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Hintergrund: Die Überexpression von Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) wird mit Tumorprogression und schlechter Prognose in Zusammenhang gebracht. Wir untersuchten, ob die pharmakologische Hemmung des Transkriptionsfaktors HIF-1 mittels Chetomin, einem Inhibitor der Interaktion von HIF-1 mit dem Koaktivator Protein p300, die Hypoxie-induzierte Strahlenresistenz menschlicher Fibrosarkomzellen vom Typ HT 1080 beeinflusst.
Methoden: Die optimale Dosis von Chetomin wurde durch Versuchsreihen mit Hypoxie-sensiblem Promotor in mit destabilisiertem EGFP-Vektor transfizierten HT 1080 HRE-Zellen bestimmt. HT 1080 Zellen wurden mittels RT-PCR sowie Western Blot auf die Transkription der HIF-1-regulierten Gene Carboanhydrase IX (CA9) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) untersucht. Außerdem wurden sie zur Erstellung klonogener Assays unter normoxischen sowie hypoxischen (0,1% O2, 12 Stunden) Bedingungen in vitro mit 0, 2, 5 oder 10 Gy bestrahlt mit oder ohne Chetominbehandlung (150 nM, 12 Stunden, Vorbehandlung 4 Stunden).
Ergebnisse: In der RT-PCR zeigte sich eine signifikante Reduktion (Signifikanzniveau p<0,05) der mRNS-Expression von CA9 und VEGF unter Chetomin und Hypoxie auf 44,4 +/- 7,2% beziehungsweise 39,6 +/- 16,0%, im Western Blot supprimierte Chetomin auch die Downstream-Genprodukte von CA9 und VEGF. In den Überlebenskurven erhöhte Chetomin die Wirksamkeit der Bestrahlung wesentlich, der modifizierte Sauerstoffeffekt (modified Oxygen Enhancement Ratio, OER') war mit Ausnahme der 50% SF in Bezug auf die Kontrollen bei 50%, 37% und 10% Relativem Überleben (SF) von 1,57 auf 1,58, von 1,56 auf 1,42 und von 1,38 auf 1,22 reduziert.
Schlussfolgerung: Die HIF-1-Hemmung durch Chetomin reduziert effektiv die Hypoxie-abhängige Transkription und verstärkt die Strahlensensibilität von hypoxischen HT 1080 Fibrosarkomzellen in vitro.
Das Glioblastom ist mit einem Anteil von 20% an allen hirneigenen Tumoren der häufigste und bösartigste primäre intrakranielle Tumor. Trotz multimodalem Therapiekonzept, das operative Resektion, Strahlen- und Chemotherapie verbindet, haben Patienten eine Prognose von im Mittel nur 14,6 Monaten. Sein aggressives Wachstum zieht eine Vaskularisierung nach sich, die jedoch nicht in ausreichendem Maße die Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes sicherstellen kann. Studien mit Messelektroden zeigten einen deutlich reduzierten Sauerstoffpartialdruck im Tumor im Vergleich zum umliegenden Hirngewebe. Dieses hypoxische Milieu löst genetische Alterationen und adaptive Veränderungen der Proteinexpression aus, die eine Selektion besonders aggressiver Tumorzellen bewirkt. Für eine bessere prognostische Einschätzung sowie als zukünftige therapeutische Ziele zur Erhöhung der Response auf Chemo- und Strahlentherapie ist es von großem Interesse, solche Faktoren als mögliche Hypoxiemarker aufzufinden. In dieser Arbeit wurden die Proteine HIF-1α, CAIX, VEGF, EPO und NDRG1 auf mRNA- und Proteinebene in den Glioblastomzelllinien GaMG, U251 und U373 auf eine Veränderung ihrer Expression unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Ausmaß (5% O2, 1% O2 und 0,1% O2) und Dauer (1 h, 6 h und 24 h) der Hypoxie wurde variiert. Anschließend wurde über 24 h und 48 h eine Reoxygenierung durchgeführt. Auch wurden Expressionsuntersuchungen an Gewebeproben von Normalhirnen, Astrozytomen WHO Grad II und Glioblastomen vorgenommen. Die Verwendbarkeit von GAPDH als Marker für diese Analysen wurde durch Experimente sichergestellt, die dessen mRNA und das Protein als nicht durch Hypoxie oder Malignisierung reguliert nachwiesen. Wir bestätigten die Rolle von HIF-1α als Mediator der hypoxischen Zellantwort. Während die mRNA konstant blieb, wurde das Protein unter hypoxischen Bedingungen hochreguliert. Dies zeigte auch, dass unser experimentelles Setting funktionierte. NDRG1, CA-IX sowie EPO wurden unter Hypoxie sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene hochreguliert und blieben unter Reooxygenierung stabil. In Glioblastomen waren diese Gene auf mRNA-Ebene bedeutend stärker exprimiert als in niedriggradigen Astrozytomen. HIF-1α, NDRG1, CA-IX sowie EPO können also in humanen Glioblastomzellen als Hypoxiemarker dienen und möglicherweise auch eine prognostische und therapeutische Bedeutung haben.
