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Die verfügbaren in vitro Genotoxizitätstests weisen hinsichtlich ihrer Spezifität und ihres Informationsgehalts zum vorliegenden Wirkmechanismus (Mode of Action, MoA) Einschränkungen auf. Um diese Mängel zu überwinden, wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt, die zu der Entwicklung und Etablierung neuer in vitro Methoden zur Prüfung auf Genotoxizität in der Arzneimittelentwicklung beitragen.
1. Etablierung und Bewertung einer neuen in vitro Genotoxizitätsmethode (MultiFlow Methode)
Die MultiFlow Methode basiert auf DNA-schadensassoziierten Proteinantworten von γH2AX (DNA-Doppelstrangbrüche), phosphorylierten H3 (S10) (mitotische Zellen), nukleären Protein p53 (Genotoxizität) und cleaved PARP1 (Apoptose) in TK6-Zellen. Insgesamt wurden 31 Modellsubstanzen mit dem MultiFlow Assay und ergänzend mit dem etablierten Mikrokerntest (MicroFlow MNT), auf ihre Fähigkeit verschiedene MoA-Gruppen (Aneugene/Klastogene/Nicht-Genotoxine) zu differenzieren, untersucht. Die Performance der „neuen“ gegenüber der „alten“ Methode führte zu einer verbesserten Sensitivität von 95% gegenüber 90%, Spezifität von 90% gegenüber 72% und einer MoA-Klassifizierungsrate von 85% gegenüber 45% (Aneugen vs. Klastogen).
2. Identifizierung mechanistischer Biomarker zur Klassifizierung genotoxischer Substanzen
Die Analyse 67 ausgewählter DNA-schadensassoziierter Gene in der QuantiGene Plex Methode zeigte, dass mehrere Gene gleichzeitig zur MoA-Klassifizierung beitragen können. Die Kombination der höchstrangierten Marker BIK, KIF20A, TP53I3, DDB2 und OGG1 ermöglichte die beste Identifizierungsrate der Modellsubstanzen. Das synergetische Modell kategorisierte 16 von 16 Substanzen korrekt in Aneugene, Klastogene und Nicht-Genotoxine. Unter Verwendung der Leave-One-Out-Kreuzvalidierung wurde das Modell evaluiert und erreichte eine Sensitivität, Spezifität und Prädiktivität von 86%, 83% und 85%. Ergebnisse der traditionellen qPCR Methode zeigten, dass Genotoxizität mit TP53I3, Klastogenität mit ATR und RAD17 und oxidativer Stress mit NFE2L2 detektiert werden kann.
Durch die Untersuchungen von posttranslationalen Modifikationen unter Verwendung der High-Content-Imaging-Technologie wurden mechanistische Assoziationen für BubR1 (S670) und pH3 (S28) mit Aneugenität, 53BP1 (S1778) und FANCD2 (S1404) mit Klastogenität, p53 (K373) mit Genotoxizität und Nrf2 (S40) mit oxidativem Stress identifiziert.
Diese Arbeit zeigt, dass (Geno)toxine unterschiedliche Gen- und Proteinveränderungen in TK6-Zellen induzieren, die zur Erfassung mechanistischer Aktivitäten und Einteilung (geno)toxischer MoA-Gruppen (Aneugen/Klastogen/ Reaktive Sauerstoffspezies) eingesetzt werden können und daher eine bessere Risikobewertung von Wirkstoffkandidaten ermöglichen.
Durch Messung der Progranulinspiegel im Blutplasma mittels ELISA konnte in vorliegender Arbeit ein signifikanter Unterschied zwischen bipolaren Patienten und
Kontrollen nachgewiesen werden. Dabei wies das Patientenkollektiv durchschnittlich niedrigere Konzentrationen auf. Befunde vorausgegangener Studien deuten darauf hin, dass ein peripherer Progranulinmangel auch mit zentralnervösen Veränderungen einhergehen kann und somit einen Anteil an der Pathophysiologie der bipolaren Störung haben könnte. Insbesondere eine immunologisch-entzündliche Dysregulation sowie
fehlende neurotrophe Impulse könnten dabei eine wesentliche Rolle spielen.
Überdies fiel bei der Auswertung der Daten eine hochsignifikante Korrelation zwischen Progranulinspiegel und Lebensalter der Probanden auf. Dabei nahm mit steigendem Alter auch die periphere Progranulinkonzentration zu, was im Zuge des physiologischen Alterungsprozesses oder aber auch als Folge von neurodegenerativen bzw. -
inflammatorischen Vorgängen auftreten könnte.
Bei der molekulargenetischen Untersuchung der Polymorphismen rs2879096, rs4792938 und rs5848 konnten keine signifikanten Unterschiede in der Genotypen- und
Haplotypenverteilung zwischen Patienten und Kontrollen gefunden werden, was sich möglicherweise auf die relativ kleine Stichprobe von 181 Probanden zurückführen lässt.
Zumindest existieren Hinweise auf eine Rolle der jeweiligen Polymorphismen bei verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen, möglicherweise auch bei der bipolaren Störung.
Außerdem fand sich bei den im Progranulingen liegenden SNPs rs2879096 und rs4792938 keine Assoziation einer Risikogenvariante zu veränderten Progranulinspiegeln, das heißt keiner der beiden Polymorphismen scheint funktionelle Bedeutung zu haben. Somit ließe sich kein Effekt des Genotyps auf die periphere Progranulinkonzentration nachweisen, wobei wiederum die verhältnismäßig niedrigen Fallzahlen beachtet werden müssen.
Der in der 3’UTR liegende SNP rs5848 scheint hingegen im Patientenkollektiv zu deutlich erniedrigten Proteinspiegeln zu führen. Dieser Befund steht auch im Einklang 47 mit einer Vielzahl von Studien, die rs5848 eine Bedeutung bei verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen beimessen und unterstreicht die Rolle niedriger Progranulinkonzentrationen in der bipolaren Störung.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei bipolaren Patienten signifikant niedrigere Progranulinkonzentrationen als in der Kontrollgruppe gemessen wurden.
Weitere Studien, welche die zu Grunde liegenden biochemischen Vorgänge und Pathomechanismen erforschen, wären nun von Interesse, um ein besseres Verständnis
der Erkrankung zu erlangen. Langfristig wäre die Nutzung des Progranulinspiegels als diagnostisches Werkzeug erstrebenswert, wobei sich dies auf Grund des großen
Overlaps zwischen Patienten- und Kontrollgruppe wohl eher schwierig gestalten wird.
Die relativ unkomplizierte Progranulinbestimmung im Blutplasma könnte möglicherweise im Rahmen einer Messung vieler verschiedener Parameter als Baustein eines diagnostischen Apparates zur Erkennung der bipolaren affektiven Störung dienen. Somit wären weiterführende Untersuchungen anhand größerer Fallzahlen und
funktionelle Studien der pathomechanistischen Zusammenhänge des Progranulins ein interessantes Feld, um einige der zahlreichen ungeklärten Fragen rund um die bipolare Störung weiter aufzuklären.
Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen.
Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation.
Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden.
Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden.
