Refine
Is part of the Bibliography
- yes (79)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (49)
- Journal article (30)
Keywords
- Thrombozyt (12)
- platelets (9)
- VASP (7)
- LASP-1 (6)
- Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein (6)
- Thrombozyten (4)
- endothelial cells (4)
- phosphorylation (4)
- Brustkrebs (3)
- Clopidogrel (3)
- LASP1 (3)
- Maus (3)
- Phosphorylierung (3)
- Signaltransduktion (3)
- actin cytoskeleton (3)
- platelet (3)
- Blutgerinnung (2)
- Blutstillung (2)
- Cyclo-AMP (2)
- Cyclo-GMP (2)
- Cyclo-GMP-Derivate (2)
- Cyclonucleotide (2)
- Endothel (2)
- Endothelzelle (2)
- Endothelzellen (2)
- Genexpression (2)
- Haemostasis (2)
- Kongestive Herzmuskelkrankheit (2)
- Medulloblastom (2)
- Medulloblastoma (2)
- Megakaryozyten (2)
- Molekulargenetik (2)
- NET (2)
- PRRT (2)
- Spred (2)
- Spred Protein (2)
- Stickstoffmonoxid (2)
- Zelladhäsion (2)
- Zellskelett (2)
- aorta (2)
- apoptosis (2)
- atherosclerosis (2)
- cell adhesion (2)
- cell staining (2)
- clopidogrel (2)
- diet (2)
- flow cytometry (2)
- inflammation (2)
- macrophages (2)
- 5-> (1)
- 5C6 (1)
- ADP receptors (1)
- ADP-Rezeptoren (1)
- AMPK (1)
- Actin (1)
- Actin-Polymerisation (1)
- Actin-bindende Proteine (1)
- Adenylatcyclase (1)
- Adenylylcyclase (1)
- Aktin Zytoskelett (1)
- Aktin-Zytoskelett (1)
- Aktivierung (1)
- Angiogenese (1)
- Antigen CD41 (1)
- Apple Domäne (1)
- Apple domain (1)
- Arginine (1)
- Arteriosklerose (1)
- Atherosklerose (1)
- BCR-ABL (1)
- BMP (1)
- BMP-2 (1)
- Blutgefäß (1)
- Bradykinin (1)
- C-terminal-Src-Kinase (1)
- CCM3 (1)
- CHO cell (1)
- CHO-Zelle (1)
- CML (1)
- CRKL (1)
- Cell permeability (1)
- Chronische Herzinsuffizienz (1)
- Cortical Actin Cytoskeleton (1)
- Cyclic nucleotides (1)
- Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 (1)
- DAPI staining (1)
- DCM (1)
- DLD (1)
- DNA double-strand breaks (1)
- Denaturing high-performance liquid chromatography (1)
- Dendritische Zelle (1)
- Desmoplakin (1)
- Diabetes mellitus (1)
- Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (1)
- Dipyridamol (1)
- Dissoziationskonstante (1)
- Domäne <Biochemie> (1)
- Drosophila (1)
- Durchflußzytometrie (1)
- EDS (1)
- ERK signaling cascade (1)
- ES-Cells (1)
- EVH-1 (1)
- EVH1 Domäne (1)
- EVH1 domain (1)
- EVH1 domains (1)
- Ehlers-Danlos syndrome (1)
- Eierstockkrebs (1)
- Endothelial Cell-Cell Contacts (1)
- Endotheliale Zell-Zell-Kontakte (1)
- Enzyme immunoassay (1)
- Enzymkinetik (1)
- Epac (1)
- Erbkrankheit (1)
- Ewing-Sarkom (1)
- Extrazelluläre Matrix (1)
- FGF19 (1)
- FRET (1)
- FXI (1)
- FXR (1)
- Faktor V Leiden (1)
- Familiäre dilatative Kardiomyopathie (1)
- Fibroblastenwachstumsfaktor (1)
- Fibrose (1)
- Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (1)
- GAF Domaine (1)
- Gaf domaine (1)
- Gehirn (1)
- Genanalyse (1)
- Genmutation (1)
- Genommutation (1)
- Gerinnungsfaktor XI (1)
- Gerinnungsfaktor XII (1)
- Gerinnungsfaktoren (1)
- Gerinnungsfaktoren in Thrombozytenkonzentraten (1)
- Group B streptococcus (1)
- Harnblasenkarzinom (1)
- Herzinsuffizienz (1)
- Herzkrankheit (1)
- Herzmuskelerkrankung (1)
- Herzmuskelkrankheit (1)
- Hoher Faktor XI (1)
- Hydrolyse (1)
- Hyperkalaemia (1)
- Hämostase (1)
- Immunoblot (1)
- Inhibition (1)
- Inosite (1)
- Insulin (1)
- Insulinrezeptor (1)
- Integrin alphaIIb-beta3 (1)
- Juvenile biventricular cardiomyopathy (1)
- Kallikrein-Kinin-System (1)
- Kallikreine (1)
- Kardiomyopathie (1)
- Kern-Zytosoltranslokation (1)
- Ki67 (1)
- Kind / Onkologie (1)
- Kinin (1)
- Knockout <Molekulargenetik> (1)
- Knockout Mäuse (1)
- Kontaktphasensystem (1)
- Krankheitsgen (1)
- LASP-2 (1)
- LASP1 (LIM and SH3 Protein 1) (1)
- LASP1 (LIM und SH3 Protein 1) (1)
- LNCaP (1)
- Lamellipodium (1)
- Laminopathie (1)
- Laminopathy (1)
- Linear Mixed Inhibition (1)
- Linear mixed inhibition (1)
- Lipidomics (1)
- Lipophilicity (1)
- Lysine (1)
- MAG3 (1)
- MAP Kinase (1)
- MAP kinase (1)
- MAPK (1)
- MMP (1)
- MMP (Matrix-Metalloproteasen) (1)
- MMP (Matrix-Metalloproteases) (1)
- Mammakarzinom (1)
- Matrix-Metalloproteasen (1)
- Matrixmetalloproteinase (1)
- Medaka (1)
- Medizin (1)
- Megakaryocytes (1)
- Megakaryozyt (1)
- Metabolism (1)
- Metabolismus (1)
- Metalloproteasen (1)
- Mikrokalorimetrie (1)
- Missbildung (1)
- Mitochondriopathie (1)
- Mitochondriopathy (1)
- Mutation (1)
- Myc (1)
- NIR3 (1)
- NO (1)
- NONO (1)
- Neutrophile (1)
- Nucleotide (1)
- Ovarkarzinom (1)
- PDEF (1)
- PITPnm2 (1)
- PKA (1)
- PKB (1)
- PKG (1)
- PSA (1)
- Palmoplantar keratoderma (1)
- Phosphatidylinositol Transfer Proteine (1)
- Plakophilin-2 (1)
- Plasmakallikrein (1)
- Plasmakonzentrate (1)
- Platelets (1)
- Platets (1)
- Pluripotency (1)
- Plättchen (1)
- Plättchenaktivierung (1)
- Plättchenhemmung (1)
- Polymorphismus (1)
- Polyphosphate (1)
- Proliferation (1)
- Prostaglandine (1)
- Prostanoid-Rezeptor (1)
- Prostanoide (1)
- Protamin (1)
- Protamine (1)
- Protein interactions (1)
- Proteine (1)
- Proteinkinase A (1)
- Proteinkinase B (1)
- Proteinkinase G (1)
- Proteinphosphorylierung (1)
- Punktmutation (1)
- Purinorezeptor (1)
- RAR (1)
- RNS-Interferenz (1)
- RNS-Spleißen (1)
- ROS (1)
- RXR (1)
- Reaktive Sauerstoffspezies (1)
- Regulation (1)
- Restriktive Herzmuskelkrankheit (1)
- Rezeptor (1)
- Rezeptorregulation (1)
- SNP (1)
- STAT3 (1)
- Sekretion (1)
- Seque (1)
- Sequenzierung (1)
- Skleroproteine (1)
- Spectrin (1)
- Spektrin (1)
- Spleißvarianten (1)
- Spred protein (1)
- Src-Proteine (1)
- Stammzellen (1)
- Staphylococcus aureus (1)
- Stickst (1)
