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Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt.
Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln.
Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt.
dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden.
Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar.
Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht.
Untersuchungen zur Akkumulation phenolischer Inhaltsstoffe von Equisetum an gametophytischen und unterirdisch wachsenden sporophytischen Geweben vervollständigten den Kenntnisstand der phenolischen Inhaltsstoffe in dieser Gattung. In beiden Geweben konnten – wie in oberirdischen sporophytischen Geweben – Hydroxyzimtsäurederivate nachgewiesen werden. Styrylpyrone und Protoflavonoide ersetzen hier die in oberirdischen sporophytischen Geweben nachgewiesenen Flavonoide. Hydroxyzimtsäurederivate wurden in Prothallien aller untersuchter Arten gefunden wohingegen in Rhizomen der jeweiligen Arten einzelne Hydroxyzimtsäurederivate fehlten. Die Inhaltsstoffmuster der Styrylpyrone bei verschiedenen Arten entsprachen sich weitgehend. Die sukzessive Analyse des Übergangsbereiches - unterirdisch wachsendes Rhizom zu oberirdischem Spross - zeigte einen ebenso sukzessiven Wechsel im Akkumulationsmuster. Der Gehalt löslicher Styrylpyrone nahm - von unten nach oben betrachtet - in gleichem Maße ab, wie der Gehalt an Flavonoiden anstieg. In lokal braun pigmentierten Sprossbereichen, die vereinzelt an oberirdisch wachsenden Sporophyten auftraten, wurden neben den in Rhizomen konstitutiv akkumulierten Styrylpyronen auch, offenbar durch Verwundung induziert, Styrylpyrone detektiert. In den grünen, nicht pigmentierten Bereichen dieser Sprosse wurden dagegen ausschließlich Flavonoide und Hydroxyzimtsäurederivate detektiert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen belegten eine vakuoläre Speicherung der löslichen Inhaltsstoffe Styrylpyrone und Hydroxyzimtsäurederivate in Rhizomen und Prothallien. Hydroxyzimtsäurederivate wurden vorwiegend in zentral liegenden Rhizombereichen detektiert, während Styrylpyrone über den gesamten Rhizomquerschnitt verteilt sichtbar gemacht werden konnten. Folgende Styrylpyrone wurden aus Rhizomen von E. arvense isoliert und mit Hilfe spektroskopischer Methoden in ihrer Struktur aufgeklärt: 3,4-Dihydroxy-6-(4´-hydroxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-D-glucopyranosid und 3,4-Dihydroxy-6-(3´-hydroxy-4´methoxy-E-styryl)-2-pyron-3-O-ß-glucopyranosid. Untersuchungen zur Biosynthese von Styrylpyronen zeigten eine enzymkatalysierte Bildung von Hispidin und Bisnoryangonin in Gametophyten verschiedener Equisetum-Arten sowie in Rhizomen und fertilen Sporophyten von E. arvense. Ebenso gelang der Nachweis der enzymatischen Glycosilierung von 3-Hydroxyhispidin zu Equisetumpyron in Gametophyten von E. arvense. Eine Styrylpyronsynthase wurde charakterisiert: Das pH-Optimum für die Bildung von Bisnoryangonin lag bei pH 7,5-7,8 und für die Bildung von Hispidin bei 6,8-7,0, jeweils in 0,5 M KPi-Puffer. Das Temperaturoptimum für die Bildung von Bisnoryangonin betrug 30° C bzw. 37°C für die Bildung von Hispidin. Die Substanzen Natriumascorbat in einer Konzentration von 20 mM, BSA (0,1 % w/V), Dithiothreitol (2,5 mM) bzw. Mercaptoethanol (7 mM) konnten die Enzymaktivität deutlich steigern. Die KmWerte wurden für die Substrate Kaffeoyl-CoA und Malonyl-CoA bei 116 µM bzw. 141 µM ermittelt. Für die Substrate p-Cumaroyl-CoA und Malonyl-CoA lagen die KmWerte bei 182 µM bzw. 238 µM. Das relative Molekulargewicht des nativen Enzyms wurde mittels Gelfiltration mit 78-80 kD bestimmt. Im Rahmen der Proteinreinigung wurde eine auf chromatographischen Techniken basierende Methode entwickelt, mit der die Styrylpyronsynthase mit einem Anreicherungsfaktor von 1107 bei einer Ausbeute von 0,08 % gereinigt werden konnte.
Die vorliegende Dissertation leistet einen Beitrag zur spektroskopischen Messmethodik nanoskaliger Strukturen. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Entwicklung und Erprobung eines spektrofluorimetrischen Aufbaus, mit dessen Hilfe ein aus Kohlenstoffnanoröhren und DNA-Oligomeren bestehendes supramolekulares Modellsystem einer optischen Untersuchung zugänglich gemacht wird. Die Vielseitigkeit der Messeinheit aus Mikroskop und Spektrometer wird an einer weiteren Substanzklasse untermauert. So wird das Emissionsverhalten von in Siliziumcarbidkristallen induzierten Defektzentren einer räumlich, spektral und zeitlich aufgelösten Charakterisierung unterzogen.
Die zentrale Komponente des Spektrofluorimetrieaufbaus stellt eine Superkontinuumlichtquelle dar. In Verbindung mit einem elektronisch geregelten Filtermodul zur Wellenlängenselektion erlaubt sie die Durchführung von Photolumineszenz-Anregungsexperimenten. Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Systemen, die überwiegend auf eine spektroskopische Charakterisierung gelöster oder kolloidal stabilisierter Substanzen abzielen, erlaubt der hier realisierte Aufbau auch die PL- mikroskopische Untersuchung kondensierter Proben, was durch die Epi-Bauweise auch opake Substrate einschließt. Der Einsatz von InGaAs-Sensoren weitet das Detektionsfenster auf den Nahinfrarotbereich aus, sowohl hinsichtlich des Kamera- als auch des Spektroskopiekanals.
