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Aufklärung der Struktur und Charakterisierung des ternären Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB
(2006)
„Bone Morphogenetic Proteins“ (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehomöostase. Wie TGF-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. Für die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation, Kristallisation und Strukturaufklärung des ternären Komplexes aus BMP-2 und den extrazellulären Domänen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses ternären Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 präsentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellulären Domänen der Rezeptoren können keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativität bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erklärbar. Vielmehr repräsentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativität über die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgeführten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinität und Spezifität im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. Während polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbrücke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinität, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen über den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifität möglich. Diese BMP-2 Varianten können als Werkzeuge zur Aufklärung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso wäre es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgeprägter Typ II Rezeptor Spezifität in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise könnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.
Single crystal X-ray studies on bis[3,4,5,6-tetrabromo-1 ,2-benzenediolato(2- )](pyrrolidiniomethyl)silicate acetonitrile solvate [(C6Br40 2hSiCH2(H)NC4H8 · CH3CN; monoclinic, P2t/c, a = 808.5(4), b = 1533.0(8), c = 2212.6(1) pm, ß = 97.67(2)0 , Z = 4] revealed a zwitterionic structure with a pentacoordinate, formally negatively charged silicon atom and a positively charged ammonium moiety. The silicon atom is surrounded by four oxygen atoms and one carbon atom in a trigonalbipyramidal fashion, with the carbon atom in an equatorial position. The structure is displaced by 7.0% from the trigonal bipyramid towards the square pyramid. The zwitterion and the CH3CN molecule form intermolecular N-H · · · N hydrogen bonds.
Für BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembranärer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinität und Spezifität gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage für das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis für die Affinität und Spezifität dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Auflösung von 1,9Å ermittelt. Mit der höheren Auflösung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Brückenbindungen in der Interaktionsfläche zwischen BMP-2 und BR-IAec möglich. Deren zentrale Bedeutung für dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse bestätigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfläche liegenden Wasserstoff-Brückenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Brücke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Darüber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Prä-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermoleküle für die Anpassung der Bindungsfläche an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für ein neues Modell zur Beschreibung von Affinität und Spezifität der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Brückenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, während die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfläche die Bildung von Wasserstoff-Brückenbindungen energetisch begünstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringfügigen Einfluss auf die Affinität nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Präparation und Kristallisation von binären Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der ternären Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellulären Domänen der hierfür verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abhängigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinitäten ermittelt werden konnten. In Übereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe für BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex präpariert. Des Weiteren konnte die Bildung des ternären BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in Lösung nachgewiesen werden. Für all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualität der erhaltenen Kristalle nicht für eine Aufklärung der Struktur aus. Für eine detailliertes Verständnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgeführt werden. Die präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass über die Kenntnis der einzelnen Affinitäten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe möglich ist.