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Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. Ätiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich während des Krankheitsverlaufes eine ausgeprägte Immunantwort des natürlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt führt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiemöglichkeit diesbezüglich könnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen für einen möglichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgewählt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgewählt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden für weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgewählten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine äußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und führten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die Fähigkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung“ stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.
Semaphorin receptors in the immunological synapse: regulation and measles virus-driven modulation
(2010)
Measles virus (MV) infection causes approximately 164,000 deaths per year worldwide (WHO, 2008). The main cause of death is MV-induced immunosuppression but the underlying mechanisms are not fully understood. It has been suggested that MV renders T cells dysfunctional by disrupting the integrity of actin dynamics while MV infection of dendritic cells results in their inability to sustain T cell activation. During neuronal development, semaphorins (SEMAs), especially SEMA3A, induce a collapse of growing dendrites via the binding to plexin-A1 (plexA1) and its coreceptor neuropilin-1 (NP-1). The collapse results from a disruption of actin dynamics. In this study, the roles of these three molecules were investigated in human immune cells and their possible role in MV induced immunosuppression. The present data have shown that plexA1 is an important component of human immunological synapse (IS). It translocated transiently to the surface of T cells after CD3/28 ligation and accumulated at the stimulatory interface between T cells and DCs (or CD3/28 coated beads). When plexA1 expression was inhibited (RNAi) or its function was disrupted (exogenous blocking or dominant negative expression), T cell expansion was reduced. Upon MV exposure, translocation of plexA1 and NP-1, another important component of IS, towards the stimulatory interface in T cells was abrogated. Moreover, MV infection interfered with plexA1/NP-1 turnover in maturing DCs and promoted early and substantial release of SEMA3A from these cells, particularly in the presence of allogenic T cells. As revealed by scanning electron microscopy, the release of SEMA3A caused a transient loss of actin-based protrusions on T cells. SEMA3A affected chemotactic migration of T cells and DCs, and reduced formation of allogenic DC/T cell conjugates. In conclusion, MV targeted SEMA receptor function both by disrupting their recruitment to the IS and by promoting a premature release of their repulsive ligand, SEMA3A. Both of which could contribute to MV-induced immunosuppression.
Trotz der Existenz einer Lebendvakzine gegen Masernvirusinfektionen erkranken jährlich 30-40 Millionen Menschen an Masern und mehr als 1 Million versterben daran. Besonders Kleinkinder besitzen innerhalb des ersten Lebensjahres ein hohes Risiko an Masern zu erkranken und der Anteil an schweren Krankheitsverläufen mit letalem Ausgang ist in dieser Altersgruppe besonders hoch. Aus diesem Grund wäre es sehr wichtig, wenn man Säuglinge bereits in den ersten Lebensmonaten erfolgreich immunisieren könnte. Da eine Immunisierung mit dem derzeitigen MV-Impfstoff in den ersten Lebensmonaten durch maternale MV-spezifische Antikörper inhibiert wird, hat die WHO dazu aufgerufen neuartige Impfstoffe zu entwickeln, die in Gegenwart maternaler Antikörper effektiv sind. Zur Entwicklung und Erprobung von alternativen Impfstoffen in Gegenwart maternaler Antikörper konnte bislang nur das Affenmodell benutzt werden, welches durch das geringe Angebot an Tieren und aus praktischen Gründen nur beschränkt einsetzbar ist. In der hier vorgestellten Dissertation wurde gezeigt, daß Baumwollratten (Sigmodon hispidus) alternativ zum Affen ein hervorragendes Tiermodell sind, um die Immunogenität potentieller Impfstoffvektoren und ihre Effektivität in Gegenwart maternaler