Anhand verschiedenartiger Kohlenstoffnanorohrproben, die entweder in flüssiger Phase dispergiert oder in festem Zustand als Film abgeschieden vorliegen, wird die Leistungsfähigkeit des PLE-Experiments unter Beweis gestellt. Neben der Zuordnung der Chiralitäten in polydispersen SWNT-Suspensionen wird dies auch durch die Untersuchung von Energietransferprozessen und die Studie von Umgebungseinflüssen demonstriert.
Die Charakterisierung des DNA-SWNT-Modellsystems in mikrofluidischer Umgebung macht von der fluoreszenzmikroskopischen Detektionseinheit Gebrauch. Während die intrinsische Photolumineszenz der Nanoröhren sicherstellen soll, dass Letztere in ausreichender Anzahl auf den mikrostrukturierten Substraten vorhanden sind, wird die extrinsische Photolumineszenz der funktionalisierten Oligonukleotide als spektroskopisches Maß für die DNA-Konzentration herangezogen. Das hierbei beobachtete Agglomerationsverhalten der farbstoffmarkierten Oligomere geht mit einer lokal erhöhten Fluoreszenzintensität einher und erlaubt damit die quantitative Auswertung der auf PL-Einzelbildern basierenden Zeitserien. Zugleich wird damit eine Abschätzung der DNA-Belegung auf den Nanoröhren möglich. Im Falle der aus 16 alternierenden Guanin-Thymin-Einheiten bestehenden Basensequenz lösen sich nach Initiieren des Desorptionsvorgangs ein Großteil der Oligomere von der Nanorohroberfläche ab. Lediglich ein Fünftel bleibt in adsorbierter Form zurück, was sich jedoch für die Hybridstabilität als ausreichend erweist. Die Freisetzung weiterer Oligomere bleibt bei der Versuchstemperatur von 20 °C trotz der hohen Verdünnung aus, da aufgrund des größeren Interadsorbatabstands und der damit verbundenen Abnahme repulsiver Wechselwirkungen die Aktivierungsbarriere für ihre Desorption steigt. Die Stabilität der DNA-SWNT-Konjugate liegt demnach in ihrer kinetischen Inertheit begründet, die sie vor einer Reaggregation bewahrt.
Die Studie der in Siliziumcarbid induzierten Fehlstellendefekte kann als Beleg für die breite Anwendbarkeit des spektrofluorimetrischen Aufbaus gelten. PL-Mikroskopaufnahmen zeigen hierbei, dass die Anzahl der Defektzentren mit der Bestrahlungsintensität kontrolliert werden kann – von einer kontinuierlichen Verteilung bei hohen Strahlungsintensitäten über heterogene Defektansammlungen bis hin zu Einzeldefektstellen bei niedrigen Strahlungsdosen. Letztere resultieren in beugungsbegrenzten Signaturen und erlauben damit eine Charakterisierung des abbildenden Systems sowie des Anregungsfokus. Anhand der PLE-Analyse lässt sich das Absorptionsmaximum abschätzen. Aussagen zur zeitlichen Entwicklung des Emissionsverhaltens werden durch TCSPC-Messungen erhalten. Die abschließende Untersuchung des Photonenflusses mit Hilfe von Korrelationsexperimenten nach Hanbury Brown-Twiss zeigt bei Raumtemperatur kein Auftreten von Photonantibunching.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist.
The resolution of fluorescence light microscopy was long believed to be limited by the diffraction limit of light of around 200-250 nm described in 1873 by Ernst Abbe. Within the last decade, several approaches, such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion STED and (direct) stochastic optical reconstruction microscopy (d)STORM have been established to bypass the diffraction limit. However, such super-resolution techniques enabling a resolution <100 nm require specialized and expensive setups as well as expert knowledge in order to avoid artifacts. They are therefore limited to specialized laboratories. Recently, Boyden and colleagues introduced an alternate approach, termed expansion microscopy (ExM). The latter offers the possibility to perform superresolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded. Since its introduction in 2015, expansion microscopy has developed rapidly offering protocols for 4x, 10x and 20x expansion of proteins and RNA in cells, tissues and human clinical specimens.
Mitochondria are double membrane-bound organelles and crucial to the cell by performing numerous tasks, from ATP production through oxidative phosphorylation, production of many important metabolites, cell signaling to the regulation of apoptosis. The inner mitochondrial membrane is strongly folded forming so-called cristae. Besides being the location of the oxidative phosphorylation and therefore energy conversion and ATP production, cristae have been of great interest because changes in morphology have been linked to a plethora of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. However, cristae imaging remains challenging as the distance between two individual cristae is often below 100 nm. Within this work, we demonstrate that the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to fluorescent protein GFP (MtCK-GFP) can be used as a cristae marker. Upon fourfold expansion, we illustrate that our novel marker enables visualization of cristae morphology and localization of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. Furthermore, we show the applicability of expansion microscopy for several bacterial pathogens, such as Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus. Due to differences in bacterial cell walls, we reveal important aspects for the digestion of pathogens for isotropic expansion. We further show that expansion of the intracellular pathogens C. trachomatis and S. negevensis, enables the differentiation between the two distinct developmental forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We demonstrate the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside the chlamydial inclusion. Moreover, we show that expansion microscopy enables the investigation of bacteria, herein S. aureus, within LAMP1 and LC3-II vesicles. With the introduction of the unnatural α-NH2-ω-N3-C6-ceramide, we further present the first approach for the expansion of lipids that may also be suitable for far inaccessible molecule classes like carbohydrates. The efficient accumulation and high labeling density of our functionalized α-NH2-ω-N3-C6-ceramide in both cells and bacteria enables in combination with tenfold expansion nanoscale resolution (10-20 nm) of the interaction of proteins with the plasma membrane, membrane of organelles and bacteria. Ceramide is the central molecule of the sphingolipid metabolism, an important constituent of cellular membranes and regulates many important cellular processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Many studies report about the importance of sphingolipids during infection of various pathogens. While the transport of ceramide to Chlamydia has been reported earlier, one of the unanswered questions remaining was if ceramide forms parts of the outer or inner bacterial membrane. Expansion of α-NH2-ω-N3-C6-ceramide enabled the visualization of ceramide in the inner and outer membrane of C. trachomatis and their distance was determined to be 27.6 ± 7.7 nm.