Bei Tumoren von Kopf und Hals kann primär oder adjuvant durch Bestrahlung therapiert werden. Die Folgen dieser Behandlung können Xerostomie, Karies, Infektionen, Dysphagie oder Mundgeruch sein. Diese Nebenwirkungen vermindern die Lebensqualität des Patienten. Unterschiedliche Behandlungsansätze haben aufgrund von therapiebedingten Einschränkungen nicht den Weg in den klinischen Alltag gefunden. Eine Alternative zu den vorhandenen Behandlungsansätzen kann das Tissue Engineering sein. Das Ziel einer Normalisierung der Speichelproduktion nach Behandlung soll durch eine implantierbare, künstliche Speicheldrüse erreicht werden. Kann humanes natives Speicheldrüsengewebe der Parotis auf gradientenfreiem dreidimensional aufgebauten Polyurethan wachsen und seine Funktionalität beibehalten?
Humane Parotiszellen wurden von 20 Patienten im Alter von 42 - 90 Jahren durch Operation entnommenen und in Polystyrol-Zellkulturflaschen mit dem Nährmedium BEGM herangezüchtet. Es erfolgte eine 2D-Zellverteilung der reinen Parotiskultur. Zur Kontrolle der Vitalität zwischen den Passagen wurde eine Trypan-Blau Färbung verwendet. Als Trägermaterial der Zellen wurde eine biokompatible, abbaubare Matrix aus ε-Polycaprolacton verarbeitet. Die Übertragung der humanen Parotiszellen wurde mit einer Kleberproteinlösung, bestehend aus den Hauptbestandteilen Aprotinin, Fibrinogen und der Thrombinlösung durchgeführt. 7,14 und 21 Tage nach Aufbringung wurde der Überstand der zeitgleich entnommenen Konstrukte zur Überprüfung des α-Amylase konserviert. Zusätzlich wurden an den 3 Untersuchungstagen Konstrukte für die Anfertigung von histologischen Schnitten, quantitativer PCR, indirekter Immunfluoreszenz und zur Elektronenmikroskopie entnommen. Zur Überprüfung der Funktionalität der angezüchteten Speicheldrüsenzellen wurde das Enzym α-Amylase und das Wasserkanalprotein Aquaporin 5 herangezogen.
Bei der Kultivierung der humanen Speicheldrüsenzellen konnte durch den Vitalitätstest Trypan-Blau Färbung in Kombination mit einer Neubauerzählkammer eine konstant hohe Anzahl an vitalen Zellen bis zur 4. Passage nachgewiesen werden. Durch die Lebend/Tot Färbung auf FDA/EB Basis der Konstrukte über die Untersuchungszeit von 14 Tagen konnte keine Vermehrung von avitalen Zellen mikroskopisch festgestellt werden. Die statistische Auswertung mittels Boxplots des ELISA berechnete für den ersten Untersuchungstag einen Median auf niedrigem Niveau von 4,4 U/l und sank im weiteren Zeitverlauf am Untersuchungstag 21 auf die niedrigsten Median von 2,2 U/l ab. α-Amylase konnte an allen 3 Tagen mittels quantitativer PCR und indirekter Immunfluoreszenz belegt werden. Aquaporin 5 als Funktionsnachweis war in der vorliegenden Studie nicht signifikant durch quantitative PCR beweisbar. Die Rasterelektronenmikroskopie bildete adhärente Zellen in kugeliger Form aus den besiedelten Matrices nach 7 Tagen Kultivierung ab. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie konnten Zellen, die Zellfortsätze ausgebildet hatten nach 14 Tagen beobachtet werden. Der Versuch, histologische Schnitte auf Grundlage der Paraffineinbettung oder Kryo-Konservierung zu erzeugen, musste frustran abgeschlossen werden.
Eine Kultivierung von Speicheldrüsenzellen auf einer Matrix aus ε-Polycaprolacton ohne Gradienten ist eingeschränkt umsetzbar. Die Studie konnte zeigen, dass das Wachstum der Zellen auf konstant niedrigem Niveau über den Untersuchungszeitraum von 21 Tagen lag. Der Funktionsnachweis von α-Amylase auf absinkendem niedrigem Niveau sowie fehlender Bestätigung von Aquaporin 5 kann als stationäre Phase des Wachstums interpretiert werden. Zur Verbesserung der Zellentwicklung sollte die besiedelte Matrix zu einem 3D-Zellwachstum anregen. Bei sequenziell entstehender Polarität der Zellen käme es zu einer Verbesserung der Vitalität sowie der vermehrten Ausbildung von α-Amylase und Aquaporin 5. Dies könnte in einer Kombination der Zellkultur aus Parotiszellen mit Kokulturen aus humanen Myoepithelzellen und Parenchymzellen erreicht werden. Sehr gute Ergebnisse des Zellwachstums und der Zellfunktion konnten aktuell in anderen Studien auf der Trägersubstanz Matrigel oder durch Rebesiedelung von dezellularisierten Organen beobachtet werden.
Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können.
Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht.
Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische
Zusammenfassung
Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten.
Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an.
Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten.
Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten.
In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der
Zusammenfassung
pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern.
In der Nuklearmedizin werden radioaktive Substanzen eingesetzt, um zu therapeutischen Zwecken gezielt bösartiges Gewebe zu zerstören oder in diagnostischen Anwendungen Stoffwechselvorgänge bildlich darzustellen. Die ionisierende Strahlung der eingesetzten Radionuklide kann jedoch auch DNA-Schäden in gesunden Zellen verursachen. DNA-Doppelstrangbrüche gehören dabei zu den kritischsten Läsionen, da sie schwer zu reparieren sind und eine fehlerhafte Reparatur zu Mutationen oder zum Zelltod führen kann. Während Radionuklidtherapien ist daher in Risikoorganen darauf zu achten, dass die deponierte Energie pro Masse, die Energiedosis, bestimmte Werte nicht überschreitet. Zu diesen Risikoorganen gehört auch das blutbildende System. Da eine Abschätzung der Energiedosis im Knochenmark häufig über die Bestimmung der Energiedosis im Blut als Surrogat erfolgt, ist deren Kenntnis von besonderem Interesse.
In dieser Arbeit wurden daher Berechnungen der Energiedosis im Blut nach interner Bestrahlung durchgeführt und die Ergebnisse mit der Anzahl an strahlungsinduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen in PBMCs korreliert. Zur Quantifizierung der DNA-Schäden wurden die Biomarker \(\gamma\)-H2AX und 53BP1 verwendet, die nach Entstehung eines Doppelstrangbruchs um diesen akkumulieren und sich durch Immunfluoreszenzfärbung als mikroskopische Foci sichtbar machen und quantifizieren lassen. Dadurch ermöglicht der \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Assay einen quantitativen Nachweis strahlungsinduzierter Doppelstrangbrüche. Somit konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Kenntnisse über die Dosisabhängigkeit von DNA-Schäden in PBMCs während interner Bestrahlung mit unterschiedlichen Radionukliden sowohl ex vivo als auch in vivo gewonnen werden.
