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The thesis enhances the strategy of non-destructive fluorescence read-out in rylene bisimide-diarylethene containing photochromic systems. The fluorescence of the emitter unit is quenched by a photoinduced electron transfer only to one of the isomeric forms of the photochrome. The driving force of the fuorescence-quenching electron transfer was calculated by the help of the Rehm-Weller equation. The novel photochromic systems satisfy the necessary requirements for non-destructive read-out in write/read/erase fluorescent memory devices.
This thesis will outline studies performed on the fluorescence dynamics of phenyl-benzo-
[c]-tetrazolo-cinnolium chloride (PTC) in alcoholic solutions with varying viscosity using
time-resolved fluoro-spectroscopic methods. Furthermore, the properties of femtosecond
Laguerre-Gaussian (LG) laser pulses will be investigated with respect to their temporal
and spatial features and an approach will be developed to measure and control the spatial
intensity distribution on the time scale of the pulse.
Tetrazolium salts are widely used in biological assays for their low oxidation and reduction
thresholds and spectroscopic properties. However, a neglected feature in these applications
is the advantage that detection of emitted light has over the determination of the
absorbance. To corroborate this, PTC as one of the few known fluorescent tetrazolium
salts was investigated with regard to its luminescent features. Steady-state spectroscopy
revealed how PTC can be formed by a photoreaction from 2,3,5-triphenyl-tetrazolium
chloride (TTC) and how the fluorescence quantum yield behaved in alcoholic solvents
with different viscosity. In the same array of solvents time correlated single photon counting
(TCSPC) measurements were performed and the fluorescence decay was investigated.
Global analysis of the results revealed different dynamics in the different solvents, but
although the main emission constant did change with the solvent, taking the fluorescence
quantum yield into consideration resulted in an independence of the radiative rate from
the solvent. The non-radiative rate, however, was highly solvent dependent and responsible
for the observed solvent-related changes in the fluorescence dynamics. Further studies
with the increased time resolution of femtosecond fluorescence upconversion revealed an
independence of the main emission constant from the excitation energy, however the dynamics
of the cooling processes prior to emission were prolonged for higher excitation
energy. This led to a conceivable photoreaction scheme with one emissive state with a
competing non-radiative relaxation channel, that may involve an intermediate state.
LG laser beams and their properties have seen a lot of scientific attention over the past two
decades. Also in the context of new techniques pushing the limit of technology further to
explore new phenomena, it is essential to understand the features of this beam class and
check the consistency of the findings with theoretical knowledge. The mode conversion
of a Hermite-Gaussian (HG) mode into a LG mode with the help of a spiral phase plate
(SPP) was investigated with respect to its space-time characteristics. It was found that
femtosecond LG and HG pulses of a given temporal duration share the same spectrum
and can be characterized using the same well-established methods. The mode conversion
proved to only produce the desired LG mode with its characteristic orbital angular momentum
(OAM), that is conserved after frequency doubling the pulse. Furthermore, it
was demonstrated that temporal shaping of the HG pulse does not alter the result of its
mode-conversion, as three completely different temporal pulse shapes produced the same
LG mode. Further attention was given to the sum frequency generation of fs LG beams
and dynamics of the interference of a HG and a LG pulse. It was found that if both are
chirped with inverse signs the spatial intensity distribution does rotate around the beam
axis on the time scale of the pulse. A strategy was found that would enable a measurement
of these dynamics by upconversion of the interference with a third gate pulse. The results
of which are discussed theoretically and an approach of an experimental realization had
been made. The simulated findings had only been reproduced to a limited extend due to
experimental limitations, especially the interferometric stability of the setup.
