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Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
In large vessel occlusion stroke, recanalization to restore cerebral perfusion is essential but not necessarily sufficient for a favorable outcome. Paradoxically, in some patients, reperfusion carries the risk of increased tissue damage and cerebral hemorrhage. Experimental and clinical data suggest that endothelial cells, representing the interface for detrimental platelet and leukocyte responses, likely play a crucial role in the phenomenon referred to as ischemia/reperfusion (I/R)-injury, but the mechanisms are unknown. We aimed to determine the role of endoglin in cerebral I/R-injury; endoglin is a membrane-bound protein abundantly expressed by endothelial cells that has previously been shown to be involved in the maintenance of vascular homeostasis. We investigated the expression of membranous endoglin (using Western blotting and RT-PCR) and the generation of soluble endoglin (using an enzyme-linked immunosorbent assay of cell culture supernatants) after hypoxia and subsequent reoxygenation in human non-immortalized brain endothelial cells. To validate these in vitro data, we additionally examined endoglin expression in an intraluminal monofilament model of permanent and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Subsequently, the effects of recombinant human soluble endoglin were assessed by label-free impedance-based measurement of endothelial monolayer integrity (using the xCELLigence DP system) and immunocytochemistry. Endoglin expression is highly inducible by hypoxia in human brain endothelial monolayers in vitro, and subsequent reoxygenation induced its shedding. These findings were corroborated in mice during MCAO; an upregulation of endoglin was displayed in the infarcted hemispheres under occlusion, whereas endoglin expression was significantly diminished after transient MCAO, which is indicative of shedding. Of note is the finding that soluble endoglin induced an inflammatory phenotype in endothelial monolayers. The treatment of HBMEC with endoglin resulted in a decrease in transendothelial resistance and the downregulation of VE-cadherin. Our data establish a novel mechanism in which hypoxia triggers the initial endothelial upregulation of endoglin and subsequent reoxygenation triggers its release as a vasoactive mediator that, when rinsed into adjacent vascular beds after recanalization, can contribute to cerebral reperfusion injury.
Neisseria meningitidis ist einer der wichtigsten Erreger bakterieller Meningitiden und gefürchtet für das Potential Epidemien auszulösen. Die Meningokokken-Meningitis bleibt bis heute auch in Industrieländern mit hoher Mortalität verbunden. Um eine Meningitis verursachen zu können, müssen Meningokokken die Blut-Hirn/Liquor-Schranke überqueren. Dies erfolgt vermutlich über den transzellulären Weg durch die Endothelzellbarriere der Gehirnkapillare. Ereignisse unmittelbar vor der bakteriellen Internalisierung sind vielfach untersucht, noch wenig erforscht sind jedoch die in der Endothelzelle durch den initialen Kontakt des Erregers ausgelösten Signalkaskaden. Die Rolle des für eine ADP-Ribosyltransferase kodierenden narE Gens in der Pathogenese der Meningokokken-Infektion und die mögliche Bedeutung in der Aktivierung von Signaltransduktionsmechanismen wird diskutiert. Eine narE Insertionsmutante wurde hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurde die Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK) im Verlauf von Infektionsassays in HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) mittels Western Blot untersucht. Eine Zu- oder Abnahme in der Phosphorylierung von ERK und folglich eine Aktivierung oder Deaktivierung der ERK-vermittelten Signalkaskaden in HBMEC konnte jedoch im Laufe der Infektion bei der narE Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm nicht festgestellt werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen Meningokokken intrazellulär einzeln aber auch zu mehreren in phagosomenähnlichen membranumgebenen Strukturen. Die Fähigkeit von N. meningitidis sich intrazellulär zu replizieren wurde mittels Infektions-assay untersucht. Bekapselte Meningokokken waren in der Lage, sich sowohl in Epithel- als auch in Endothelzellen zu replizieren, während unbekapselte Erreger intrazellulär abgetötet wurden. Bei Meningokokken wie auch beim Erreger neonataler Meningitiden E. coli K1 wird eine O-Acetylierung des Kapselpolysaccharids beobachtet. Die biologische Bedeutung der O-Acetylierung der Sialinsäure wurde in Infektionsassays mit einem nicht acetylierten E. coli K1 Stamm und einer isogenen konstitutiv acetylierten Mutante untersucht. In der Adhärenz an und Invasion in HBMEC konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Eine stärker ausgeprägte intrazelluläre Replikation wurde jedoch nach einer Verzögerung von mehreren Stunden bei dem nicht acetylierten Isolat beobachtet. Um die Neisseria containing Vacuole (NCV) näher zu charakterisieren und mögliche Interaktionen mit dem Endozytoseweg in HBMEC zu untersuchen, wurde eine dreifache Immunfluoreszenzfärbung zur simultanen Darstellung intrazellulärer Meningokken und spezifischer Marker des frühen bzw. späten Endosoms und Lysosoms etabliert. Eine Akquirierung des Transferrinrezeptors als Marker für das frühe Endosom und des Lamp-1 (lysosomal associated membrane protein 1) als Marker für das späte Endosom konnte durch Kolokalisationsstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt werden.