Antikörper zu testen. Baumwollratten sind das einzige Nagetiermodell, in dem das Masernvirus wie beim Menschen im Respirationstrakt replizieren und auch in der Peripherie nachgewiesen werden kann. Nach Immunisierung mit MV-Impfstämmen entwickeln Baumwollratten wie der Mensch eine MV-spezifische Immunantwort und sind gegen eine anschließende Infektion mit MV-Wildtypstämmen geschützt. Um zu überprüfen, ob maternale Antikörper wie bei Säuglingen auch bei Baumwollratten die Vakzine-induzierte Serokonversion inhibieren, wurden zwei Modellsysteme für maternale Antikörper entwickelt. MV-immune Weibchen übertragen MV-spezifische maternale Antikörper auf ihre Jungtiere und stellen ein Modell für natürliche maternale Antikörper dar. Im zweiten Modell können nach Injektion eines humanen MV-spezifischen Serums in Baumwollratten maternale Antikörper simuliert werden. Die Vakzine-induzierte Serokonversion wurde sowohl durch natürliche maternale Antikörper, als auch durch passiv transferierte humane MV-spezifische Antikörper inhibiert. Die Verwendung eines heterologen Serums als Modell für maternale Antikörper bietet drei Vorteile: die Gabe von Humanserum ist gut reproduzierbar, humane MV-spezifische Antikörper werden schneller abgebaut, als natürliche maternale Antikörper und passiv transferierte (“maternale”) Antikörper können im ELISA von aktiv induzierten Antikörpern unterschieden werden. Mit Hilfe der DNS-Immunisierung konnte gezeigt werden, daß das MV-Hämagglutinin, das Fusionsprotein und das Nukleokapsidprotein (MV-Hauptantigene) in der Baumwollratte MV-spezifische Antikörper und eine MV-spezifische T-Zellantwort induzieren. Aber nur die beiden Glykoproteine F und H konnten im Gegensatz zum Nukleokapsidprotein MV-neutralisierende Antikörper induzieren und gegen eine Infektion des Respirationstraktes schützen. In Gegenwart maternaler Antikörper führte diese Form der Immunisierung nicht zu einer Vakzine-induzierten Serokonversion und zu Protektion. Um in Gegenwart maternaler Antikörper MV-neutralisierende Antikörper und Schutz gegen eine Infektion mit MV zu induzieren, wurde ein rekombinantes vesikuläres Stomatitis Virus (VSV-H) verwendet, welches das MV-Hämagglutinin (Hauptantigen für MV-neutralisierende Antikörper) in der Hülle von VSV exprimierte. Eine alternative MV-Vakzine muß die beiden MV-Glykoproteine (Hämagglutinin- und Fusionsprotein) enthalten, da sie sonst die atypischen Masern (eine schwere Verlaufsform der akuten Masern) in immunisierten Individuen nach Infektion mit dem Wildtypvirus induzieren kann. Da VSV das Fusionsprotein nicht stabil exprimiert, kann VSV nicht als Impfvektor bei Patienten eingesetzt werden. Im Baumwollrattensystem ließen sich mit diesem Vektorsystem jedoch wichtige Untersuchungen zur Immunisierung in Gegenwart maternaler Antikörper duchführen. Das MV-Hämagglutinin ist als zusätzliches Protein ("passenger protein") in die Hüllmembran von VSV inkorporiert und hat keine funktionelle Bedeutung für die virale Replikation. In vitro konnte gezeigt werden, daß VSV-H im Gegensatz zu MV durch MV-spezifische Antikörper nicht neutralisiert werden kann. Eine Immunisierung mit VSV-H induzierte sehr schnell hohe Titer an MV-neutralisierenden Antikörpern, die höher waren als nach Immunisierung mit MV. In vivo konnte bestätigt werden, das VSV-H durch maternale Antikörper nicht neutralisiert wird und auch in Gegenwart maternaler Antikörper MV-neutralisierende Antikörper und Schutz gegen eine respiratorische MV-Infektion induziert. Hierbei ist die Stimulation des mukosalen Immunsystems sehr wichtig, da VSV-H nur nach intranasaler und nicht nach intraperitonealer Immunisierung maternale Antikörper umgehen kann. Die Replikationsfähigkeit von VSV-H ist ebenfalls essentiell, da Immunisierungsversuche mit UV-inaktiviertem VSV-H bzw. mit VSV-H Deletionsmutanten, die eine stark verminderte Replikationsfähigkeit aufweisen, nicht zu Vakzine-induzierter Serokonversion und zu Schutz in Gegenwart maternaler Antikörper führten. An alternative Vektorsysteme muß deshalb die Forderung gestellt werden, daß sie das Schleimhaut-assoziierte Immunsystem stimulieren, Masernvirusproteine als akzessorische Proteine exprimieren und eine gewisse Restvirulenz aufweisen. Für die Untersuchung derartiger Vakzine-Kandidaten auf die Induktion der Serokonversion in Gegenwart maternaler Antikörper und Schutz gegen MV Infektion ist das Baumwollrattenmodell hervorragend geeignet.