Einführung: Die physikalischen Eigenschaften des intravenösen Anästhetikums Propofol (2,6-Diisopropylphenol) erlauben dessen fluoreszenzspektrometrische Detektion. Zur Entwicklung eines direkten Online-Monitorings im optisch dichten Medium Blut wird das Signalverhalten von Propofol im mit Blutprodukten gefüllten Kreislaufsystem untersucht. Material und Methoden: Der kontinuierliche Umsatz von 140,2 ml Probenvolumen im Kreislaufmodell mit integrierter Durchflussquarzküvette bezweckt ein stabiles Fluoreszenzniveau des Messmediums, da Blutprodukte in statischer Versuchsanordnung unter der verwendeten Anregungsstrahlung (UV-C) starken photochemischen Bleichungseffekten ausgesetzt sind. Als Messmedien untersucht werden Gefrorenes Frischplasma (GFP), eine Suspension aus Erythrozytenkonzentrat und GFP (EK + GFP) sowie am Versuchstag gespendetes heparinisiertes Vollblut. Es erfolgt die standardisierte Injektionen von vier Propofolboli, durch die im System Konzentrationen von 35,7 μg/ml bis 3,6 μg/ml entstehen und den klinisch relevanten Wirkspiegeln bei Narkoseeinleitung sowie Narkoseaufrechterhaltung entsprechen. Unter Anregung mit Licht der Wellenlänge 274 nm liefert Propofol ein maximales Signal bei 300 nm. Anhand der in engen zeitlichen Abständen aufgenommen Fluoreszenzspektren werden die Propofoleffekte bei 300 nm im Summationsspektrum des Blut-Propofol-Gemischs analysiert. Ergebnisse: Die Signalanstiege bei 300 nm nach Injektion in das mit GFP bzw. EK + GFP gefüllte Kreislaufsystem sind hochsignifikant für die erzeugten Propofolspiegel von 35,7 μg/ml bis 3,6 μg/ml und weisen eine sehr gute lineare Korrelation von R2 = 0,73 bis zu R2 = 0,99 zwischen Fluoreszenzsignal und Propofolkonzentration auf. Allein für diese Messmedien kann durch den Einsatz des Kreislaufmodells ein ausreichend stabiles Fluoreszenzsignal zum Propofolnachweis erreicht werden. Dem Fluoreszenzanstieg nach Propofolinjektion folgt in allen Messmedien ein über 30 Minuten andauernder Signalabfall, für den nach fluoreszenzspektrometrischer Untersuchung von Schlauchproben des Kreislaufmodells die Adsorption des lipophilen Anästhetikums an Silikon als ein ursächlicher Faktor bestimmt werden kann. Schlussfolgerung: Der direkte konzentrationsabhängige Fluoreszenznachweis von klinisch eingesetzten Propofol-Wirkspiegeln gelingt allein in transfusionsmedizinisch aufbreiteten Blutprodukten.
Complexation properties of 2,2':6',2''-terpyridine (tpy) have been studied with a series of first row transition metal ions by UV-vis, 1H NMR and isothermal titration calorimetry and ƒ´H values for the tpy complexation processes have been determined. These studies reveal that Zn2+ is the best suited metal ion for the reversible coordination of the terpyridine ligand. Thus, supramolecular coordination polymerization of perylene bisimide fluorophores containing terpyridine functionalities have been investigated by using Zn2+ as metal ion. The formation of the dimeric complexes in the case of monotopic model comounds and coordination polymerization of ditopic functional building blocks have been confirmed by 1H NMR studies. The optical properties of dimeric and polymeric complexes have been investigated by UV-vis and fluorescence spectroscopy. The Zn2+ coordination to the terpyridine unit does not effect the advantageous fluorescence properties of perylene bisimide moieties. The reversibility of the formation of coordination polymers has been established by 1H NMR and additionally by DOSY NMR and fluorescence anisotropy measurements. Coordination polymer strands can be visualized by atomic force microscopy (AFM), which also reveals the formation of an ordered monolayer film at higher concentration. The average polymer length has been determined by AFM to 15 repeat units, which correlates well with the value estimated by 1H NMR to >10 repeat units.
Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern“ war es neue Oktapeptide zu finden, die die Fähigkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekundärstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es möglich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molekül zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren Lösungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Größe des Moleküls, konnte kein β-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren Lösungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als nächster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminosäuren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als β-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminosäuren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein β-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix“ Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminosäuren ist die Bibliothek für die Katalyse in polaren Lösungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zunächst wurde für beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das künstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminosäure Histidin essentiell für die katalytische Aktivität ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig für die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminosäuren eine Verringerung der Aktivität von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in wässrigem gepufferten Lösung durchgeführt werden. Damit ist es möglich gewesen neue Oktapeptide für die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in Lösung zu untersuchen.
