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Diese Arbeit ist eine epidemiologische, deskriptive Beobachtungsstudie mit retrospektiver Datenerhebung. Sie stellt das bakterielle Erreger- und Resistenzspektrum von pädiatrischen Patienten mit Blutkultur-positiver Sepsis in Innsbruck dar.
Dazu wurden 797 positive Blutkulturen von pädiatrischen Patienten des Departments für Pädiatrie der Medizinischen Universität Innsbruck, bei denen gemäß Patientenakte eine Sepsis diagnostiziert wurde, im Zeitraum von Januar 2000 bis Dezember 2008 an der Sektion für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen Universität Innsbruck bezüglich der Erregerverteilung und des Resistenzspektrums untersucht. In einem weiteren Schritt wurde im Rahmen einer statistischen Auswertung überprüft, inwieweit patientenbezogene Daten (Geschlecht, Alter, Begleiterkrankung) sowie der Infektionsort (nosokomial oder ambulant erworben), die Entnahmestelle der Blutkultur und der Zeitraum das Erreger- und Resistenzspektrum beeinflussen.
EINLEITUNG: Die frühzeitige Erregeridentifikation bei Sepsis-Patienten ist essentiell zur Therapieoptimierung und Senkung der Letalität. Molekularbiologische Detektionsmethoden mit direktem Nachweis bakterieller oder fungaler DNA aus Vollblut stellen einen vielversprechenden Ansatz dar, mit kürzerer Zeitdauer bis zum Resultat und potentiell erhöhter Sensitivität. Beim Vergleich dieser PCR-basierten, kulturunabhängigen Verfahren mit der konventionellen Blutkultur muss streng zwischen antibiotisch vorbehandelten und antibiotisch nicht vorbehandelten Patienten unterschieden werden.
METHODIK: Bei Patienten, die sich von Mai 2010 bis Dezember 2011 mit V.a. Sepsis im Zentrum für Innere Medizin einer Universitätsklinik vorstellten, wurden im Rahmen der IMPACT Sepsis Studie zusätzlich zum routinemäßigen Vorgehen 2 x 5 ml EDTA Blut für die VYOO®-PCR entnommen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Erregernachweise der PCR mit den Ergebnissen der Blutkultur für alle antibiotisch nicht vorbehandelten Patienten hinsichtlich Detektionsrate, Time to Result und Plausibilität verglichen. Außerdem wurde die antibiotische Therapie dieser Patienten analysiert und potentielle Therapieoptimierungen durch die PCR-Ergebnisse evaluiert.
ERGEBNISSE: 126 der 200 in die IMPACT Sepsis Studie eingeschlossenen Patienten waren nicht antibiotisch vorbehandelt. Ihr Durchschnittsalter betrug 66,0 ± 16,4 (MW ± SD) Jahre, der Anteil männlicher Patienten 60% und der Anteil immunsupprimierter Patienten 33%. Die durchschnittliche Krankenhaus-Liegedauer lag bei 11,9 ± 10,5 (MW ± SD) Tagen, der Anteil der Patienten mit schwerer Sepsis oder septischem Schock bei 47% und die Letalitätsrate bei 9,7%. Die durchschnittliche Latenzzeit bis zur ersten Antibiotika-Gabe betrug 4,13 ± 6,75 (MW ± SD) h bei einem Median von 2,16 h.
Insgesamt wurden 26 Erreger identifiziert. In 6 Fällen wurde der Erreger von beiden Methoden identifiziert, in 15 nur von der Blutkultur und in 5 nur von der PCR. Die Detektionsraten betrugen 8,7% für die PCR und 16,7% für die Blutkultur (Fisher-Yates-Test; p=0,087; korrigiertes p=1). Die Zeitdauer bis zum Erregerresultat war bei der PCR signifikant kürzer (8,0h bzw. 40,0h; korrigiertes p<0,001). Die PCR versagte vor allem beim Nachweis von Streptokokken, während die Blutkultur mehrere, teilweise gramnegative Problemkeime nicht erfasste. Bei mindestens 4% aller Patienten, 9% der Patienten mit schweren Verlaufsformen und 45% der Patienten mit positivem PCR-Resultat hätte eine Berücksichtigung des PCR-Ergebnisses höchstwahrscheinlich zu einer Therapieoptimierung beigetragen.
SCHLUSSFOLGERUNG: Die beiden untersuchten Verfahren zur Erregerdiagnostik unterschieden sich hinsichtlich der Detektionsrate nicht signifikant, eine diagnostische Überlegenheit der VYOO®-PCR gegenüber der Blutkultur konnte also nicht festgestellt werden. Als komplementäres Verfahren zusätzlich zur Blutkultur bei ausgewählten Patientengruppen eingesetzt, kann durch die PCR eine Verbesserung des therapeutischen Managements von Sepsis-Patienten erzielt werden.