Die Matrix-Proteine von Vertretern der Ordnung Mononegavirales sind essentiell für späte Schritte im viralen Lebenszyklus, insbesondere der Knospung und Partikelmorphogenese. Die Abschnürung und Freisetzung umhüllter RNA-Viren ist dabei abhängig von dem Transport des viralen Matrix-Proteins und seiner Interaktion mit Wirtsproteinen wie dem ESCRT-System (endosomal sorting complex required for transport), welches in die Sortierung zellulärer Proteine involviert ist. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein einerseits mit dem viralen Nukleoproteinkomplex und andererseits mit den viralen Glykoproteinen an der Oberfläche. Die Bedeutung des MV-M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang kaum untersucht. Bisher ist nur bekannt, dass das M-Protein oligomerisiert, teilweise monoubiquitiniert vorliegt und in Zellen, wenn alleine exprimiert, die Produktion von Virus-like-particle (VLP) vermittelt (Pohl et al., 2007). In dieser Studie wird gezeigt, dass das MV-M-Protein ähnlich wie das VP40-Protein des Ebolavirus (EBOV) mit Lipid Rafts und TEMs (tetraspanin enriched microdomain) assoziiert ist, wobei aber das M-Protein weniger effizient an der Plasmamembran akkumuliert. Beide Proteine unterscheiden sich nicht wesentlich in ihrer Assoziation mit Kompartimentmarkern. Interessant ist jedoch, dass das VP40-Protein und das M-Protein an der Plasmamembran mit dem Adaptor Protein-3 (AP-3) kolokalisieren. Die Kolokalisation des M-Proteins mit AP-3 wird aber nur in infizierten Zellen und nicht in Zellen, in denen das M-Protein allein exprimiert wird, beobachtet. Im Gegensatz zum VP40-Protein, welches die ESCRT-Komponenten über seine N-terminale L-Domäne rekrutiert und diese für die Partikelproduktion benutzt, geschieht dies beim M-Protein ESCRT-unabhängig, da die Mutation der Motive, die Ähnlichkeiten zu den bekannten L-Domänen zeigen, keine Auswirkungen auf die VLP-Produktion haben. Zudem rekrutierte das M-Protein weder Tsg101, Aip-1 oder Vps4 an die Plasmamembran, noch wird die VLP- oder die Virusproduktion durch dominant negatives Vps4 inhibiert. Der Transfer der VP40 L-Domäne in das MV-M-Protein hatte weder einen Einfluss auf die Assoziation mit Tetraspaninen noch auf die ESCRT-Abhängigkeit der VLP-Produktion. Damit wurde gezeigt, dass die VLP-Freisetzung des MV-M-Proteins ESCRT-unabhängig ist. Die Freisetzung erfolgt beim MV durch einen grundsätzlich anderen Weg, der noch untersucht werden muss.
Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2).
In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren.
Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen.
In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist.
Im Gegensatz zu genetisch modifizierten Viren ermöglicht der Einsatz von siRNA zur RNA Interferenz (RNAi) die post-transkriptionelle Inhibition der Gen-Expression zur Analyse von Infektionen mit völlig identischen Viren. Mittels RNase-III hergestellter siRNA wurde die Expression der sechs Masernvirus Gene unterbunden. Ist die siRNA gegen das Nukleokapsid (N)-, das Phospho (P)- oder gegen das Large (L)- Protein gerichtet, kommt es zur effektiven Einschränkung der Replikation und der generellen Gen-Expression. Diese drei Proteine sind für Transkription und Replikation essentiell, da die Genprodukte dieser drei Proteine die RNA-abhängige RNA Polymerase und den Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bilden. SiRNA gegen das Fusionsprotein (F) und das Hämagglutinin (H) schränken das Ausmaß der Zell-Zell Fusion ein. Interessanterweise führt die Inhibition der Expression des Matrix-Proteins (M) nicht nur zu einer Verstärkung der fusogenen Aktivität, sondern erhöht gleichzeitig die Expression der übrigen viralen mRNA und genomischer RNA um den Faktor 2-2,5, so dass das Verhältnis mRNA:Genom konstant bleibt. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass M als negativer Regulator der viralen Polymeraseaktivität wirkt, und sowohl die Produktion von mRNA wie auch die Genom- Replikation in gleichem Maß beeinflusst. Anschließend wurden synthetische siRNAs gegen die L-mRNA gesucht. Effektive Sequenzen wurden dann, in Form einer shRNA Expressionskassette, in einen lentiviralen Vektor einkloniert. Damit sollen dann lentivirale Partikel hergestellt werden, mit denen Zellen infiziert werden können, so dass diese Zellen dann stabil siRNA exprimieren. Dieser Teil der Arbeit war zum Zeitpunkt der Niederschrift noch nicht beendet.