Ex-vivo-Untersuchungen haben den Vorteil, dass sie unter gleichbleibenden, gut definierten Bedingungen durchgeführt werden können und somit eine Analyse der Induktion von Doppelstrangbrüchen bei festgelegten Energiedosen und einer konstanten Bestrahlungsdauer erlauben. In dieser Arbeit wurden Blutproben von gesunden Versuchspersonen durch Zugabe von Radionukliden in bestimmten Aktivitätskonzentrationen eine Stunde lang intern bestrahlt. Für die Bestrahlung wurden die \(\alpha\)-Emitter \(^{223}\)Ra und \(^{224}\)Ra, die \(\beta\)\(^{-}\)-Emitter \(^{177}\)Lu und \(^{90}\)Y, der \(\beta\)\(^{+}\)-Emitter \(^{68}\)Ga und der \(\gamma\)-Emitter \(^{99m}\)Tc verwendet. Der untersuchte Energiedosisbereich lag zwischen 5 mGy und 136 mGy.
Nach der Bestrahlung von Blutproben mit \(\beta\)- beziehungsweise \(\gamma\)-Emittern wurde beobachtet, dass die Anzahl der strahlungsinduzierten \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Foci (RIF) in den PBMCs linear mit der Energiedosis im Blut ansteigt. Zudem zeigte sich, dass die Induktion der RIF unabhängig vom verwendeten Radionuklid und unabhängig von der Versuchsperson ist.
Nach der Bestrahlung von Blutproben mit \(\alpha\)-Emittern waren zusätzlich zu den nach Expositionen mit \(\beta\)- beziehungsweise \(\gamma\)-Emittern beobachteten kleinen, runden Foci auch \(\gamma\)-H2AX+53BP1 enthaltende Spuren \(\alpha\)-Spuren) in den Zellkernen erkennbar, welche die Trajektorien der emittierten \(\alpha\)-Teilchen darstellten. Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl dieser \(\alpha\)-Spuren linear mit der Energiedosis im Blut zunimmt und damit ein geeigneter Parameter für die Biodosimetrie nach Expositionen mit \(\alpha\)-emittierenden Radionukliden ist.
Auch in vivo wurde die Dosisabhängigkeit der DNA-Doppelstrangbrüche während der internen Bestrahlung durch Radionuklide mit unterschiedlichen Emissionseigenschaften untersucht. Aufgrund der neuen, vielversprechenden Entwicklungen von Radiopharmaka zur Therapie und Diagnostik des Prostatakarzinoms in den letzten Jahren wurden dafür Blutproben von Prostatakarzinom-Patienten während Therapie mit [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T, während PET/CT-Diagnostik mit [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T und während Therapie mit [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\) untersucht.
Während Therapie mit [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T zeigte sich, dass die Anzahl der RIF in den ersten Stunden nach Therapiebeginn durch eine lineare Anpassungskurve angenähert werden kann, die mit der Energiedosis im Blut ansteigt, gefolgt von einem Rückgang der RIF zu späteren Zeitpunkten, der durch die DNA-Reparatur erklärt werden kann. Die gesamte Energiedosis im Blut lag im Mittel bei (109 \(\pm\) 28) mGy. Der linear dosisabhängige Anstieg der RIF zu Therapiebeginn gleicht der dosisabhängigen Induktion der RIF ex vivo nach Bestrahlung mit \(\beta\)- und \(\gamma\)-emittierenden Radionukliden und kann gut mit der entsprechenden Ex-vivo-Kalibrierkurve beschrieben werden. Zu späteren Zeitpunkten (48 h und 96 h nach Verabreichung) konnte in dieser Arbeit eine lineare Korrelation zwischen der Anzahl der noch verbleibenden RIF und der Dosisleistung nachgewiesen werden. Eine signifikante Korrelation der Anzahl der RIF 96 h nach Verabreichung mit dem PSA-Wert deutet zudem darauf hin, dass ein Zusammenhang mit klinischen Parametern besteht.
Ein signifikanter Anstieg der \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Foci konnte auch nach Verabreichung von [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T für diagnostische PET/CT-Untersuchungen beobachtet werden, obwohl die Energiedosen im Blut bis zum PET/CT-Scan nur < 3 mGy betrugen. Im Vergleich zur Ex-vivo-Kalibrierkurve war die Steigung der linearen Anpassungskurve in vivo im Bereich < 3 mGy in dieser Studie etwa um ein Zehnfaches höher, was auf eine mögliche Hypersensitivität im Niedrigdosisbereich hindeuten könnte. Der Beitrag der CT zur Energiedosis im Blut konnte durch Ex-vivo-Experimente auf etwa 12 mGy abgeschätzt werden.
Auch während Therapie mit [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\) lagen die berechneten Energiedosen im Blut im Niedrigdosisbereich < 17 mGy. Trotzdem konnten in dieser Studie erstmalig \(\alpha\)-Spuren in vivo nach der Verabreichung eines \(\alpha\)-emittierenden Radionuklids quantifiziert werden, deren Anzahl 3 h und 4 h nach Verabreichung des Radiopharmakons signifikant erhöht war. Auch zu späten Zeitpunkten, bis vier Wochen nach Therapiebeginn, waren noch \(\alpha\)-Spuren nachweisbar, was auf eine unvollständige Reparatur der komplexen, durch die \(\alpha\)-Teilchen induzierten DNA-Schäden hinweisen könnte. Leider erlaubte die geringe Anzahl an Patienten und Datenpunkten keine zuverlässigen Korrelationen mit der Energiedosis oder mit klinischen Parametern.
Nachdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass DNA-Schäden nach interner Bestrahlung mit \(\alpha\)-, \(\beta\)- und \(\gamma\)-emittierenden Radionukliden mit Hilfe des \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Assays zuverlässig nachgewiesen und anhand der Schadensgeometrie unterschieden werden können, wäre es in Zukunft interessant, DNA-Schäden auch nach Bestrahlung mit Radionuklidgemischen zu untersuchen. Dies könnte sowohl im Hinblick auf den Nachweis von Inkorporationen bei Strahlenunfällen hilfreich sein als auch zu einem besseren Verständnis der Effekte bei Behandlungen mit Radionuklidgemischen beitragen, welche vielversprechende Möglichkeiten für nuklearmedizinische Therapien bieten.
Zudem zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass insbesondere im für die Diagnostik relevanten Bereich sehr niedriger Energiedosen < 10 mGy weiterer Forschungsbedarf besteht. Durch die Untersuchung der dosisabhängigen Reparatur der durch interne Bestrahlung induzierten DNA-Schäden könnte beispielsweise analysiert werden, ob die Reparaturfähigkeit im Niedrigdosisbereich eingeschränkt ist. Außerdem wäre es gerade im Bereich niedriger Dosen von Interesse, zu untersuchen, inwiefern Beobachtungen ex vivo das Verhalten in vivo geeignet repräsentieren. Um die erhöhten statistischen Unsicherheiten im Niedrigdosisbereich zu reduzieren, könnten zukünftig Verbesserungen auf dem Gebiet der automatisierten Auswertung der \(\gamma\)-H2AX+53BP1 enthaltenden Foci und Spuren hilfreich sein.
Weitere Ziele zukünftiger Forschungsvorhaben könnten gezielte Untersuchungen zu Korrelationen zwischen der dosisabhängigen Induktion und Reparatur von DNA-Schäden und klinischen Parametern sowie die Analyse von DNA-Schäden während mehrerer Therapiezyklen darstellen. In Zusammenhang mit der Analyse klinischer Parameter wäre es denkbar, dass biodosimetrische Auswertungen zukünftig auch zur personalisierten Therapieplanung oder auch zur Vorhersage des Therapieerfolgs dienen und somit langfristig zu einer Optimierung nuklearmedizinischer Therapien beitragen könnten.