Das Nebennierenrindenkarzinom ist ein seltener maligner, epithelialer Tumor mit einer jährlichen Inzidenz in Deutschland von 2 pro 1 Million Einwohnern. Es ist für etwa 0,2% aller Krebstodesfälle verantwortlich. Die Seltenheit der Erkrankung erschwert die Entwicklung wirksamer Therapieansätze erheblich. Erst in letzter Zeit gelang es, größere Patientenkohorten in kontrollierten Studien zu behandeln (Allolio et al. 2006) und größere Fallzahlen an Tumorgewebe wissenschaftlichen Untersuchungen zuzuführen. Erstmalig besteht damit auch die Möglichkeit, die Expression eventuell relevanter Proteine für moderne Therapiekonzepte auch an großen Fallzahlen zu untersuchen. Bislang liegen nur sehr lückenhafte diesbezügliche Studien vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression einiger möglicherweise therapeutisch relevanter Proteine mittels immunhistochemischer Analyse unter Zuhilfenahme der Tissue Microarray-(TMA)-Technik in einer großen Serie von 104 NNR-Ca untersucht und mit der von Nebennierenadenomen und normalem Nebennierengewebe verglichen. Insgesamt 9 verschiedene Proteine wurden immunhistochemisch dargestellt: Als wichtigster Befund wurde eine Überexpression der Alpha-methylacyl-CoA Racemase (AMACR) in 89% der untersuchten NNR-Ca festgestellt. Interessanterweise zeigte auch die Mehrzahl der untersuchten Nebennierenadenome (80%) zumindest eine schwache AMACR-Reaktivität, während die mituntersuchten normalen Nebennieren negativ blieben. Diese bislang nicht beschriebene Beobachtung gleicht den bekannten Befunden z.B. in der Prostata, in der sowohl die dort entstehenden Adenokarzinome, als auch deren Vorläuferläsionen (PIN) eine AMACR-Expression zeigen. EGFR, ein Tyrosinkinaserezeptor, auf den der bereits etablierte therapeutische Antikörper Cetuximab (Erbitux®) zielt, wurde in 49% der untersuchten NNR-Ca verstärkt exprimiert, so dass eine gegen den EGFR gerichtete Therapie in ausgewählten Fällen eine Behandlungsoption zu eröffnen scheint. Die Suche nach Mutationen in diesem potentiellen Zielprotein könnte weitere Ansatzpunkte für Wirkstoffe aufzeigen, Studien gibt es dazu bislang keine. Ähnliche Ergebnisse fanden sich in dieser Studie für VEGF, das von 19% der untersuchten NNR-Ca mäßig oder stark exprimiert wurde. Auch hier könnte eine entsprechende Therapie mit einem bereits kommerziell erhältlichen spezifischen Antikörper (Bevacizumab/Avastin®) in einem Teil der Fälle eine Behandlungsoption, ggf. auch als supportive Maßnahme, eröffnen. Angesichts der Expression von VEGF in nur rund einem Drittel der Fälle, wäre hier aber eine vorangehende Bestimmung des Expressionsstatus am Tumorgewebe unerläßlich. Weitere Untersuchungen sollten auch den VEGF-Rezeptor als möglichen Ansatzpunkt neuer Wirkstoffe, wie z.B. der Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor Sunitinib [SU11248; SUTENTTM] (Le Tourneau et al., 2007), erforschen. Im Gegensatz