Diese multizentrische, randomisierte, doppel-blinde Studie hatte zum Ziel, die additive Wirksamkeit von Pentaglobin® bei der Behandlung der Peritonitis zu untersuchen. Pentaglobin® wurde hierbei zusammen mit einer im klinischen Alltag üblichen Antibiotikatherapie intravenös verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt ein Placebo bestehend aus Humanalbumin. Primäre Endpunkte waren der postoperative kumulierte Summenwert der SIRS-Kriterien nach Bone bis zum 23. postoperativen Tag sowie der postoperative kumulierte Summenwert des SOFA-Score bis zum 28. postoperativen Tag. Ergebnisse wurden durch Anwendung verschiedener Scores überprüft. Insgesamt konnten 260 Patienten mit Peritonitis an 16 Studienzentren eingeschlossen werden. 258 Patienten kamen in die Safety-Analyse sowie 255 in die Intentio-To-Treat Analyse. Bei den primären Endpunkten konnte eine Tendenz für die Wirksamkeit von Pentaglobin® bei septischen Patienten gezeigt werden. Insbesondere die Patienten mit einem höheren MPI-Wert scheinen mehr von einer Therapie mit Pentaglobin® profitiert zu haben. Eine statistische Signifikanz konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Bei den sekundären Endpunkten zeigte sich eine statistisch signifikant kürzere Therapie mit Katecholaminen in der Pentaglobin®-Gruppe. Weiterhin fanden sich statistisch signifikante Unterschiede des IL-2-Rezeptors sowie des TNF-1-Rezeptors im Studienverlauf zwischen der Pentaglobin®- und der Placebo-Gruppe. Bei der Überprüfung der Verträglichkeit der Studienmedikation fanden sich keine signifikanten Unterschiede.
Chirurgische Nahtmaterialien werden nach ihren Konstitutionsmerkmalen und deren geschichtlicher Entwicklung beschrieben. Hierbei wird gezielt auf die Entwicklung der physikalischen und biologischen Eigenschaften eingegangen. Nahtmaterialien sind das Ergebnis der Erfahrungen operativer Tätigkeiten seit 2000 v. Chr. und gezielter wissenschaftlicher Forschung seit Mitte des 19. Jahrhunderts. Um 1500 v.Chr. ist die Wundnaht zum ersten Mal dokumentiert (Papyri Edwin Smith und Ebers, Ägypten). Man bediente sich jenerzeit vorwiegend der Leinenfäden oder ähnlicher Materialien zum Wundverschluss. Aus der Literatur sind Hinweise auf weitere Ausgangsmaterialien bekannt, die uns einen Einblick in die operativen Tätigkeiten chinesischer, indischer, ägyptischer, griechischer und römischer Ärzte vor hunderten von Jahren geben. Naturprodukte wie Baumrinde, Dornen, Schleimharze oder auch Pergament werden als Nahtmaterial verwendet. Die von Walter v. Brunn 1928 beschriebene Ameisennaht, die als Ursprung der heutigen Wundklammerung anzusehen ist, wurde schon von arabischen Ärzten wie Abû`l-Qasim (~1000 n.Chr.) und italienischen Chirurgen wie Mondino de Liucci (1275-1326) und Bruno von Longoburgo(~1252) angewandt. Haare von Mensch und Tier, Federkiele, Darmsaiten und schließlich die Seide komplettieren neben anorganischen Stoffen das Nahtmaterialsortiment bis ca. 1930. Von da an gewannen synthetische Fäden zunehmend an Bedeutung, bis zu den heute bekannten Nahtmaterialien aus z.B. Polyamid (Nylon®), Polyglactin (Vicryl®), Polyglykolsäure (Dexon®) oder Polydioxanon (PDS®) und viele andere mehr. Zunächst waren die Chirurgen durch das Einbringen von Fremdmaterial in die Wunde mit schwerwiegenden Problemen konfrontiert. Infektionen, Abstoßungsreaktionen und unzureichender Wundverschluss beschreiben nur einen Teil der Komplikationen und Schwierigkeiten, denen ein Arzt, besser der Patient, bei der Wundversorgung ausgesetzt war. Bis zur Einführung der Antisepsis und Asepsis in der Chirurgie mit Pasteur (1822-1895) und Lord Lister (1827-1912), war der Ausgang nach Versorgung einer Wunde durch die "blutige Naht" häufig letal. Während man nun Ende des 19. Jahrhunderts um Sterilisationsverfahren und Darreichungsformen von Nahtmaterialien bemüht war, widmete man sich auch speziellen Handhabungseigenschaften von chirurgischen Fäden sowie - bereits seit Mitte des 19. Jahrhunderts - auch deren Verhalten im Gewebe. Die Armierung chirurgischer Fäden gipfelt um 1920 in der Entwicklung der atraumatischen Nadel-Faden-Kombinationen, die eine