Polyneuropathien sind eine ätiologisch heterogene Erkrankung des peripheren Nervensystems. In bis zu 30% der Fälle ist eine Zuordnung zu einem bestimmten PNP Subtyp auch nach aufwändiger und zum Teil invasiver Diagnostik nicht möglich. Bislang fehlt ein diagnostischer Biomarker bei PNP, der z.B. bei der Unterscheidung zwischen einzelnen diagnostischen Subgruppen oder entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungsformen helfen könnte. In einer prospektiven Studie mit insgesamt 97 Patienten mit Neuropathien verschiedenster Ätiologie und 17 gesunden Kontrollpersonen erstellten wir Genexpressionsprofile von inflammatorischen Markern und Markern der Regeneration peripherer Nerven in Haut- und N. suralis-Biopsaten. Es wurden Inflammationsmarker (TAC1, CRMP2, AIF1, IL-6) und Marker, die in die Regeneration peripherer Nerven involviert sind (SCD, Netrin-1, DCC, UNC5H2, NEO1, Netrin-G1, Netrin-G2), mittels qRT-PCR untersucht. Alle Patienten erhielten eine N. suralis-Biopsie und/oder eine Hautbiopsie von Ober- beziehungsweise Unterschenkel. Weder in den Haut- noch in den N. suralis-Biopsaten konnten Unterschiede in der Genexpression dieser Marker zwischen einzelnen diagnostischen Subgruppen gefunden werden. Der Inflammationsmarker AIF1 war jedoch in Patienten-Hautproben sowohl proximal als auch distal höher exprimiert als bei gesunden Kontrollpersonen (p < 0,05 bzw. p < 0,01). Zudem fand sich in den Hautproben von PNP-Patienten eine deutlich reduzierte Genexpression von Regenerationsmarkern aus der Netrin-Familie verglichen mit den Hautproben gesunder Probanden (Netrin-1, DCC, UNC5H2, NEO1 sowie Netrin-G1 und G2; p < 0,05 bis p < 0,001). Ferner wies Netrin-1 in distalen Hautproben bei Patienten mit einer entzündlichen PNP eine niedrigere Genexpression auf, als bei Patienten mit einer nicht-entzündlichen Erkrankungsform (p < 0,05). Die Genexpression von NEO1 in distalen Hautproben war bei schmerzloser PNP und gesunden Kontrollpersonen höher als bei schmerzhafter PNP (p < 0,05). Sowohl eine Erhöhung bestimmter Inflammationsmarker als auch eine Verminderung von Regenerationsmarkern peripherer Nerven können bei der Pathophysiologie von Polyneuropathien involviert sein. Insbesondere Mitglieder der Netrin-Familie scheinen eine komplexe Rolle für das Axonwachstum, jedoch auch für entzündliche Prozesse zu spielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde geprüft, ob Gb3 in Hautstanzbiopsien von Patienten mit M. Fabry nachweisbar ist, die Ablagerungen quantifizierbar sind, mit der Krankheitsschwere korrelieren, und ob eine Unterscheidung von Patienten und gesunden Kontrollen anhand der dermalen Gb3-Ablagerungen möglich ist. Es wurden 84 Patienten mit M. Fabry über das FAZiT sowie 27 gesunde Kontrollen zwischen 2008 und 2013 prospektiv rekrutiert und jeweils eine proximale und eine distale Hautbiopsie entnommen. Zusätzlich erfolgten eine Anamnese, eine klinische Untersuchung, eine QST, das Ausfüllen von Fragebögen mit der Fragestellung nach Schmerz und Depression sowie eine Blutentnahme und kardiale Diagnostik. Die Immunfluoreszenz erfolgte mit Antikörpern gegen CD77, einem Marker für Gb3. Es erfolgte die verblindete, semiautomatische Quantifizierung der Gb3 Ablagerungen. Hierzu wurden pro Biopsie drei ROI ausgewählt und die Fläche der ROIs mit Gb3-Ablagerungen in Relation zu der Gesamtfläche der ROIs gesetzt. Für die Auswertung wurden die Patienten sowohl nach Geschlecht als auch nach Krankheitsschwere und einzelnen Symptomen stratifiziert Die Gb3 Ablagerungen ließen sich bevorzugt in Schweißdrüsen und Endothel nachweisen. Es fanden sich jedoch auch größere Mengen an Gb3-Ablagerungen ohne ersichtliches anatomischer Korrelat. Die Gb3-Ablagerungen wurden semiautomatisch quantifiziert. Es konnte nachgewiesen werden, dass männliche Fabry-Patienten eine deutlich größere Menge an Gb3 in den distalen Hautbiopsien zeigen als gesunde Kontrollen, Patienten mit einer eingeschränkten Nierenfunktion hatten eine größere Menge an Gb3-Ablagerungen in der Haut als Patienten mit einer uneingeschränkten Nierenfunktion. Bei Patienten mit einer SFN waren erhöhte dermale Gb3 Mengen vorhanden im Vergleich zu gesunden Kontrollen, bei Patienten ohne eine SFN fand sich dieser Unterschied nicht. Patienten mit einem niedrigen SNAP zeigten im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine größere Menge an Gb3 in ihrer distalen Haut, bei Patienten mit einem höheren SNAP fand sich dies nicht. Aus diesen Ergebnissen ergeben sich ein mögliches weiteres Werkzeug sowohl für die Diagnosestellung als auch für das Monitoring der Erkrankung, sowie weiterführend auch ein möglicher Indikator für den Therapieerfolg der ERT.