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Darstellung und Untersuchung von einfachen Triyrrinen. Dabei wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Entwicklung der Koordinationschemie dieses Liganden gelegt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Durchführung von Röntgenstrukturanalysen metallorganischer und koordinationschemischer Verbindungen. Den Hintergrund für den ersten Teil bilden die jüngsten Versuche anderer Forschergruppen, mit den innerhalb der Porphyrinchemie kaum beachteten offenkettigen Tetrapyrrolen vom Bilen-Typ Phänomene der molekularen Erkennung, der supramolekularen Chemie und der Bioanorganik koordinationschemisch zu bearbeiten. Die Thematik ist zudem von Interesse, da anders als bei tetrapyrrolischen Liganden kaum etwas über das koordinationschemische Verhalten tripyrrolischer Spezies bekannt ist. Gerade das Tripyrrin erscheint hier als interessanter Modellligand, denn durch Wegnahme einer Pyrroleinheit wird eine neue, freie Koordinationsstelle geschaffen, deren Einfluß die Chemie der Tripyrrinate bestimmen sollte. In Kapitel 1 wird die Synthese der Tripyrrine aus pyrrolischen Vorstufen durch eine Kondensationsreaktion in Trifluoressigsäure beschrieben. Der Tripyrrin-Ligand erweist sich gegenüber Nukleophilen als höchst reaktiv, was wahrscheinlich der Grund dafür ist, daß dieser Ligand bislang nur in einer Arbeit beschrieben wurde. Eine Isolierung gelingt zwar nicht, wohl aber eine spektroskopische in situ-Charakterisierung mit Hilfe von NMR- und MS-Methoden. Die direkte Umsetzung der erhaltenen Rohprodukte mit überschüssigen Metall(II)acetaten (M = Fe, Mn, Co, Ni, Pd, Cu, Zn) führt in allen Fällen zu grün gefärbten Lösungen, aus denen sich für M = Co, Pd, Cu und Zn Tripyrrinkomplexe mit zweiwertigem, tetrakoordinierten Metallion und Trifluoracetat als viertem Donor isolieren lassen. Strukturell werden drei unterschiedliche Geometrien beobachtet. Das bevorzugt planar koordinierende Ion Pd(II) liefert Beispiele für den helikalen und den pseudoplanaren Strukturtyp, da aus sterischen Gründen die Ausbildung einer spannungsfreien planaren Molekültopologie unmöglich ist. Auch Cu(II) koordiniert als Trifluoracetat in der pseudoplanaren Variante, während Zn(II) in der nicht gespannten pseudotetraedrischen Form gebunden wird. Die in den Palladium-Komplexen vorhandenen Spannungen bewirken schnelle Ligandenaustauschreaktionen mit Halogeniden und Pseudohalogeniden. Bei den Strukturen der so zugänglichen TrpyPdX-Komplexe mit X = Cl, Br, I, N3, NCO, NCS, NO3, CN und StBu zeigt sich, daß mit zunehmender Größe des anionischen Donors die pseudoplanare Geometrie gegenüber der helikalen zunehmend begünstigt wird. Für Kupfer(II)-Komplexe wird beim Übergang vom Trifluoracetat zum Chlorid ein Wechsel von der gespannten pseudoplanaren zur wenig gespannten pseudotetraedrischen Koordination beobachtet. Die sterisch gespeicherte Spannungsenergie der Tripyrrine läßt tetrakoordinierte Pd(II)-Komplexe wie eine gespannte Feder erscheinen und unterstützt den Austritt des anionischen Liganden unter Bildung eines koordinativ und elektronisch ungesättigten 14 VE-Komplexes. Entscheidend für die Stabilisierung dieser Spezies ist die Verwendung des schwachkoordinierenden Tetrakis[3,5-bis(trifluormethyl)-phenyl]borats [B(Arf)4] als Anion. Der ungesättigte Komplex erweist sich als sehr reaktiv. So koordiniert er bereitwillig an eine Vielzahl von Donoren. Die Umsetzung des Trifluoracetato-Komplexes mit einem halben Äquivalent NaB(Arf)4 führt zu dinuklearen Komplexen, in denen zwei kationische Tripyrrinatopalladium-Fragmente durch ein Trifluoracetat verbunden sind. Mit Trialkylphosphanen bilden sich stabile Komplexe. Eine Besonderheit stellt dabei die Reaktion mit Trimethylphosphan dar. Bei Verwendung überschüssiger Mengen PMe3 beobachtet man die Bildung pentakoordinierter Komplexe. Im Gegensatz dazu führen die Umsetzungen mit Triethyl- und Tri-iso-propylphosphan ausschließlich zur Bildung von Monophosphankomplexen. Die ungewöhnliche Reaktivität des Tripyrrinatopalladium-Kations zeigt sich insbesondere bei der Umsetzung mit Diazoalkanen. So konnten erstmals Carbenpalladium-Komplexe mit nicht-heteroatomstabilisierten Carbenliganden synthetisiert werden. Kapitel 5 beschreibt einen präparativen Einstieg in die Chemie kationischer Kobalt- und Zinkkomplexe von Tripyrrinen. Die Reaktivität und Stabilität des Tripyrrinatokobalt-Kations, die an die Verhältnisse des TrpyPd-Kations erinnern, erlauben dabei die Isolierung von kationischen Phosphan- und Isonitril-Komplexen. Das entsprechende kationische Zink-Chelat konnte isoliert und NMR-spektroskopisch charakterisiert werden.