minimale Traumatisierung des Stichkanals zum Ziel hatte. Heute sind chirurgische Nahtmaterialien Mittelpunkt eines ausgereiften Industriezweiges. Ausgangsmaterialien werden hinsichtlich ihres Einsatzbereiches modifiziert, um dem Operateur ein Fadenmaterial maximaler Qualität an die Hand zu geben. Um ein Nahtmaterial als Mittel zum Wundverschluss einzuordnen und seine Wirkung im Gewebe einschätzen zu können, können folgende Kriterien zur Beschreibung und Evaluierung chirurgischen Nahtmaterials aufgestellt werden: Konstitutionsmerkmale (Degradationsverhalten, Filament-Architektur, Oberflächeneigenschaften, Durchmesser, Beschichtung, Farbe), unterscheidende Parameter in vitro und in vivo (Zugfestigkeit, Knotenhalt, Dehnbarkeit, Elongation, Gewebeverträglichkeit, Quellung, Dochtwirkung, Funktionszeit), Handhabungseigenschaften, Sterilität, Armierung und Verpackung. Ziel ist es, die historischen Wurzeln der einzelnen Eigenschaften aufzudecken und ihre Entwicklung bis in die Neuzeit zu verfolgen.
Vor dem Hintergrund der steigenden Inzidenz und der nahezu unverändert hohen Letalität der schweren Sepsis wurden in den letzten Jahren beeindruckende Fortschritte auf dem Gebiet der Diagnostik und v.a. der Therapie der Sepsis erlangt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des neuen Medikaments Drotrecogin alpha (aktiviert) auf Patienten mit septischem Schock bzgl. Mortalität zu prüfen und Kriterien, die auf eventuellen Erfolg bzw. Misserfolg hinweisen, zu identifizieren. Hierzu wurden die Akten von 63 Patienten mit septischem Schock, die zwischen Oktober 2002 und September 2006 auf der internistischen Intensivstation der Medizinischen Klinik und Poliklinik I des Universitätsklinikums Würzburg betreut wurden, ausgewertet. Die ermittelten Daten wurden in Bezug auf neuere Literatur analysiert. Alle Patienten (44 Männer, 19 Frauen, Durchschnittsalter 53,4 ± 13,7 Jahre) wurden zusätzlich zur Standardsepsistherapie mit DrotAA (24 µg/kg KG/h) für eine Gesamtzeit von max. 96 h behandelt. Jedem Patienten mussten zur Kreislaufstabilisierung Katecholamine verabreicht werden, folglich befanden sich per definitionem alle Studienteilnehmer im septischen Schock. Der durchschnittliche Apache II-Score lag bei 36 und die mittlere Anzahl an Organversagen war 4,4 (100 % der Patienten erlitten ein Kreislaufversagen, 94 % hatten ein Lungenversagen, 78 % ein Nierenversagen, 68 % eine metabolische Azidose, 64 % eine DIC, 35 % ein Leberversagen). Insgesamt verstarben 30 der 63 Patienten (47,6 %) innerhalb von 30 d nach Beginn der Applikation von DrotAA. 46 % unserer Patienten sind innerhalb von 24 h nach Aufnahme auf die ITS mit DrotAA behandelt wurden. In der statistischen Analyse zeigte sich der Beginn der Therapie mit DrotAA innerhalb von 24 h jedoch nicht als signifikanter Prädiktor für die 30 d-Mortalität (HR: 0,87; 95 % CI: 0,422 – 1,791; p = 0,705). Die unabhängigen Prädiktoren des 30 d-Mortalitätsrisikos waren die Anzahl an Organversagen (HR je Organ: 1,51; 95 % CI: 1,14 – 1,99; p = 0,004), die Anzahl an verabreichten Antibiotika (HR je Medikament: 0,57; 95 % CI: 0,42 – 0,79; p = 0,001), das Ansteigen des Noradrenalinbedarfs (HR: 2,884; 95 % CI: 1,156 – 7,195; p = 0,023), das Ansteigen des CRP-Wertes (HR: 1,453; 95 % CI: 0,970 – 2,177; p = 0,070), sowie das Abfallen des Quick- (HR: 0,520; 95 % CI: 0,283 – 0,953; p = 0,034) bzw. des pH-Wertes (HR:0,428; 95 % CI: 0,188 – 0,973; p = 0,043). Verglichen mit der Literatur [45], war eine Behandlung mit DrotAA bei Patienten mit einem Apache II-Score ≥ 25 mit einem reduzierten Mortalitätsrisiko assoziiert. Signifikant war diese Differenz bei Patienten mit einem Apache II-Score von 35 – 44. Bei keinem der 63 Patienten traten während der Gabe von DrotAA intrakranielle Blutungen oder Blutungen, die die Gabe von mehr als drei Blutkonserven notwendig machten, auf. Mit den Daten dieser hier vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass eine DrotAA-Behandlung bei Patienten mit septischen Schock und höchsten Mortalitätsrisiken mit einem besseren Outcome assoziiert ist, als es entsprechend des Apache II-Scores zu erwarten wäre.