Fluorescence microscopy is a form of light microscopy that has developed during the 20th century and is nowadays a standard tool in Molecular and Cell biology for studying the structure and function of biological molecules. High-resolution fluorescence microscopy techniques, such as dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the visualization of cellular structures at the nanometre scale (10−9 m). This has already made it possible to decipher the composition and function of various biopolymers, such as proteins, lipids and nucleic acids, up to the three-dimensional (3D) structure of entire organelles. In practice, however, it has been shown that these imaging methods and their further developments still face great challenges in order to achieve an effective resolution below ∼ 10 nm. This is mainly due to the nature of labelling biomolecules. For the detection of molecular structures, immunostaining is often performed as a standard method. Antibodies to which fluorescent molecules are coupled, recognize and bind specifcally and with high affnity to the molecular section of the target structure, also called epitope or antigen. The fluorescent molecules serve as reporter molecules which are imaged with the use of a fluorescence microscope. However, the size of these labels with a length of about 10-15 nm in the case of immunoglobulin G (IgG) antibodies, cause a detection of the fluorescent molecules shifted to the real position of the studied antigen. In dense regions where epitopes are located close to each other, steric hindrance between antibodies can also occur and leads to an insuffcient label density. Together with the shifted detection of fluorescent molecules, these factors can limit the achievable resolution of a microscopy technique. Expansion microscopy (ExM) is a recently developed technique that achieves a resolution improvement by physical expansion of an investigated object. Therefore, biological samples such as cultured cells, tissue sections, whole organs or isolated organelles are chemically anchored into a swellable polymer. By absorbing water, this so-called superabsorber increases its own volume and pulls the covalently bound biomolecules isotropically apart. Routinely, this method achieves a magnifcation of the sample by about four times its volume. But protocol variants have already been developed that result in higher expansion factors of up to 50-fold. Since the ExM technique includes in the frst instance only the sample treatment for anchoring and magnifcation of the sample, it can be combined with various standard methods of fluorescence microscopy. In theory, the resolution of the used imaging technique improves linearly with the expansion factor of the ExM treated sample. However, an insuffcient label density and the size of the antibodies can here again impair the effective achievable resolution. The combination of ExM with high-resolution fluorescence microscopy methods represents a promising strategy to increase the resolution of light microscopy. In this thesis, I will present several ExM variants I developed which show the combination of ExM with confocal microscopy, SIM (Structured Illumination Microscopy), STED (STimulated Emission Depletion) and dSTORM. I optimized existing ExM protocols and developed different expansion strategies, which allow the combination with the respective imaging technique. Thereby, I gained new structural insights of isolated centrioles from the green algae Chlamydomonas reinhardtii by combining ExM with STED and confocal microscopy. In another project, I combined 3D-SIM imaging with ExM and investigated the molecular structure of the so-called synaptonemal complex. This structure is formed during meiosis in eukaryotic cells and contributes to the exchange of genetic material between homologous chromosomes. Especially in combination with dSTORM, the ExM method showed its high potential to overcome the limitations of modern fluorescence microscopy techniques. In this project, I expanded microtubules in mammalian cells, a polymer of the cytoskeleton as well as isolated centrioles from C. reinhardtii. By labelling after expansion of the samples, I was able to signifcantly reduce the linkage error of the label and achieve an improved label density. In future, these advantages together with the single molecule sensitivity and high resolution obtained by the dSTORM method could pave the way for achieving molecular resolution in fluorescence microscopy
Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology.
Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family – not only in classical mechanosensory structures.
This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function.
The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons – a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology.
SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt.
Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden.
Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert.
In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann.
Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert.
Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert.
Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen
Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind.
Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu.
In mammals, anucleate platelets circulate in the blood flow and are primarily responsible for maintaining functional hemostasis. Platelets are generated in the bone marrow (BM) by megakaryocytes (MKs), which mainly reside directly next to the BM sinusoids to release proplatelets into the blood. MKs originate from hematopoietic stem cells and are thought to migrate from the endosteal to the vascular niche during their maturation, a process, which is, despite being intensively investigated, still not fully understood.
Long-term intravital two photon microscopy (2PM) of MKs and vasculature in murine bone marrow was performed and mean squared displacement analysis of cell migration was performed. The MKs exhibited no migration, but wobbling-like movement on time scales of 3 h. Directed cell migration always results in non-random spatial distribution. Thus, a computational modelling algorithm simulating random MK distribution using real 3D light-sheet fluorescence microscopy data sets was developed. Direct comparison of real and simulated random MK distributions showed, that MKs exhibit a strong bias to vessel-contact. However, this bias is not caused by cell migration, as non-vessel-associated MKs were randomly distributed in the intervascular space. Furthermore, simulation studies revealed that MKs strongly impair migration of other cells in the bone marrow by acting as large-sized obstacles. MKs are thought to migrate from the regions close to the endosteum towards the vasculature during their maturation process. MK distribution as a function of their localization relative to the endosteal regions of the bones was investigated by light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The results show no bone-region dependent distribution of MKs. Taken together, the newly established methods and obtained results refute the model of MK migration during their maturation.
Ischemia reperfusion (I/R) injury is a frequent complication of cerebral ischemic stroke, where brain tissue damage occurs despite successful recanalization. Platelets, endothelial cells and immune cells have been demonstrated to affect the progression of I/R injury in experimental mouse models 24 h after recanalization. However, the underlying Pathomechanisms, especially in the first hours after recanalization, are poorly understood.
