypan-Blau-Färbungen ausgeschlossen. Außerdem verringerte der knock-down von LASP-1 die Migration der Krebszellen, wohingegen die Überexpression von LASP-1 in PTK2- (Potorous tridactylis kidney) Zellen, welche kein endogenes LASP-1 exprimieren, in einer signifikanten Steigerung der Migration resultierte. Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass der knock-down von LASP-1 von einer verringerten Konzentration seines Interaktionspartners Zyxin an fokalen Kontakten begleitet wird, ohne dabei das Actin-Zytoskelett oder die Morphologie der fokalen Kontakte zu verändern. Die Transfektion der Brust- und Eierstockkrebszellen mit einer Kontroll-siRNA (scrambled Neuropilin1) beeinflusste hingegen keinen der genannten Parameter. Diese Daten unterstreichen die wichtige Rolle von LASP-1 für die Tumorzellproliferation und -migration. LASP-1 könnte daher in Interaktion mit Zyxin an der molekularen Karzinogenese von Brust- und Eierstockkrebs beteiligt sein und in der Zukunft als viel versprechender Prognosemarker dienen.
Die DNA-Durchflusszytometrie ist eine anerkannte Methode zur Erfassung genetischer Abweichungen und Änderungen der Proliferationsfraktion von Tumorzellen. Die Aufarbeitung von Tumorzellen mit vorhandenen Begleitpopulationen bewirkt allerdings bei der Einfachfärbung der DNA eine Ungenauigkeit der Zellzyklusanalyse. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Begleitpopulationen auf die Analyse von Ploidie und Zellzyklus mit Hilfe der DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung am Mammakarzinom untersucht. Zum anderen wird auf Zusammenhänge zwischen p53, Proliferation und Ploidie von Mammakarzinomen eingegangen. Von 28 untersuchten Fällen waren 26 für die DNA-Zytokeratin-Doppelfärbung komplett auswertbar. Bei 9 dieser 26 ausgewerteten Fälle konnte immunhistochemisch p53 nachgewiesen werden. Die Zellen wurden aus Gefriermaterial mechanisch vereinzelt und mit Propidium Jodid und FITC-konjugiertem anti-Zytokeratin-Antikörper bzw. anti-p53-Antikörper gefärbt. Die Messungen wurden mit einem FACScan durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Multicycle Software AV. Die Auswertung der Zytokeratin-Doppelfärbung ergab im Vergleich zur Einfachfärbung einen Anstieg sowohl des Anteiles aneuploider Tumoren als auch des mittleren DNA-Index. Die Proliferationsrate, insbesondere die S-Phasen-Fraktion erhöhte sich ebenfalls signifikant. Die vergleichenden Zellzyklusanalysen der Zytokeratin-positiven und der p53-positiven Tumorzellen zeigte eine geringere Proliferationsfraktion der p53-positiven Zellen, verglichen mit den p53-negativen Tumorzellen. Der überwiegende Anteil der p53-positiven Zellen zeigte eine Aneuploidie. Weiterhin ergaben sich in dieser Untersuchung Hinweise auf eine Zellzyklusabhängige Expression des p53-Proteins. Durch die Nutzung der Doppelfärbung für DNA und Zytokeratin in der Durchflusszytometrie gelingt die exaktere Wiedergabe der Biologie von Tumoren. Es ist zu erwarten, dass dies die prognostische Aussagekraft der DNA-flowzytometrischen Parameter Ploidie und Proliferationsfraktion erhöht.
Tumorzellen, Stromazellen, Extrazellulärmatrix (EZM) und lösliche Faktoren in der Tumormikroumgebung beeinflussen und verstärken sich gegenseitig in der Ausbildung eines malignen Phänotyps. Sowohl die fibrotische EZM als auch eine kleine Subpopulation von pluripotenten Tumorstammzellen sind bekanntermaßen für die Steigerung der Tumoraggressivität verantwortlich. Inwiefern diese beiden unabhängigen Faktoren im Kontext von Brustkrebs miteinander in Beziehung stehen, ist jedoch bis heute unklar.