- Streptococcus (1)
- T cells (1)
- TRIP6 (1)
- Therapiekontrolle (1)
- Therapieresistenz (1)
- Thrombin (1)
- Thrombingenerierung (1)
- Thrombocytes (1)
- Thrombose (1)
- Thrombosis (1)
- Thrombozytenkonzentrate (1)
- Transkriptionsfaktor (1)
- Troponin I (1)
- Tumorzelle (1)
- Urothelkarzinom (1)
- Variabilität (1)
- Vasodilatatoren (1)
- Vasodilator-stimulated phosphoprotein (1)
- Vitamin A (1)
- Willebrand-Jürgens-Syndrom (1)
- Wirkmechanismus (1)
- ZO-2 (1)
- Zelldifferenzierung (1)
- Zellkern (1)
- Zwergenwuchs (1)
- Zyxin (1)
- abdominal aortic-aneurysm (1)
- aberrant transcripts (1)
- amino acids (1)
- angiogenesis (1)
- atherosclerotic vascular disease (1)
- autotoxicity (1)
- beta-aminopropionitrile (1)
- biomarker (1)
- bladder cancer (1)
- brain tumor (1)
- breast cancer (1)
- breast cancer cells (1)
- cAMP (1)
- cDNA arrays (1)
- cDNA-Arrays (1)
- cGMP (1)
- cPLA2 (1)
- calcium signaling (1)
- camp signaling pathway (1)
- cancer (1)
- cancer cells (1)
- cancer treatment (1)
- cardiomyopathy (1)
- cell differentiation (1)
- cell membranes (1)
- cerebral small vessel disease (1)
- colorectal cancer (1)
- contact activation system (1)
- csk (1)
- curative resection (1)
- cyclic nucleotides (1)
- cytotoxic T cells (1)
- dependent protein-kinase (1)
- differentiation (1)
- dilation (1)
- dipyridamole (1)
- discrete (1)
- drug-monitoring (1)
- dwarfism (1)
- early onset sepsis (1)
- endothelium (1)
- epithelial cells (1)
- erythrocytes (1)
- factor V Leiden (1)
- factor binding profiles (1)
- familial dilated cardiomyopathy (1)
- fibrosis (1)
- gene expression (1)
- gene targeting (1)
- genetisch bedingte Krankheit (1)
- genome integrity (1)
- haert muscle disease (1)
- heart (1)
- heat shock response (1)
- hematopoietic stem cells (1)
- hemoglobin (1)
- hepatic resection (1)
- high factor XI (1)
- histology (1)
- human osteosarcoma xenografts (1)
- humans (1)
- hypercholesterolemia (1)
- hyperkalemia (1)
- hypoxia inducible factor 1 (1)
- hämatopoetische Stammzellen (1)
- immunity (1)
- immunotherapy (1)
- infection (1)
- innate immunity (1)
- integrin alphaIIb-beta3 (1)
- integrins (1)
- intracellular receptors (1)
- intrinsic coagulation cascade (1)
- intrinsische Gerinnungskaskade (1)
- invadopodia (1)
- ischaemic heart disease (1)
- isothiocyanates (1)
- kidney function (1)
- kinin (1)
- knock-out (1)
- knockout (1)
- knockout mice (1)
- lamellipodium (1)
- lipidomics (1)
- lung resection (1)
- lymphocytes (1)
- mammary carcinoma (1)
- megakaryocytes (1)
- melanin (1)
- melanocytes (1)
- melanoma cells (1)
- melanomas (1)
- membrane proteins (1)
- metastasis (1)
- miRNA 17-92 Cluster (1)
- miRNS (1)
- microRNA (1)
- microdomains (1)
- mir-203 (1)
- monocyte subset (1)
- monocytes (1)
- mouse (1)
- mouse model (1)
- mouse models (1)
- mustard oil bomb (1)
- mutation (1)
- myocardial infarction (1)
- myocarditis (1)
- nardilysin (1)
- neovascularization, physiologic (1)
- neutrophils (1)
- nilotinib (1)
- nitric oxide (1)
- nuclear cytosolic translocation (1)
- nucleo-cytoplasmic (1)
- nutritional deficiencies (1)
- open-access database (1)
- ovarian carcinoma (1)
- p38 MAP kinase (1)
- p53 (1)
- pancreatic cancer (1)
- pathogenic bacteria (1)
- peripheral artery occlusive disease (1)
- phosphatidylinsoitol transfer protein (1)
- plakophilin 2 (1)
- plasma kallikrein (1)
- platelet activation (1)
- platelet aggregation (1)
- platelet dysfunction (1)
- polystyrene (1)
- prediction (1)
- proliferation (1)
- prostanoid receptor (1)
- prostanoids (1)
- prostate cancer (1)
- protein phosphorylation (1)
- pädiatrische Onkologie (1)
- r760c (1)
- r854q (1)
- reactive electrophilic species (1)
- receptor-regulation (1)
- redox homeostasis (1)
- regulatory T cells (1)
- repair and replication (1)
- rupture (1)
- sequencing (1)
- signal transduction (1)
- smooth muscle cells (1)
- solid tumors (1)
- soluble guanylate cyclase (1)
- spleen (1)
- splice variant (1)
- src kinase (1)
- streptococci (1)
- sulforaphane (1)
- surgical oncology (1)
- surgical resection (1)
- t-lymphocytes (1)
- teeth (1)
- therapy non-responder (1)
- thrombin generation (1)
- thrombosis (1)
- tooth eruption (1)
- transcapillary pressure gradient (1)
- transcription factor SPT5 (1)
- transfection (1)
- transitional cell carcinoma (1)
- troponin I (1)
- tumor growth (1)
- tumor microenvironment (1)
- tumor-infiltrating (1)
- tyrosine (1)
- variability (1)
- vascular normalization (1)
- vascular type (1)
- vasodilator-stimulated phosphoprotein (1)
- vasodilators (1)
- vesicles (1)
- vitamin D (1)
- von-willebrand-syndrom (1)
- von-willebrand-syndrome (1)
- xenopus oocytes (1)
- y1146c (1)
- Überexpression (1)
- Überleben (1)
Institute
- Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie (79) (remove)
Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Gefäßerkrankung. Dabei sind alle entscheidenden Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems involviert. Besonders dendritische Zellen (DCs) expandieren subendothelial während der Progression einer Atherosklerose. Diese können Antigene aufnehmen und daraufhin Zytokine produzieren oder andere Immunzellen aktivieren. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende Stränge aus Ribonukleinsäure, welche als weitere Ebene der Genregulation wichtige Zellvorgänge beeinflussen können. Diese Arbeit zeigt mögliche Zielproteine des miRNA 17-92 Clusters in dendritischen Zellen auf und schlägt mögliche Modelle vor, wie dadurch Zellvorgänge von DCs in der Atherosklerose reguliert werden könnten.