dazu wurde eine wesentliche Expression weiterer untersuchter Proteine (CD117/C-kit, Her-2/neu, Östrogen- und Progesteronrezeptor) in NNR-Ca in dieser Studie nicht in einem Maße gefunden, welches in einer signifikanten Zahl von Fällen eine Therapieoption eröffnen würde. Eine immunhistochemisch bestimmbare Expression von p53, als Surrogatmarker für ein mutiertes p53-Gen wurde in 85% der untersuchten NNR-Ca nachgewiesen. Dies weist auf eine zentrale Bedeutung von p53-Mutationen in der Genese von NNR-Ca hin. (Reincke et al., 1994; Gicquel et al., 2001; Barzon et al.I, 2001; Soon et al., 2008) Auch die Proliferationsfraktion, bestimmt als Ki67-Index, war in den untersuchten Karzinomen gegenüber den Adenomen und den mitgeführten normalen Nebennieren deutlich erhöht, was das aggressive Wachstumspotential der Mehrzahl der NNR-Ca wiederspiegelt.
Grundlage dieser Arbeit war es die verschiedenartigen Effekte von Butyrat, unter anderem im Rahmen der Prävention von kolorektalen Karzinomen auf die bereits fortgeschrittenen Formen, zu erweitern. Hierzu erfolgte eine Unteruchung von Angiogenesefaktoren und deren Beeinflussung durch die kurzkettige Fettsäure Butyrat. Die untersuchten Faktoren umfassten VEGF, als potentes angiogenetisches Agens und dessen zugehörigen Rezeptor FLT-1. Zudem wurde das Tumorsuppressorgen p53, ein wichtiger Modulator der Tumorentstehung und Tumorprogression, mituntersucht. Ziel war es, die positiven Effekte im Rahmen der Prävention auf die metastasierten kolorektalen Karzinome bzw. derer Zelllinien aufzuzeigen. Die verwendeten Methoden stützten sich einerseits auf die Analyse der mRNA und der Proteine. Hierfür wurden die Zellkultur, die RNA-Isolation, ein RNase Protection Essay (RPA), der Westernblot und ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) durchgeführt. Die Analysen zeigten einen positiven Effekt auf die Supprimierbarkeit des Wachstumsfaktors VEGF und dessen Rezeptor FLT-1, sowie auch auf das Tumorsuppressorgen p53mut- in seiner mutierten Variante. Butyrat senkte somit die Expression von VEGF und FLT-1 sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene. Bezüglich der Expression von p53 konnte gezeigt werden, dass die RNA-Expression durch Butyrat ebenfalls eine Hemmung erfuhr. Ein weiteres Ergebnis der Arbeit bestand darin, den Stress, welcher sowohl die Zugabe von Butyrat als auch eine Episode mit Serumentzug auf das Verhalten des Wachstumsfaktors VEGF hatte. Hierbei zeigte sich eine sehr rasche Zunahme der Expression. Diese normalisierte sich im weiteren Verlauf und hatte somit keinen längerfristigen Einfluß auf die Ergebnisse. Zusammenfassend zeigt sich eine deutliche Beeinflussung der Angiogenese durch Butyrat, welche auch auf dem Hintergrund der aktuellen Studienlage bezüglich VEGF Antikörpern einen adjuvanten Behandlungsweg darstellen könnte. Kritisch anzumerken bleiben die Probleme der Applikation von Butyrat.