Ein Schlüsselereignis, welches dem prognosebestimmenden Organversagen bei systemi-schen Entzündungsprozessen und Sepsis vorangeht, ist die Entwicklung einer mikrovas-kulären endothelialen Schrankenstörung. Das vaskuläre endotheliale (VE-) Cadherin als mechanischer Stabilisator der Endothelbarriere spielt dabei eine wichtige Rolle. In der Inflammation werden Spaltprodukte von VE-Cadherin (sVE-Cadherin) gebildet. Ge-genstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Hypothese ob diese Spalt-produkte selbst an der Störung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt sind.
Es wurde hierfür humanes sVE-Cadherin bestehend aus den extrazellulären Domänen EC1-5 (sVE-CadherinEC1-5) generiert. In Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstands (TER), mit Immunfluoreszenzfärbungen und Western Blot Analysen wird gezeigt, dass sVE-Cadherin dosisabhängig die Barriere Integrität in primären humanen dermalen Endothelzellen stört. Dies führt zu einer Reduktion von VE-Cadherin und den assoziierten Proteinen α-, γ- und δ-Catenin und ZO-1, die nach der Applikation von sVE-Cadherin an den Zellgrenzen reduziert sind. Die Interaktion zwischen VE-PTP und VE-Cadherin wird durch sVE-CadherinEC1-5 reduziert. Durch pharmakologische Hem-mung der Phosphataseaktivität von VE-PTP mittels AKB9778 wird der durch sVE-CadherinEC1-5-induzierte Verlust der Endothelbarriere aufgehoben. Dagegen zeigt die direkte Aktivierung von Tie-2 mittels Angiopoetin-1 keinen protektiven Effekt auf die durch sVE-CadherinEC1-5 gestörte Endothelbarriere. Weitere Analysen zeigen eine erhöh-te Expression von GEF-H1 durch sVE-CadherinEC1-5. Diese ist ebenfalls durch AKB9778 hemmbar.
Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wurden die Konstrukte EC1-4 und EC3-5 in ver-schiedene Vektoren kloniert, um zu bestimmen, ob die extrazelluläre Domäne 5 von VE-Cadherin die dominante Rolle bei den sVE-Cadherin-vermittelten Effekten spielt.
Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen zum ersten Mal, dass sVE-CadherinEC1-5 unabhängig von proinflammatorischen Auslösern über die Aktivierung des VE-PTP/RhoA-Signalweges den Zusammenbruch der Endothelbarriere mitversursacht. Dies stellt einen neuen pathophysiologischer Mechanismus dar, der zum Gesamtverständnis der entzündungsinduzierten Barriereveränderungen des Endothels beiträgt.