Neutrophile Granulozyten sind wichtige Effektorzellen des menschlichen Immunsystems. Eine Suppression der Neutrophilen kann zur Immundeffizienz mit Gefahr für bakterielle Erkrankungen und maligne Tumoren führen, eine Überstimulation dieser Zellen ist jedoch an der Entstehung der Autoimmunerkrankungen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden aktivierende und hemmende Wege untersucht, die für zukünftige Strategien in Prävention und Therapie dieser Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Neutrophile Granulozyten enthalten VASP in hoher Konzentration. VASP ist ein bereits gut charakterisiertes Substrat der cAMP-PK und der cGMP-PK. Phosphorylierungsversuche mit cAMP-erhöhenden Substanzen ergaben eine rasche, reversible Phosphorylierung dieses Proteins an Ser-157 und Ser-239 in intakten humanen Neutrophilen Granulozyten. Versuche mit cGMP-erhöhenden Substanzen zeigten jedenfalls eine Phosphorylierung am Ser-157, jedoch keine Phosphorylierung am Ser-239. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich das Vorhandensein und die physiologische Funktion der cAMP-PK bezüglich der Phosphorylierung von VASP, stellen jedoch die Funktion der cGMP-PK in humanen Neutrophilen Granulozyten in Frage. Basierend auf der Methode der Immunfluoreszenz wurde gezeigt, dass VASP bei der Adhärenz der Neutrophilen eine entscheidende Rolle spielt. So ist mit Hilfe der spezifischen monoklonalen Antikörper eine Phosphorylierung am Ser-157 und am Ser-239 nach der Adhäsion der Neutrophilen an die Objektträger nachgewiesen worden. Nach zusätzlicher Stimulation mit PG-E1 zeigte sich kein wesentlicher Phosphorylierungsanstieg in adhärierten Neutrophilen. Zahlreiche chemotaktische Faktoren wie fMLP führen zur Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie auch der PKB. Diese intrazellulären Signalmoleküle spielen eine zentrale Rolle bei der Neutrophilenaktivierung. Da es bereits von hemmenden Einflussen der Vasodilatatoren auf die Aktivierung der Neutrophilen Granulozyten berichtet worden ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von cAMP- und cGMP-erhöhenden Substanzen auf die fMLP-induzierte Phosphorylierung der p42/p44-, p38-MAPK sowie der PKB untersucht. Flolan, ein cAMP-erhöhender Vasodilatator führte zur signifikanten Hemmung der fMLP-induzierten p42/p44-, p38- sowie PKB-Phosphorylierung. cGMP-erhöhender Vasodilatator SNP zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fMLP-induzierte Aktivierung dieser Signalmoleküle. Physiologisch vorkommende cAMP-erhöhende Substanzen besitzen im menschlichen Körper eine wichtige regulatorische Funktion, die Neutrophile Granulozyten vor der „Überstimulation“ bewahrt.
Die Rolle des Proteins VASP für die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen
(2005)
Im Rahmen der Arbeit wurden in mehreren Teilprojekten die Eigenschaften und Funktionen des Vasodilatator stimulierenden Phosphoproteins (VASP) untersucht. Es wurde ein neuer Antikörper (5C6) charakterisiert, der für an Serin157 phosphoryliertes VASP spezifisch sein sollte. Es konnte gezeigt werden, dass der 5C6 Antikörper spezifisch VASP erkennt, welches an der Stelle Serin157 phosphoryliert ist. Auch konnten mit dem neuen Antikörper Ergebnisse bestätigt werden, die vorher mit anderen Methoden erhoben wurden, nämlich, dass Serin157 sowohl cAMP- als auch cGMP-vermittelt phosphoryliert wird. Der Antikörper 5C6 stellte sich als ein guter Marker für die Phosphorylierung von VASP an Serin157 durch die PKA dar und ermöglichte, die Zeitkinetik der VASP-Phosphorylierung zu beschreiben. In einem weiteren Projekt wurde die Rolle des Proteins VASP bei der Proliferation und Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu Megakaryozyten und Thrombozyten untersucht. Die Stammzellen wurden zusätzlich zu Wachstumsfaktoren mit unterschiedlichen Dosen eines cGMP-Analogons stimuliert. Es zeigte sich hierbei, dass 8-pCPT-cGMP einen dualen, konzentrationsabhängigen Effekt auf die Proliferation und die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen von Wildtypmäusen hat. Niedrige Dosen hemmten die Proliferation und förderten die Differenzierung, dagegen hatten höhere Konzentrationen einen proliferationsfördernden und differenzierungshemmenden Effekt auf die Stammzellen. Im Vergleich hierzu ergab eine Stimulation mit 8-pCPT-cGMP bei VASP knock out Mäusen immer einen proliferationsfördernden Effekt, hingegen einen hemmenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen. Bei den knock out Zellen führten höhere Konzentrationen lediglich zu einer stärkeren Reaktion als niedrige.
Distinct functions of specialized dendritic cell subsets in atherosclerosis and the road ahead
(2014)
Atherosclerotic vascular disease is modulated by immune mechanisms. Dendritic cells (DCs) and T cells are present within atherosclerotic lesions and function as central players in the initiation and modulation of adaptive immune responses. In previous years, we have studied the functional contribution of distinct DC subsets in disease development, namely, that of CCL17-expressing DCs as well as that of plasmacytoid DCs that play specialized roles in disease development. This review focuses on important findings gathered in these studies and dissects the multifaceted contribution of CCL17-expressing DCs and pDCs to the pathogenesis of atherosclerosis. Furthermore, an outlook on future challenges faced when studying DCs in this detrimental disease are provided, and hurdles that will need to be overcome in order to enable a better understanding of the contribution of DCs to atherogenesis are discussed, a prerequisite for their therapeutic targeting in atherosclerosis.
