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Despite intense research efforts, a safe and effective HIV-1/AIDS vaccine still remains far away. HIV-1 escapes the humoral immune response through various mechanisms and until now, only a few nAbs have been identified. A promising strategy to identify new epitopes that may elicit such nAbs is to dissect and analyze the humoral immune response of sera with broadly reactive nAbs. The identified epitopes recognized by these antibodies might then be incorporated into a vaccine to elicit similar nAbs and thus provide protection from HIV-1 infection. Using random peptide phage display libraries, the Ruprecht laboratory has identified the epitopes recognized by polyclonal antibodies of a rhesus monkey with high-titer, broadly reactive nAbs that had been induced after infection with a SHIV encoding env of a recently transmitted HIV-1 clade C. The laboratory analyzed phage peptide inserts for conformational and linear homology with computational assistance. Several of the identified peptides mimicked domains of the original HIV-1 clade Env, such as conformational V3 loop epitopes and the conserved linear region of the gp120 C-terminus. As part of this work, these mimotopes were analyzed for cross-reactivity with other sera obtained from rhesus monkeys with nAbs and antibody recognition was shown for several mimotopes, particularly those representing the V3 loop. In addition, these mimotopes were incorporated into a novel DNA prime/phage boost strategy to analyze the immunogenicity of such phage-displayed peptides. Mice were primed only once with HIV-1 clade C gp160 DNA and subsequently boosted with mixtures of recombinant phages. This strategy was designed to focus the humoral immune response on a few, selected Env epitopes (immunofocusing) and induced HIV-1 clade C gp160 binding antibodies and cross-clade nAbs. Furthermore, the C-terminus of gp120, a conserved HIV Env region, was linked to the induction of nAbs for the first time. The identification of such conserved antigens may lead to the development of a vaccine that is capable of inducing broadly reactive nAbs that might confer protection form HIV-1 infection.
Machbarkeitsstudie bezüglich der Einführung Hochaktiver Antiretroviraler Therapie (HAART) in Namibia/Afrika. 1) Es erfolgt eine Dokumentation des Projektes(Therapieregime, örtliche Gegebenheiten, Personal, Einschluss-und Ausschlusskriterien) und 2) eine statistische Auswertung verschiedener Laborparameter (Leukozyten, Hb, Gewicht/BMI, CD4) unter der Therapie. 3) Untersuchung der Todesfälle mit der Frage nach prognostischer Vorhersagekraft verschiedener Parameter. 4) Ergebniss: Verbesserung von Lebensqualität und Lebensdauer betroffener Patienten durch die Therapie. Die weitere Einführung von HAART in afrikanischen Ländern wird ausdrücklich empfohlen.
Im Jahr 2015 wurde Plasmaproben von 161 HIV-positive Menschen auf HIV-Drug-Resistance untersucht. Die Patienten waren therapienaiv und wurde am Lighthouse-Hospital in Lilongwe, die Hauptstadt Malawis behandelt. Es zeigte sich eine HIVDR von insgesamt 17% welche aus mehreren Gesichtspunkte dargestellt worden sind, um zu zeigen ob 20105 in Malawi eingesetzte first-line Therapieregime eine gute Wirksamkeit zeigte.
Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei therapienaiven Patienten in der Viktoriasee-Region in Tansania
Seitdem HIV im Jahr 1983 als Ursache des „acquired immundeficiency syndrome“ (AIDS) isoliert wurde, hat sich viel in der Therapie dieser Infektion getan. Trotzdem handelt es sich um eine Erkrankung, welche bisher nicht geheilt werden kann. Da der weitaus größere Anteil der betroffenen Menschen in strukturschwachen Ländern lebt, ist die größte Herausforderung, eine flächendeckende Therapie weltweit zu etablieren und diese für jeden zugänglich zu machen.
Aufgrund der hohen Mutationsrate des HI-Virus, kommt es zur schnellen Resistenzentwicklung. In strukturschwachen Ländern wie Tansania ist eine Resistenztestung vor Therapiebeginn aktuell aufgrund fehlender Infrastruktur sowie geringer finanzieller Mittel nicht denkbar. Deshalb wird nach WHO-Empfehlung eine standardisierte Dreifachkombination, in der Regel Tenofovir, Lamivudin und Efavirenz, angewendet, ohne vorher eine Resistenztestung vorzunehmen. In regelmäßigen Nachuntersuchungen wird anhand von Viruslast und CD4-Zahl der Erfolg der begonnenen Therapie gemessen und nur bei einem Versagen dieser eine Umstellung vorgenommen.