We introduce fluorescence-detected pump–probe microscopy by combining a wavelength-tunable ultrafast laser with a confocal scanning fluorescence microscope, enabling access to the femtosecond time scale on the micrometer spatial scale. In addition, we obtain spectral information from Fourier transformation over excitation pulse-pair time delays. We demonstrate this new approach on a model system of a terrylene bisimide (TBI) dye embedded in a PMMA matrix and acquire the linear excitation spectrum as well as time-dependent pump–probe spectra simultaneously. We then push the technique towards single TBI molecules and analyze the statistical distribution of their excitation spectra. Furthermore, we demonstrate the ultrafast transient evolution of several individual molecules, highlighting their different behavior in contrast to the ensemble due to their individual local environment. By correlating the linear and nonlinear spectra, we assess the effect of the molecular environment on the excited-state energy.
In this thesis the syntheses and detailed investigations on two foldable PBI systems were presented. The reversible, solvent-dependet folding/unfolding-behavior was used to study the ground and excited states properties of folda-dimer and folda-trimer by means of different spectroscopic methods as well as theoretical studies. The switching between charge transfer or excimer formation pathways of photoexcited molecules influenced by the spatial arrangement of chromophores within defined dye systems illustrates the impact of conformational preferences on functional properties.
The scope of this work is to develop a novel single-molecule imaging technique by combining atomic force microscopy (AFM) and optical fluorescence microscopy. The technique is used for characterizing the structural properties of multi-protein complexes. The high-resolution fluorescence microscopy and AFM are combined (FIONA-AFM) to allow for the identification of individual proteins in such complexes. This is achieved by labeling single proteins with fluorescent dyes and determining the positions of these fluorophores with high precision in an optical image. The same area of the sample is subsequently scanned by AFM. Finally, the two images are aligned and the positions of the fluorophores are displayed on top of the topographical data. Using quantum dots as fiducial markers in addition to fluorescently labeled proteins, fluorescence and AFM information can be aligned with an accuracy better than 10 nm, which is sufficient to identify single fluorescently labeled proteins in most multi-protein complexes. The limitations of localization precision and accuracy in fluorescence and AFM images are investigated, including their effects on the overall registration accuracy of FIONA-AFM hybrid images. This combination of the two complementary techniques opens a wide spectrum of possible applications to the study of protein interactions, because AFM can yield high resolution (5–10 nm) information about the conformational properties of multi-protein complexes while the fluorescence can indicate spatial relationships of the proteins within the complexes. Additionally, computer simulations are performed in order to validate the accuracy of the registration algorithm.
Zwei Arten helikal-chiraler Verbindungen mit einem oder zwei Boratomen wurden nach einem modularen Ansatz synthetisiert. Die Bildung der helikalen Strukturen erfolgte durch Einführung von Bor in flexible Biaryl- bzw. Triaryl-Vorstufen, hergestellt aus kleinen achiralen Bausteinen. Die durchgehend ortho-fusionierten Azabora[7]helicene zeichnen sich dabei durch außergewöhnliche Konfigurationsstabilität, blaue oder grüne Fluoreszenz in Lösung mit Quantenausbeuten (Φ\(_{fl}\)) von 18–24 %, grüne oder gelbe Emission im Festkörper (Φ\(_{fl}\) bis zu 23 %) und starke chiroptische Resonanz mit großen Anisotropiefaktoren von bis zu 1.12×10\(^{-2}\) aus. Azabora[9]helicene, aufgebaut aus winkelförmig sowie linear angeordneten Ringen, sind blaue Emitter mit Φ\(_{fl}\) von bis zu 47 % in CH\(_{2}\)Cl\(_{2}\) und 25 % im Festkörper. DFT-Rechnungen zeigen, dass ihre P-M-Interkonversion über einen komplexeren Weg verläuft als im Fall von H1. Röntgenstrukturanalyse von Einkristallen zeigt deutliche Unterschiede in der Packungsanordnung von Methyl- und Phenylderivaten auf. Die Moleküle werden als Primärstrukturen verlängerter Helices vorgeschlagen.