p38 Mitogen-activated protein (MAP) kinase is involved in the apoptosis of nucleated cells. Although platelets are anucleated cells, apoptotic proteins have been shown to regulate platelet lifespan. However, the involvement of p38 MAP kinase in platelet apoptosis is not yet clearly defined. Therefore, we investigated the role of p38 MAP kinase in apoptosis induced by a mimetic of BH3-only proteins, ABT-737, and in apoptosis-like events induced by such strong platelet agonists as thrombin in combination with convulxin (Thr/Cvx), both of which result in p38 MAP kinase phosphorylation and activation. A p38 inhibitor (SB202190) inhibited the apoptotic events induced by ABT-737 but did not influence those induced by Thr/Cvx. The inhibitor also reduced the phosphorylation of cytosolic phospholipase \(A_2\) (cPLA2), an established p38 substrate, induced by ABT-737 or Thr/Cvx. ABT-737, but not Thr/Cvx, induced the caspase 3-dependent cleavage and inactivation of cPLA2. Thus, p38 MAPK promotes ABT-737-induced apoptosis by inhibiting the cPLA2/arachidonate pathway. We also show that arachidonic acid (AA) itself and in combination with Thr/Cvx or ABT-737 at low concentrations prevented apoptotic events, whereas at high concentrations it enhanced such events. Our data support the hypothesis that the p38 MAPK-triggered arachidonate pathway serves as a defense mechanism against apoptosis under physiological conditions.
von Willebrand factor/ristocetin (vWF/R) induces GPIb-dependent platelet agglutination and activation of αIIbβ3 integrin, which also binds vWF. These conditions make it difficult to investigate GPIb-specific signaling pathways in washed platelets. Here, we investigated the specific mechanisms of GPIb signaling using echicetin-coated polystyrene beads, which specifically activate GPIb. We compared platelet activation induced by echicetin beads to vWF/R. Human platelets were stimulated with polystyrene beads coated with increasing amounts of echicetin and platelet activation by echicetin beads was then investigated to reveal GPIb specific signaling. Echicetin beads induced αIIbβ3-dependent aggregation of washed platelets, while under the same conditions vWF/R treatment led only to αIIbβ3-independent platelet agglutination. The average distance between the echicetin molecules on the polystyrene beads must be less than 7 nm for full platelet activation, while the total amount of echicetin used for activation is not critical. Echicetin beads induced strong phosphorylation of several proteins including p38, ERK and PKB. Synergistic signaling via P2Y12 and thromboxane receptor through secreted ADP and TxA2, respectively, were important for echicetin bead triggered platelet activation. Activation of PKG by the NO/sGC/cGMP pathway inhibited echicetin bead-induced platelet aggregation. Echicetin-coated beads are powerful and reliable tools to study signaling in human platelets activated solely via GPIb and GPIb-triggered pathways.
Background
Direct interaction between Red blood cells (RBCs) and platelets is known for a long time. The bleeding time is prolonged in anemic patients independent of their platelet count and could be corrected by transfusion of RBCs, which indicates that RBCs play an important role in hemostasis and platelet activation. However, in the last few years, opposing mechanisms of platelet inhibition by RBCs derived nitric oxide (NO) were proposed. The aim of our study was to identify whether RBCs could produce NO and activate soluble guanylate cyclase (sGC) in platelets.
Methods
To test whether RBCs could activate sGC under different conditions (whole blood, under hypoxia, or even loaded with NO), we used our well-established and highly sensitive models of NO-dependent sGC activation in platelets and activation of purified sGC. The activation of sGC was monitored by detecting the phosphorylation of Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASPS239) by flow cytometry and Western blot. ANOVA followed by Bonferroni’s test and Student’s t-test were used as appropriate.
Results
We show that in the whole blood, RBCs prevent NO-mediated inhibition of ADP and TRAP6-induced platelet activation. Likewise, coincubation of RBCs with platelets results in strong inhibition of NO-induced sGC activation. Under hypoxic conditions, incubation of RBCs with NO donor leads to Hb-NO formation which inhibits sGC activation in platelets. Similarly, RBCs inhibit activation of purified sGC, even under conditions optimal for RBC-mediated generation of NO from nitrite.
Conclusions
All our experiments demonstrate that RBCs act as strong NO scavengers and prevent NO-mediated inhibition of activated platelets. In all tested conditions, RBCs were not able to activate platelet or purified sGC.
Introduction: The aim of our study was to develop a reproducible murine model of elastase-induced aneurysm formation combined with aortic transplantation.
Methods: Adult male mice (n = 6-9 per group) underwent infrarenal, orthotopic transplantation of the aorta treated with elastase or left untreated. Subsequently, both groups of mice were monitored by ultrasound until 7 weeks after grafting.
Results: Mice receiving an elastase-pretreated aorta developed aneurysms and exhibited a significantly increased diastolic vessel diameter compared to control grafted mice at 7 week after surgery (1.11 +/- 0.10 mm vs. 0.75 +/- 0.03 mm; p <= 0.001). Histopathological examination revealed disruption of medial elastin, an increase in collagen content and smooth muscle cells, and neointima formation in aneurysm grafts.
Conclusions: We developed a reproducible murine model of elastase-induced aneurysm combined with aortic transplantation. This model may be suitable to investigate aneurysm-specific inflammatory processes and for use in gene-targeted animals.