Background
Ureaplasma species (spp.) are commonly regarded as low-virulent commensals but may cause invasive diseases in immunocompromised adults and in neonates, including neonatal meningitis. The interactions of Ureaplasma spp. with host defense mechanisms are poorly understood. This study addressed Ureaplasma-driven cell death, concentrating on apoptosis as well as inflammatory cell death.
Methods
Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) were exposed to Ureaplasma (U.) urealyticum serovar 8 (Uu8) and U. parvum serovar 3 (Up3). Resulting numbers of dead cells as well as mRNA levels and enzyme activity of key agents in programmed cell death were assessed by flow cytometry, RNA sequencing, and qRT-PCR, respectively. xCELLigence data were used for real-time monitoring of changes in cell adhesion properties.
Results
Both Ureaplasma isolates induced cell death (p < 0.05, vs. broth). Furthermore, Ureaplasma spp. enhanced mRNA levels for genes in apoptosis, including caspase 3 (Up3 p < 0.05, vs. broth), caspase 7 (p < 0.01), and caspase 9 (Up3 p < 0.01). Caspase 3 activity was increased upon Uu8 exposure (p < 0.01). Vice versa, Ureaplasma isolates downregulated mRNA levels for proteins involved in inflammatory cell death, namely caspase 1 (Uu8 p < 0.01, Up3 p < 0.001), caspase 4 (Uu8 p < 0.05, Up3 p < 0.01), NOD-like receptor pyrin domain-containing 3 (Uu8 p < 0.05), and receptor-interacting protein kinase 3 (p < 0.05).
Conclusions
By inducing apoptosis in HBMEC as main constituents of the blood-brain barrier, Ureaplasma spp. may provoke barrier breakdown. Simultaneous suppression of inflammatory cell death may additionally attenuate host defense strategies. Ultimate consequence could be invasive and long-term CNS infections by Ureaplasma spp.
Ureaplasma species are common colonizers of the adult genitourinary tract and often considered as low-virulence commensals. Intraamniotic Ureaplasma infections, however, facilitate chorioamnionitis and preterm birth, and cases of Ureaplasma-induced neonatal sepsis, pneumonia, and meningitis raise a growing awareness of their clinical relevance. In vitro studies are scarce but demonstrate distinct Ureaplasma-driven impacts on immune mechanisms. The current study addressed cytokine and chemokine responses upon exposure of native or lipopolysaccharide (LPS) co-stimulated human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) to Ureaplasma urealyticum or U. parvum, using qRT-PCR, RNA sequencing, multi-analyte immunoassay, and flow cytometry. Ureaplasma exposure in native HBMEC reduced monocyte chemoattractant protein (MCP)-3 mRNA expression (p < 0.01, vs. broth). In co-stimulated HBMEC, Ureaplasma spp. attenuated LPS-evoked mRNA responses for C-X-C chemokine ligand 5, MCP-1, and MCP-3 (p < 0.05, vs. LPS) and mitigated LPS-driven interleukin (IL)-1α protein secretion, as well as IL-8 mRNA and protein responses (p < 0.05). Furthermore, Ureaplasma isolates increased C-X-C chemokine receptor 4 mRNA levels in native and LPS co-stimulated HBMEC (p < 0.05). The presented results may imply immunomodulatory capacities of Ureaplasma spp. which may ultimately promote chronic colonization and long-term neuroinflammation.