Tumore der Nebennieren stellen häufige Tumore dar, welche bei mindestens 3 % der Population über 50-Jähriger vorkommen. Im Gegensatz dazu ist das Nebennierenrindenkarzinom mit einer Inzidenz von 1-2 Einwohner pro Million ein sehr seltener Tumor. Da seine Prognose allerdings ungünstig, und diese maßgeblich davon abhängt wie fortgeschritten der Tumor bei Diagnosestellung ist, ist es wichtig, dass die richtige Diagnose frühzeitig gestellt wird. Bis heute ist kein zuverlässiger immunhistochemischer Nebennierenrindenkarzinom-spezifischer Marker etabliert um das Nebennierenrindenkarzinom von anderen retroperitonealen Tumoren zu differenzieren. Sasano et al. schlug bereits 1995 erstmalig den Transkriptionsfaktor Steroidogenic Factor 1 (SF1) als Marker zur Differenzierung von Nebennierenrinden- und Nicht-Nebennierenrindentumoren vor. Allerdings wurde die diagnostische Wertigkeit bisher nur in sehr kleinen Fallserien mit insgesamt nur 17 Nebennierenrindenkarzinomen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die SF1 Protein-Expression bei 163 Nebennierenrindenkarzinomen, 52 Nebennierenrinden-Adenomen, 12 normalen steroidogenen Geweben (6 Nebennieren und 6 Ovare), sowie 73 Nicht-Steroidtumoren immunhistochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, das SF1 bei 158 von 161 evaluierbaren Nebennierenrindenkarzinomen und bei allen Proben von normalen und gutartigen Geweben (n=64) nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war keine der 73 Nicht-Steroidgeweben SF1 positiv, so dass die diagnostische Genauigkeit extrem gut ist (Sensitivität: 98.6 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value jeweils 100 % und 97.3 %). In einem zweiten Schritt wurde untersucht ob die Protein-Expression von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom auch prognostische Bedeutung hat. Hierbei zeigte sich, dass Patienten mit Tumoren mit starker SF1 Färbung (30 %) ein deutlich schlechteres tumorstadium-adjustiertes Rezidiffreies- und Gesamt-Überleben haben als Patienten mit geringer SF1 Expression (hazard ratio: 2.45). Zusätzlich zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden FISH Analysen durchgeführt. Hierbei zeigte sich allerdings keine signifikante Korrelation zwischen SF1 Gendosis und der SF1 Protein-Expression, so dass zu vermuten ist, dass SF1 maßgeblich auf Transkriptions- und Translationsebene reguliert wird. In einem Versuch diese Frage zu beantworten wurden zwei mutmaßliche SF1 Interaktionspartner, FATE1 und DAX1, genauer immunhistochemisch untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass FATE1 bei 62 von 141 evaluierbaren Nebenierenrindenkarzinomen und 12 von 62 normalen und gutartigen Geweben nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu waren alle 9 Nicht-Steroidgewebe FATE1 negativ. Dies zeigt, das FATE1 nicht zur Diagnostik nutzbar ist (Sensitivität: 61 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value 100 % bzw. 14 %). Die DAX1 Analyse zeigte, dass alle 20 normalen und gutartigen Gewebe eine positive DAX1 Färbereaktion zeigten. Von 126 Nebennierenrindenkarzinomen waren 71 DAX1 positiv. Von den 8 untersuchten Nicht-Steroidgeweben waren 6 DAX1 positiv. Diese Ergebnisse belegen, dass auch DAX1 keine diagnostische Genauigkeit besitzt (Sensitivität: 56 %, Spezifität: 25 %, positive und negative predictive value 92 % bzw. 4 %). Die Untersuchung der prognostischen Fähigkeiten von FATE1 und DAX1 zeigte, dass Patienten mit Tumoren mit starker FATE1 Färbung (39 %) ein schlechteres tumorstadium-adjustiertes Gesamt- aber nicht Rezidiffreies-Überleben haben als Patienten mit niedriger FATE1 Protein-Expression (hazard ratio: 2.01). Weiterhin wurde deutlich, dass DAX1 keine deutlichen prognostischen Fähigkeiten besitzt. Zusammenfassend läßt sich aus der vorliegenden Arbeit folgern, das SF1 aktuell der beste diagnostische Marker zur Diagnose von Tumoren der Nebennierenrinde ist und damit Eingang in die histopathologische Routine-Diagnostik von Nebennierentumoren finden wird. Zusätzlich ist die SF1 Expression ein sehr guter prognostischer Marker beim Nebennierenrindenkarzinom, wobei sich die prognostische Aussage durch zusätzliche Färbung von FATE1 und DAX1 nur unwesentlich verbessern läßt.
Neue Ansätze zur Entwicklung von Alternativmethoden zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität
(2009)
Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane für Toxizität, allerdings stellt die frühzeitige Erkennung einer Nierenschädigung und/oder kanzerogenen Wirkung infolge einer wiederholten Exposition gegenüber toxischen Verbindungen ein großes Problem dar, da traditionelle Marker für Nierenfunktionsstörungen wenig empfindlich sind. Daher ist es notwendig, verbesserte Testmethoden (Alternativmethoden) zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es daher, mögliche Alternativmethoden zur Prüfung auf Nephrotoxizität nach wiederholter Exposition zu untersuchen. Zum einen wurden dazu in einem in vivo-Modell für chronische Nierentoxizität neue Biomarker für Stress und Gewebeschädigung untersucht, deren erhöhte Genexpression in mehreren Modellen für akute Schädigung des Nierengewebes gezeigt wurde, einschließlich kidney injury molecule-1 (KIM-1), Lipocalin-2 (LCN2), Clusterin (CLU), Osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), Vimentin (VIM) und Hämoxygenase-1 (HO-1). Diese Marker wurden nachfolgend auch in einem zellkulturbasierten in vitro-Modell untersucht. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Veränderungen der Zellteilung als möglicher Marker für die Früherkennung kanzerogener Effekte. Das in vivo-Modell bestand in einer Studie in männlichen F344/N-Ratten, die 14, 28 oder 90 Tage oral mit 0, 21, 70 oder 210 µg/kg Körpergewicht (KG) Ochratoxin A (OTA) behandelt wurden. OTA ist ein Mykotoxin, das in Ratten bei wiederholter Gabe eine Nierenschädigung und Nierenkrebs verursacht. Die Analyse der mRNA-Expression der neuen Biomarker in Nierengewebe zeigte bei Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden, eine frühzeitige, zeit- und dosisabhängige Induktion von KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN und CLU, die mit histopathologischen Veränderungen in Form von Zelldegeneration und Regeneration einherging und das Fortschreiten der Schädigung gut widerspiegelte. Auch die mRNA-Expression von HO 1 und VIM wurde durch OTA moduliert, allerdings war eine Erhöhung nicht zu allen Zeitpunkten zu messen bzw. trat nicht so früh auf wie bei den anderen Markern. Effekte auf traditionelle Marker für Nephrotoxizität (Serum-Kreatinin, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase und γ-Glutamyltransferase im Urin) wurden im Vergleich zu den neuen Markern zu einem späteren Zeitpunkt und zumeist nur in der Hochdosisgruppe festgestellt. Zusätzlich zu den Effekten auf die Genexpression konnte in den Zielzellen von OTA im proximalen Tubulusepithel eine erhöhte Proteinexpression von KIM-1, CLU, OPN und VIM gezeigt werden; nur für KIM-1 wurde allerdings auch im Urin eine erhöhte Konzentration nachgewiesen, die mit den Effekten auf die mRNA- und Proteinkonzentration im Gewebe korrelierte. Damit stellt KIM-1 in dieser Studie hinsichtlich Empfindlichkeit und Messbarkeit den empfindlichsten Biomarker für Nephrotoxizität dar. Die Untersuchung der Zellteilung nach wiederholter Gabe von OTA zeigte einen dramatischen, zeit- und dosisabhängigen Anstieg der Proliferation von proximalen Tubulusepithelzellen in Nieren von Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden. Dagegen wurden nach wiederholter Exposition gegenüber 21 µg/kg KG über 90 Tage keine OTA-abhängigen Effekte auf die renale Zellproliferation festgestellt. Somit korrelieren die Veränderungen der Zellteilung in der Niere in der 90-Tages-Studie sehr gut mit dem Ergebnis der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie mit OTA, in der Nierentumoren nur nach Behandlung mit 70 oder 210 µg/kg KG auftraten. Ausgehend von den verschiedenen Endpunkten für Toxizität, die in der Studie untersucht wurden, liegt der no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) bei 21 µg/kg KG OTA. Dies entspricht dem NOAEL der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die neuen in vivo-Biomarker für Nephrotoxizität in NRK 52E-Zellen als in vitro-Modell ausgetestet. Allerdings konnte eine erhöhte mRNA-Expression von KIM-1, einem sensitiven Marker in vivo, nach 24 oder 48 Stunden Behandlung mit verschiedenen nephrotoxischen Modellverbindungen (OTA, Kaliumbromat (KBrO3), Cisplatin oder Cadmiumchlorid (CdCl2)) in den Zellen nicht nachgewiesen werden. Die mRNA-Expression anderer Marker (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) war dagegen in unbehandelten Zellen bereits so hoch, dass die Behandlung mit Nephrotoxinen zu keiner weiteren Induktion führte. Allein die Gen- und Proteinexpression von HO-1 wurde durch CdCl2, KBrO3 und OTA induziert und könnte daher einen potentiellen Marker für screening-Studien in vitro darstellen. Insgesamt war der Nachweis zytotoxischer Wirkungen jedoch der empfindlichste Endpunkt in der Zellkultur. Die Ergebnisse stützen somit die Verwendung der neuen in vivo-Biomarker als gewebespezifische Marker für Nephrotoxizität in vitro nicht.