Anhand der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente lässt sich feststellen, dass der VASP-POD-Assay eine sensitive Methode zur Erfassung der Aktivität humaner Thrombozyten ist. Mithilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion kann der hemmende Effekt zahlreicher Vasodilatoren auf Thrombozytenaktivität quantitativ in-vitro erfasst werden. VASP, das Zielantigen dieser Reaktion, spielt eine Schlüsselrolle. Der Phospho¬rylierungszustand dieses Proteins beeinflusst die Thrombozytenaktivierung bzw. Hemmung der Thrombozytenaktivität. Die Phosphorylierung von VASP wiederum bedingt sowohl eine intrazelluläre NO/cGMP- als auch PGI2/cAMP-Signalkaskade. Die cAMP bzw. cGMP abhängigen Signalkaskaden können durch VASP-Phorylierung an Serin 157 und Serin 239 quantifiziert werden. Die Verwendung von mit Meerretich¬peroxidase konjugierten Antikörpern erlaubt eine quantitative Messung von Phospho-VASP Anteil am Gesamt-VASP. Diese markiert den phosphorylierten Serinrest des VASP. Ebengenanntes Verhältnis von Phospho-VASP zum Gesamt-VASP korreliert wiederum mit Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die thrombozyten¬aggregationshemmende Wirkung von vasodilatierenden Substanzen – wie z.B. NO und PGI2 – kann durch die Messung der VASP-Phosphorylierung mithilfe VASP-POD-Assay quantifiziert werden. Diese Substanzen entfalten ihre Wirkung durch intrazelluläre Erhöhung von zyklischen Nukleotiden (cAMP und cGMP). Die thrombozytäre VASP-Phosphorylierung unter Wirkung von NO bzw. PGI2. wurden in-vitro in unterschiedlichen Bedingungen – sowohl in gewaschenen Thrombozyten als auch in Vollblut – ermittelt. Somit ist P-VASP als biochemischer Marker für das Monitoring der NO/cGMP- bzw. PGI2/cAMP-Signalkaskade in humanen Thrombozyten geeignet. Eine Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen kann außerdem mithilfe von VASP-POD-Assay ermittelt werden. In einem vereinfachten Modell des humanen, geschlossenen Kreislaufsystems wurden gewaschene Thrombozyten und Endothelzellen mit verschiedenen Substanzen, die endotheliale NO-Synthese stimulieren und somit die NO-Bioverfügbarkeit erhöhen, inkubiert. Die Erhöhung der extrazellulären NO-Bioverfügbarkeit korreliert mit dem intrazellulären Anstieg des P-VASP Anteils am Gesamt-VASP in Thrombozyten. Durch die Messung der intrathrombozytären VASP-Phosphorylierung in VASP-POD-Assay kann man indirekt Rückschlüsse auf die Wirkung dieser Substanzen auf die Thrombozytenaktivität und die Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothelzellen ziehen. Zur Verifizierung der Empfindlichkeit dieser Analysenmethode wurde der VASP-Phosphorylierungsgrad von Thrombozyten gesunder Probanden mit der an Diabetes Mellitus erkrankten Probanden verglichen. Die gesteigerte Thrombozytenaktivität von erkrankten Probanden kann unter Verwendung dieses Verfahrens (VASP-POD-Assay) diagnostiziert und quantifiziert werden. VASP-Assay ermöglicht eine schnelle, leichte und reproduzierbare Quantifizierung der Interaktion zwischen Thrombozyten und Endothelzellen. Somit wird das gesetzte Ziel der Entwicklung dieser Messmethode erreicht, nämlich die Früherkennung gestörter Interaktion zwischen humanen Thrombozyten und Endothel¬zellen und folglich die pathologische Veränderung des Funktionszustandes humaner Thrombozyten bei Diabetes Mellitus in Frühstadium. Unter Berücksichtigung des thrombozytenaggregationshemmenden Effekts des P-VASP kann die Stimulation zur Phosphorylierung von VASP einerseits als protektive Maßnahme und andererseits als möglicher Angriffspunkt der zukünftigen Medikation betrachtet werden.
Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden.
Das Ewing-Sarkom (EFT) ist nach dem Osteosarkom das zweihäufigste Knochen-assoziierte Malignom im Kindesalter. Das entscheidende Ereignis in der Pathogenese dieser Entität stellt eine chromosomale Translokation dar, welche zur Entstehung eines chimären Transkriptionsfaktors, meist EWS-FLI1, führt. Unsere Absicht war es, die Mechanismen zu verstehen, die letztlich zur Metastasierung von Ewing-Sarkomen mit der damit verbundenen, infausten Prognose führen.
Die Mitglieder der Zyxin-Proteinfamilie sind in vielfältige zelluläre Funktionen involviert. Hierbei nehmen sie, teilweise funktionell redundant, Einfluss auf zytoplasmatische und nukleäre Prozesse. Durch Analyse von öffentlich verfügbaren Microarraydaten konnten wir belegen, dass lediglich das Protein TRIP6 (thyroid receptor interacting protein 6) aus der Familie in EFT deutlich überexprimiert ist. Dieses Protein ist, neben seiner Funktion in der Organisation des Zytoskeletts, auch nukleär als Kotranskriptionsfaktor und als Element der Telomerprotektion tätig. Vielfach wurde eine Implikation des multifunktionellen Adaptorproteins in maligne Prozesse dokumentiert. Die Überexpression von TRIP6 in EFT ist jedoch unabhängig von EWS-FLI1. Eine Bindung von EWS-FLI1 an eine putative Bindungsstelle im Promotor von TRIP6 konnte nicht nachgewiesen werden.
Die Analyse von Microarrays nach TRIP6-Knockdown in EFT-Zelllinien identifizierte mehrere Gensets, welche mit Proliferation und Invasivität assoziiert sind und die nach TRIP6-Knockdown vermindert exprimiert werden. Die für Malignome pathogenetisch relevanten Zielgene Radixin, CD164 und CRYZ konnten als Zielgene des Kotranskriptionsfaktors TRIP6 durch qRT-PCR und Western Blot bestätigt werden. Durch RNA-Interferenz-mediierte Verminderung der Proteinmenge von TRIP6 in EFT kam es zu einer deutlich reduzierten Klonogenität und Migration der Zellen in vitro. Nach induzierbarem TRIP6-Knockdown konnte eine verminderte Tumorigenität und hepatische Metastasierung von hierfür generierten EFT-Einzelzellklonen in vivo beobachtet werden. Zusammengefasst deuten diese Daten auf eine Rolle von TRIP6 in der Pathogenese der EFT und insbesondere beim Prozess der Metastasierung hin. Somit legen diese Ergebnisse eine weitere Evaluierung von TRIP6 als Biomarker oder molekulare Zielstruktur für therapeutische Ansätze in EFT nahe.
Das Vasodilatator stimulierte Phosphoprotein (VASP) ist ein Zytoskelett-assoziiertes Protein der Ena (Enabled)/VASP-Proteinfamilie. Seine Funktionen bezüglich Aktin- Polymerisation, Thrombozyten-Aggregation, Wachstumskegel-Führungsprozessen und Motilität sowohl von Zellen als auch von Listerien sind bisher nur unvollständig charakterisiert. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, wie die VASP-F-Aktin Interaktion in vitro durch die Phosphorylierung zweier Aminosäuren von VASP reguliert wird. Transfektions-Experimente mit VASP und RhoA deuten eine mögliche Beteiligung von VASP im Signalweg von RhoA an. Zudem führen Überexpression und Deletion von VASP in Zellen zu demselben Stressfaser-Phänotyp, der unabhängig vom stimulierenden Einfluss von Serum ist. In VASPdefizienten Fibroblasten ist außerdem die Membranrigidität und die Phosphorylierung der leichten Kette des Myosins erhöht, was auf ein stabileres und stärker kontrahiertes Aktin- Zytoskelett in diesen Zellen schließen lässt. Die Regulation und Organisation des Aktin- Zytoskeletts beeinflusst auch die zelluläre Adhäsion, die in VASP-defizienten Zellen verändert ist. VASP-defiziente Zellen adhärieren signifikant stärker an Fibronektinbeschichtete Perlen als Wildtyp-Zellen. Der Widerstand dieser Perlen gegenüber mechanischen Kräften ist in VASP (-/-) Zellen signifikant erhöht. Dieser Unterschied beruht in erster Linie auf dem verstärkten Aktin-Zytoskelett in diesen Zellen und ist unabhängig von Mikrotubuli. Messungen mit rekonstituierten Zelllinien zeigen zudem eine VASPAbhängigkeit dieses Effekts. Der GTPase Rap1 kommt eine wichtige Bedeutung bei der Integrin-abhängigen Adhäsion von Zellen zu. Aktivierung von Epac, einem Guanin-Nukleotid- Austauschfaktor von Rap1, führt in Wildtyp-Zellen zur Verstärkung des Widerstandes gegenüber mechanischen Kräften, die auf Fibronektin-beschichtete Perlen wirken, ohne dabei die Membranrigidität zu verändern. Diese Kraft-Verstärkung wird weder vom Aktin- noch vom Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst. Es exisitiert daher ein Mechanismus, bei dem die Länge von elastischen Membranfortsätzen unabhängig von der Membranfestigkeit und dem Aktin-Zytoskelett reguliert wird. Diese Experimente zeigen, dass VASP eine wichtige Rolle bei der Stabilität und Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts, der Membranrigidität sowie bei der zellulären Adhäsion spielt. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass hierbei weniger die direkte Interaktion von VASP mit dem Aktin-Zytoskelett von Bedeutung ist, sondern viel mehr seine mögliche Funktion als Gerüstprotein (Scaffold), das eine geregelte Signaltransduktion organisiert.