Here, LSFM, 2PM and complemental advanced image analysis workflows were established for investigation of platelets, the vasculature and neutrophils in ischemic brains. Quantitative analysis of thrombus formation in the ipsilateral and contralateral hemispheres at different time points revealed that platelet aggregate formation is minimal during the first 8 h after recanalization and occurs in both hemispheres. Considering that maximal tissue damage already is present at this time point, it can be concluded that infarct progression and neurological damage do not result from platelet aggregated formation. Furthermore, LSFM allowed to confirm neutrophil infiltration into the infarcted hemisphere and, here, the levels of endothelial cell marker PECAM1 were strongly reduced. However, further investigations must be carried out to clearly identify the role of neutrophils and the endothelial cells in I/R injury.
Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication.
Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains.
This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron.
The present thesis concerns the molecular imaging of opioid receptors and human butyrylcholinesterase with the aid of tailored probes, which are suitable for the respective applied imaging techniques. The first part focusses on imaging of opioid receptors with selective probes using total internal reflection- and single molecule fluorescence microscopy. Design and synthesis of the ligands are presented and their pharmacological characterization and application in microscopy experiments are shown. The second part of this thesis focused on the development of 18F-labeled, selective radiotracers for imaging of butyrylcholinesterase via positron emission tomography. The design and synthesis of each a reversible and pseudoirreversible 18F-labeled tracer are presented. After evaluation of the binding properties of each tracer, their initial application in ex vivo autoradiography- and preliminary in vivo microPET studies is described and analyzed.
In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD.
This thesis includes measurements that were recorded by cooperation partners. The EPR spec‐ trosa mentioned in section 5.2 were recorded by Michael Auth from the Dyakonov Group (Ex‐ perimental Physics VI, Julius‐Maximilians‐Universität, Würzburg). The TREFISH experiments and transient absorption in section 5.4 spectra were performed by Jašinskas et al. from the V. Gulbi‐ nas group (Center for Physical Sciences and Technology, Vilnius, Lithuania). This dissertation investigated the interactions of semiconducting single‐walled carbon nanotubes (SWNTs) of (6,5) chirality with their environment. Shear‐mixing provided high‐quality SWNT sus‐ pensions, which was complemented by various film preparation techniques. These techniques were in turn used to prepare heterostructures with MoS2 and hBN, which were examined with a newly constructed photoluminescence microscope specifically for this purpose. Finally, the change of spectral properties of SWNTs upon doping was investigated in more detail, as well as the behaviour of charge carriers in the tubes themselves. To optimise the SWNT sample preparation techniques that supplied the other experiments, the sample quality of shear‐mixed preparations was compared with that of sonicated samples. It was found that the quantum efficiency of sheared suspensions exceeds that of sonicated suspensions as soon as the sonication time exceeds 30 min. The higher PLQY is due to the lower defect concentration in shear‐mixed samples. Via transient absorption, a mean lifetime of 17.3 ps and a mean distance between defects of 192.1 nm could be determined. Furthermore, it was found that the increased efficiency of horn sonication is probably not only due to higher shear forces acting on the SWNT bundles but also that the shortening of PFO‐BPy strands plays a significant role. Sonication of very long polymer strands significantly increased their effectiveness in shear mixing. While previous approaches could only achieve very low concentrations of SWNTs in suspensions, pre‐sonicated polymer yielded results which were comparable with much shorter PFO‐BPy batches. Reference experiments also showed that different aggregation processes are relevant during production and further processing. Initial reprocessing of carbon nanotube raw material requires 7 h sonication time and over 24 h shear mixing before no increase in carbon nano concentration is detectable. However, only a few minutes of sonication or shear mixing are required when reprocessing the residue produced during the separation of the slurry. This discrepancy indicates that different aggregates are present, with markedly different aggregation properties. To study low‐dimensional heterostructures, a PL microscope was set up with the ability to ob‐ serve single SWNTs as well as monolayers of other low‐dimensional systems. Furthermore, sam‐ ples were prepared which bring single SWNTs into contact with 2D materials such as h‐BN andMoS2 layers and the changes in the photoluminescence spectrum were documented. For h‐BN, it was observed whether previous methods for depositing SWNTs could be transferred for photo‐ luminescence spectroscopy. SWNTs were successfully deposited on monolayers via a modified drip coating, with the limitation that SWNTs aggregate more at the edges of the monolayers. Upon contact of SWNTs with MoS2, significant changes in the emission properties of the mono‐ layers were observed. The fluorescence, which was mainly dominated by excitons, was shifted towards trion emission. Reference experiments excluded PFO‐BPy and toluene as potential causes. Based on the change in the emission behaviour of MoS2, the most plausible explanation is a photoinduced charge transfer leading to delocalised charge carriers on MoS2. In contrast, on SWNTs, the introduction of additional charges would constitute a quenching centre, which would quench their PL emission, making them undetectable in the PL image. In the last chapter, the electronic properties of doped SWNTs and the behaviour of charge carri‐ ers inside the tubes should be investigated. First, the change in the conductivity of SWNT films with increasing doping levels was docu‐ mented. The resistance of the films drops drastically at minimum doping. After the initial in‐ troduction of charges, the resistance drops with increasing dopant concentration according to a double logarithmic curve. The initial drop could be due to a reduction of contact resistances within the SWNT network film, but this