Schimmelpilze können in Abhängigkeit des Immunstatus und der Vorerkrankungen betroffener Patienten unterschiedliche Krankheitsbilder wie Hypersensitivitäts-erkrankungen oder lebensbedrohliche invasive Infektionen hervorrufen. Da die Diagnosestellung dieser Erkrankungen mitunter komplex und insensitiv ist, sollten im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Ansätze neuer diagnostischer Assays untersucht werden.
In den letzten Jahren wurden Assays entwickelt, die auf Basis durchflusszytometrisch quantifizierter Pilz-spezifischer T-Zellen aus peripherem Blut einen supportiven Biomarker zur Diagnostik invasiver Mykosen liefern könnten. Da die hierfür isolierten T-Zellen anfällig gegenüber präanalytischer Lagerzeiten und immunsuppressiver Medikation sind, wurden hier Protokolloptimierungen vorgenommen, um anhand eines Vollblut-basierten Assays mit zusätzlicher CD49d-Kostimulation diesen Limitationen entgegen zu wirken. In einer Studie an gesunden Probanden konnte dabei gezeigt werden, dass die Kombination der Durchflusszytometrie mit ausgewählten Zytokin-Messungen (IL-5, IL-10 und IL-17) zu einer verbesserten Erkennung vermehrt Schimmelpilz-exponierter Personen beitragen könnte. Neben Infektionen könnten dabei im umwelt- und arbeitsmedizinischen Kontext Polarisationen der T-Zell-Populationen detektiert werden, welche mit Sensibilisierungen und Hypersensitivität assoziiert werden.
Zusätzlich wurde ein in vitro Transwell® Alveolarmodell zur Simulation pulmonaler Pilzinfektionen für Erreger der Ordnung Mucorales adaptiert, durch Reproduktion wichtiger Merkmale der Pathogenese von Mucormykosen validiert, und für Untersuchungen der Immunpathologie und Erreger-Invasion verwendet. Das Modell wurde anschließend zur in vitro Evaluation von radioaktiv markiertem Amphotericin B mit 99mTc oder 68Ga als nuklearmedizinischen Tracer verwendet. Die untersuchten Schimmelpilze zeigten dabei eine zeit- und dosis-abhängige Aufnahme der Tracer, während bakteriell infizierte Proben nicht detektiert wurden. Die erhobenen Daten dokumentieren ein vielversprechendes Potenzial von Amphotericin B-basierten Tracer, das in zukünftigen in vivo Studien weiter evaluiert werden sollte.
LASP1 spielt eine Schlüsselrolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie etwa in der Entwicklung, Zellstruktur, Zellkommunikation, Tumorgenese und Metastasierung. Die Vielseitigkeit von LASP1 ist hauptsächlich durch seine besondere Proteinstruktur bedingt, die eine Interaktion mit vielen verschiedenen Bindepartnern ermöglicht. Effekte von LASP1 werden aber wahrscheinlich nicht nur durch cytosolische Interaktion mit Bindepartnern vermittelt, sondern auch, in Folge einer Translokation in den Zellkern, durch nukleäre Interaktion, evtl. als transkriptioneller Co-Faktor.
Besonders die Rolle von LASP1 in diversen Krebserkrankungen stand in den letzten Jahren im Fokus der Forschung. Sowohl in Karzinomen, als auch in Medulloblastom und Leukämien wächst die Evidenz für eine LASP1-Überexpression, die vor allem durch fehlende microRNA Regulation und Mutationen im p53 Tumorsuppressor bedingt scheint. Die hohe LASP1-Expression konnte in vielen in vitro und in vivo Studien mit vermehrter Proliferation, Migration und/ oder Invasion von Krebszelllinien in direkten Zusammenhang gebracht werden. Dieser Effekt von LASP1 auf Tumoraggressivität ist eine mögliche Erklärung für die mit hoher LASP1-Expression korrelierte schlechtere Prognose in verschiedenen Krebserkrankungen.
Das Transitionalzellkarzinom ist die fünfhäufigste Krebserkrankung des Menschen und weist eine hohe Rezidivrate auf. Daher sind regelmäßige Nachsorgeuntersuchungen notwendig. Angesichts bisher fehlender verlässlicher Biomarker für das Transitionalzellkarzinom ist die Zystoskopie weiterhin der Goldstandard in der Nachsorge. Diese wird aber von Patienten als unangenehm empfunden, ist mit einem Infektionsrisiko verbunden, von der Erfahrung des Untersuchers abhängig und kostenintensiv. Tatsächlich ist das Transitionalzellkarzinom eine der teuersten Krebserkrankungen in der Nachsorge, weshalb die Entwicklung alternativer Diagnostikverfahren auch gesundheitsökonomische Relevanz hat.
LASP1 wurde als ein vielversprechender Biomarker des Transitionalzellkarzinom-Rezidivs identifiziert, der durch einfache Proteinmengenbestimmung mittels Western Blot im Urinpellet evaluiert werden kann. Zum damaligen Zeitpunkt gab es außerdem bereits erste Hinweise auf eine funktionelle Relevanz von LASP1 im Blasenkarzinom in vitro.
Angesichts dieser Erkenntnisse wurden als Ziele dieser Arbeit formuliert, 1) die Generierung von stabil transfizierten, induzierbar LASP1 spezifische shRNA exprimierenden Transitionalzellkarzinomzelllinien, 2) die funktionelle Charakterisierung eines LASP1-Knockdowns in selbigen in vitro, und 3) der Vergleich von Eigenschaften von LASP1 im Transitionalzellkarzinom mit denen in anderen Karzinomen.
Für die zwei Transitionalzellkarzinomzelllinien T24 und RT4 konnte eine 4-5-Fache LASP1-Überexpression, verglichen mit normalem Urothel, gezeigt werden. Beide Zelllinien wurden erfolgreich mit einem induzierbar shRNA gegen LASP1 exprimierenden Konstrukt transduziert, sodass ein 50 % LASP1-Knockdown durch Doxycyclin induziert werden kann. Bei der Evaluierung des Effektes des LASP1-Knockdowns auf die Adhäsion, Proliferation und Migration dieser Zelllinien in vitro konnte eine signifikante Reduktion der Migration in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Passend dazu ergab eine GSEA von TCGA Daten zum Blasenkarzinom eine Korrelation von LASP1-Expression mit diversen Gen-Sets, die mit dem Phänotyp Metastasierung annotiert sind. Des Weiteren konnte für T24 und RT4 eine nukleäre LASP1-Lokalisation nachgewiesen werden, die abhängig von der Serin-146 Phosphorylierung war. Bioinformatische Analysen ergaben eine hochsignifikante, negative Korrelation von LASP1-Expression und miR-203 im Blasenkarzinom.