Koordinationspolymere auf der Basis von Terpyridin und Dipyridyltriazin: Synthese und Anwendung
(2015)
Der erste Teil der Arbeit untersucht den Einsatzes von 4,6-Di-(pyrid-2´-yl)-1,3,5-triazin als Baustein für Metallo-supramolekulare Polyelektrolyte. Die dafür nötigen ditopen Liganden werden mittels Stille Kreuzkupplungen dargestellt. Die Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften können durch den Einbau von Oligothiophenen eingestellt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit werden die elektrorheologischen Eigenschaften von Metallo-supramolekularen Polyelektrolyten untersucht. Zu diesem Zweck werden die Koordinationspolymere in das Schichtsilikat Montmorillonit interkaliert. Die Interkalation wird mittels verschiedener analytischer Methoden wie Pulverdiffraktometrie, Thermoanalyse oder Infrarotspektroskopie untersucht. Die entstehenden Nanokomposite zeigen einen elektrorheologischen Effekt bei einer geringen Stromdichte.
Es wurde ein Leitpartikeltyp mit hoher Fluoreszenz sowie einem Absorptionsbereich oberhalb von 600 nm evaluiert. Zur Anbindung der hochspezifisch wirkenden Antikörper wurde die Teilchenoberfläche mit Carboxylgruppen funktionalisiert. Die Darstellung dieser sphärischen, komplex aufgebauten erfolgte über eine nasschemische Synthese. Die synthetisierten Partikel besitzen eine hohe Fluoreszenzintensität, gutes Chromatographierverhalten und spezifische Beladbarkeit mit monoklonalen Antikörpern (z.B. Troponin T) auf einer mit Carboxylgruppen modifizierten Partikeloberfläche. Auf die Partikel mit dem favorisierten Fluorophor musste eine zusätzliche Silicathülle aufkondensiert werden, damit diese im Anschluss erfolgreich mit Antikörpern beladen werden konnte. Die erhaltenen partikulären Systeme wurden sowohl qualitativ als auch quantitativ charakterisiert. Die Fluoreszenzintensität dieser dotierten Kern-Schale-Partikel konnte soweit optimiert werden, dass sich klinisch relevante und noch höhere Sensitivitäten in Prüfteststreifen detektieren ließen. Weiterhin wurden neuartige Fluoralkylsilan und Fluorophor codotierte Silicat-Nanopartikel synthetisiert, die auf Anhieb eine gute untere Nachweisgrenze von Troponin erzielten. Durch UV-VIS- und Fluoreszenz-Untersuchungen sowie Konjugations- und Prüfteststreifen-Versuche konnte gezeigt werden, dass die Cokondensation des Fluoralkylsilans in einer Erhöhung von Absorption und Fluoreszenz der Partikel resultiert. Weitere Untersuchungen von zeigten, dass eine zusätzliche Oberflächenmodifizierung mit Fluoralkylsilan zu einer signifikanten Verschlechterung der Konjugationseigenschaften mit Antikörpern führt. Alternative Detekorreagenzien und -methoden wurden ebenfalls untersucht. So konnte der kationische Komplex Tris-(1,10-phenantrolin)ruthenium(II)-dichlorid erfolgreich in monodisperse Silicat-Partikel eingebaut werden. Aufgrund ihrer geringen Sauerstoffpermeabilität sind sie als impermeabler Referenzstandard in O2-Sensoren geeignet. Eine andere untersuchte Detektionsmethode basiert auf zeitaufgelöster Fluoreszenz (TRF). Hierbei werden hauptsächlich Lanthanoid-Komplexe eingesetzt. Am besten untersucht sind Europium-Komplexe, welche meistens Diketone als Liganden besitzen. Bislang konnten diese neutralen Komplexe jedoch nicht in polare Silicatpartikel-Matrizes eingebaut werden. Durch Einsatz von 3,3,3-Trifluoropropyltrimethoxysilan gelang es erstmalig, einen Europium(III)-tris-4,4,4-trifluoro-1-(2-naphthoyl)-1,3-butandion-Komplex (Eu(TNB)3) in hydrophobierte Silicat-Nanopartikeln physikalisch einzubauen. TRF-Messungen zeigten Abklingzeiten von ca. 300 µs. In diesem bislang nicht verfügbaren Partikel-Typ konnten positive Eigenschaften von Latex- und Silicatpartikeln kombiniert werden. Auch einige Porphyrinkomplexe mit langen Fluoreszenzlebensdauern sind in Silicat-Nanopartikel eingebaut worden. Der neutrale Komplex 5,10,15,20-Tetrakis(4-carboxyphenyl)-porphyrin-Pd(II) konnte nur durch vorhergehende Silanisierung erfolgreich eingebunden werden. Die erhaltenen sphärischen Partikel weisen eine Größenverteilung von 200-300 nm auf. Ein weiteres, kationisches Porphyrin (5,10,15,20-Tetrakis(N-methyl-4-pyridyl)-21,23H-porphyrin-Zn(II)) konnte ebenfalls erfolgreich in etwa 140 nm große Silicat-Nanopartikel blutungsstabil eingebaut werden.