could not be further investigated within the scope of this PhD thesis. In cooperation with Andreas Sperlich and Michael Auth, the spin concentration of SWNTs at different doping levels was determined. The obtained concentrations were compared with the carrier concentrations determined from PL and absorption spectra. At low spin densities, good agreement with previous models was found. Furthermore, the presence of isolated spins strongly suggests a localised charge carrier distribution at temperatures around 10 K. When the charge density is increased, the spin density deviates significantly from the charge carrier con‐ centration. This discrepancy is attributed to the increasing delocalisation of charge carriers at high charge densities and the interactions of neighbouring spins. These results strongly indicate the existence of localised charge carriers in SWNTs at low temperatures. Next, the effect of doping on the Raman spectra of SWNT suspensions was investigated. In gen‐ eral, doping is expected to reduce the intensity of the Raman bands, i.e. a consequence of the reduced resonance gain due to bleaching of the S2 transition. However, similar to the resistivity measurements, the oscillator strength of the G+ band drops sharply in the first doping steps. It was also found that the G+ band decreases more than would be expected due to loss of reso‐ nance condition. Furthermore, the G‐ is bleached faster than the G+ band. All these anomalies suggest that resonance enhancement is not the only relevant effect. Another much faster deac‐ tivation path for the excitons may be introduced by doping. This would leave less time for the scattering process to occur and reduce the oscillator strength of the Raman bands. In cooperation with Vidmantas et al., the photoinduced charge carrier behaviour of SWNT/PCBM films was investigated. The required films were prepared by drop coating. The SWNT suspen‐ sions required for this were obtained from sheared SWNT preparations. Using transient absorp‐ tion and TREFISH, a number of charge transfer effects were identified and their dynamics in‐ vestigated: the recombination of neutral excitons (< 50 ps), the electron transfer from carbon nanotubes to PCBM molecules (< 1 ps), the decay of charge‐transfer excitons (∼200 ps), the recombination of charge carriers between charge‐transfer excitons (1 ns to 4 ns) and finally the propagation through the SWNT network (∼20 ns)
Photolumineszenzmikroskopie und -spektroskopie endohedraler Farbstoffe in Bornitridnanoröhren
(2024)
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, wie die Einkapselung organischer Farbstoffmoleküle in Bornitridnanoröhren (BNNTs) die photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore beeinflusst. Als Farbstoffe wurden hierbei alpha-Quaterthiophen (4T), alpha-Sexithiophen (6T), alpha-Octithiophen (8T) sowie Nilrot (NR) ausgewählt. Die eingesetzten BNNTs besitzen einen nominellen Durchmesser von \(5 \pm 2\)nm.
Für die Charakterisierung der reinen Farbstoffe und der hybriden Systeme aus Farbstoff und Nanoröhre kam ein Laboraufbau zum Einsatz, der neben Absorptions- und Photolumineszenz (PL)-Spektroskopie auch PL-Mikroskopie ermöglicht. Zusätzlich lässt sich damit auch eine zeitaufgelöste Untersuchung der PL (engl. time correlated single photon counting, TCSPC) im Ensemble und an einzelnen, separierten Nano-Objekten (mit Farbstoff gefüllte BNNTs) umsetzen.
In Kapitel 5 wurden zunächst die freien Farbstoffe in Lösung charakterisiert. Es hat sich gezeigt, dass sowohl 4T als auch NR im verwendeten Lösemittel Dimethylformamid (DMF) löslich sind, wohingegen 6T und 8T hier eine geringere Löslichkeit zeigen. Die unterschiedlichen Verläufe der konzentrationsabhängigen PL-Spektren für 4T und 6T in DMF lassen sich vermutlich auf diesen Löslichkeitsunterschied zurückführen. Zudem wurden Extinktionskoeffizienten für 4T und NR mittels konzentrationsabhängiger Absorptionsspektren bestimmt und es zeigte sich eine gute Übereinstimmung mit der Literatur. Für 6T und 8T war eine Bestimmung aufgrund der geringen Löslichkeit nicht möglich, weshalb auf Literaturwerte zurückgegriffen wurde oder diese extrapoliert wurden (8T).
In Kapitel 6 erfolgte die detaillierte Charakterisierung der mit Oligothiophenen gefüllten BNNTs. Die Befüllung wurde dabei im Wesentlichen nach einem von C. Allard publizierten Verfahren durchgeführt und auf die zusätzlichen Fluorophore 4T, 8T und NR übertragen. Für Messungen mittels UV-Vis-Spektroskopie in Lösung bzw. Dispersion hat sich beim Farbstoff 6T gezeigt, dass sich das Absorptionsmaximum von 407nm (freies 6T) hin zu 506nm (6T@BNNT) verschiebt. Ursache hierfür ist vermutlich die Bildung von J-Aggregaten im Inneren der Röhren. Die entsprechenden PL-Spektren von freiem 6T und dem Hybridsystem zeigen dabei keine signifikanten Unterschiede. Für konzentrationsabhängige PL-Spektren von 6T@BNNT ergibt sich (anders als bei freiem 6T in DMF) keine Änderung des Verlaufs der Kurven, was als ein Indiz für eine erfolgreiche Einkapselung gedeutet werden kann.
Durch Kombination von Rasterkraft- und PL-Mikroskopie konnten die Außendurchmesser von einzelnen 6T@BNNT Objekten ermittelt und in direkten Zusammenhang mit deren photophysikalischen Eigenschaften gebracht werden. Bei einer Analyse der Polarisation des Emissionslichtes von 6T@BNNT in Abhängigkeit des Außendurchmessers ließ sich jedoch keine klare Korrelation zwischen Struktur und Emissionscharakteristiken erkennen. Diese Beobachtung lässt sich vermutlich dadurch erklären, dass mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie lediglich der Außendurchmesser der (teils mehrwandigen) BNNTs bestimmt werden kann. Die entscheidende Größe an dieser Stelle ist allerdings der innere Durchmesser der BNNTs, welcher die Ausrichtung und damit auch die Polarisation der Farbstoffmoleküle beeinflusst.
Ein Vergleich des mittleren maximalen Polarisationsgrades der jeweiligen Hybridsysteme hat gezeigt, dass 4T@BNNT den geringsten und 6T@BNNT mit den höchsten Wert aufweist. Dies bestätigt die Annahme, dass mit zunehmender Moleküllänge die Polarisation, aufgrund des höheren Templat-Effektes der Röhre, zunimmt. 8T@BNNT liegt zwischen den beiden anderen Werten, was dieser Annahme widerspricht. Der mittlere Verkippungswinkel der eingekapselten Farbstoffmoleküle gegenüber der Röhrenachse liegt für 4T@BNNT bei etwa 16° und ist damit etwas größer als derjenige von 6T@BNNT. Somit zeigt sich auch hier, dass kürzere Moleküle mehr sterische Freiheitsgerade im Innern der Röhren besitzen. Für 8T@BNNT liegt der Winkel bei ca. 28° und widerspricht abermals der Annahme.