Eine Korrelation von LASP1-Expression mit Prognose konnte mittels TCGA Daten für das Blasenkarzinom nicht festgestellt werden. Jedoch lagen lediglich Expressionsdaten auf mRNA Level vor, die meisten LASP1 mit Prognose assoziierenden Studien basieren hingegen auf Immunhistochemie, also der Expression auf Proteinlevel, welche in Blasenkrebszelllinien von der Expression auf mRNA Level abweichen kann.
Die generierten Zelllinien wiesen nach lentiviraler Transduktion, Selektion und Sorten im Vergleich zum Wildtyp teilweise veränderte Zelleigenschaften auf, und ein Verlust des Fluoreszenzsignals des der shRNA vorangestellten tRFP wurde beobachtet. Daher müssen die Zellen bei weiterer Verwendung regelmäßig mit Puromycin nachselektioniert werden und die Validität dieser Zellen als Modell für das Transitionalzellkarzinom, besonders im Xenograft Mausmodell, ist kritisch zu hinterfragen.
Entsprechend sind die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit bisherigen Studien zu LASP1. Damit unterstreicht diese Arbeit einmal mehr die Relevanz von LASP1 in diversen Krebserkrankungen. Weitere Studien zum Wert von LASP1 als prognostischer oder gar diagnostischer Marker erscheinen daher vielversprechend.
Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals-Bereichs bilden die weltweit sechst-häufigste Gruppe maligner Erkrankungen. Trotz moderner interdisziplinärer und multimodaler Therapie sind die durchschnittlichen 5-Jahres-Überlebensraten mit ca. 50-60 Prozent seit vielen Jahren unverändert niedrig. Es besteht ein großer Bedarf an verlässlichen Biomarkern zur Abschätzung des individuellen Risikos von aggressiven Krankheitsverläufen sowie zur Prognosebestimmung und Therapie-Überwachung. miRNAs sind kleine nicht protein-codierende RNA-Moleküle, deren Funktion in der posttransskriptionalen Genregulation besteht. Diese RNAs können möglicherweise als Biomarker verwendet werden. In dieser Studie sollte daher die Extraktion von 30 microRNAs an 43 Proben formalin-fixierter, in Paraffin eingebetteter (FFPE) Proben von Mundhöhlenkarzinomen vorgenommen werden. Hierzu erfolgte eine Trennung von Tumor und gesundem Gewebe. Außerdem erfolgte eine Korrelationsanalyse der Expressionsdaten mit relevanten klinischen und pathologischen Daten wie Alter, Geschlecht, Tumor-Stadium und Größe. Das Extraktionsverfahren war erfolgreich und es konnten diverse unterschiedlichen Expressionsmuster zwischen Tumor und Vergleichsgewebe festgestellt werden. Außerdem zeigten sich signifikante Korrelationen zwischen den Expressionsdaten und den klinischen Parametern.
Einfluss einer Prednisolon-Behandlung auf B-Zell-Populationen bei Patienten mit HIV-Infektion
(2021)
Die HIV-Infektion wird von einer Hyperimmunaktivierung begleitet, die vermutlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Die Rolle der B-Zellen im Rahmen dieser Veränderungen und dem Einfluss einer Prednisolontherapie wird durch die ProCort-Studie genauer beschrieben. Diese stellt eine zweijährige, Placebo-kontrollierte, randomisierte Doppelblindstudie dar, bei der die Patienten 5mg Prednisolon täglich einnahmen. Mittels durchflusszytometrischen Messungen wurden bestimmte B-Zellpopulationen differenziert und quantifiziert. Die resultierenden Ergebnisse wurden weiterhin mit bekannten Immunaktivierungsmarkern korreliert.
In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen durch eine Prednisolontherapie signifikant mehr Memory-B-Zellen bzw. resting Memory-B-Zellen im Vergleich zur Placebogruppe aufweisen.
Ferner konnte die Bedeutung der B-Zellen als prognostischer Marker der HIV-Infektion dadurch unterstützt werden, dass die genannten B-Zellreihen signifikant negative Korrelationen zu anderen, bereits etablierten Progressionsmarkern (CD4/CD8-Ratio, CD8/CD38/HLADR-Aktivierung, suPAR, sCD14) vorlagen.
Zusammenfassend zeigt die Arbeit, dass die Veränderungen im B-Zellkompartment Teil des Immunaktiverungsprozesses im Rahmen der HIV- Infektion sind und Prednisolon modulierende Einflüsse darauf hat.
Der Morbus Fabry ist eine sehr heterogenetische und heterophänotypische Krankheit. Ursache der Erkrankung liegt in der Mutation des alpha- Galaktosidase Gens. Es kommt zur Akkumulation von Glykosphingolipiden. Man kann den klassischen Typ von mehreren Varianten unterscheiden. Es konnte bisher noch keine Genotyp- Phänotyp Relation hergestellt werden. In unsere Studie wurden 124 Fabry Patienten eingeschlossen. Vier klinische Domänen wurden beurteilt (Herz, Nieren, Nervensystem, Fabry-Symptome). Daneben wurden genetische Analysen und Labortests (inklusive Lyso Gb3) durchgeführt. Die Studie besitzt einen zweiteiligen Aufbau: in die Evaluationsstudie wurden alle bisher bekannten Mutationen eingeschlossen, während die bisher unbekannten Mutationen der Validierungsstudie zugeteilt wurden. Es konnte gezeigt werden, dass mithilfe des Biomarkers Lyso Gb3 die Schwere der Erkrankung vorausgesagt werden kann (insbesondere bei Frauen) und die Diagnostik erleichtert werden kann. Eine bisher unbekannte Mutation kann jetzt viel besser eingeordnet werden, da man mithilfe des Biomarkers Lyso Gb3 zwischen atypischer und klassischer Variante unterscheiden kann und man durch den Biomarker die Krankheitskapazität einer Mutation beurteilen kann.
Patienten mit arterieller Hypertonie haben ein erhöhtes Risiko eine Tumorerkrankung, insbesondere Nierenzellkarzinome, zu entwickeln. Die arterielle Hypertonie ist über die Entstehung von oxidativem Stress mit der Entwicklung von DNA-Schäden verknüpft, wobei ein hochreguliertes Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eine entscheidende Rolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es zum einen Hypertoniker (HypAll) und gesunde Kontrollen und zum anderen gut (HypGut) und schlecht (HypSch) eingestellte Hypertoniker unter Berücksichtigung der eingenommenen Antihypertensiva bezüglich ihrer Level an oxidativem Stress und DNA-Schäden zu vergleichen. Zusätzlich erfolgte im Rahmen einer Längsschnittanalyse der intraindividuelle Vergleich unter den Hypertonikern. Hierfür erfolgte die Bestimmung von SHp, D-ROM und 3-Nitrotyrosin als Marker für oxidativen Stress im Plasma, von 8-oxodG, 15-F2t-Isoprostan und Malondialdehyd als Marker für oxidativen Stress im Urin und von γ-H2AX und Mikrokernen als Marker für DNA-Schäden in Lymphozyten.