Um untersuchen zu können, welchen Beitrag Tumorzellen, Stromazellen, EZM und lösliche Faktoren einzeln und im Zusammenspiel zur Malignität eines Tumors leisten, ist die Entwicklung geeigneter in-vitro-Modelle unabdingbar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, ein 3D-Mikrotumormodell zu generieren, in dem eine Analyse dieser genannten Faktoren stattfinden könnte. An diesem Modell wurden darüber hinaus erste Untersuchungen von im Tumorkontext bekannten EZM-Proteinen durchgeführt. Um die dreidimensionale Anordnung von Tumorzellen und ihrer Gewebeumgebung adäquat wiedergeben zu können, beinhalteten die 3D-Tumorsphäroide sowohl Brustkrebszellen (MDA-MB-231) als auch Stromazellen (hASCs).
Die EZM als wichtiger Bestandteil der (Tumor-) Mikroumgebung sollte übersichtshalber durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung und detaillierter durch immunhistochemische Analyse nach zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten charakterisiert werden, um EZM-Veränderungen im zeitlichen Verlauf darzustellen. Im Fokus der Analyse standen die beiden wichtigsten profibrotischen EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I, die maßgeblich an der Pathogenese von Brustkrebs beteiligt sind. Zudem wurde das Vorkommen des Myofibroblastenmarkers α-SMA untersucht.
An den Sphäroiden einer Kontrollgruppe, die lediglich hASCs beinhaltete, sollte vergleichend eine Analyse der genannten EZM-Proteine sowie α-SMA durchgeführt werden. Um schließlich den Einfluss der von Tumorzellen sezernierten löslichen Faktoren in der Tumormikroumgebung herauszustellen, wurden Sphäroide aus hASCs in tumorkonditioniertem Medium gezüchtet und darin ebenfalls Matrixproteine und α-SMA untersucht.
Abschließend erfolgte eine Korrelation der EZM-Analyse mit dem Vorhandensein von Tumorstammzellen in den 3D-Tumorsphäroiden. Dafür wurden die Tumorstammzellen mithilfe eines GFP-basierten Reporters für den Stammzellmarker NANOG (NANOG-GFP-Reporterzelllinie) in mikroskopischen Aufnahmen der 3D-Tumorsphäroide nachgewiesen und im Kontext mit der EZM lokalisiert.
Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
iROLL - 3D-bildnavigierte, radioaktivitätsgestützte Resektion des nicht-palpablen Mammakarzinoms
(2019)
In dieser prospektiven Studie wurde die Durchführbarkeit der 3D-bildnavigierten, radioaktivitätsgestützten Resektion des nicht-palpablen Mammakarzinoms (iROLL) unter Verwendung der freehand SPECT (fhSPECT)-Technologie untersucht. Das Verfahren wurde mit der als Goldstandard etablierten, drahtgestützten Lokalisation (WGL) verglichen. Sekundäre Endpunkte der Studie waren die erfolgreiche Sentinellymphknotenbiopsie (SLNB) mittels fhSPECT, der Patientenkomfort beider Verfahren, die mögliche Vorhersage tumorpositiver Resektatränder mittels fhSPECT, inklusive notwendiger Nachresektionen und der Einfluss von iROLL auf die OP-Dauer.
Die fhSPECT-gestützte iROLL ist ein schmerzarmes, patientenfreundliches, zeiteffizientes und v.a. gut durchführbares brusterhaltendes Therapieverfahren (BET) ist. Gegenüber der WGL wird eine einzeitige Markierung zur Primarius- und SLN-Markierung möglich, ohne dabei auf eine visuell fassbare, intraoperative Navigationshilfe verzichten zu müssen.
Das duktale Carcinoma in situ (DCIS) der Mamma stellt eine Neoplasie mit sowohl heterogener Morphologie als auch variierendem biologischen Verhaltens dar. Dies führte in der Vergangenheit zur Etablierung zahlreicher pathohistologischer Klassifikationssysteme mit dem Ziel, das Risiko einer malignen Transformation in ein invasives Carcinom und die Wahrscheinlichkeit eines Lokalrezidivs nach Tumorektomie anhand histologischer Kriterien abzuschätzen. Zur Untersuchung solcher Klassifikationsparameter auf ihre Wichtigkeit sollte der genetische Hintergrund am Beispiel der chromosomalen Trisomie untersucht werden und mit diesen korreliert werden. Die Ergebnisse einer DNA-in situ-Hybridisierung an Paraffin-Material mit spezifischen Proben für die Chromosomen 1, 7, 8 und 18 zeigen, daß Trisomien in dieser Neoplasie ein häufiges Ereignis darstellen (56 Prozent aller Fälle) und daß diese mit den histologischen Parametern der Nekrose und einem hohen Kernatypiegrad korrelieren. Dieser Befund wird durch die Tatsache untermauert, daß solche Beziehungen sogar im gleichen Tumor gefunden werden, wenn dieser eine heterogene Morphologie aufwies. So läßt sich die große Bedeutung der Klassifikationsparameter Nekrose und Kern-Atypie auch durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstreichen. Eine Trisomie des Chromosoms 18 konnte nur in Fällen von einer Koinzidenz mit mikroinvasiven Herden detektiert werden. Dies deckt sich mit sämtlichen Angaben der Literatur, bei denen eine Trisomie 18 nie bei streng intraduktalem DCIS, sondern nur bei mikroinvasiven oder invasiven Mamma-Karzinomen gefunden wurde. Folglich wäre es wichtig, mit weiteren Untersuchungen die Bedeutung dieser Aberration im Invasionsgeschehen und in der Diagnosestellung einer Mikroinvasion des DCIS zu analysieren.
Die Ziele dieser Arbeit waren, das aktuelle Informationsbedürfnis von metastasierten Brustkrebspatientinnen und -patienten, deren Einschätzung der Arzt-Patient-Kommunikation sowie erwiesene Prädiktoren der QoL zu erheben und auf einen Zusammenhang mit der aktuellen patientenseitigen QoL zu untersuchen. Zu dieser oder ähnlichen Fragestellungen existieren lediglich Publikationen mit Brustkrebspatientinnen ohne Metastasierung. Studien mit ausschließlich metastasierten Brustkrebs-patientinnen sind generell sehr selten.
Die Daten von 30 Patientinnen und einem Patienten mit metastasiertem Brustkrebs, rekrutiert in vier Kliniken in Bayern und Baden-Württemberg im Rahmen der Pilotphase des BRE-4-MED-Projektes, konnten ausgewertet werden. Die Studienteilnehmer waren zum Zeitpunkt der Rekrutierung zwischen 30 und 85 Jahre alt, das Durchschnittsalter betrug 57 Jahre (SD = 13,4).
Für die Datenerhebung wurden nebst einzelner ordinalskalierter Fragen standardisierte, teils modifizierte Fragebögen wie die CARE-Skala, PROMIS PF4a, PHQ-4 oder ein Item des EORTC QLQ-C30 verwendet. In der QoL-Messung durch ein Item des EORTC QLQ-C30 Fragebogens erzielten die Probandinnen und Probanden geringfügig schlechtere Werte als eine gesunde deutsche Vergleichspopulation.
Angesichts bisheriger Forschungsergebnisse wurde mit unbefriedigten Informations- und Kommunikationsbedürfnissen gerechnet. Außerdem wurden Zusammenhänge zwischen der QoL und unbefriedigten Informationsbedürfnissen, einer schlechten Arzt-Patient-Kommunikation sowie Prädiktoren der QoL erwartet. Diese Hypothesen wurden durch die vorliegende Arbeit zum Teil bestätigt, nämlich das Vorliegen von unerfüllten Informationsbedürfnissen sowie einer Korrelation der QoL mit Depression, körperlicher Funktionalität und mit Schmerz. Ein Zusammenhang mit dem Alter der Befragten bestand, jedoch genau entgegengesetzt der Erwartung.
Letzteres Ergebnis sowie die nicht signifikanten Ergebnisse der Studie sind am ehesten durch eine zu geringe Probandenzahl bedingt. In puncto Informationsbedürfnisse der Patienten sowie Prädiktoren der QoL konnte die vorliegende Arbeit die bisherige Forschung größtenteils bestätigen, woraus die ärztlichen Handlungsempfehlungen abgeleitet werden können, auf diese Themen im Umgang mit metastasierten Mammakarzinompatienten besonders einzugehen. Die Aussagekraft der vorliegenden Ergebnisse ist allerdings angesichts der bisherigen Stichprobengröße als gering einzustufen, die Wiederholung der durchgeführten Analysen in der Hauptphase des BRE-4-MED-Projektes wären wünschenswert. Das BRE-4-MED-Register ist zusammenfassend als vielversprechendes Projekt zur Ergänzung der Versorgungsforschung und langfristig zur Verbesserung der Versorgung metastasierter Brustkrebspatienten einzustufen.
GDF-15 wird seit wenigen Jahren als prognostischer und prädiktiver Marker in der Tumortherapie diskutiert. Diese Pilotstudie sollte erstmals GDF-15 bei Patienten mit HER2/neu positivem Mammakarzinom im frühen Stadium im klinischen Verlauf untersuchen. Dazu wurden 22 Patienten rekrutiert und die GDF-15-Spiegel mittels ELISA vor und während einer Antikörpertherapie bestimmt. Um GDF-15 als prädiktiven Marker zu testen, wurde nach neoadjuvanter Therapie und anschließender Operation der Regressionsgrad nach Sinn bewertet. In der untersuchten Kohorte wurde ein medianer GDF 15-Spiegel von 0,33 ng/ml ermittelt. Im Therapieverlauf kam es zu keiner signifikanten Veränderung des Spiegels. Höhere GDF-15-Spiegel konnten allerdings bei größeren Tumoren und bei einem höheren BMI analysiert werden. Ebenfalls konnten wir zeigen, dass der GDF-15-Spiegel signifikant mit dem Alter steigt. Nicht signifikant, aber von Bedeutung ist der Zusammenhang zwischen GDF-15 und dem Regressionsgrad nach Sinn. Die untersuchten Patienten wiesen tendenziell höhere GDF-15-Werte bei niedrigem Regressionsgrad auf. Ein schlechteres Ansprechen auf eine Antikörpertherapie bei höheren GDF 15-Spiegeln ist somit anzunehmen.
In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv Daten von 321 Fällen eines fortgeschrit-
tenen Mammakarzinoms ausgewertet. Beobachtungsdaten lagen bis einschließlich Juli
1998 vor. Ein Fokus dieser Arbeit lag auf der Trichotomie der HER2-Ausprägung und
deren prognostischen Wert im Verlauf einer metastasierten Brustkrebserkrankung. In
einer neueren Entwicklung wurde HER2-low als Nomenklatur einer Subgruppe etabliert
für jene Mammakarzinome, die als IHC 1+ oder IHC 2+ gelten und ein negatives ISH-
Ergebnis aufweisen. Neue Studien-Ergebnisse zeigten einen signifikanten klinischen
Vorteil der Therapie mit HER2-basierten Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten für HER2-low
Patientinnen (91).
Der Anteil der HER2-low Mammakarzinome nahm im Laufe einer fortgeschrittenen
Brustkrebserkrankung kontinuierlich zu und lag bei 39,3 % im Primärtumor, bei 47,7 %
im ersten Rezidiv und bei 47,8 % in einer zweiten Fernmetastase. Parallel vergrößerte
sich die HER2-positive Subgruppe, wobei sich die HER2-negative Kohorte folglich ver-
kleinerte. Es konnte entsprechend der aktuellen Literatur (117,156) eine Assoziation (p
< 0.001) des HER2-low Subtypen und HR-positiven Mammakarzinomen gezeigt werden.
HER2-low nahm in HR-positiven/Her2-negativen Mammakarzinomen im Laufe der Me-
tastasierung zu (56,7 % - 64,1 % - 75,6 %). Der Anteil der HER2-low-Expression im
Triple-negativen Subtypen initial bei 14,6 % und vergrößerte sich konstant (48,2 % - 50
%). Ein Verlust der HER2-Ausprägung im Krankheitsverlauf korrelierte statistisch signi-
fikant mit einem besseren OS (Hazards Ratio 0,533, 95%-KI[0,316, 0,898], p = .018).
Die Gruppe mit einer HER2-Konversion zu einer schwächeren Ausprägung wies im di-
rekten Vergleich zur Gruppe mit einer Her2-Konversion zu einer stärkeren Ausprägung
ein 21,0 Monate längeres Überleben auf (p = 0.177). Die Entwicklung eines HER2-posi-
tiven Primärtumor zu einer HER2-low Metastase (Hazards Ratio 0,385, 95%-KI[0,17,
0.874], p = .023), eine Veränderung von einem HER2-0 Primärtumor zu einer HER2-low
Metastase (Hazards Ratio 0,124, 95%-KI[0,023, 0,655], p = .014) sowie die ausblei-
bende Veränderung eines HER2-low Primärtumor zu einer Fernmetastase (Hazards Ra-
tio 0,169, 95%-KI[0,035, 0,813], p = .027) wurden in dieser Analyse als weitere protektive
Faktoren nachgewiesen. Kein klinisch-pathologischer oder therapeutischer Faktor
konnte als signifikanter Einflussfaktor auf eine Konversion im HER2-Rezeptor identifi-
ziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen keine klare Aussage darüber treffen,
ob die Anpassung der tumorspezifischen Therapie nach einer Rezeptorkonversion das
OS verbessert.