TCSPC-Messungen an freien Oligothiophen-Farbstoffen sowie an den hybriden Systemen zeigten, dass die Fluoreszenzlebensdauer \(\tau\) für 4T und 6T (jeweils in DMF) infolge der Einkapselung deutlich zunimmt wenn die Hybridsysteme ebenfalls in DMF dispergiert sind. Die ermittelten Werte für \(\tau\) der separierten Nanoobjekte lagen für 4T@BNNT und 6T@BNNT unterhalb der entsprechenden in DMF. Für 8T bzw. 8T@BNNT ergab sich eine deutlich kürzerer Lebensdauer der separierten Nanoobjekte im Vergleich zum freien Farbstoff in kolloidaler Suspension. Ein erster Ansatz, um den zugrundeliegende Mechanismus aufzuklären, bestand darin, die TCSPC-Spektren (für 6T in DMF und 6T@BNNT in DMF) hinsichtlich der einzelnen Zerfallskanäle zu analysieren. Die erhaltenen Ergebnisse deuteten darauf hin, dass bei freiem 6T in DMF andere Zerfallskanäle dominieren als beim Hybridsystem 6T@BNNT (in DMF). Eine Korrelation der Fluorezenslebensdauer von 6T@BNNT vom äußeren Durchmesser der Nanoröhren zeigte keinen eindeutigen Zusammenhang.
Die Charakterisierung von Nilrot bzw. NR@BNNT (analog zu den Oligothiophenen) erfolgte in Kapitel 4. Auch hier zeigte sich eine Verschiebung des PL-Spektrums des Fluorophores durch die Einkapselung in die BNNTs. Allerdings ist das PL-Spektrum des Hybridsystems (NR@BNNT) um etwa 20nm hypsochrom verschoben. Nilrot ist in der Literatur zudem als Nanosonde zur Ermittlung der Permittivität des Lösemittels bzw. der Umgebung bekannt. Dies erlaubte eine Abschätzung der relativen Permittivät im Inneren der BNNTs. Der ermittelte Wert von ca. 4 für ein isoliertes NR@BNNT Objekt deutet auf eine relativ unpolare Umgebung im Röhreninneren hin. Zum Vergleich dazu, liegt der Wert von freiem NR in DMF bei 47, was die relativ hohe Polarität von DMF bestätigt. Der ermittelte Wert für die mittlere maximale Polarisation lag leicht über dem der hybriden Systeme aus Oligothiophenen und Nanoröhren. Für die Auslenkung der NR-Moleküle gegenüber der Röhrenachse ergab sich ein Winkel von etwa 16°, was im Bereich der Werte von 4T@BNNT und 6T@BNNT liegt. Die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz von freiem und eingekapseltem Nilrot hat ergeben, dass auch in diesem Fall eine Verkürzung der Lebensdauer (von 4091 ps auf 812 ps) erfolgte. Eine solche Verkürzung der Lebensdauer von Chromophoren wird in der Literatur unter anderem mit der Bildung von J-Aggregaten in Zusammenhang gebracht.
The plasma membrane is one of the most thoroughly studied and at the same time most complex, diverse, and least understood cellular structures. Its function is determined by the molecular composition as well as the spatial arrangement of its components. Even after decades of extensive membrane research and the proposal of dozens of models and theories, the structural organization of plasma membranes remains largely unknown. Modern imaging tools such as super-resolution fluorescence microscopy are one of the most efficient techniques in life sciences and are widely used to study the spatial arrangement and quantitative behavior of biomolecules in fixed and living cells. In this work, direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) was used to investigate the structural distribution of mem-brane components with virtually molecular resolution. Key issues are different preparation and staining strategies for membrane imaging as well as localization-based quantitative analyses of membrane molecules.
An essential precondition for the spatial and quantitative analysis of membrane components is the prevention of photoswitching artifacts in reconstructed localization microscopy images. Therefore, the impact of irradiation intensity, label density and photoswitching behavior on the distribution of plasma membrane and mitochondrial membrane proteins in dSTORM images was investigated. It is demonstrated that the combination of densely labeled plasma membranes and inappropriate photoswitching rates induces artificial membrane clusters. Moreover, inhomogeneous localization distributions induced by projections of three-dimensional membrane structures such as microvilli and vesicles are prone to generate artifacts in images of biological membranes. Alternative imaging techniques and ways to prevent artifacts in single-molecule localization microscopy are presented and extensively discussed.
Another central topic addresses the spatial organization of glycosylated components covering the cell membrane. It is shown that a bioorthogonal chemical reporter system consisting of modified monosaccharide precursors and organic fluorophores can be used for specific labeling of membrane-associated glycoproteins and –lipids. The distribution of glycans was visualized by dSTORM showing a homogeneous molecule distribution on different mammalian cell lines without the presence of clusters. An absolute number of around five million glycans per cell was estimated and the results show that the combination of metabolic labeling, click chemistry, and single-molecule localization microscopy can be efficiently used to study cell surface glycoconjugates.
In a third project, dSTORM was performed to investigate low-expressing receptors on cancer cells which can act as targets in personalized immunotherapy. Primary multiple myeloma cells derived from the bone marrow of several patients were analyzed for CD19 expression as potential target for chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Depending on the patient, 60–1,600 CD19 molecules per cell were quantified and functional in vitro tests demonstrate that the threshold for CD19 CAR T recognition is below 100 CD19 molecules per target cell. Results are compared with flow cytometry data, and the important roles of efficient labeling and appropriate control experiments are discussed.