Efficient quadrupolar chromophores (A–pi–A) with triarylborane moieties as acceptors have been studied by the Marder group regarding their non‐linear optical properties and two‐photon absorption ability for many years. Within the present work, this class of dyes found applications in live‐cell imaging. Therefore, the dyes need to be water‐soluble and water‐stable in diluted aqueous solutions, which was examined in Chapter 2. Furthermore, the influence of the pi‐bridge on absorption and emission maxima, fluorescence quantum yields and especially the two-photon absorption properties of the chromophores was investigated in Chapter 3. In Chapter 4, a different strategy for the design of efficient two‐photon excited fluorescence imaging dyes was explored using dipoles (D–A) and octupoles (DA3). Finding the optimum balance between water‐stability and pi‐conjugation and, therefore, red‐shifted absorption and emission and high fluorescence quantum yields, was investigated in Chapter 5
Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine.
Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror
(2020)
The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches.
One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror.
I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens.
The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here.
Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated.
Polyneuropathien (PNP) können zu einer Reorganisation der nodalen und paranodalen Membranproteine mit in der Folge fehlerhafter Axon-Schwann-Zell-Interaktionen führen. Im Rahmen der Basisdiagnostik einer Polyneuropathie haben sich Hautbiopsien als weniger invasive Ergänzung zur Suralisbiopsie mit einem geringen Nebenwirkungsrisiko entwickelt. Die Morphologie dermaler Nervenfasern lässt sich mittels Immunohistochemie in der Haut gezielt untersuchen. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese überprüft, ob pathologisch auffällige Ranvier-Schnürringe Hinweise auf Unterschiede bei PNP-Subgruppen und Schädigungsmuster liefern. Daneben wurden die Hypothesen überprüft, ob Entzündungszellen an myelinisierten Nervenfasern kolokalisiert nachweisbar sind und ob Hautbiopsien einen zusätzlichen Nutzen zur PNP-Basisdiagnostik liefern. Von 92 Patienten wurden Hautbiopsien von Finger, Ober-und Unterschenkel wurden entnommen, daraus gewonnene myelinisierte Nervenfasern der Haut wurden mittels immunohistochemischer Antikörper-Doppelfärbungen analysiert. Neuropathische Schädigungsformen vom axonalen und demyelinisierenden Typ zeigten keine signifikante Korrelation mit dem Auftreten von verlängerten Ranvier-Schnürringen und der Dispersion charakteristischer paranodaler und nodaler Membranproteine (Neurofascin, Caspr, Pan-Natrium-Kanäle). Kolokalisierte Entzündungszellen an myelinisierten Nervenfasern bei entzündlichen PNP ließen sich nicht nachweisen. PNP-Subgruppen zeigten keine signifikanten Unterschiede in Hinblick auf eine pathologische nodale oder paranodale Organisation. Der Zusatznutzen von Hautbiopsien in der PNP-Basisdiagnostik kann in Bezug auf die vorliegende Arbeit nur eingeschränkt bestätigt werden. Da Fingerbiopsien im Vergleich zu Proben aus Ober- und Unterschenkel eine signifikant höhere Dichte myelinisierter Nervenbündel pro Fläche Dermis aufweisen, wäre es durchaus denkbar, zukünftig primär Fingerbiopsien zu entnehmen um diese auf etwaige pathologische Veränderungen infolge neuropathischer Erkrankungen zu untersuchen. Anamnese, Basisdiagnostik und klinischer Befund erbringen nach wie vor den wichtigsten Beitrag zur PNP-Diagnostik.
Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays.