Dabei konnte ein erhöhter oxidativer Stress in der HypAll-Gruppe verglichen zu den Kontrollen anhand aller Marker für oxidativen Stress mit Ausnahme von Malondialdehyd festgestellt werden. Nach Altersadjustierung zeigte sich dieser Gruppenunterschied nur noch für die Proteinstressmarker SHp und 3-Nitrotyrosin signifikant. Bezüglich der Marker für DNA-Schäden ergab sich kein Unterschied zwischen HypAll und Kontrollen. Ebenso zeigte sich kein signifikanter Unterschied in den Leveln für oxidativen Stress und DNA-Schäden zwischen der HypGut- und HypSch-Gruppe. Zuletzt konnte im Rahmen der Längsschnittstudie ein positiver Zusammenhang zwischen der Entwicklung des Blutdrucks und des oxidativen Stresses anhand der Veränderung von D-ROM und des systolischen Blutdrucks beobachtet werden.
Die teils nicht-signifikanten und teils mangelnden Unterschiede zwischen HypAll und Kontrollen sowie zwischen HypGut und HypSch sind am ehesten durch das besondere Patientengut, welches sich auch grundlegend von dem anderer vergleichbarer Studien unterscheidet, erklärbar. Die Patienten mit therapieresistenter Hypertonie (TRH) zeichnen sich durch eine langjährige Einnahme zahlreicher Antihypertensiva aus. Diese, insbesondere die RAAS-wirksamen, besitzen eine über die reine Blutdrucksenkung hinausgehende antioxidative und antigenotoxische Wirkung, welche vermutlich zu einer Angleichung der Level für oxidativen Stress und DNA-Schäden geführt hat.
Um die Dynamik der Biomarker und den Einfluss der Antihypertensiva auf oxidativen Stress und DNA-Schäden besser zu verstehen, sind weitere Studien über einen längeren Beobachtungszeitraum sowie mit zusätzlich therapienaiven Hypertonikern sinnvoll. Die weitere Erforschung von Biomarkern, um sie im klinischen Alltag zur Verbesserung der Patientenbehandlung einsetzen zu können, ist notwendig.
microRNA-221 und ihr Einfluss auf Zytokin-vermittelte Signalwege im Hochrisiko-Karzinom der Prostata
(2016)
Der klinische Verlauf von Prostatakarzinom(PCa)-Erkrankungen ist extrem unterschiedlich und lässt sich mit den bisher üblichen Verfahren wie der feingeweblichen Beurteilung der Prostatastanzbiopsie bzw. des OP-Präparates und der PSA-Wert-Bestimmung nur unzureichend vorhersagen. Für eine bessere Versorgung von PCa-Patienten sind deshalb neuartige Marker notwendig, die das individuelle Progressions-Risiko bestimmen. Ein hoffnungsvoller Ansatz sind miRNA-Vertreter als Prognose-Parameter. Besonders interessant in dieser Hinsicht ist miR-221, die im PCa-Gewebe signifikant niedriger exprimiert wird. Jedoch existieren für diese in den meisten Neoplasien als Onkogen betrachtete miRNA kaum Erklärungsansätze für eine tumorsuppressive Funktion im PCa.
Die vorliegende Arbeit konnte mit Hilfe von Microarray-basierten Expressionsanalysen und deren bioinformatischer Auswertung sowie zell- und molekularbiologischen Experimenten erstmals zeigen, dass miR-221 das protektive Interferon-Signal in PCa-Zellen stärkt und auf diese Weise deren Proliferation hemmt. Daneben konnten zwei prominente Inhibitoren dieses Signals, IRF2 und SOCS3, als neue Zielgene von miR-221 in vitro nachgewiesen und eine Korrelation von miR-221 mit diesen Zielgenen auch in PCa-Nativmaterial identifiziert werden. Somit konnte erstmals ein Mechanismus der – vorher lediglich aufgrund der Herabregulation in PCa-Nativmaterial postulierten – tumorsuppressiven Funktion von miR-221 im Rahmen der PCa-Entstehung und -Progression dargestellt werden.
Eine Aktivierung des JAK / STAT-vermittelten Interferon-Signals durch miR-221 erscheint auch in einem breiteren infektiologischen Kontext interessant – sind doch zahlreiche Virenarten wie das HI-Virus, Hepatitis- und Herpesviren in der Lage, die zelluläre miR-221-Expression zu vermindern und auf diese Weise wohl das antivirale Interferon-Signal zu umgehen. Die Erhöhung der zellulären miR-221-Spiegel könnte nach diesem Prinzip auch Interferon-basierte Therapie-Strategien unterstützen bzw. erst ermöglichen.
Für das PCa müssen weitere experimentelle sowie klinisch-translationale Untersuchungen zeigen, ob miR-221 als Bestandteil einer Biomarker-Signatur dazu beiträgt, Patienten mit einem letalen PCa frühzeitig zu identifizieren und der dringend notwendigen Primärtherapie bzw. einer adjuvanten Behandlung zuzuführen. Im Gegenzug könnte zahlreichen Patienten, deren (hohe) miR-221-Expression im Tumorgewebe einen günstigeren Verlauf prognostiziert, die übermäßige Therapie erspart werden.
Im Rahmen der Progression des klarzelligen Nierenzellkarzinoms kann es zur Invasion der Vena cava durch einen Tumorthrombus (ccRCC/TT) kommen. Allerdings besteht auch in diesem fortgeschrittenen Stadium eine deutliche Heterogenität bezüglich des klinischen Verlaufs. Während sich mit bekannten Verfahren die Prognose bislang unzureichend vorhersagen ließ, gelang es in Vorarbeiten mittels im Tumorgewebe erfasster miRNA-Expressionen, ein Überlebensklassifikationsmodell auf Basis eines Kombinierten Risikoscores (miR-21, miR-126, miR-221) zu konzipieren. Hierdurch konnte das postoperative Überleben von ccRCC/TT Patienten des Würzburger Universitätsklinikums retrospektiv vorhergesagt werden.
In der vorliegenden Arbeit war es möglich, mit Hilfe molekularbiologischer und biostatistischer Methoden das vorbeschriebene Modell erfolgreich an einem unabhängigen, größeren Regensburger ccRCC/TT Patientenkollektiv zu validieren. Am Tumor verstorbene Patienten konnten erneut einer klinisch relevanten High-Risk-Gruppe bzw. einer prognostisch günstigeren Gruppe zugeordnet werden. MiR-21 und miR-126 waren erneut statistisch signifikant mit der Fernmetastasierung und dem tumorbedingten Versterben assoziiert. MiR-21 präsentierte sich sowohl in der am Tumor verstorbenen als auch in der fernmetastasierten Patientengruppe deutlich überexprimiert, während die Expression von miR-126 stark vermindert war. Die neu untersuchte miR-205 zeigte sich in der fernmetastasierten sowie nodal positiven Patientengruppe hochreguliert, ein geringer Zusammengang mit dem tumorbedingten Versterben konnte hergestellt werden.
Im zweiten Ansatz gelang es relevante miRNA-Expressionsunterschiede zwischen Seren Würzburger ccRCC-Patienten mit und ohne Invasion des Gefäßsystems sowie tumorfreien Kontrollen zu identifizieren.
Die langfristige Herausforderung besteht darin, das validierte Überlebensklassifikationsmodell derart weiterzuentwickeln, dass es supportive klinische Anwendung in der Therapieplanung finden kann.
Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositionsbiomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss.