Refine
Has Fulltext
- yes (34)
Is part of the Bibliography
- yes (34)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (31)
- Journal article (3)
Keywords
- Antikörper (34) (remove)
Institute
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (9)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (4)
- Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I) (4)
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (4)
- Abteilung für Molekulare Innere Medizin (in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II) (3)
- Graduate School of Life Sciences (3)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (3)
- Missionsärztliche Klinik (2)
- Neurologische Klinik und Poliklinik (2)
- Pathologisches Institut (2)
Despite intense research efforts, a safe and effective HIV-1/AIDS vaccine still remains far away. HIV-1 escapes the humoral immune response through various mechanisms and until now, only a few nAbs have been identified. A promising strategy to identify new epitopes that may elicit such nAbs is to dissect and analyze the humoral immune response of sera with broadly reactive nAbs. The identified epitopes recognized by these antibodies might then be incorporated into a vaccine to elicit similar nAbs and thus provide protection from HIV-1 infection. Using random peptide phage display libraries, the Ruprecht laboratory has identified the epitopes recognized by polyclonal antibodies of a rhesus monkey with high-titer, broadly reactive nAbs that had been induced after infection with a SHIV encoding env of a recently transmitted HIV-1 clade C. The laboratory analyzed phage peptide inserts for conformational and linear homology with computational assistance. Several of the identified peptides mimicked domains of the original HIV-1 clade Env, such as conformational V3 loop epitopes and the conserved linear region of the gp120 C-terminus. As part of this work, these mimotopes were analyzed for cross-reactivity with other sera obtained from rhesus monkeys with nAbs and antibody recognition was shown for several mimotopes, particularly those representing the V3 loop. In addition, these mimotopes were incorporated into a novel DNA prime/phage boost strategy to analyze the immunogenicity of such phage-displayed peptides. Mice were primed only once with HIV-1 clade C gp160 DNA and subsequently boosted with mixtures of recombinant phages. This strategy was designed to focus the humoral immune response on a few, selected Env epitopes (immunofocusing) and induced HIV-1 clade C gp160 binding antibodies and cross-clade nAbs. Furthermore, the C-terminus of gp120, a conserved HIV Env region, was linked to the induction of nAbs for the first time. The identification of such conserved antigens may lead to the development of a vaccine that is capable of inducing broadly reactive nAbs that might confer protection form HIV-1 infection.
Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.
Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 % of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110.
CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine
(2014)
Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-genüber dem TNFL CD95L entdeckt (28 %). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in veränderten Zellen Apoptose zu induzieren, während gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert lösliches TRAIL hauptsächlich den Todesrezeptor TRAILR1, während membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivität löslicher TNFL zu steigern. Hierzu zählen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molekülanordnung über die TNC-Domäne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antikörpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabhängigen Membranständigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberflächenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die für die Apoptoseinduktion benötigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verstärkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivität des monoklonalen Antikörperfragments scFv:CD40 zurückzuführen. Die Antikörperdomäne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung fähig, sondern konnte zusätzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der lösliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberflächenimmobilisierung über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizität überführt werden kann.
Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit möglich die selektive Toxizität von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivität effizient zu nutzen. Zusätzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden können. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abhängig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgeführt werden.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data.
No abstract available.
In der vorliegenden Studie wurde der mögliche Einfluß von heterophilen Antikörpern auf die Thyreoglobulinbestimmung in der Nachsorge beim Patienten mit differenziertem Schilddrüsenkarzinom untersucht. Dazu wurde bei 201 Patientenseren der Thyreoglobulinwert auf herkömmliche Weise und in einer Parallelbestimmung nach Vorbehandlung mit heterophilen Antikörper blocking tubes bestimmt. Dieses Vorgehen ermöglichte es, einen direkten Vergleich beider Messergebnisse anzustellen und einen möglichen Einfluß heterophiler Antikörper aufzudecken. Darüber hinaus wurde das selbe Verfahren bei einer heterogenen Kontrollgruppe angewandt. In 99% der Proben ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Messergebnissen. Somit ist ein Einfluß von heterophilen Antikörpern auf die Thyreoglobulinbestimmung bei Patienten mit differenziertem Schilddrüsenkarzinom unwahrscheinlich.
Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren.
Cancer cells frequently escape from immune surveillance by down-regulating two important components of the immune defence: antigen-presenting MHC and costimulatory molecules. Therefore several novel anti-tumour compounds that aim to assist the immune system in recognising and fighting cancer are currently under development. Recombinant bispecific antibodies represent one group of such novel therapeutics. They target two different antigens and recruit cytotoxic effector cells to tumour cells. For cancer immunotherapy, bispecific T cell-engaging antibodies are already well characterised. These antibodies target a tumour-associated antigen and CD3ε, the constant molecule of the T cell receptor complex.
On the one hand, this study presents the development of a bispecific antibody targeting CD3ε and the rhabdomyosarcoma-associated fetal acetylcholine receptor. On the other hand, it describes a novel two-part trispecific antibody format for the treatment of leukaemia and other haematological malignancies in the context of haematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
For HSCT, an HLA-identical donor is preferred, but very rarely available. In an HLA-mismatched setting, the HLA disparity could be exploited for targeted cancer treatment. In the present study, a two-part trispecific HLA-A2 × CD45 × CD3 antibody was developed for potential cases in which the patient is HLA-A2-positive, but the donor is not. This holds true for about half the cases in Germany, since HLA-A2 is the most common HLA molecule found here. Combinatorial targeting of HLA-A2 and the leucocyte-common antigen CD45 allows for highly specific dual-antigen restricted tumour targeting.
More precisely, two single-chain antibody constructs were developed: i) a single-chain variable fragment (scFv) specific for HLA-A2, and ii) a scFv against CD45, both linked to the VL and the VH domain of a CD3ε-specific antibody, respectively. It turned out that, after the concomitant binding of these constructs to the same HLA-A2- and CD45-expressing cell, the unpaired variable domains of a CD3ε-specific antibody assembled to a functional scFv. In a therapeutic situation, this assembly should exclusively occur on the recipient’s blood cancer cells, leading to T cell-mediated cancer cell destruction. In this way, a relapse of disease might be prevented, and standard therapy (radiation and chemotherapy) might be omitted.
For both approaches, the antibody constructs were periplasmically expressed in E. coli, purified via His tag, and biochemically characterised. Their binding to the respective targets was proven by flow cytometry. The stimulatory properties of the antibodies were assayed by measuring IL-2 release after incubation with T cells and antigen-expressing target cells. Both the bispecific antibody against rhabdomyosarcoma and the assembled trispecific antibody against blood cancer mediated T-cell activation in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations. For the trispecific antibody, this effect indeed proved to be dual antigen-restricted, as it could be blocked by prior incubation of either HLA-A2- or CD45-specific scFv and did not occur on single-positive (CD45+) or double-negative (HLA-A2- CD45-) target cells. Furthermore, antibodies from both approaches recruited T cells for tumour cell destruction in vitro.
Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberflächlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zukünftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zunächst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine für Immunisierungsstudien zu nutzen. Zunächst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antikörpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen für den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antikörpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antikörper-Behandlung zu evaluieren. Für die Herstellung der gewünschten Proteine wurden die Gensequenzen zunächst aus verschiedenen S. aureus-Stämmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen Stämmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal für Wachstum und Überexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der Überexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zunächst in nur unzureichender Quantität vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA überwiegend im Pellet in sogenannten Einschlusskörpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erklärte dieses Phänomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration für die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antikörper gewonnen werden, die die Grundlage für einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich stärkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antikörper gegen IsaA) erhalten hatten, gegenüber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antikörpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target für eine Immuntherapie gegen S. aureus.
Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen.
Bei agonistischen Antikörpern gegen Rezeptoren der TNFRSF reicht eine einfache Bindung der Antikörper an die Rezeptoren oft nicht aus, um ein intrazelluläres Signal zu erzeugen. Es konnte herausgefunden werden, dass die Verankerung der Antikörper über ihren Fc-Anteil an Fc gamma Rezeptoren ihre Fähigkeit zur agonistischen Aktivierung der TNFR extrem steigert. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob die Verankerung über andere Rezeptoren möglich ist. Mit scFv:CD70 als Beispiel, konnte diese Frage positiv beantwortet werden.