Spreds are a new Sprouty-related family of membrane-associated proteins inhibiting the MAPK signaling pathway by interacting with Ras and Raf-1. Different studies have already demonstrated the inhibitory function of Spreds in cell culture systems, but the in vivo function of Spreds in the whole organism was still unclear. Therefore, Spred-2 knockout mice were generated using a gene trap approach. The Spred-2 deficiency was verified on RNA and protein levels and the lack of functional Spred-2 protein in mice caused a dwarf phenotype similar to achondroplasia, the most common form of human dwarfism. Spred-2-/- mice showed reduced growth and body weight, they had a shorter tibia length and showed narrower growth plates as compared to wildtype mice. Spred-2 promoter activity and protein expression were detected in chondrocytes, suggesting an important function of Spred-2 in chondrocytes and bone development. Furthermore, stimulation of chondrocytes with different FGF concentrations showed earlier and augmented ERK phosphorylation in Spred-2-/- chondrocytes as compared to Spred-2+/+ chondrocytes. These observations suggest a model, in which loss of Spred-2 inhibits bone growth by inhibiting chondrocyte differentiation through upregulation of the MAPK signaling pathway. An additional observation of Spred-2-/- mice was an increased bleeding phenotype after injuries, whereas the bleeding volume was extremely enlarged and the bleeding time was significantly prolonged. So far, hypertension as cause could be excluded, but to discover the physiological reasons for this phenotype, the different steps of the clotting cascade have to be investigated further. As the Spred-2 promoter activity studies demonstrated a high and specific Spred-2 expression in vascular smooth muscle cells and previous studies showed an interaction of Spreds with RhoA, a key regulator of vascular smooth muscle contraction, the regulation of smooth muscle contractility seems to be a good candidate of this phenomenon. Moreover, Spred-1 and Spred-2 specific antibodies were generated as important tools to study the protein expression patterns in mice. Furthermore, nothing was known about the Spred-2 promoter region and its regulation. Here, a detailed in situ analysis of the physiological promoter activity profile in the gene trapped Spred-2-deficient mouse strain was shown. In these mice, the beta-galactosidase and neomycin fusion gene (β-geo) of the gene trap vector was brought under control of the endogenous Spred-2 promoter, giving the opportunity to monitor Spred-2 promoter activity in practically every organ and their corresponding sub-compartments. X-Gal staining of sections of newborn and adult mice revealed 1) a very high Spred-2 promoter activity in neural tissues and different glands; 2) a high activity in intestinal and uterine smooth muscle cells, and kidney; 3) a low activity in heart, testis, lung, and liver; 4) an almost lacking activity in skeletal muscle and spleen, and 5) very interestingly, a very distinct and strong activity in vascular smooth muscle cells. Moreover, comparison of newborn and adult mouse organs revealed a nearly congruent Spred-2 promoter activity. These detailed data provide valuable information for further studies of the physiological functions of Spred-2 in organs showing strong Spred-2 promoter activity, which are in most of these organs still unclear. Finally, gene targeting vectors for Spred-1 and Spred-2 were cloned, to generate ES cells with a floxed exon 2 of the Spred-1 and Spred-2 gene, respectively. Now, these ES cells are valuable tools to establish conditional knockout mice. This is of major interest to investigate the physiological tissue specific functions of Spred-1 and Spred-2, especially if the double knockout mice are not viable.
Brustkrebs ist gegenwärtig die häufigste bösartige Erkrankung der Frau weltweit und verantwortlich für 15 % der Krebs¬todes-ursachen in der westlichen Welt. Maligne Erkrankungen in metastasierten Stadien gelten generell als unheilbar mit einem medianen Überleben von wenigen Jahren. Das LIM und SH3 Domänen Protein (LASP-1) ist ein spezielles fokales Ad¬hä¬sions-protein, das an den Vorgängen der Zellproliferation und -migration beteiligt ist. Der Knockdown von LASP-1 in metastatischen Brust- und Eier¬stock¬krebs-zelllinien führt zu einer starken Hemmung der Zellmigration und -proliferation. Um¬ge-kehrt kommt es nach Überexpression des Proteins in nicht neoplastischen Zellen zu einer erhöhten Migration. Bei den von uns untersuchten Patientinnen mit Brust- oder Eierstockkrebs korreliert die Überexpression des Proteins mit fortgeschrittener Tumor-größe und Lymphknoten-Metastasierung. Die genetische Analyse von 63 mikrodissektierten histologischen Brust-krebs-Schnittpräparaten mit anschließender qRT PCR auf LASP-1 ergab (mit nur einer positiven Probe; 1,6 %) allerdings keine Amplifikation des Gens. Es scheint, dass die LASP 1 Proteinüberexpression als aktiver Prozess in der Tumorgenese aufgefasst werden kann und in der Mehrheit der Brustkrebsfälle bevorzugt durch trans¬krip-tionelle Regulation als durch Gen¬amplifi¬ka-tion hervorgerufen wird. LASP-1 ist nicht ausschließlich ein zytosolisch lokalisiertes Protein, sondern in malignen Zellen außerdem im Zellkern nachweisbar. In einer Langzeitstudie (Januar 1985 – Dezember 2007) wurde anhand anti-LASP-1 gefärbter histologischer Schnittpräparate die LASP Expression bestimmt und mit dem Patienten-Überleben korreliert. Patientinnen mit nukleärer LASP-1-Lokalisation zeigen, im Vergleich zu nukleär-LASP-1 negativen Schnitten, ein signifikant (p = 0,0250) reduziertes Langzeitüberleben. Mit diesen Ergebnissen lassen sich zukünftig vielleicht prognostische Aussagen über die Auswirkungen der LASP-1-Expression für den einzelnen Patienten treffen.
LASP-1, das LIM und SH3 Protein 1, ist ein Aktin-bindendes Gerüstprotein, das in verschiedenen Tumorentitäten überexprimiert ist. Dabei scheint LASP-1 eine wichtig Rolle sowohl bei der Proliferation und Migration von Zellen als auch bei der Tumorgenese und Metastasierung zu spielen.
Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von LASP-1 im Urothelkarzinom der Harnblase zu untersuchen und eine daraus abzuleitende klinische Relevanz für die Diagnostik zu evaluieren. Dazu wurden histologische Blasenschnitte immunhistochemisch nach LASP-1 gefärbt und Western Blot-Analysen von Urinproben durchgeführt.
Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Blasenschnitte ergab, dass Urothelkarzinome signifikant mehr LASP-1 auf Proteinebene exprimieren als gesundes Blasengewebe. Allerdings konnte keine Korrelation zwischen der Stärke der LASP-1-Expression und verschiedener klinisch-pathologischer Parameter nachgewiesen werden.
Mittels Western Blot-Analysen gelang es, LASP-1 eindeutig im Urin und statistisch signifikant häufiger bei Blasenkarzinompatienten zu detektieren. Ohne Berücksichtigung einer Kontamination mit LASP-1-positiven Blut- und Entzündungszellen ist der LASP-1-Nachweis im Western Blot mit einer Gesamtsensitivität von 84,2% derzeit sensitiver als die meisten erhältlichen Tumormarker. Darüber hinaus ergab der Vergleich von Spontanurin und von Harnblasenspülflüssigkeit, dass Spontanurinproben sogar geeigneter zur Diagnostik zu sein scheinen.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass LASP-1 aufgrund der einfachen, nicht invasiven und kostengünstigen Probengewinnung zusammen mit den hohen Werten für Sensitivität und Spezifität als Urin-basierter Tumormarker für das Urothelkarzinom der Harnblase vielversprechend zu sein scheint.
Background
While hypercholesterolemia plays a causative role for the development of ischemic stroke in large vessels, its significance for cerebral small vessel disease (CSVD) remains unclear. We thus aimed to understand the detailed relationship between hypercholesterolemia and CSVD using the well described Ldlr\(^{−/-}\) mouse model.
Methods
We used Ldlr\(^{−/-}\) mice (n = 16) and wild-type (WT) mice (n = 15) at the age of 6 and 12 months. Ldlr\(^{−/-}\) mice develop high plasma cholesterol levels following a high fat diet. We analyzed cerebral capillaries and arterioles for intravascular erythrocyte accumulations, thrombotic vessel occlusions, blood-brain barrier (BBB) dysfunction and microbleeds.
Results
We found a significant increase in the number of erythrocyte stases in 6 months old Ldlr\(^{−/-}\) mice compared to all other groups (P < 0.05). Ldlr\(^{−/-}\) animals aged 12 months showed the highest number of thrombotic occlusions while in WT animals hardly any occlusions could be observed (P < 0.001). Compared to WT mice, Ldlr\(^{−/-}\) mice did not display significant gray matter BBB breakdown. Microhemorrhages were observed in one Ldlr\(^{−/-}\) mouse that was 6 months old. Results did not differ when considering subcortical and cortical regions.
Conclusions
In Ldlr\(^{−/-}\) mice, hypercholesterolemia is related to a thrombotic CSVD phenotype, which is different from hypertension-related CSVD that associates with a hemorrhagic CSVD phenotype. Our data demonstrate a relationship between hypercholesterolemia and the development of CSVD. Ldlr\(^{−/-}\) mice appear to be an adequate animal model for research into CSVD.
The subject of this thesis was the cloning and the initial biochemical and functional characterisation of novel human proteins with an N-terminal Ena-VASP homology (EVH)-1 domain and a C-terminal Sprouty homologous region (SPR), which are related to the Drosophila AE33 protein. During the course of this work, three mouse homologues of the AE33 fly protein have been reported and termed Sprouty-related protein with an EVH-1 domain 1, 2 and 3 (Spred-1, -2, -3)(Wakioka et al, 2001; Kato et al, 2003). Spred-1, -2 and -3 are membrane associated substrates of receptor tyrosine kinases and they act as negative regulators of the Ras pathway during growth factor stimulation. As the Spred-family members seem to exert similar functions, the specific function of each member remains enigmatic. Therefore, we investigated the mRNA and protein expression patterns of the two murine protein family members Spred-1 and Spred-2 on the whole organ level. Furthermore, we focussed on the cellular localisation and the role of human and murine Spred-2 in the organism. The expression patterns of Spred-1 and Spred-2 differed markedly among various tissues and cell types. In mouse, Spred-1 is abundantly expressed in adult brain, cerebellum, and fetal tissues, whereas Spred-2 was ubiquitously expressed. In humans, Spred-2 was found to be strongly expressed in glandular epithelia and in invasive cytotrophoblasts, and at the subcellular level its immunoreactivity was associated with secretory vesicles and was found to colocalise with Rab11 GTPase. The new human Spred gene family was investigated in detail. Cloning of the fulllength form of human Spred-2 resulted in an 1254 bp coding sequence, corresponding to a 418 amino-acids protein. Immunoblotting with a set of affinitypurified antibodies confirmed the expression of a 47 kDa protein and suggested the presence of additional differently sized variants. Cloning of various shortened Spred- 2 mRNAs and identification of 2 additional human Spred genes (localised on different chromosomes) with their respective EST (expressed sequence tag) revealed that the new human Spred gene family displays extensive splicing, leading to the generation of short and long Spred proteins. All protein isoforms and splicing variants contain an EVH1-domain located at the N-terminus of the protein. The full-length forms (“a” forms) comprised the SPR, another functional domain localised at the C-terminus whereas the short variants (Spred-1b, 2 c-e, 3 c) lack the entire C-terminal SPR domain or part of it. The existence of short and long splicing variants of Spred-1, -2 and -3 revealed a common principle of organisation and splicing pattern in the Spred family. Functional analyses of the 5 cloned Spred-2 splicing variants revealed differential subcellular localisation and differential regulation of serum- and EGF- mediated ERK activation in HEK-293 cells. Taken together, these results indicate a highly specific expression pattern of Spred-1 and Spred-2 in various tissues suggesting a specific physiological role for the individual Spred isoform in these tissues. For example, Spred-2 appears to be involved in regulating secretory pathways. Furthermore, the human Spred family contains three genes, which are subject to extensive alternative splicing resulting in at least 8 different proteins with differential subcellular localisation and differential regulatory potential of the MAPK pathways during growth factor stimulation.
LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
Herzinsuffizienz ist eine Krankheit mit wachsender medizinischer und ökonomischer Bedeutung. Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen für Herzversagen und führt in den meisten Fällen zu einer Herztransplantation. 20-30 % der DCM-Erkrankungen haben einen genetischen Hintergrund. Durch die Anwendung molekulargenetischer Methoden konnte bereits eine Reihe DCM-verursachender Gene identifiziert werden. Mutationen in Zytoskelettproteinen führten zu der Hypothese, dass eine Beeinträchtigung der Kraftübertragung vom Sarkomer auf be-nachbarte Myozyten eine Ursache für die DCM sein könnte. Zusätzlich scheint auch eine reduzierte Kraftentwicklung, ausgelöst durch Mutationen in den Proteinen des Sarkomers die Entwicklung der DCM zu begünstigen. Darüber hinaus wurden Mutationen in Proteinen gefunden, wie z.B. im Lamin A/C- oder Tafazzin-Gen, deren Rolle in der Pathophysiologie der DCM noch nicht geklärt sind. Um die Komplexität der genetischen Defekte, die eine DCM verursachen, besser zu verste-hen, ist es notwendig weitere krankheitsverursachende Gene zu identifizieren. Im ersten Projekt untersuchten wir eine Familie (DCM-I) mit 16 an DCM erkrankten Familienmit-gliedern. Der Phänotyp folgte einem autosomal-dominanten Erbgang. Nach Ausschluss aller be-kannter DCM-Loci, führten wir eine genomweite genetische Suche mit den Mikrosatellitenmarkern der 10. Version des Weber-Screeningsets durch. Durch die Kopplungsanalyse war es möglich, ge-netische Kopplung für 80 % des Genoms auszuschließen. Mehrere benachbarte Marker auf dem langen Arm von Chromosom 7 zeigten hingegen Kosegregation mit dem Krankheitsstatus. Ein maximaler LOD-Score von 4,20 wurde für die Marker D7S471 und D7S501 erzielt. Die Feinkartie-rung mit zusätzlichen Markern identifizierte eine Kandidatenregion, die von den beiden Markern D7S2545 und D7S2554 begrenzt wird und ein Intervall von 9,73 Mb umschließt. In dem minima-len Intervall sind 32 Gene sowie 6 aufgrund von Sequenzvergleichen vorhergesagte Transkripte kodiert. Keines dieser Gene kodiert für ein Zytoskelett- oder Sarkomerprotein. Durch Sequenzana-lyse konnten wir eine neue DCM-verursachende Mutation (A100G) in Exon 2 des Gens DLD iden-tifizieren, das für das mitochondriale Protein Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) kodiert. Die Mutation veränderte die vorletzte Aminosäure des Signalpeptids, das den Import des Proteins in die Mitochondrien dirigiert. Daher hatten wir die Hypothese, dass möglichweise der Transport oder die Prozessierung des Signalpeptids beeinträchtigt sein könnte. Dazu haben wir das DLD-Signalpeptid mit GFP markiert und die Verteilung des Fusionsproteins in transfizierten humanen Zellen und in isolierten Mitochondrien untersucht. Die Resultate zeigten, dass die Fusionsproteine mit dem mu-tierten Signalpeptid genauso in die Mitochondrien transportiert und prozessiert wurden, wie die Fusionsproteine mit dem Wildtyp-Signalpeptid. Die Enzymaktivität der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase in Lymphozyten mit der Mutation A100G liegt innerhalb der normalen Brandbreite und ist im Vergleich zu der Enzymaktivität in Kontroll-Lymphozyten nicht reduziert. Die Identifikation von DLD, einem Protein des Energiemetabolismus, als neues DCM-verursachendes Gen in Familie DCM-I, kann zu einem besseren Verständnis der komplexen Pa-thophysiologie der dilatativen Kardiomyopathie beitragen. Im zweiten Projekt haben wir eine Familie (DCM-II) untersucht, in der die erkrankten Familien-mitglieder eines oder meherer der folgende Symptome aufwiesen: Reizleitungsstörungen, Schlag-anfall, dilatative Kardiomyopathie, Gliedergürtel-Muskeldystrophie. Dilatative Kardiomyopathie assoziiert mit Reizleitungsstörungen und Skelettmyopathie ist mit Mutationen im Gen für Lamin A und Lamin C (LMNA) korreliert. Zusätzlich wurden Mutationen im LMNA in Zusammenhang mit der Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, der Gliedergürtel-Muskeldystrophie, Lipodystrophie, dem Charcot-Marie-Tooth-Syndrom und der Hutchinson-Gilford Progerie beschrieben. Da über 90 % der LMNA-Mutationen Missense-Mutationen sind, resultierte daraus die Hypothese, dass die mu-tierten Proteine über einen dominant-negativen Effekt die dreidimensionale Struktur der Lamin-Intermediärfilamente zerstören. Durch Sequenzanalyse der proteinkodierenden Exons des LMNA konnten wir einen Basenpaaraus-tausch von C nach T an Position 700 (C700T) in Exon 4 identifizieren, der mit dem Phänotyp in der Familie segregierte. Die Mutation führte zum Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons (PTC) an Position 234 (Q234X) der Aminosäuresequenz. Bei der Sequenzanalyse der Lamintranskripte aus Lymphozyten von erkrankten Individuen konnten wir nur das Wildtyp-Allel detektieren, aber nicht das mutierte Allel, was darauf schließen ließ, dass das mutierte Allel möglicherweise durch einen Kontrollmechanismus (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) degradiert wurde. Nach Inhibition des NMD durch Inkubation der Lymphozyten mit Cycloheximid oder Emetin, akkumulierte das mutierte Transkript wieder in der Zelle. Die Quantifizierung der Lamintranskripte durch Amplifi-kation mittels Real-Time-PCR zeigte eine deutliche Reduktion der Menge an Transkripten in Fi-broblasten von erkrankten Familienmitgliedern. Die Western-Blot-Analyse konnte eine reduzierte Expression von Lamin A und Lamin C bestätigen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Transkript mit dem PTC durch die NMD-Maschinerie degradiert wird und eine Haploinsuffizienz von Lamin A und Lamin C die DCM in dieser Familie verursacht.
Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Einblicke in die Aktivierung von FGF19 und
FXR durch diverse nukleäre Agonisten und deren spezifischer Rezeptoren zu
gewinnen. Hierbei soll im humanen Zellmodell versucht und mittels DNA-Analyse
untersucht werden, welche messbaren molekularbiologischen
Auswirkungen eine Behandlung mit unterschiedlichen Substanzen in
variierenden Konzentrationen bewirkt. Genauer soll betrachtet werden, ob sich
Vitamin A und Vitamin D als Induktoren von FGF19 in menschlichen
Darmzelllinien eignen, da dies bereits im Mausmodel demonstriert werden
konnte.
Dieser initialen Vermutung folgend, sollen auch die möglichen
Wechselwirkungen und Synergismen untersucht werden – welche
Mechanismen liegen diese zu Grunde und über welche molekularen
Signalwege werden dies vermuteten Effekte vermittelt.
Hierdurch soll ein besseres Verständnis für die Rezeptor und Agonistenabhängigen
Abläufe ermöglicht werden, um mögliche Rückschlüsse auf weitere
Funktionen bereits bekannter Vertreter zu erlauben.
Aufgrund der bereits oben beschriebenen Tiermodelle und der daraus
gewonnenen Einsichten würde sich durch ein noch besseres Verständnis des
FGF15/19 und des Farnesoid X Rezeptors in menschlichen Zellen, auf eine
zukünftige Anwendung in analytischen und/oder therapeutischen Bereichen
hoffen lassen.
Diese Arbeit soll sich deshalb den Fragen widmen, ob eine FGF19 Induktion in
humanen Darmzellen durch die nukleären Agonisten VD3, 9-cis RA und CDCA,
ähnlich dem Mausmodel, möglich ist und welche Faktoren dabei Einflüsse auf
die beschriebenen Effekte haben.