Zu den gefährlichen Komplikationen der Masern gehört die selten vorkommende ZNS-Erkrankung subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE), die erst mehrere Jahre nach einer akuten Masernvirusinfektion auftritt. Die SSPE verläuft immer tödlich und bis heute gibt es keine spezifische Therapie gegen diese Erkrankung. Unsere Arbeitsgruppe hat ein Modell für eine persistierende, virale ZNS-Infektion entwickelt, in dem 2-Wochen-alte, immunologisch normale C57BL/6-Mäuse mit einem rekombinanten, neurotropen Masernvirus (MV), das das Hämagglutinin eines an Nagern angepassten MV-Stammes enthält, intrazerebral (i.c.) infiziert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle regulatorischer CD4+ CD25+ Foxp3+ T-Zellen (Treg) in diesem Mausmodell analysiert und untersucht, ob die persistierende ZNS-Infektion durch Manipulation peripherer Treg beeinflusst werden kann. Außerdem wurde ein IFN-y-ELISPOT-Assay etabliert, der CD8+ zytotoxische T-Zellen (CTL) identifiziert, die spezifisch für die MV-Hämagglutinin-Epitope MV-H22-30 (RIVINREHL) bzw. MVH446-454 (SNHNNVYWL) sind. In Bezug auf das erstgenannte Epitop wurde desweiteren eine Pentamer-Färbung etabliert, um CTLs mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu identifizieren, die H-2Db-gekoppelte MV-H22-30-Epitope erkennen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass sich trotz eines hohen Anteils Masern-spezifischer CTLs und nur sehr wenigen Treg im Gehirn eine persistierende ZNSInfektion ausbildet. Periphere Treg wurden während der persistierenden Phase der ZNS-Infektion expandiert bzw. depletiert und die Konsequenzen für die Virus-spezifische Immunantwort sowie das Ausmaß der persistierenden Infektion wurden analysiert. Die Expansion von Treg mit Hilfe des superagonistischen anti-Maus CD28 Antikörpers D665 verursachte eine transiente Immunsuppression, die die Virus-Replikation sowie -Ausbreitung im Gehirn verstärkte. Im Gegensatz dazu führte die Depletion von Treg in DEREG-Mäusen mittels Diphtherietoxin zu einem erhöhten Anteil Virus-spezifischer CTLs im Gehirn sowie zu einer Reduktion der persistierenden ZNS-Infektion. Diese Daten zeigen, dass Treg die Fähigkeit besitzen, die Persistenz von MV im Gehirn zu kontrollieren und somit möglicherweise Teil eines Therapiekonzeptes gegen ZNS-Infektionen mit dem Masernvirus sein können. Frühere Studien unserer Arbeitsgruppe haben außerdem gezeigt, dass das durch IFN-y induzierbare Enzym Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) antivirale Aktivitäten gegen MV aufweist. Dies wurde in dieser Doktorarbeit in vivo in unserem Mausmodell anhand von IDOk.o.-Tieren bestätigt, die nach i.c. Infektion nicht nur eine erhöhte Mortalitätsrate aufwiesen sondern auch in den überlebenden Tieren eine verstärkte persistierende ZNS-Infektion zeigten.
Dendritische Zellen (DCs) sind als Zielzellen des MV für dessen Pathogenese von zentraler Bedeutung und fördern sowohl Dissemination und Transmission des Virus. Auf zellulärer Ebene findet sich eine Modulation des Sphingolipidmetabolismus in MV-infizierten DC-Kulturen. S1P selbst ist ein bioaktives Sphingolipid, das über auto- und parakrine S1P-Rezeptorstimulation Funktion, Migration und Positionierung von Immunzellen, aber auch als intrazellulärer Botenstoff Calcium-Haushalt, Apoptose und Proliferation reguliert. Über die an der Vermittlung der intrazellulären S1P-Effekte beteiligten Strukturen ist bisher weniger bekannt und der S1P-Metabolismus einzelner Zellen trotz Kompartiment-abhängiger Schwankungen der S1P-Konzentrationen kaum adressiert. Für murine DCs konnte eine kontinuierliche S1P-Produktion und Sekretion nachgewiesen werden. Ob dies auch auf humane DCs zutrifft und pathophysiologisch im Rahmen einer MV-Infektion moduliert wird, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen S1Ps sowie dessen Metabolismus in humanen DCs quantitativ erfasst, und der Einfluss inflammatorischer, bakterieller und viraler (MV) Stimuli einbezogen. In Anbetracht der bekannten chemoattraktiven Potenz wurde nachfolgend der Beitrag S1Ps für die DC-induzierte T-Zellmigration untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass beide SphK Isoenzyme und auch die irreversibel degradierende SPL in humanen unreifen DCs (iDCs) auf mRNA-Ebene exprimiert werden. S1P konnte intrazellulär nachgewiesen werden, eine mit Erythroyzten vergleichbare Speicherkapazität ist nicht anzunehmen. Unter bakteriell oder inflammatorisch vermittelter Ausreifung (mDCs) wurde eine Reduktion des S1P Gehalts in DCs beobachtet. Abweichend davon behielten insbesondere stark MV infizierte DC-Kulturen die hohen S1P-Spiegel unreifer DCs bei, was möglicherweise neben der modulierten Chemokinsynthese und Oberflächenexpression ko-stimulatorischer Moleküle einen weiteren Parameter ihrer inkompletten Reifung nach MV Infektion reflektiert. Da die Veränderungen zwischen MV-infizierten DCs und mDCs nur für S1P, nicht aber für andere Sphingolipidmetaboliten messbar waren, liegt ihnen wohl eine Regulation der Sphingosinkinasen oder S1P degradierender Enzyme zugrunde. Bei unveränderter Akkumulation der hierfür spezifischen mRNAs müsste dies auf Ebene der Translation, Stabilität oder Aktivität der Enzyme beruhen.
Die indirekte Messung des extrazellulären S1Ps anhand der gegenläufigen S1P1-Dichte ließ vermuten, dass in DCs synthetisiertes S1P extrazellulär wirken konnte. Es kann dabei autokrin auf DCs wirken, beispielsweise deren Motilität oder Genexpression regulieren, ist aber auch Voraussetzung zum Aufbau eines S1P-Gradienten und damit parakriner Regulation lymphozytärer Migrationsvorgänge. Einen Beitrag S1Ps zur mDCs-induzierten T Zellchemotaxis konnte durch die erhobenen Daten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Bezüglich der durch iDCs oder MV infizierte DCs induzierten T Zellchemotaxis konnte aufgrund experimenteller Limitationen keine abschließende Aussage zur Beteiligung S1Ps getroffen werden. Die T-Zellmigration auf DCs erwies sich im 2 D-System als gerichtete Bewegung. Weder Ausreifung noch MV-Infektion der DCs hatten Auswirkungen auf die Quantität der T-Zellmigration. Differentielle Expressionsmuster von Chemokinen in iDCs, mDCs und MV infizierten DCs sind jedoch bekannt und legen Variationen der Subset-Komposition innerhalb der migrierenden T Zellen nahe. Diese sollten gezielt in nachfolgenden Arbeiten untersucht werden.
Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit eine kontinuierliche Synthese S1Ps in DCs mit Stimulus-abhängiger Fluktuation nach. Eine MV Infektion löst dabei einen zu inflammatorischen und bakteriellen Stimuli divergenten Effekt auf den S1P-Gehalt aus mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen. Eine Modulation der T Zellchemotaxis und damit der DC-T-Zell-Interaktion wäre im Rahmen inflammatorischer, bakterieller oder viraler Szenarien denkbar. Unter inflammatorischen und bakteriellen Bedingungen trug S1P jedoch nicht zur T-Zellchemotaxis bei, für MV blieb dies unklar. Dahingegen zeigten weitere Experimente der Arbeitsgruppe einen autokrin vermittelten Beitrag des intrazellulär produzierten S1Ps zur Migration MV-infizierter DCs im respiratorischen Epithel und identifizierten damit einen bisher unbekannten Einflussfaktor einer erfolgreichen MV-Transmission.
Die Infektion mit MV Wildtypvirus führt zu einer starken Immunsuppression und Sekundärinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Bestätigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfstämmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypstämmen (Bilthoven, ICB) und Impfstämmen gefunden. Eine Ursache für den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfstämmen könnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfstämme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfstämme wurden ursprünglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Phänomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Phänotyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfstämme, welche das Oberflächenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die Rückmutation in dem WTF H-Protein an der Aminosäure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) veränderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Phänotyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminosäureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 ausübt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen rückisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Ausprägung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgelöst. Erklären läßt sich das möglicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdrückung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfstämmen mit den Befunden in der Baumwollratte übereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdrückung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte könnte die Hypothese unterstützen, dass die Immunsuppression während der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort begünstig wird.
Das Masernvirus (MV) gehört zu den negativ-strängigen RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae und verursacht beim Menschen akute und subakute Enzephalitiden. Es wurde beschrieben, dass sich MV-RNA in den Endothelzellen von SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis)-Gehirnen nachweisen lässt (Cosby & Brankin, 1995). In dieser Arbeit konnte ich eine CD46- und CD150-unabhängige Infektion von Endothelzellen durch Wildtyp-MV nachweisen. Ferner wurde beschrieben, dass das Typ II-Interferon (IFN-g) im Serum von Patienten mit akuten Masern und nach einer Masernimpfung erhöht ist (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) und dieses Zytokin lässt sich auch in Gehirnläsionen von SSPE-Patienten detektieren (Nagano et al., 1994). Basierend auf diesen Erkenntnissen, konnte ich eine durch das Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) vermittelte antivirale Aktivität von IFN-g gegen MV nachweisen. Endothelzellen (EZ) sind bei der akuten Masernerkrankung oder nachfolgenden Komplikationen, die auf einer persistierenden Infektion basieren, wichtige Zielzellen. CD46 und CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) wurden als zelluläre Rezeptoren für MV beschrieben (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass humane EZ aus dem Gehirn und aus der Nabelschnurvene (HBMECs und HUVECs) zwar CD46, aber auf RNA- und auf Proteinebene kein SLAM exprimieren. Diese Zellen konnten jedoch mit den Wildtyp-MV, die CD46 nicht als Rezeptor benutzen, infiziert werden. Diese Untersuchungen deuten auf die Präsenz eines zusätzlichen Rezeptors für die Aufnahme und Verbreitung von MV in humanen EZ hin. Der antivirale Effekt von Interferonen spielt bei der MV-Vermehrung eine entscheidende Rolle und variiert jedoch in Abhängigkeit von der Wirtszelle (Schnorr et al., 1993). Im Gegensatz zu den attenuierten MV-Impfstämmen können Wildtyp-MV den antiviralen Effekt von Typ I-IFN blockieren, indem sie die Induktion von IFNa/b hemmen und die Sensivität gegenüber dem antiviralen Effekt vermindern. Dabei spielen die V- und C-Proteine des MV eine Rolle (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003), die mit zellulären STAT-Proteinen und IRF-9 interagieren (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-g die Replikation aller MV-Stämme vorwiegend in Endo- und Epithelzellen hemmen kann und, dass diese durch IFN-g induzierte, antivirale Aktivität mit der Induktion der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) korreliert. IDO ist ein Enzym, welches in Anwesenheit von Sauerstoff den Abbau von Tryptophan zu Kynurenin katalysiert (Hirata et al., 1975) und hauptsächlich antiparasitäre, antibakterielle und antivirale (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004) Effekte vermittelt. Im Zusammenhang mit Masern wurde beschrieben, dass die Tryptophan Katabolite in SSPE-Patienten erhöht sind (Kurup & Kurup, 2002). Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch IFN-g-induzierte antivirale Aktivität durch Zugabe von L-Tryptophan nahezu aufgehoben werden kann und daher IDO im Zuge der anti-MV Aktivität eine entscheidende Rolle spielt.
