Refine
Has Fulltext
- yes (9)
Is part of the Bibliography
- yes (9) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (9)
Language
- German (9) (remove)
Keywords
- Coronaviren (9) (remove)
Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.
Coronaviren sind mit einer Genomgröße von 27-32 kb die größten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und führen zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie führt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmoleküle für die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst fünf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Domäne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivität gegenüber synthetischen Peptiden und konnten somit für die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repräsentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die über Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. Übereinstimmend konnte für die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine frühzeitige (möglicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge hätte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repräsentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen überaus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage für die Entwicklung eines für Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay für Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verfügbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und könnte in modifizierter Form auch für andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays für ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie für die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. Für das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifität. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit für die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften führten, die gute Voraussetzungen für eine röntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen.