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Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte.
IRAK2 besitzt eine Schlüsselrolle im Signalweg des TLR4. Fehlregulationen dieses Signalwegs führen zu fehlgeleiteten Immunreaktionen, die auch die Entstehung und Progression von Krebserkrankungen fördern. Bevor IRAK2 als therapeutisches Ziel in Frage kommen kann, muss erst noch weitere Klarheit über die grundsätzliche Funktionsweise dieses Proteins bestehen. So ist für IRAK2 aufgrund der Substitution einer Aminosäure in der Kinase-Domäne im Vergleich zu IRAK1 noch nicht abschließend geklärt, ob es sich um eine aktive Kinase oder eine Pseudokinase handelt und ob diese Veränderung eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Funktion im TLR4-Signalweg nach sich zieht.
Um diese Fragen anzugehen, wurde in dieser Arbeit Asparagin im vermeintlich aktiven Zentrum (Aminosäure 333) wieder zur Asparaginsäure [N333D] revertiert und damit versucht die Phosphorylierungsaktivität zu steigern bzw. vergleichbar zu IRAK1 wiederherzustellen. Das Einbringen der Mutation in IRAK2 erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Mit dieser und anderen Mutanten und mit wildtypischem IRAK2 wurden durch die CRISPR/Cas9-Methode generierte IRAK2-defiziente 264.7 Makrophagen rekonstituiert und damit ein System etabliert, mit dem der Einfluss der Mutation auf den Signalweg des TLR4 nach Stimulation mit LPS quantitativ analysiert werden konnte. Sowohl die indirekte NF-κB-Messung über CD40-Expression als auch die direkte NF-κB-Messung über die NF-κB-getriebene Expression eines Reportergens (cyan fluorescent protein) ergab, dass IRAK2[N333D] die LPS-abhängige NF-κB-Aktivierung über den TLR4 Signalweg schlechter ermöglicht als IRAK2.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die in der Entwicklungsgeschichte aufgetretene Veränderung des aktiven Zentrums von IRAK2 im Vergleich zu IRAK1 zu einer besseren Aktivierung der MyD88-abhängigen NF-κB-Aktivität führte und somit eine erhöhte und länger anhaltende Signalleitung ermöglichte. Diese Erkenntnis kann als weiterer Schritt hin zu einem besseren Verständnis der Funktion des IRAK2-Proteins und zu einer möglichen zukünftigen Verwendung von IRAK2 als Ziel therapeutischer Behandlungen gesehen werden.