Zur Abschätzung der Wachstums- und Progressionstendenz des Harnblasenkarzinoms ist die Erforschung neuer diagnostischer Marker notwendig. Kriterien wie Staging und Grading erweisen sich oftmals als unzureichend, da Tumoren mit ähnlichen Stadien unterschiedliche klinische Verläufe zeigen können. Der VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) wurde als wichtiger angiogenese-stimulierender Mediator beim Harnblasenkarzinom identifiziert. Bisher konnte zeigt werden, dass die Expression von VEGF im Harnblasenkarzinom gegenüber unauffälligem Blasengewebe erhöht ist. Um die Expession von VEGF in verschieden Tumorstadien zu evaluieren, wurde Tumormaterial von 52 Harnblasenkarzinompatienten untersucht, das durch transurethrale Resektion (TUR-B) und durch Cystektomie gewonnen wurde. Die Tumoren zeigten invasives Wachstum und eine urotheliale Differenzierung. Die Schnitte wurden mit einem polyklonalen Antikörper gegen die Splicing-Varianten VEGF189, 165, 121 gefärbt, und die VEGF-positiven Tumorzellen ausgezählt. Im Stadium pT1 und pT4 wurden die höchsten Werte VEGF-positiver Zellen gefunden. Im Stadium pT2 wurde der niedrigste Wert ermittelt. G2-Tumoren unterscheiden sich statistisch nicht signifikant von den G3-Tumoren. Bei Tumoren mit lymphogener Metastasierung lag der Wert VEGF-positiver Zellen niedriger als bei denen ohne Lymphknotenmetastasen. Tumoren mit hämatogener Metastasierung wiesen höhere Werte auf als die ohne Fernmetastasen. Vergleiche der Ergebnisse der Tumorpräparate gewonnen durch TUR-B und Cystektomie ergeben für die Stadien pT1 und pT2 vergleichbare Werte. Deutliche Unterschiede ergeben sich für das Stadium pT3 und pT4. Durch Interpretation der Ergebnisse muss davon ausgegangen werden, dass die Auswertung der VEGF-Protein-Expression keinen unabhängigen prognostischen Indikator darstellt. VEGF scheint beim Blasenkarzinom nicht der alleinige Mediator in der Tumorausdehnung und Filialisierung zu sein.
Einfluss des VEGFRezeptor-2 spezifischen RTK-Inhibitors PTK 787/ ZK 222584 auf Angiogenese und somit Wachstum maligner Gliome in einem Tiermodell. Verwendet wurden hierbei C6-Rattengliomzellen aus denen durch retrovirale Transfektion von VEGF cDNA in sense Richtung ein stark VEGF exprimierender Zellklon generiert wurde.
Die Abschätzung des individuellen Rezidiv- und Progressrisikos eines Patienten mit einem Nierenzellkarzinom gelingt durch Bestimmung von Staging und Grading nur unzureichend. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es neben etablierten Prognoseparametern wie Staging und Grading eines Nierentumors die VEGF-Immunreaktivität zu untersuchen und auf seine Tauglichkeit als Prognoseparameter zu überprüfen. Hierzu wurden parafin-fixierte Präparate von 200 Patienten, die an der Urologischen Universitätsklinik Würzburg zwischen 1985 und 1994 tumornephrektomiert wurden, immunhistochemisch untersucht. Zu allen Patienten ist ein postoperativer Verlauf bekannt. Die Präparate wurden zunächst nach der Avidin-Biotin-Methode gefärbt und zur Auswertung vorbereitet. Für jedes Präparat wurde nun der prozentuale Anteil der VEGF-positiven Zellen im Tumor durch zwei unabhängige Untersucher bestimmt. Als Mass der Prognose (abhängige Variable) wurden Überlebenszeit und rezidivfreie Zeit nach Tumornephrektomie gewählt. Als prognostische Parameter (unabhängige Variable) dienten die etablierten Faktoren wie Staging und Grading sowie der potentiell relevante Faktor VEGF. VEGF erwies sich, im Präparat immunhostochemisch gemessen, als statistisch signifikanter Prognosefaktor, der aber den klassischen Faktoren unterlegen ist. In einer multivariaten Prognoseanalyse und in einer Berechnung von Prognoseindizes sowie Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven konnte gezeigt werden, dass eine Kombination der etablierten Prognosefaktoren mit VEGF eine statistisch signifikante Steigerung der Vorhersagegenauigkeit erreicht