Der Kontakt humaner T-Zellen mit dem MV Glykoproteinkomplex interferiert mit der CD3/CD28 stimulierten Aktivierung von PI3/Akt-Kinase Signalwegen. Damit verbunden ist der ineffiziente Transport PH-Domänen-enthaltender Proteine in Membran-rafts, wie der Akt-Kinase und Vav, den Guaninnukleotid-Austauschfaktor von Rho GTPasen. Es konnte gezeigt werden, dass infolge des MV-Kontaktes die CD3/CD28 stimulierte Aktivität der Rho GTPasen Cdc42 und Rac1 inhibiert ist. Dagegen war in MV-behandelten Zellen eine leichte RhoA Aktivierung festzustellen. Rho GTPasen spielen eine kritische Rolle in der Regulation von Zytoskelettorganisation von T-Lymphozyten. Übereinstimmend damit wurde gezeigt, dass der Kontakt mit MV die CD3/CD28 costimulierte Aktivierung und Polymerisation des F-Aktins inhibiert. Damit verbunden ist die reduzierte Fähigkeit MV-behandelter T-Zellen auf Fibronektin- und mit CD3/CD28 Antikörpern-beschichteten Objektträgern zu polarisieren. Die Ausbildung F-Aktin-getriebener morphologischer Veränderungen, wie Filopodien, Lamellipodien und Uropodien, ist drastisch reduziert. Rasterelektronenmikroskopische Auf-nahmen zeigten in nicht-stimulierten und CD3/CD28 costimulierten MV-behandelten T-Zellen einen nahezu kompletten Verlust an Mikrovilli und Lamellipodien. Die Bindung von MV induziert die Dephosphorylierung des F-Aktin–bindenden Proteins Cofilin und der ERM-Proteine. Es konnte demonstriert werden, dass der MV-Kontakt die Ausbildung einer reifen immunologischen Synapse stört. Trotz der morphologischen Veränderungen konjugieren MV-behandelte T-Zellen mit DCs. Die Anzahl MV-behandelter T-Zellen, die mit DCs inter-agieren, ist vergleichbar mit der mock-behandelter T-Zellen. Allerdings zeigt die 3-dimensionale Rekonstruktion der DC/T-Zell-Kontaktzone, dass in MV-behandelten T-Zellen die zentrale Akkumulation und Clusterbildung des CD3-Moleküls gestört ist und keine monozentrische Synapse ausbildet wird. Desweiteren erfolgt die Relokalisation des MTOC in T-Zellen in Richtung der DC unvollständig. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der MV Glykoproteinkomplex mit essentiellen Schritten einer erfolgreichen T-Zell-Aktivierung während der APC/T-Zell-Interaktion interferiert.
Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden führen kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antikörperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminosäuren charakterisieren, die einerseits für die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antikörper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits für die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundgerüst des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. Über gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingefügt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminosäureänderungen identifiziert werden, die für die Bindung der jeweiligen Antikörper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminosäureänderungen im Hämagglutinin-Protein für den Escape verantwortlich: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminosäureveränderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam für die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen für den Antikörperescape. Der Aminosäureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren führt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine für das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molekül entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verstärkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgeführt werden könnten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminosäuren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abhängt und nicht durch die transgene Expression zellulärer Rezeptoren für MV vermittelt werden kann.