The present thesis introduce different synthetic strategies towards a variety of polycyclic aromatic dicarboximides (PADIs) with highly interesting and diverse properties. This included tetrachlorinated, tetraaryloxy- and tetraaryl-substituted dicarboximides, fused acceptor‒donor(‒acceptor) structures as well as sterically shielded rylene and nanographene dicarboximides. The properties and thus the disclosure of structure‒property relationships of the resulting dyes were investigated in detail among others with UV‒vis absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy, cyclic voltammetry and single crystal X-ray analysis. For instance, some of the fused and substituted PADIs offer strong absorption of visible and near infrared (NIR) light, NIR emission and low-lying LUMO levels. On the contrary, intriguing optical features in the solid-state characterize the rylene dicarboximides with their bulky N-substituents, while the devised sterically enwrapped nanographene host offered remarkable complexation capabilities in solution.
Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen sind häufig entscheidend beteiligt an verschiedenen einer Infektion oder malignen Erkrankung zugrunde liegenden molekularen Erkennungs-prozessen, die zu Adhäsion, Zell-Zell-Interaktion sowie Immunreaktion und -toleranz führen. Trotz der hohen Relevanz für Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen sind die betreffenden Strukturen und Mechanismen bisher nur ungenügend untersucht und verstanden. Ziel dieser stark interdisziplinär angelegten Arbeit war es daher, Methoden der Fachbereiche Chemie und Pharmazie, Biologie und Medizin, aber auch Physik zu kombinieren, um Kohlenhydraterkennungsprozesse im Detail zu untersuchen und auf dieser Basis strukturell neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen zu entwerfen.
Die hochkomplexe Zusammensetzung einer Zelloberfläche wurde zunächst auf ihren Glycan-anteil reduziert und stark vereinfacht auf der Oberfläche sogenannter Glycochips imitiert. Die verwendeten Systeme auf Basis einer Gold- bzw. Glasoberfläche ergänzen sich optimal in ihrer Eignung für komplementäre analytische Methoden wie Massenspektrometrie sowie quantifizierbare Fluoreszenzspektroskopie.
Der Übergang auf die lebende Zelloberfläche gelang mit Hilfe des Metabolic Glyco-engineering, das die kovalente Präsentation definierter Motive durch eine Cycloaddition zwischen zwei bioorthogonalen Reaktionspartnern (z.B. Azid und Alkin) ermöglicht.
Auf diese Weise wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Sauer (Universität Würzburg) zunächst die Dichte und Verteilung verschiedener Oberflächenglycane auf humanen Zellen mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) bestimmt. Diese Parameter zeigten im Modell des Glycochips einen entscheidenden Einfluss auf Bindungsereignisse und multivalente Erkennung und zählen auch auf natürlichen Zelloberflächen – in engem Zusammenhang mit der lateralen und temporalen Dynamik der Motive – zu den wichtigen Faktoren molekularer Erkennungsprozesse.
Die gezielte Modifikation zellulärer Oberflächenglycane eignet sich aber auch selbst als Methode zur Beeinflussung molekularer Wechselwirkungsprozesse. Dies wurde anhand des humanpathogenen Bakteriums S. aureus gezeigt, dessen Adhäsion auf Epithelzellen der Blasenwand durch Metabolic Glycoengineering partiell unterdrückt werden konnte.
In einem ergänzenden Projekt wurden zwei potentielle Metabolite eines konventionellen Antibiotikums – des Nitroxolins – mit bakteriostatischer sowie antiadhäsiver Wirksamkeit dargestellt. Diese dienten als Referenzsubstanzen zur Verifizierung der postulierten Struktur der Derivate, werden aber auch selbst auf ihr Wirkprofil hin untersucht. Gleichzeitig stehen sie zusammen mit der Grundverbindung zudem als Referenz für die Wirkstärke potentieller neu entwickelter Antiadhäsiva zur Verfügung.
Pyrene is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) that has very interesting photophysical properties which make it suitable for a broad range of applications. The 2,7-positions of pyrene are situated on nodal planes in both the HOMO and LUMO. Hence, electrophilic reactions take place at the 1-, 3-, 6-, and 8-positions. The goal of this project was to develop novel pyrene derivatives substituted at the 2- and 2,7-positions, with very strong donors or/and acceptors, to achieve unprecedented properties and to provide a deeper understanding of how to control the excited states and redox properties. For that reason, a julolidine-type moiety was chosen as a very strong donor, giving D-π and D-π-D systems and, with Bmes2 as a very strong acceptor, D-π-A system. These compounds exhibit unusual photophysical properties such as emission in the green region of the electromagnetic spectrum in hexane, whereas all other previously reported pyrene derivatives substituted at the 2,7-positions show blue luminescence. Furthermore, spectroelectrochemical measurements suggest very strong coupling between the substituents at the 2,7-positions of pyrene in the D-π-D system. Theoretical studies show that these properties result from the very strong julolidine-type donor and Bmes2 acceptor coupling efficiently to the pyrene HOMO-1 and LUMO+1, respectively. Destabilization of the former and stabilization of the latter lead to an orbital shuffle between HOMO and HOMO 1, and LUMO and LUMO+1 of pyrene. Consequently, the S1 state changes its nature sufficiently enough to gain higher oscillator strength, and the photophysical and electrochemical properties are then greatly influenced by the substituents.
In another project, further derivatives were synthesized with additional acceptor moieties at the K-region of pyrene. These target derivatives exhibit strong bathochromically shifted absorption maxima (519-658 nm), which is a result of the outstanding charge transfer character introduced into the D-π-D pyrene system through the additional acceptor moiety at the K-region. Moreover, emission in the red to NIR region with an emission maximum at 700 nm in CH2Cl2 is detected. The excited state lives unusual long for K-region substituted pyrenes; however, such a lifetime is rather typical for 2,7-substituted pyrene derivatives.
The polycyclic aromatic hydrocarbon perylene, especially perylene diimide, has received considerable attention in recent years and has found use in numerous applications such as dyes, pigments and semiconductors. Nevertheless, it is of fundamental importance to understand how to modulate the electronic and photophysical properties of perylene depending on the specific desired application. Perylenes without carboxyimide groups at the peri positions are much less well studied due to the difficulties in functionalizing the perylene core directly. In particular, only ortho heteroatom substituted perylenes have not been reported thus far (exception: (Bpin)4-Per was already reported by Marder and co-workers). Thus, the effect of substituents on the ortho positions of the perylene core has not been investigated.
Two perylene derivatives were synthesized that bear four strong diphenylamine donor or strong Bmes2 acceptor moieties at the ortho positions. These compounds represent the first examples of perylenes substituted only at the ortho positions with donors or acceptors.
The investigations show that the photophysical and electronic properties of these derivatives are unique and different compared to the well-studied perylene diimides. Thus, up to four reversible reductions or oxidations are possible, which is unprecedented for monomeric perylenes. Furthermore, the photophysical properties of these two ortho-substituted derivatives are unusual compared to reported perylenes on many regards. Thus, large Stokes shifts are obtained, and the singlet excited state of these derivatives lives remarkably long with intrinsic lifetimes of up to 94 ns.
In a cooperation with Dr. Gerard P. McGlacken at University College Cork in Ireland, different quinolones were borylated using an iridium catalyst system to study the electronic and steric effect of the substrates. It was possible to demonstrate that the Ir-catalyzed borylation with the dtbpy ligand allows the direct borylation of various 4-quinolones at the 6- and 7-positions. Thus, later stage functionalization is possible with this method and more highly functionalized quinolones are also compatible with this mild reaction conditions.
We demonstrate two-quantum (2Q) coherent two-dimensional (2D)electronic spectroscopy using a shot-to-shot-modulated pulse shaper and fluorescence detection. Broadband collinear excitation is realized with the supercontinuum output of an argon-filled hollow-core fiber, enabling us to excite multiple transitions simultaneously in the visible range. The 2Q contribution is extracted via a three-pulse sequence with 16-fold phase cycling and simulated employing cresyl violet as a model system. Furthermore, we report the first experimental realization of one-quantum−two-quantum (1Q-2Q) 2D spectroscopy, offering less congested spectra as compared with the 2Q implementation. We avoid scattering artifacts and nonresonant solvent contributions by using fluorescence as the observable. This allows us to extract quantitative information about doubly excited states that agree with literature expectations. The high sensitivity and background-free nature of fluorescence detection allow for a general applicability of this method to many other systems.