Bereits im Jahr 2011 wurde von unserer Arbeitsgruppe (Kasang, Kalluvya et al.) nachgewiesen, dass eine deutlich höhere Prävalenz für Primärresistenzen von HI-Viren gegenüber antiretroviraler Therapie bestand, als zuvor angenommen. Betrachtet wurden dabei alle Patienten, welche neu als HIV-positiv getestet wurden und nun therapiert werden sollten. Neu war, dass auch ältere Patienten (>25 Jahre) mit einbezogen wurden. Aufgrund der hohen Prävalenz an Primärresistenzen (19%) nahm man an, dass durch antiretrovirale Therapie entstandene resistente Viren zwischen Partnern direkt übertragen werden können.
In der vorliegenden Arbeit sollte durch die Untersuchung einer größeren Patientengruppe dieser These nachgegangen werden. Untersucht wurde das Plasma von 114 Patienten (> 25 Jahre), welche unmittelbar vor dem Start einer antiretroviralen Therapie standen und bisher therapienaiv waren. Zur Bestimmung von möglicherweise vorliegenden Resistenzen erfolgte im S3-Labor zunächst die Isolierung der Virus-RNA aus dem Plasma. Diese wurde anschließend in DNA umschrieben, amplifiziert, aufgereinigt und sequenziert. Die Sequenzen wurden online durch die „HIV DRUG RESISTANCE DATABASE“ der Stanford University im Hinblick auf den Subtyp der reversen Transkriptase (RT), der Protease sowie auf Resistenzen gegenüber den gängigen aniretroviralen Medikamenten analysiert mit folgenden Ergebnissen:
1. Die Prävalenz für eine Primärresistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten betrug 21,5 %
2. Die Medikamente der Triple-Therapie waren in der untersuchten Gruppe mit einer Prävalenz von 10,53 % betroffen.
3. Diese Ergebnisse sind besorgniserregend und bestätigen die von Kasang, Kalluvya et al. aufgestellte These
Für den weitaus größeren Teil der untersuchten Patienten wäre jedoch die Triple-Therapie ohne kostspielige und aufwendige Resistenztestung ausreichend gewesen. Vorderstes Ziel bleibt somit die finanziellen Ressourcen weiterhin Zugänglichkeit der medikamentösen Behandlung zu nutzen, da dies die beste Methode ist, die Ausbreitung dieser Pandemie einzudämmen. Dennoch werden in den nächsten Jahren weiterhin Untersuchungen mit noch größeren Patientenzahlen nötig sein, um die Wirksamkeit des aktuellen Therapieregimes ständig zu überprüfen und gegebenenfalls eine Anpassung vorzunehmen.
Infectious diseases are still a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Despite the progress in drug development, the occurrence of microbial resistance is still a significant concern. Alternative therapeutic strategies are required for non-responding or relapsing patients. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells has revolutionized cancer immunotherapy, providing a potential therapeutic option for patients who are unresponsive to standard treatments. Recently two CAR T cell therapies, Yescarta® (Kite Pharma/Gilead) and Kymriah® (Novartis) were approved by the FDA for the treatments of certain types of non-Hodgkin lymphoma and B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia, respectively. The success of adoptive CAR T cell therapy for cancer has inspired researchers to develop CARs for the treatment of infectious diseases. Here, we review the main achievements in CAR T cell therapy targeting viral infections, including Human Immunodeficiency Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis B Virus, Human Cytomegalovirus, and opportunistic fungal infections such as invasive aspergillosis.
Background and Objective: Staphylococcus aureus is one of the major pathogens of nosocomial infections as wells as community-acquired (CA) infections worldwide. So far, large-scale comprehensive molecular and epidemiological characterisation of S. aureus from very diverse settings has not been carried out in India. The objective of this study is to evaluate the molecular, epidemiological and virulence characteristics of S. aureus in both community and hospital settings in Chennai, southern India. Methods: S. aureus isolates were obtained from four different groups (a) healthy individuals from closed community settings, (b) inpatients from hospitals, (c) outpatients from hospitals, representing isolates of hospital-community interface and (d) HIV-infected patients to define isolates associated with the immunocompromised. Antibiotic susceptibility testing, multiplex polymerase chain reactions for detection of virulence and resistance determinants, molecular typing including Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and agr typing, were carried out. Sequencing-based typing was done using spa and multilocus sequence typing (MLST) methods. Clonal complexes (CC) of hospital and CA methicillin-resistant S. aureus (MRSA) were identified and compared for virulence and resistance.