Fluorescence microscopy has become one of the most important techniques for the imaging of biological cells and tissue, since the technique allows for selective labeling with fluorescent molecules and is highly suitable for low-light applications down to the single molecule regime. The methodological requirements are well-defined for studying membrane receptors within a highly localized nanometer-thin membrane. For example, G-protein-coupled receptors (GPCRs) are an extensively studied class of membrane receptors that represent one of the most important pharmaceutical targets. Ligand binding and GPCR activation dynamics are suspected to take place at the millisecond scale and may even be far faster. Thus, techniques that are fast, selective, and live-cell compatible are required to monitor GPCR dynamics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) are methods of choice to monitor the dynamics of GPCRs selectively within the cell membrane.
Despite the remarkable success of these modalities, there are limitations. Most importantly, inhomogeneous illumination can induce imaging artifacts, rendering spectroscopic evaluation difficult. Background signal due to scattering processes or imperfect labeling can hamper the signal-to-noise, thus limiting image contrast and acquisition speed. Careful consideration of the internal physiology is required for FRET sensor design, so that ligand binding and cell compatibility are well-preserved despite the fluorescence labeling procedures. This limitation of labeling positions leads to very low signal changes in FRET-based GPCR analysis. In addition, microscopy of these systems becomes even more challenging in single molecule or low-light applications where the accuracy and temporal resolution may become dramatically low. Fluorescent labels should therefore be brighter, protected from photobleaching, and as small as possible to avoid interference with the binding kinetics. The development of new fluorescent molecules and labeling methods is an ongoing process. However, a complete characterization of new labels and sensors takes time. So far, the perfect dye system for GPCR studies has not been found, even though there is high demand.
Thus, this thesis explores and applies a different approach based on improved illumination schemes for TIRF-M as well as metal-coated coverslips to enhance fluorescence and FRET efficiency. First, it is demonstrated that a 360° illumination scheme reduces typical TIRF artifacts and produces a much more homogenously illuminated field of view. Second, membrane imaging and FRET spectroscopy are improved by metal coatings that are used to modulate the fluorescent properties of common fluorescent dyes. Computer simulation methods are used to understand the underlying photophysics and to design the coatings. Third, this thesis explores the operational regime and limitations of plasmonic approaches with high sectioning capabilities. The findings are summarized by three publications that are presented in the results section of this work. In addition, the theory of fluorescence and FRET is explained, with particular attention to its emission modulations in the vicinity of metal-dielectric layers. Details of the instrumentation, computer simulations, and cell culture are described in the method section. The work concludes with a discussion of the findings within the framework of recent technological developments as well as perspectives and suggestions for future approaches complete the presented work.
Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror
(2020)
The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches.
One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror.
I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens.
The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here.
Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated.
Single-molecule fluorescence microscopy in live \(Trypanosoma\) \(brucei\) and model membranes
(2018)
The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to escape
the host immune response and maintain a persistent infection inside a host. One central
feature of the parasite’s defense mechanism relies on the shielding function of their surface
protein coat. This coat is composed of a dense arrangement of one type of glycosylphosphatidylinositol
(GPI)-anchored variant surface glycoproteins (VSGs) which impair the
identification of epitopes of invariant surface proteins by the immune system. In addition
to the importance of understanding the function of the VSG coat and use it as a potential
target to efficiently fight the parasite, it is also crucial to study its biophysical properties as it is not yet understood sufficiently. This is due to the fact that microscopic investigations
on living trypanosomes are limited to a great extent by the intrinsic motility of the parasite.
In the present study, state-of-the-art single-molecule fluorescence microscopy (SMFM)
is introduced as a tool for biophysical investigations in the field of trypanosome research.
The work encompasses studies of VSG dynamics under the defined conditions of an
artificial supported lipid bilayer (SLB). First, the impact of the lateral protein density on
VSG diffusion was systematically studied in SLBs. Ensemble fluorescence after photobleaching
(FRAP) and complementary single-particle tracking experiments revealed that a
molecular crowding threshold (MCT) exists, above which a density dependent decrease
of the diffusion coefficient is measured. A relative quantification of reconstituted VSGs
illustrated that the VSG coat of living trypanosomes operates very close to its MCT and
is optimized for high density while maintaining fluidity. Second, the impact of VSG
N-glycosylation on VSG diffusion was quantitatively investigated. N-glycosylation was
shown to contribute to preserving protein mobility at high protein concentrations. Third,
a detailed analysis of VSG trajectories revealed that two distinct populations of freely
diffusing VSGs were present in a SLB, which is in agreement with the recent finding, that
VSGs are able to adopt two main structurally distinct conformations. The results from
SLBs were further complemented by single-particle tracking experiments of surface VSGs
on living trypanosomes. A high mobility and free diffusion were measured on the cell
surface, illustrating the overall dynamic nature of the VSG coat. It was concluded that
the VSG coat on living trypanosomes is a protective structure that combines density and
mobility, which is supported by the conformational flexibility of VSGs. These features are
elementary for the persistence of a stable infection in the host.
Different hydrogel embedding methods are presented, that facilitated SMFM in immobilized,
living trypanosomes. The hydrogels were found to be highly cytocompatible for one
hour after cross-linking. They exhibited low autofluorescence properties in the spectral
range of the investigations, making them suitable for super-resolution microscopy (SRM).
Exemplary SRM on living trypanosomes illustrated that the hydrogels efficiently immobilized
the cells on the nanometer lever. Furthermore, the plasma membrane organization was studied in living trypanosomes. A statistical analysis of a tracer molecule inside the
inner leaflet of the plasma membrane revealed that specific membrane domains exist, in
which the tracer appeared accumulated or diluted. It was suggested that this distribution
was caused by the interaction with proteins of the underlying cytoskeleton.
In conclusion, SMFM has been successfully introduced as a tool in the field of trypanosome
research. Measurements in model membranes facilitated systematic studies of VSG dynamics
on the single-molecule level. The implementation of hydrogel immobilization
allowed for the study of static structures and dynamic processes with high spatial and
temporal resolution in living, embedded trypanosomes for the first time.
Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are
likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost.
However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time.
In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data.
I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them.
I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units.
The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model.
I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples.
I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities.
Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems.
I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging.
Die hier vorliegende Forschungsarbeit überprüfte eine mögliche Beteiligung des peripheren Nervensystems bei M. Parkinson und den atypischen Parkinson-Syndromen. 31 Patienten mit einem idiopathischen Parkinson-Syndrom (IPD-Patienten) und neun Patienten mit einem atypischen Parkinson-Syndrom (APD-Patienten) sowie 35 altersentsprechende Kontrollprobanden wurden zwischen 2011 und 2012 für diese Studie rekrutiert. Neben der Eigenanamnese und der neurologischen Untersuchung erhielten die Patienten eine Suralisneurographie zur Überprüfung der large fibers und eine Quantitative sensorische Testung (QST) zur Detektion einer möglichen Small-fiber-Dysfunktion. Die Vitamin-Bestimmung diente der Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen der Levodopa-Therapie, eventuell daraus resultierenden Vitamin-Mangelzuständen und einer reduzierten intraepidermalen Nervenfaser-Dichte (IENF-Dichte) beim M. Parkinson. Für die histologische Auswertung der IENF-Dichte und der dermalen, myelinisierten Nervenfaserbündel (PGP 9.5- / MBP- Doppelfärbung) sowie für die immunohistochemische Untersuchung der Nervenfasersubtypen (anti-alpha-CGRP- und anti-Substanz P-Antikörper) wurden bei jedem Probanden vier Hautbiopsien von den Extremitäten und dem Körperstamm entnommen.
Sieben IPD-Patienten und ein Proband mit einem atypischen Parkinson-Syndrom wiesen ein vermindertes sensorisches Nervenaktionspotenzial (SNAP) in der Suralisneurographie auf. Dagegen war eine pathologisch reduzierte Nervenleitgeschwindigkeit nur bei einem IPD-Patienten nachweisbar. Auffällig war zudem eine negative Korrelation zwischen der Erkrankungsdauer und dem SNAP (Korrelationskoeffizient -0,367, p<0,03). In der Auswertung der Hautbiopsien konnte eine statistisch signifikante Reduktion der myelinisierten Bündel am Unterschenkel der IPD-Patienten festgestellt werden.
Bei zehn von 30 IPD-Patienten, jedoch bei keinem der Probanden mit einem atypischen Parkinson-Syndrom, konnte eine verminderte IENF-Dichte nachgewiesen werden. In der statistischen Überprüfung wurde außerdem am Unterschenkel ein signifikanter Unterschied zwischen den IPD-Patienten und der Kontrollkohorte sowie eine negative Korrelation zwischen der Krankheitsdauer und der IENF-Dichte (Korrelationskoeffizient -0,320, p<0,05) festgestellt. Die QST konnte dagegen keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den einzelnen Kohorten aufzeigen.
Im Kontrast dazu fand sich eine längenunabhängige Reduktion der CGRP-positiven und der Substanz P-positiven IENF-Dichte bei den Patienten mit einem idiopathischen Parkinson-Syndrom. Bemerkenswert war zudem eine signifikante Verminderung der Substanz P-positiven intraepidermalen Nervenfasern am Oberschenkel und Rücken bei den APD-Patienten. Eine statistisch signifikante Abweichung der CGRP- und Substanz P-positiven Bündel konnte dagegen nicht festgestellt werden.
In der laborchemischen Untersuchung war ein Zusammenhang zwischen den bestimmten Vitamin-Spiegeln und der kumulativen Levodopa-Dosis sowie zwischen den Vitaminen und der IENF-Dichte lediglich bei dem Vitamin B6 nachweisbar.
Zusammengefasst erscheint eine Beteiligung des peripheren Nervensystems beim idiopathischen Parkinson als wahrscheinlich, wohingegen bei den atypischen Parkinson-Syndromen vor allem von einer zentralen Genese ausgegangen werden kann. Basierend auf den Ergebnissen der Suralisneurographie und der Bestimmung der myelinisierten Bündel erscheint eine krankheitsbedingte Large-fiber-Beeinträchtigung beim M.Parkinson möglich. Die nachgewiesene längenabhängige Small-fiber-Reduktion bei IPD-Patienten wird vermutlich durch eine axonale Transportstörung verursacht. Einen krankheitsbedingten Erklärungsansatz für die längenunabhängige Reduktion der CGRP-positiven und der Substanz P-positiven IENF-Dichte bei IPD-Patienten liefert der Nachweis von neurotoxischem α-Synuclein in den sensiblen Spinatganglien mit einem daraus resultierenden Untergang von sensorischen Nervenfasern. Aufgrund der geringen Anzahl an Parkinson-Patienten mit sensiblen Symptomen und dem fehlenden Nachweis eines statistisch signifikanten Unterschiedes in der QST liegt der Verdacht nahe, dass die ermittelte intraepidermale Nervenfaserreduktion der IPD-Patienten nicht stark genug ausgeprägt ist, um eine signifikante Abweichung der QST-Ergebnisse zu verursachen. Weiterhin konnte kein Zusammenhang zwischen der kumulativen Levodopa-Menge, den Vitaminen B12, Methylmalonsäure sowie Homocystein und dem Auftreten einer Nervenfaserverminderung nachgewiesen werden, was gegen eine iatrogene Beteiligung des peripheren Nervensystems als Nebenwirkung der Levodopa-Therapie spricht. Das idiopathische Parkinson-Syndrom geht mit einer Reduktion der kleinen Nervenfasern einher, welche vermutlich auf die Grunderkrankung selbst zurückzuführen ist. Die Untersuchung der Haut erscheint somit vielversprechend für die Erforschung der Pathogenese und für die Differentialdiagnostik des M. Parkinson.