Eine intakte Endothelbarriere ist eine unabdingbare Voraussetzung für die uneingeschränkte Funktion sämtlicher Organe. Wird die Barrierefunktion durch entzündliche Prozesse gestört, so kommt es zum Austritt von Gefäßflüssigkeit ins Interstitium. Dies resultiert in Organversagen und ist Mitverursacher der hohen Sterblichkeit bei systemischen Entzündungsreaktionen und Sepsis. Vorangehende Untersuchungen haben bereits wichtige Mechanismen aufgedeckt, die zum Barriereverlust führen (Schlegel et al., 2009). In dieser Studie wurde untersucht, ob die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB für den LPS-induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere von Bedeutung ist. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Einwirkung von LPS in zwei verschiedenen Endothelzelllinien, den makrovaskulären PSEC sowie den mikrovaskulären HDMEC, zu einer signifikanten Aktivierung von NF ĸB führte. Dies wurde sowohl mittels Kernextraktionsversuchen als auch durch Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen. Messungen des TER zeigten eine Abnahme des endothelialen Widerstands und folglich der Barrierefunktion nach Applikation von LPS, gefolgt von einer spontanen Regeneration der Barriere nach einer Inkubationszeit von 24 h. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels durch Applikation von Forskolin/Rolipram verhinderte zwar die LPS induzierte Bildung interzellulärer Lücken, nicht jedoch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF ĸB. Vielmehr verstärkte eine cAMP Erhöhung sogar eine NF ĸB Aktivierung in HDMEC nach 4 h, ohne die Morphologie der Endothelzelljunktionen zu schädigen. Der selektive NF ĸB Inhibitor NBD Peptid vermochte im Gegensatz dazu die LPS induzierte NF ĸB Aktivierung deutlich zu hemmen, verhinderte allerdings weder die interzelluläre Lückenbildung noch den Abfall des TER durch LPS. Im Gegenteil – da unter Einwirkung von NBD Peptid die spontane Regeneration des TER nach LPS Applikation ausblieb, schienen barrierekompromittierende Effekte von LPS durch Hemmung der NF ĸB Aktivierung mittels NBD-Peptid sogar verstärkt zu werden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen hemmte auch die Repression von NF ĸB p65 durch eine spezifische p65 siRNA den LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere nicht. Weitere NF ĸB abhängige Proteine wie VASP und Caveolin 1, deren Beteiligung am Pathomechanismus von anderen Arbeitsgruppen vorgeschlagen wurde, blieben in unseren Experimenten unter LPS Exposition unverändert. Zusammenfassend scheint die NF ĸB Aktivierung initial nicht entscheidend am LPS induzierten Zusammenbruch der Endothelbarriere beteiligt zu sein. Unsere Ergebnisse legen vielmehr nahe, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors möglicherweise Teil eines „Rescue“ Mechanismus sein könnte.
Die Sepsis ist ein häufiges, komplexes Krankheitsbild und oft mit einer hohen Letalität verbunden. Um das Outcome der betroffenen Patienten zu verbessern, ist eine schnelle adäquate Therapie notwendig. Durch den schnellen Erregernachweis ist eine gezielte Antibiotikatherapie möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden 57 Patienten der IMPACT-Sepsis Studie, die bereits antibiotisch vorbehandelt waren, hinsichtlich der Erregerdiagnostik mit dem aktuellen Goldstandard, der Blutkulturdiagnostik, und der VYOO®-Multiplex-PCR untersucht.
Das Patientenkollektiv war epidemiologisch vergleichbar mit dem anderer Studien, nur lag der Anteil an immunsupprimierten Patienten höher, was a. e. auf das Patientenkollektiv einer Universitätsklinik zurückzuführen ist.
Insgesamt konnten bei den Patienten 21 Erreger diagnostiziert werden. 10 Erreger wurden nur in der VYOO®-Multiplex-PCR, nur 3 in der Blutkulturdiagnostik und 4 Erreger in beiden Methoden nachgewiesen. Dies entspricht einer Nachweisquote pro Patient von 21,4% für die VYOO®-Multiplex-PCR und 12,5% für die Blutkulturdiagnostik. Es zeigte sich somit eine tendenziell bessere Detektionsrate bei der VYOO®-Multiplex-PCR. Verglichen mit Blutkulturdiagnostik gab es jedoch keine statistisch signifikante Verbesserung der Erregerdiagnostik mit der VYOO®-Multiplex-PCR. Dies ist a.e. auf eine kleine Studiengröße zurückzuführen.
Wird die aktuelle Studienlage betrachtet, so bleibt die Blutkulturdiagnostik bei septischen Patienten weiterhin der Goldstandard, was sich auch in den aktuellen Leitlinien von 2016 widerspiegelt. Ob molekulardiagnostische Verfahren, wie die PCR, die Blutkulturdiagnostik ablösen oder routinemäßig ergänzen werden, müssen weitere Studien zeigen. Auch der gesundheits-ökonomische Nutzen durch Verkürzung der intensivmedizinischen Behandlung und Reduktion des Antibiotikaverbrauchs bedarf prospektiver Untersuchungen eines großen Patientenkollektivs.