Antikörper, die Oberflächenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antikörper in diesen Bereichen eingesetzt werden können, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antikörpers oder auch eines Antikörperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierfür werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verfügbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zelluläre Einflüsse, die die Bindungseigenschaften der Antikörper beeinflussen, nicht berücksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren für zelluläre Bindungsstudien können problematisch sein, da sie meist auf Antikörpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeinträchtigungen führen kann. Außerdem zeigen solche Antikörper häufig keine einheitliche Stöchiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten Fällen nicht gewährleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig.
Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antikörpers 18D1 Antikörper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antikörpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivität der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abhängig ist von der Oligomerisierung über Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antikörper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A übertragen. GpL-Fusionsproteine der Antikörper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Veränderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was für eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antikörper-Fusionsproteinen spricht.
Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antikörperkette eine sehr gute Möglichkeit darstellt, Antigen-Antikörper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antikörpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen gängigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivität. Außerdem könnte dieses Antikörper-Fusionsproteinformat zukünftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivität benötigt werden würde.
Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays.
In Deutschland erkranken jährlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa
12.000 die Diagnose „Leukämie“ gestellt bekommen [1]. Unter den Leukämien weist
die akute myeloische Leukämie (AML) die ungünstigste Prognose auf, sodass hier
erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zusätzlich schnitten viele potentielle Therapeutika,
die sich in bisherigen präklinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen
haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die
Etablierung eines 3D in vitro Blutgefäß-/Gewebemodells als verbessertes präklinisches
System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von
Leukämien beitragen sollen.
Das 3D Blutgefäßmodell bestand aus humanen primären Endothelzellen, welche
als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix
(SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-tägiger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz
entsprechend nichtadhärente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib
oder entsprechende Kontrolllösungen beziehungsweise bimolekulare Antikörperkonstrukte
mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-tägiger Inkubation
mit Tipifarnib beziehungsweise 24-stündiger Behandlung mit Antikörperkonstrukten
wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen
mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modellüberstände ermittelt. Zum
Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde,
stellvertretend für alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-Färbung durchgeführt,
welche negativ ausfiel. Mögliche Kollateralschäden am Endothel wurden
mittels histologischen Färbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht.
In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell
äquivalente, dosisabhängige und antileukämische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen.
Bei Applikation der Antikörperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich
bei konstanten Konzentrationen der Antikörperkonstrukte im 3D Modell deutlich
höhere Apoptoseraten (58%) als im 2D Modell (38%). Stellt man Vergleiche von
Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antikörperkonstrukten an, so ließen sich
im 2D Modell ähnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38% bei
Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger
konzentrierten Antikörperkonstrukte bei kürzerer Inkubationsdauer eine noch
höhere spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58%) als 500 nM
Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40%). Bezüglich der Nebenwirkungen ließ sich
im 3D Modell nach Applikation von Antikörperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss
auf das Endothel erkennen, während Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO
versetzten Kontrolllösungen zu einer dosisabhänigen Destruktion des ursprünglichen
Endothelzellmonolayers führten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische,
Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige
onkologische Therapien dar.
Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur
konventionellen Zellkultur eine natürlichere Mikroumgebung für Zellen geschaffen
und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf
die Gefäßstrukturen untersucht werden.
Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application
(2019)
Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches.
This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid.
Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed.
Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible.
Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared.
Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions.
In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site.
Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) spielt eine zentrale Rolle in entzündlichen Prozessen. Die Behandlung mit Antikörpern, die murines GM-CSF neutralisieren, zeigte signifikante Behandlungseffekte in Maus-Modellen für Rheumatoide Arthritis, Autoimmune Enzephalomyelitis, entzündliche Erkrankungen der Lunge und Psoriasis. Diese Arbeit beschreibt die Generierung des ersten vollständig humanen Einzelketten (scFv)-Antikörpers, der effektiv humanes GM-CSF (hGM-CSF) neutralisiert. Dieser humane scFv-Antikörper wurde mit Hilfe der Phage-Display-Technologie, ausgehend von einem monoklonalen Ratten-Antikörper mit hGM-CSF-neutralisierender Aktivität, konstruiert. In einem ersten Schritt wurde die VH-Domäne des parentalen Ratten-Antikörpers mit einem humanen leichte Ketten V-Repertoire kombiniert. Nach Phage-Display-Selektion wurde ein dominanter Klon identifiziert, der für ein chimäres Ratte/Human scFv-Fragment kodiert. Dieser scFv-Antikörper neutralisiert hGM-CSF mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) im nanomolaren Bereich. Die humane leichte Kette dieses Klons wurde dann mit einem humanen schwere Ketten V-Repertoire kombiniert. Um die Bindungsspezifität des Ursprungsantikörpers für den neutralisierenden Bereich auf dem Antigen zu erhalten, enthielt dieses Repertoire die Komplementaritäts-bestimmende Region 3 (CDR3) der parentalen VH-Domäne. Nach Phage-Display-Selektion wurden mehrere scFv-Antikörper identifiziert, die hGM-CSF im niedrig nanomolaren Konzentrationsbereich neutralisierten. Das scFv-Fragment mit der höchsten hGM-CSF-neutralisierenden Aktivität (3077) wurde in verschiedene therapeutisch relevante Antikörperformate überführt. Zum einen wurde das scFv-Fragment über einen zusätzlichen C-terminalen Cystein-Rest an ein verzweigtes, 40 kD-grosses Polyethylenglycol (PEG) –Polymer konjugiert. Zum anderen wurde das scFv-Fragment durch Fusion mit humanen konstanten Immunglobulin-Domänen zu einem ganzen IgG1/kappa-Antikörper vervollständigt. Die so generierten Konstrukte mit identischer Spezifität wurden dann in vitro im Hinblick auf Bindungsaffinität, Neutralisierungsaktivität und Stabilität untersucht. Die Konjugation des PEG-Polymers hatte einen vernachlässigbaren Effekt auf das Neutralisierungspotential des scFv-Fragments in vitro, obwohl sie aufgrund einer verlangsamten Assoziationsrate eine reduzierte Bindungsaffinität verursachte. Der humane IgG1-Antikörper zeigte sowohl eine verbesserte Bindungsaffinität als auch eine erhöhte Neutralisierungsaktivität im Vergleich zum nicht-PEGylierten wie auch zum PEGylierten scFv-Fragment. Wir konnten außerdem zeigen, dass die PEGylierung in der thermischen Stabilität des scFv-Antikörpers einen deutlichen Anstieg um 10°C vermittelte. Aufgrund der hohen Neutralisierungsaktivität und Stabilität des IgG1-Antikörpers 3077 wie auch des PEGylierten scFv-Fragments 3077 sind beide Moleküle - in unterschiedlichen klinischen Anwendungsbereichen - potentielle Kandidaten für eine Behandlung humaner entzündlicher Erkrankungen.
Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie für Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantikörpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zelluläre Prion-Protein beschrieben und die zellulären und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten Mäusen spezifische Antikörper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erhöhte Zytokinspiegel von TNF und IFN induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antikörperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypmäusen nachgewiesen werden. Die induzierten Antikörper in Wildtypmäusen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgeführt. Hierfür wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zusätzlich zum PrP für das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in früheren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen körpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antikörperantwort in Prnp0/0-Mäusen induziert werden konnte. In Wildtypmäusen wurden allerdings nur geringe Antikörpertiter nachgewiesen. Die Antikörper aus den Prnp0/0-Mäusen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-Mäusen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 stärker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypmäusen eine unspezifische Erhöhung der Zytokinantwort mit erhöhten TNF- und IFN-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgeführt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypmäuse mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle Mäuse aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und für Prionenerkrankungen typische histopathologische Veränderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren.
Humane Antikörper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universität Würzburg einige rein humane monoklonale Antikörper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antikörper galt es im Rahmen dieser Arbeit näher zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antikörper. Mithilfe immunhistochemischer Färbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antikörpern eine tumorspezifische Reaktivität ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgewählten Fälle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus lässt sich eine zuverlässige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumorösen Zellen, als auch der Größe und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verlässliche Marker für multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und können somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterführenden Untersuchungen überlassen werden.