Die Infektion mit dem Masernvirus (MV) stellt weltweit immer noch ein großes Problem dar. Trotz des vorhandenen Lebendimpfstoffs, der eine Erkrankung sicher zu verhindern vermag, haben nicht nur die Entwicklungsländer, in denen ein flächendeckender Impfschutz schwieriger zu erreichen ist, mit der Erkrankung und ihren Komplikationen zu kämpfen. Hat sich die Erkrankung klinisch manifestiert gibt es keine kausalen Therapiemöglichkeiten und es kann nur noch symptomatisch behandelt werden. Dies ist v.a. auch in Hinblick auf die schweren Komplikationen der Maserninfektion von Bedeutung. Bei Erstkontakt mit dem Masernvirus ist die Suszeptibilität nicht geimpfter Menschen sehr hoch. Das bedeutet, dass es in 95-98 % der Fälle nach einer Infektion mit dem Masernvirus auch zum klinischen Bild der Masern kommt, unabhängig von Alter und Geschlecht. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, potentielle Hemmstoffe der Maserninfektion auf ihre Wirkung zu testen und zu verstehen, wo im Infektions- und Replikationszyklus des MV sie eingreifen. Es wurden eine Reihe Substanzen mit potentiell-inhibitorischen Eigenschaften in Infektions-Hemmtests und im Zytotoxizitätstest untersucht, von denen im Anschluss die drei besten Inhibitoren (JK80, QD6-8 und Droseron) weiter untersucht wurden. JK80 und QD6-8 waren beide mit IC50-Werten um 30 µM und SI-Werten von über 2 nur mäßig spezifisch antiviral wirksam. Während JK80 vermutlich den Eintritt des MV in die Zellen verhindert, hemmt QD6-8 die intrazelluläre Virusreplikation und wäre im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger, spezifischer Medikamente gegen die Maserninfektion von grossem Interesse. Eine Zielmolekülanalyse der Substanz und die Testung anderer Derivate könnten Aufschluss darüber geben, wie Substanzen aussehen müssten, die eine spezifische Hemmung der intrazellulären Replikation bewirken können. Der Naturstoff Droseron könnte mit einer spezifischen Hemmung (IC50 ca. 10 µM; SIWert 6 im Fluoreszenzreader, bzw. IC50 ca. 2 µM; SI-Wert 30 in der Titration) eine mögliche Leitsubstanz für einen neuen MV-Inhibitor darstellen. Allerdings waren alle bisher getesteten Droseron-Derivate entweder weniger inhibitorisch wirksam oder deutlich zytotoxischer als Droseron selbst. Die Ergebnisse der Infektionshemmversuche mit Zugabe von Droseron vor, während oder nach der Infektion mit MV sprechen dafür, dass Droseron den Eintritt des Virus in die Zelle stört.
Die Morphogenese von Viruspartikeln und deren Freisetzung aus infizierten Zellen sind späte Schritte im viralen Lebenszyklus. Matrix-Proteine (M) negativsträngiger RNA-Viren und Retroviren, bei denen es sich um periphere Membran-assoziierte Proteine handelt, spielen für diese Prozesse eine besonders wichtige Rolle. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein mit dem viralen Nukleoproteinkomplex im Innern der Viruspartikel einerseits und mit den viralen Glykoproteinen auf der Oberfläche andererseits. Die Bedeutung des MV M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang wenig untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das MV M-Protein in höhermolekularen Komplexe oligomerisiert und transient mono-ubiquitiniert vorliegt. Beide biochemischen Eigenschaften des M-Proteins sind wahrscheinlich für die Partikelentstehung von Bedeutung, wie durch Studien an M-Protein-Orthologen anderer Viren bereits belegt wurde. Das MV M-Protein assoziierte mit Membranen und speziellen Membranmikrodomänen, sogenannten Detergenz-resistenten Membranfraktionen (DRMs), und vermittelte nach transienter Expression in Fibroblasten die Produktion Virus-ähnlicher Partikel (virus-like particles, VLPs). Es ist beschrieben, dass umhüllte Viren präferenziell aus DRMs freigesetzt werden. Die Koexpression des MV-Glykoproteins F erhöhte den Anteil mit DRM-assoziierten M-Proteins um ein Vierfaches, steigerte jedoch, wie auch das H-Protein, die Effizienz der VLP-Freisetzung nicht. Überraschenderweise waren beide jedoch selbst in der Lage VLPs zu induzieren. Die Effizienz der VLP-Produktion war gering und entsprach der der Viruspartikelfreisetzung. Dendritische Zellen (DCs) sind für MV semipermissiv. Obwohl alle viralen Proteine synthetisiert werden, wird kein infektiöses Virus freigesetzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation der M-, H- und N-Proteine dramatisch von der in der produktiv infizierbaren Fibroblastenzelllinie HeLa abweicht. Während in infizierten HeLa-Zellen das M-Protein mit Lamp-1-positiven späten Endosomen kolokalisierte, akkumulierten in DCs alle untersuchten viralen Proteine in einem spät endosomalen Kompartiment, das das Tetraspanin CD81, aber nicht Lamp-1, enthielt und möglicherweise an der MHC-Klasse-II-abhängigen Antigenpräsentation beteiligt ist.
Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen, die Pathogene erkennen und nach erfolgreicher Reifung spezifische adaptive Immunität induzieren. Die Infektion unreifer DCs durch Masernviren (MV) erfolgt CD150-abhängig und DC-SIGN-unterstützt. Infizierte DCs vermitteln wahrscheinlich den MV-Transport vom Respirationstrakt in sekundäre lym-phatische Gewebe, wo die MV-spezifische Immunität und die generalisierte Immunsuppressi-on initiiert werden sowie die MV-Transmission an T-Zellen stattfinden kann, die wesentlich für die Dissemination des Virus ist. Die MV-Infektion von iDCs initiierte deren Ausreifung begleitet von der moderaten Hochre-gulierung der CD150-Oberflächenexpression. Die Akkumulation viraler Proteine als auch die Freisetzung viraler Partikel waren in DCs im Vergleich zu Virus-produzierenden B-Zelllinie B95a beeinträchtigt. Diese Arbeit verglich die subzelluläre Verteilung der viralen Proteine in DCs und B95a-Zellen. In DC wiesen Matrix (M)-Proteine eine prominente Assoziation mit den Komponenten des Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexes auf. Die ausgeprägte Relokali-sierung des Tetraspanins CD81 zu Phospho (P)-Protein-Kompartimenten und die Inhibition der räumliche Interaktion der untersuchten Tetraspanine waren spezifisch für B95a-Zellen. Weder in B95a-Zellen noch für DC konnte für MV ein virus-containing compartment (VCC) detektiert werden, das für HIV-1 zuvor beschrieben wurde. Um den zellulären Transport des M-Proteins in infizierten, lebenden DCs untersuchen zu können, wurde das Protein carboxyterminal mit dem Tetracystein (TC)-Tag fusioniert. Das M-TC Fusionsprotein zeigte alle untersuchten biologischen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins bezüglich seiner subzellulären Verteilung, der Assoziation mit DRMs sowie der Generierung und Freisetzung von virus-like particles (VPLs). Innerhalb des Viruskontextes interferierte der TC-Tag allerdings stark mit der Virusreplikation bzw. Freisetzung. Durch die Verminderung der Partikelproduktion in DCs wird eine spezielle MV-Transmissionsstruktur für die effiziente Übertragung an T-Zellen benötigt. Die MV-Transmission an autologe T-Zellen basierte vorwiegend auf Infektion von DCs (cis-Infektion) und weniger auf DC-SIGN-gebundenen Virus (trans-Infektion). Die Interaktion zwischen dem MV-Glykoprotein H mit seinem Rezeptor CD150 war wichtig für die Transmission. Die Transmission von MV erfolgte hauptsächlich durch die Bildung von Kontaktflächen, entspre-chend den beschriebenen virologischen Synapsen, wo virale Proteine akkumulierten und CD150 aktinabhängig rekrutiert wurde, und seltener über aktinreiche Filopodien. Die HIV-VS Markerproteine ICAM-1, aktiviertes LFA-1, CD81, DC-SIGN und der phosphorylierte Ezrin / Radixin / Moesin (ERM)-Proteinkomplex polarisierten zur MV-VS. Moesin und der Substanz P Rezeptor (SPR), die Prozesse des MV-Eintritts oder der Aufnahme unterstützen, akkumulierten ebenfalls in den Transmissionsstrukturen. Zusammengefasst zeigte diese Arbeit, dass die gebildete Plattform für MV-Transmission (MV-VS) wichtige Gemeinsamkeiten mit der HIV-VS teilt. In der MV-VS akkumulierten Proteine, die Aktindynamiken regulieren, die die Konjugatstabilität verstärken und die die Membranfusion unterstützen, die einen effizienten Eintritt des MV in T-Zellen ermöglichen.
Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erhältlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die jährlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer während der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer Störung der zellulären Immunantwort führt. Diese Immunsuppression begünstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten Ländern begleitet von mangelhafter ärztlicher Versorgung und Unternährung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion führt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Auslösung einer primären, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und könnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tatsächlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-Stämme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypstämme im Vergleich mit Vakzinestämmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem stärkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen führte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schlüsselzytokin für die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) führten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verstärkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytohämagglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten.
Das Multiple Myelom ist trotz deutlicher Fortschritte in der Therapie meist eine unheilbare Erkrankung, so dass der Erforschung neuer therapeutischer Optionen mit dem Ziel, eine möglichst langfristige krankheitsfreie Zeit für den betroffenen Patienten zu erreichen, eine wichtige Bedeutung zukommt. Hierbei erweist sich der Ansatz, maligne Plasmazellen spezifisch mit onkolytischen Viren zu infizieren und zu eliminieren, als zunehmend vielversprechend. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues rekombinantes Masernvirus kloniert, das selektiv primäre MM-Zellen infiziert und abtötet. Diese Fähigkeit basiert auf der Verwendung eines mutierten H-Proteins, das nicht mehr mit den natürlichen Rezeptoren CD46 oder CD150 interagiert und das zusätzlich mit einem single chain Antikörper (scFvWue) verknüpft ist, der MM-Zellen spezifisch bindet. Unter Verwendung eines etablierten Rescuesystems aus cDNA konnten in vitro replikationskompetente Virionen von MV-Wue erstellt werden. Diese vorgenommenen Veränderungen beeinflussten die Fähigkeit zur effizienten Replikation und Produktion infektiöser Viren in vitro nicht. Zur funktionellen Testung des neuen rekombinanten Virus MV-Wue wurde die Spezifität des Virus für primäre maligne Plasmazellen in Infektionsexperimenten gezeigt sowie der Mechanismus der Ablation als Apoptose definiert.