In der Sepsis kommt es zu einer mikrovaskulären Schrankenstörung. Die genauen Mechanismen hierfür sind noch nicht bekannt. Im klinischen Alltag gibt es noch keine spezifische diagnostische Möglichkeit für den (frühen) Nachweis oder Therapie für die mikrovaskuläre Schrankenstörung. Ein wichtiger Bestandteil der endothelialen Barriere und deren Integrität ist das Adhärenskontaktprotein VE-Cadherin. Es wird vermutet, dass Shedding durch ADAM-10 eine wichtige Rolle bei der Permeabilitätssteigerung spielt.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es unter Inflammationsbedingungen erstens zu einem Zusammenbruch der Endothelbarriere kommt, zweitens, dass korrespondierend dazu vermehrt sVE-Cadherin im Überstand nachweisbar ist und drittens, dass eine Stabilisierung der Endothelbarriere und Reduktion von sVE-Cadherin sowohl durch einen PDE-4 Inhibitor, als auch durch spezifische ADAM-10 Inhibition möglich ist. Erstmalig konnte dargestellt werden, dass der ADAM-10-Inhibitor GI254023X zu einer wirksamen Barrierestabilisierung und verringerten sVE-Cadherin-Werten führt. Dies lässt darauf schließen, dass Shedding eine Rolle beim Zusammenbruch der Endothelbarriere spielt. Möglicherweise ist sVE-Cadherin selbst ein Faktor, der zum Zusammenbruch der Endothelbarriere führt.
Auch bei Sepsispatienten mit schwerer mikrosvaskulärer Schrankenstörung konnten erhöhte sVE-Cadherin-Werte im Serum nachgewiesen werden.
Zusammenfassend kann daher die Vermutung aufgestellt werden, dass die Bildung von sVE-cadherin bei der Entzündung eine wichtige Rolle sowohl für die Detektion, als auch bei der Induktion der mikrovaskulären Schrankenstörung spielt. Der Nachweis von sVE-cadherin bei Sepsispatienten könnte als geeigneter Biomarker für den Nachweis einer mikrovaskulären Schrankenstörung in der klinischen Anwendung eine Bedeutung erhalten.
The enteric nervous system (ENS) innervates the gastrointestinal (GI) tract and controls central aspects of GI physiology including contractility of the intestinal musculature, glandular secretion and intestinal blood flow. The ENS is composed of neurons that conduct electrical signals and of enteric glial cells (EGCs). EGCs resemble central nervous system (CNS) astrocytes in their morphology and in the expression of shared markers such as the intermediate filament protein glial fibrillary acidic protein (GFAP). They are strategically located at the interface of ENS neurons and their effector cells to modulate intestinal motility, epithelial barrier stability and inflammatory processes. The specific contributions of EGCs to the maintenance of intestinal homeostasis are subject of current research.
From a clinical point of view EGC involvement in pathophysiological processes such as intestinal inflammation is highly relevant. Like CNS astrocytes ECGs can acquire a reactive, tissue-protective phenotype in response to intestinal injury. In patients with chronic inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease and ulcerative colitis, alterations in the EGC network are well known, particularly a differential expression of GFAP, which is a hallmark of reactive gliosis in the CNS.
With increasing recognition of the role of EGCs in intestinal health and disease comes the need to study the glial population in its complexity. The overall aim of this thesis was to comprehensively study EGCs with focus on the reactive GFAP-expressing subpopulation under inflammatory conditions in vivo and in vitro. In a first step, a novel in vivo rat model of acute systemic inflammation mimicking sepsis was employed to investigate rapidly occuring responses of EGCs to inflammation. This study revealed that within a short time frame of a few hours, EGCs responded to the inflammation with an upregulation of Gfap gene expression. This inflammation-induced upregulation was confined to the myenteric plexus and varied in intensity along the intestinal rostro-caudal axis. This highly responsive myenteric GFAP-expressing EGC population was further characterized in vivo andin vitro using a transgenic mouse model (hGFAP-eGFP mice). Primary purified murine GFAP-EGC cultures in vitro were established and it was assessed how the transcriptomic and proteomic profiles of these cells change upon inflammatory stimulation. Here, myenteric GFAP-EGCs were found to undergo a shift in gene expression profile that predominantly affects expression of genes associated with inflammatory responses. Further, a secretion of inflammatory mediators was validated on protein level. The GFAP+ subpopulation is hence an active participant in inflammatory pathophysiology. In an acute murine IBD model in vivo, GFAP-EGCs were found to express components of the major histocompatibility complex (MHC) class II in inflamed tissue, which also indicates a crosstalk of EGCs with the innate and the adaptive lamina propria immune system in acute inflammation.
Taken together, this work advances our knowledge on EGC (patho-)physiology by identifying and characterizing an EGC subpopulation rapidly responsive to inflammation. This study further provides the transcriptomic profile of this population in vivo and in vitro, which can be used to identify targets for therapeutic intervention. Due to the modulating influence of EGCs on the intestinal microenvironment, the study further underlines the importance of integrating EGCs into in vitro test systems that aim to model intestinal tissues in vitro and presents an outlook on a potential strategy.
Die Stressantwort der hormonellen Nebennierenrindenaktivität auf ACTH-Stimulation und in der Sepsis
(2010)
Das Steroidhormon Dehydroepiandrosteron (DHEA) und die sulfatierte Form Dehydroepiandrosteron-Sulfat (DHEAS) werden hauptsächlich in der Nebennierenrinde produziert und sind quantitativ das Hauptprodukt der Steroidsynthese der menschlichen Nebennierenrinde. Nur DHEA kann weiter verstoffwechselt werden und ist ein wichtiger Ausgangstoff sowohl für die weibliche wie die männliche Geschlechtshormonsynthese. Bei Patienten mit Sepsis wurde ein Abfall der DHEAS-Serumkonzentration nachgewiesen. Da bisher eine kontinuierliche Interkonversion zwischen DHEA und DHEAS angenommen wurde, schloss man aus diesem Befund auch auf eine niedrige DHEA-Konzentration. Neuere Erkenntnisse – unter anderem begründet durch eine Studie von Hammer et al.(5) – widerlegen jedoch die Hypothese der kontinuierlichen Interkonversion. Um den Einfluss der Sepsis auf die DHEA-Konzentration zu bestimmen, wurden für die Studie ACTH-Tests bei drei verschiedenen Kohorten durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie weichen ab von der früheren Annahme eines DHEA-Mangels bei Patienten mit Sepsis und zeigen eine Differenz zwischen DHEA- und DHEAS-Konzentration im Sinne einer signifikant erhöhten DHEA-Konzentration und einer erniedrigten DHEAS-Konzentration. Die erhöhte DHEA-Konzentration konnte nicht für Patienten mit akuter Hüftfraktur nachgewiesen werden, sodass die Hochregulation von DHEA wahrscheinlich eine entzündugsspezifische Reaktion ist. Da die Werte für DHEAS bei der Sepsiskohorte im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant niedriger sind, könnte eine verminderte Aktivität bzw. Produktion der DHEA-Sulphotransferase der Grund für die erhöhte DHEA-Konzentration sein. Daraus folgt, dass DHEAS keinen verlässlicher Marker für die adrenale Androgenproduktion – insbesondere in pathologischen Situationen wie der Sepsis – darstellt, da die vorliegende Arbeit kein kontinuierliches Gleichgewicht von DHEA- und DHEAS-Konzentration ergab. Möglicherweise ist die erhöhte Serumkonzentration von DHEA als gegenregulatorischer Mechanismus zu verstehen, um das Gleichgewicht zwischen Cortisol- und DHEA-vermittelten Wirkungen aufrecht zu erhalten. Jedoch kann sich dieser Mechanismus erschöpfen, wie es der Verlauf bei schwerst betroffenen Patienten vermuten lässt.
Background: Septic acute liver and intestinal failure is associated with a high mortality. We therefore investigated the influence of volume resuscitation with different crystalloid or colloid solutions on liver and intestine injury and microcirculation in septic rodents. Methods: Sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP) in 77 male rats. Animals were treated with different crystalloids (NaCl 0.9% (NaCl), Ringer’s acetate (RA)) or colloids (Gelafundin 4% (Gel), 6% HES 130/0.4 (HES)). After 24 h animals were re-anesthetized and intestinal (n = 6/group) and liver microcirculation (n = 6/group) were obtained using intravital microscopy, as well as macrohemodynamic parameters were measured. Blood assays and organs were harvested to determine organ function and injury. Results: HES improved liver microcirculation, cardiac index and DO2-I, but significantly increased IL-1β, IL-6 and TNF-α levels and resulted in a mortality rate of 33%. Gel infused animals revealed significant reduction of liver and intestine microcirculation with severe side effects on coagulation (significantly increased PTT and INR, decreased haemoglobin and platelet count). Furthermore Gel showed severe hypoglycemia, acidosis and significantly increased ALT and IL-6 with a lethality of 29%. RA exhibited no derangements in liver microcirculation when compared to sham and HES. RA showed no intestinal microcirculation disturbance compared to sham, but significantly improved the number of intestinal capillaries with flow compared to HES. All RA treated animals survided and showed no severe side effects on coagulation, liver, macrohemodynamic or metabolic state. Conclusions: Gelatine 4% revealed devastated hepatic and intestinal microcirculation and severe side effects in CLP induced septic rats, whereas the balanced crystalloid solution showed stabilization of macro- and microhemodynamics with improved survival. HES improved liver microcirculation, but exhibited significantly increased pro-inflammatory cytokine levels. Crystalloid infusion revealed best results in mortality and microcirculation, when compared with colloid infusion.