Results and Conclusion: A total of 769 isolates of S. aureus isolates were studied. The prevalence of MRSA was found to be 7.17%, 81.67%, 58.33% and 22.85% for groups a, b, c and d, respectively. Of the four SCCmec types (I, III, IV and V) detected, SCCmec V was found to be predominant. Panton-Valentine leucocidin toxin genes were detected among MRSA isolates harbouring SCCmec IV and V. A total of 78 spa types were detected, t657 being the most prevalent. 13 MLST types belonging to 9 CC were detected. CC1 (ST-772, ST-1) and CC8 (ST238, ST368 and ST1208) were found to be predominant among MRSA. CA-MRSA isolates with SCCmec IV and V were isolated from all study groups including hospitalised patients and were found to be similar by molecular tools. This shows that CA MRSA has probably infiltrated into the hospital settings.
In this thesis, computational structure-based design approaches were employed to target the HIV-1 integrase and the macrophage infectivity potentiator (MIP) of Legionella pneumophila. The thesis yields valuable information about the mechanism of action of a known class of integrase inhibitors and a novel approach towards enzyme inhibition, which still is mainly unaddressed in current integrase research. For the MIP enzyme, two small-molecule MIP inhibitors were discovered. The computational studies of HIV-1 integrase have provided valuable information for IN inhibitor design. Docking experiments supported the hypothesis that the well-known diketo acid inhibitors enter the IN active site not as free ligands, but rather as metal complexes. These results help to reveal the mechanism of action of this important class of IN inhibitors.To give an impulse for the development of a novel class of inhibitors, a new strategy towards IN inhibition was introduced: An alternative binding site, the dimerization interface of an IN catalytic core domain monomer, was explored for inhibitor design. The lack of structural data of the free monomer was overcome by extensive MD studies. Snapshots derived from the MD simulation were used as protein input structures in a docking study with the inhibitory peptide YFLLKL to reveal its potential binding mode. The docking procedure showed that the peptidic ligand binds to a dimerization interface conformation which shows a Y-shaped binding site.. The next step was to address this protein conformation with small, non-peptidic molecules. The first strategy towards finding small-molecule interface binders was to create a pharmacophore model with hydrophobic features and shape constraints, aiming to find molecules with a good complementarity to the Y-shaped dimerization interface. Virtual screening yielded a total of 10 compounds, which all displayed good shape complementarity and favorable hydrophobic interactions. Unfortunately, none of the compounds showed a reproducible inhibitory activity in biological assays. Some doubts remain about the validity of the assay results: The use of BSA was critical, since it is not unlikely that BSA “intercepted” the hydrophobic candidate compounds. The first strategy towards finding small-molecule dimerization inhibitors was reconsidered: In the second approach, the satisfaction of hydrogen bonding residues at the dimerization interface, was of major interest. Two pharmacophore models were employed, which retrieved several hundred hit molecules. However, docking of these molecules showed that still many hydrogen bonding groups of the protein remained unaddressed by the ligands. Eventually, after visual inspection, only eight molecules were selected as candidate compounds for further testing (results pending). This small “yield” underlines the difficulties in finding interface binders: The IN dimerization interface is a peculiar target with frequently alternating basic, acidic, and hydrophobic residues. It is not a well-ordered binding site with continuous hydrophobic areas and distinct hydrogen bond donors / acceptors. Other protein-protein interfaces show such well-ordered binding sites. Accordingly, the peculiarity of the IN dimerization interface, in addition to the delicate task of disrupting protein-protein interactions at all, makes the development of IN dimerization inhibitors very challenging. For MIP, the studies revealed two experimentally validated MIP inhibitors, which significantly reduce MIP enzymatic activity. To our knowledge, no small-molecule MIP inhibitor has been reported in the literature so far. A detailed analysis of the available structural data of MIP and a comparison to the human PPIase counterpart, FKBP12, pointed out a conformational diversity among the MIP structures and a crucial difference between the two PPIases, which could be traced to mainly one residue (Tyr109). The detailed comparison of FKBP12 and MIP complex structures made it possible to give an explanation, why a ketoacyl-substituted pipecoline derivative most probably does not bind to MIP, but a sulfone-substituted pipecoline derivative does bind to MIP. Knowledge of Legionella MIP inhibitors could be transferred also to other organisms (e.g. trypanosoms), where homologous MIP proteins are also pathological factors.
The Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) subtype C is currently the predominant subtype worldwide. Cell culture studies of Sub-Saharan African subtype C proviral plasmids are hampered by the low replication capacity of the resulting viruses, although viral loads in subtype C infected patients are as high as those from patients with subtype B. Here, we describe the sequencing and construction of a new HIV-1 subtype C proviral clone (pZAC), replicating more than one order of magnitude better than the previous subtype C plasmids. We identify the env-region for being the determinant for the higher viral titers and the pZAC Env to be M-tropic. This higher replication capacity does not lead to a higher cytotoxicity compared to previously described subtype C viruses. In addition, the pZAC Vpu is also shown to be able to down-regulate CD4, but fails to fully counteract CD317.
Forschungsthema: Das Verstaendnis von Sexualitaet und das sexuelle Verhalten verschiedener sich hinsichtlich ihres Abstammungssystems und ihrer kulturellen Herkunft unterscheidender Bevoelkerungsgruppen im Einzugsbereich eines laendlichen Krankenhauses im Sueden Malawis. Ziel: Erarbeiten einer Grundlage für die Planung unter lokalen Bedingungen durchfuehrbarer Interventionsmaßnahmen bezueglich der Ausbreitung von HIV/AIDS. Methoden: Standardisierte Interviews an 1077 Personen dienten der Erhebung von Daten zum Sexualverhalten. Problemzentrierte Interviews mit Repraesentanten von 38 Doerfern wurden dazu genutzt, das derzeitige Sexualitaetsverstaendnis der lokalen Bevoelkerung und die Aktualitaet traditioneller Praktiken im Zusammenhang mit Sexualitaet zu eruieren. Ergebnisse: Diese zeigten ein allgemein niedriges Einstiegsalter in sexuelle Aktivitaeten bei Frauen (im Mittel 17,0 J., beginnend mit 9 J.). Bei Maennern wurde der Beginn des Sexuallebens mit zunehmend niedrigerem Alter angegeben, je juenger sie waren (im Mittel 14,7 J. bei <20jaehrigen vs. 23,9 J. bei >40jaehrigen). Das Sexualverhalten d. Maenner unterschied sich von dem d. Frauen durch eine hoehere voreheliche (67% vs. 22%) und außereheliche (27% vs. 4%) sexuelle Aktivitaet und eine groeßere Zahl von Sexualpartnern. Die Gesamtzahl der Sexualpartner betrug bei ueber 1/4 der Maenner 5 oder mehr, waehrend Frauen nur in 13% mehr als 2 angaben. Eine hoehere Schulbildung fuehrte vor allem bei Maennern zu risikoreicherem Sexualverhalten aber auch zu einer hoeheren Bereitschaft, Praeventionsmaßnahmen zu ergreifen. Gebildetere Frauen hatten zwar ebenfalls vermehrt voreheliche Sexualkontakte, verschoben den Beginn ihres Sexuallebens aber ins spaetere Lebensalter. Auch bei ihnen ging eine hoehere Bildung mit haeufigerer Kondombenutzung einher, die aber im Allgemeinen niedrig war. Insgesamt zeigte sich eine große Differenz zwischen der Anzahl sexuell aktiver Personen und der verheirateter Personen in den juengeren Altersgruppen, wie sie typisch ist fuer Laender mit hoher HIV-Praevalenz. Traditionellen Praktiken, die riskantes Sexualverhalten beguenstigen oder involvieren wie Reinigungsrituale nach dem Tod eines Menschen (kupita kufa) und andere Uebergangsriten, wurde eine hohe Aktualitaet zugeschrieben. 8,7% der Frauen und 3,3% der Männer gaben an, ein solches Ritual mit einem anderen als ihrem Ehepartner durchgefuehrt zu haben. Matrilinearitaet foerderte bei Frauen einen frueheren Beginn sexueller Aktivitaet (16,1 vs. 17,7 J.). Patrilinearitaet dagegen beguenstigte den Einsatz fremder Sexualpartner bei sexualitaetsassoziierten Ritualen. Die Befragten machten deutlich, dass die Einhaltung sexueller Normen durch eine Reihe von Tabus geregelt werde und ihre Transgression eine mdulo genannte Krankheit (keine Krankheitsentitaet im westlichen Sinne) zur Folge haben koenne. Die Aehnlichkeit der Symptome und die Verursachung durch sexuelles Verhalten fuehren offenbar trotz einer generell hohen Aufgeklaertheit zum Thema HIV zu einer Verwechslung von AIDS mit mdulo. Symptome des letzteren wurden in der Befragung im gleichen Atemzug mit AIDS genannt. Verleugnungs- und Externalisierungstendenzen im Zusammenhang mit AIDS zeigten sich darin, dass AIDS kein einziges Mal als Todesursache eines Angehoerigen genannt wurde. Schlussfolgerungen: Generell sollte eine Verschiebung des Beginns sexueller Aktivitaet in ein hoeheres Lebensalter bei Maennern und bei Frauen angestrebt werden. Bei Maennern scheint es außerdem sinnvoll, auf eine Reduktion der Partnerzahl hinzuarbeiten. Die Position von Maedchen und jungen Frauen sollte gestaerkt werden, um ihnen eigenverantwortliche Entscheidungen hinsichtlich ihres Sexuallebens zu ermoeglichen. Kondome sollten verstaerkt propagiert werden, sowohl als Protektivum bei Gelegenheitssex als auch zum Schutz eines moeglicherweise nicht infizierten Partners innerhalb einer ehelichen Beziehung. Traditionelle Praktiken, die riskanten Sex involvieren, sollten nach Moeglichkeit zugunsten alternativer Methoden verlassen werden. Und schließlich sollte eine bessere Akzeptanz der Diagnose AIDS angestrebt werden bei gleichzeitiger Abgrenzung von AIDS gegen traditionelle Konzepte von mdulo. Maßnahmen auf lokaler Ebene: 1. Arbeit mit vulnerablen Personen: junge Maedchen und Frauen mit eher niedrigem Bildungsstatus, junge Maenner mit hoeherer Bildung, Gesundheitspersonal, Sexarbeiterinnen. 2. Arbeit mit Personen, die als Mediatoren sexueller Normen fungieren und Verhaltensaenderungen bewirken können. 3. Foerderung der Akzeptanz der Diagnose AIDS und Vorbeugung von Verleugnungs- und Externalisierungstendenzen durch Einrichtung von VCT, regelmaeßiges diagnostisches Testen und Propagieren sowie Ausgabe von Kondomen.
Der Einfluss des PI3-Kinase Signalwegs auf die Regulation des alternativen HIV-1 prä-mRNA Spleißens
(2013)
In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie.
Die Rolle des Therapeutischen Drug Monitorings (TDM) in der antiretroviralen Therapie bei Kindern ist unklar. Es existieren nur wenige pharmakokinetische Daten - insbesondere von kleinen Kindern – abseits der kontrollierter Zulassungsstudien an klinisch stabilen Patienten. Es ist das Ziel dieser Untersuchung, die Lopinavir-Exposition kritisch kranker Säuglinge auf einer pädiatrischen Intensivstation zu quantifizieren und durch die Identifikation von Risikofaktoren für inadäquate Exposition sinnvolle Indikation für einen Einsatz von TDM in der pädiatrischen HIV-Versorgung zu definieren. Des Weiteren verglichen wir unter Annahme totaler Adhärenz auf die Lopinavir-Exposition auf einer Intensivstation mit der einer ambulanten Versorgungsstruktur. In dieser prospektiven Studie untersuchten wir 15 Serum Proben kritisch kranker Säuglinge auf der pädiatrischen Intensivstation des Tygerberg Hospitals im Hinblick auf LPV-Serumkonzentrationen. Sie wurden verglichen mit 22 Konzentrationen von ambulant betreuten Kindern. Die Messungen wurden mit einer etablierten HPLC-Methode durchgeführt. Alle LPV-Konzentrationen der Intensiv-Patienten waren höher als die empfohlene Talspiegel (Ctrough = 1.000 ng/ml), 60% waren höher als Cmax (8.200 ng/ml). Es wurden zum Teil extrem hohe Konzentrationen erreicht (Max. 28.778 ng/ml). Ein geringes Körpergewicht und Alter korrelierten signifikant mit hohen LPV-Konzentrationen und waren Risikofaktoren für Spiegel, die über Cmax lagen. Signifikant weniger Konzentrationen von Intensivpatienten (MW: 11.552 ng/ml ± SD 7760 ng/ml) waren subtherapeutisch als von ambulant betreuten Kindern (mean: 6.756 ng/ml ± SD 6.003 ng/ml) (0 vs. 28%, p = 0.008). Unter totaler Adhärenz in der Intensiv-Gruppe waren keine subtherapeutischen Konzentrationen festzustellen, während 28% der ambulant betreuten Kinder subtherapeutischen Spiegel aufwiesen. Ein geringes Körpergewicht und Alter sind Risikofaktoren für das Erreichen potenziell toxischer Konzentrationen von Lopinavir in dieser extrem fragilen Population. TDM kann helfen LPV-Toxizität von anderen klinischen Erscheinungen zu differenzieren. TDM kann ein sinnvolles Hilfsmittel sein, um eine sichere und effektive antiretrovirale Therapie bei Kindern zu garantieren.
Die HIV-Infektion des Gehirns induzierte eine Vielzahl neurologischer und neuropsychiatrischer Veränderungen, die gemeinsam als HIV-assoziierte Demenz bezeichnet werden. Insbesondere eine Beteiligung der glutamate-vermittelten Toxizität wird im Rahmen der HIV-Demenz diskutiert. Die vorliegende Arbeit verwendete das wichtigste Tiermodell der HIV-Infektion, mit simianen Immundefizienzviren (SIV) infizierte Rhesusaffen, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Immunaktivierung und adaptiven Veränderungen der glutamatergen Synapse und ihrer Umgebung zu untersuchen. Mittels einer Microarrayanalyse wurden allgemein Unterscheide im Genexpressionsprofil der Basalganglien von Rhesusaffen während dem Fortschreiten der Infektion erfasst. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede in der transkriptionalen Regulation zwischen Chinesischen und Indischen Makakkensubspezies, sowie ein einzigartig differenziertes Genexpressionsmuster als Antwort auf die SIV-Infektion selbst. Um adaptive Veränderungen in den funktionalen Elementen der glutamatergen Synapse weiter zu charakterisieren, wurde die Expression der N-methyl-D-aspartat-Rezeptoruntereinheiten gemessen, wobei ein progressiver Verlust der Untereinheitenexpression im Putamen sowie ein differenziellen Expressionsmuster in Abhängigkeit sowohl von der Makakkensubspezies sowie von der Hirnregion im Nucleus accumbens SIV-infizierter Rhesusaffen festgestellt wurde. Außerdem konnte die vorliegende Arbeite zum ersten Mal eine Störung der exzitatorischen Aminosäuretransporter, dem wichtigsten Glutamatwiederaufnahmesystem, im Putamen, aber nicht im Nucleus accumbens, während der SIV-Infektion nachweisen. Zuvor durchgeführte Arbeiten wiesen darauf hin, dass neurochemischen Dysfunktionen unter Umständen das Ergebnis einer indirekten Toxizität vermittelt durch aktivierte Mikroglia und der daraus resultierenden Ausschüttung schädlicher Faktoren sein könnten. Entsprechend zeigten unsere Daten einen Anstieg in der MHC-II- und TNF-alpha-Expression bereits während der asymptomatischen Phase, und eine noch deutlichere Heraufregulierung in AIDS-Tieren. Zusammenfassend weist die vorliegen Arbeit auf komplexe und kombinierte Mechanismen von einem Anstieg in der Glutamatkonzentration mit einer Dysregulation der NMDA-Rezeptorfunktion sowie der Glutamatwiederaufnahmesysteme verursacht durch eine Immunaktivierung hin. Außerdem konnte in Versuchen zur pharmakologischen Beeinflussung der glutamatergen Synapse mittels dopaminerger Substanzen, NMDAR-Antagonisten und Antioxidantien eine Verbesse-rung der neurochemischen Funktion durch den nichtkompetitiven Antagonisten Memantin und die Antioxidantien Melatonin sowie N-Acetylcystein gezeigt werden. Hingegen trugen die Ergebnisse mit dem MAO-B-Inhibitor Selegilin weiter zu Bedenken zur Sicherheit und Effizienz dopaminerger Substanzen in der Behandlung von HIV-Patienten bei. Außerdem zeigte die vorliegende Arbeit, dass Memantin spezifisch die mRNA- und Proteinexpression des Neurotrophins BNDF heraufregulierte und weist somit auf eine neuartige pharmakologische Wirkung Antidementivums hin. In einer ergänzenden Studie wurden Schritte zur Entwicklung und Verbesserung adeno-assoziierten viraler und foamyviraler Vektoren, die shRNAs für die effiziente Ausschaltung der Expression des murinen und humanen Dopamintransporters, durchgeführt. Es wurden verschieden virale Vektorplasmide kloniert, Effektormoleküle mit einer hohen Knockdown-Aktivität identifiziert, und infektiöse rekombinante Viren hergestellt. Zudem konnte die Expression des humanen Dopamintransporters auf Lymphozyten bestätigt werden. Diese Ergebnisse werden die Entwicklung transgener Tiere und Zelllinien erleichtern und tragen so zur Analyse der natürlichen dopaminergen Neurotransmission in der psychiatrischen Forschung bei, wobei die durch endogene Anpassungen der dopaminerge Systeme in klassischen Knockout-Systemen hervorgerufenen Schwierigkeiten umgangen werden können.