Es handelt sich um eine experimentelle Arbeit zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Volumensubstitutionslösungen auf die Integrität der Leber in der CLP-induzierten Sepsis der Ratte. 40 Ratten wurden in 5 Grp. eingeteilt, anästhesiert und median laparotomiert. Während das Coecum der Sham-Tiere im ursprünglichen Zustand verblieb, erhielten alle anderen Tiere eine CLP. Die Tiere wurden im Anschluss entpsprechend ihrer Gruppe entweder nur mit dem Grundbedarf an NaCl (Sham) oder mit dem Grundbedarf an NaCl und dem jeweiligen Substitutionsmittel NaCl , SteroIso, Gelafundin, 6%HES 130/0,4 infundiert. Der Versuch lief über 24 h. Danach wurde die Tiere reanästhesiert, laparotomiert und eine in-vivo-Mikroskopie der Leber durchgeführt. Im Anschluss wurden sowohl hämodynamische Werte, Serumparameter und Zytokinwerte als auch histopathologische Daten ermittelt.
Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen.
Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation.
Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden.
Sepsis ist eine dysregulierte Reaktion des Organismus auf eine Infektion. Bei Sepsis werden oft Blutungs- und Thromboseereignisse beobachtet, welche in einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung (DIG) gipfeln können. Thrombozyten sind die Schlüsselzellen von Thrombose und Hämostase. Bei Sepsis und DIG kommt es häufig zu einem Abfall der Thrombozytenzahl, doch Blutungs- und Thromboseereignisse können unabhängig von der Thrombozytenzahl auftreten, was zusätzlich eine Veränderung der Thrombozytenfunktion nahelegt.
In dieser Arbeit wurde deshalb die Thrombozytenfunktion bei 15 Patienten mit Sepsis zu drei Zeitpunkten im Krankheitsverlauf untersucht. Es konnte bei unauffälliger Rezeptorexpression keine Voraktivierung der Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie festgestellt werden. Jedoch war die Aktivierung nach Stimulation mit multiplen Agonisten signifikant reduziert. Besonders ausgeprägt war die Hyporeaktivität bei Stimulation des Kollagen-Rezeptors GPVI mit dem Agonisten CRP-XL. Es wurde gezeigt, dass nach GPVI-Stimulation eine reduzierte Phosphorylierung der nachgeschalteten Proteine Syk und LAT im Vergleich zum Gesundspender induziert wird. In Kreuzinkubationsexperimenten hatte die (Co )Inkubation von Thrombozyten in Plasma von Sepsispatienten oder mit Bakterienisolaten aus Sepsis-Blutkulturen keinen Effekt auf die Thrombozytenreaktivität. Allerdings konnte durch Sepsis-Vollblut eine signifikante GPVI-Hyporeaktivität in Thrombozyten von gesunden Probanden induziert werden, was einen zellulären Mediator als Ursache des Defekts nahelegt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass insbesondere die GPVI-Signalkaskade bei Sepsis massiv beeinträchtigt ist. Der Immunorezeptor GPVI ist ein vielversprechendes Zielmolekül, um die Pathogenese der Sepsis, des Capillary Leak und die immunregulatorische Rolle von Thrombozyten besser zu verstehen. Die GPVI-Hyporeaktivität könnte als zukünftiger Biomarker für die Sepsis-Frühdiagnose genutzt werden.
Bei hohen Inzidenz- und Sterblichkeitsraten ist die Sepsis eine ernstzunehmende Erkrankung mit zugleich ernormer volkswirtschaftlicher Relevanz. Anhand der Vorstellung der Ergebnisse einer Teilnahme an einer europäischen Querschnittstudie zur Sepsis-Epidemiolgie, die 2002 von der ESICM initiiert wurde und an der Intensivstationen ganz Europas teilnahmen, darunter auch die ITS der Chirurgischen Universitätsklinik Würzburg, sollen Schwierigkeiten bei der Erfassung dieses Krankheitsbildes aufgezeigt werden. Es wird die Entwicklung in der Definition des Sepsis-Begriffes diskutiert. Ferner wird das Augenmerk auf die verschiedenen, durch die Sepsis verursachten und dem öffentlichen Gesundheitswesen entstehenden Kosten gelegt und diese werden ihrer Gewichtung nach aufgeführt.