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abhängigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie geprüft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das natürlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgewählt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gefärbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gezählt, während Zellen die für AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranstörungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien über unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits für die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-ähnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine stärkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angehören: A3.01 Zellen und PBMC könnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die für die Durchführung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen könnten Typ 2 Zellen verkörpern, die zusätzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation könnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus könnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem früheren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antikörper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch für die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen führte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, ähnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringfügiger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivität von CAPE erklärbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. Könnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgelöst werden, so wäre das ein Schritt mehr in Richtung der vollständigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode könnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und wären so einer effizienten Therapie mit HAART zugänglich. Als nächster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.
HIV verursacht eine progressive Zerstörung des Immunsystems und führt zusätzlich durch Veränderungen im ZNS zu neurokognitiven Störungen (HIV-associated neurocognitive disorders, HAND). Die HIV-Infektion geht mit einer Dysfunktion von dopaminergen Signalwegen einher, die sich unter anderem in einer erhöhten Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor von Therapie-naiven HIV-Patienten äußert. Der Grund für die Dysregulation der dopaminergen Signalwege in HIV-Patienten ist nicht geklärt. Aufgrund dessen war das Hauptziel dieser Arbeit die Identifizierung des pathogenetischen Mechanismus, der zu einer erhöhten Dopamin-Konzentration im Liquor von HIV-Patienten führt. Die primäre Hypothese war, dass die erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nicht durch das Virus selbst, sondern vielmehr durch die genetische Konstitution der HIV-Patienten hervorgerufen wird. Deshalb wurden Polymorphismen untersucht, die die dopaminerge Neurotransmission beeinflussen. Es wurde vermutet, dass a) verschiedene Genotypen dieser Polymorphismen in nicht-infizierten und HIV-infizierten Personen mit anderen Häufigkeiten auftreten, b) verschiedene Genotypen mit veränderten Dopamin-Verfügbarkeiten assoziiert sind, c) unterschiedliche Genotypen Auswirkungen auf Marker der Progression der HIV-Infektion haben und d) verschiedene Genotypen die Immunaktivierung beeinflussen. Dazu wurden in 190 HIV-infizierten und nicht-infizierten Teilnehmern unterschiedlicher Ethnien die Polymorphismen BDNF Val66Met, COMT Val108/158Met, DAT 3‘-UTR VNTR, DRD2 TaqIα, DRD3 Ser9Gly und DRD4 VNRT mit PCR, ggf. Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese analysiert und die Expression des Dopamin-Transporters mit real time PCR bestimmt. Darüber hinaus wurden zur weiteren klinischen Charakterisierung die Immunmarker MCP-1, sCD14, suPAR und RANTES mit ELISA analysiert, da eine Erhöhung dieser Parameter mit einer beschleunigten HIV-Progression assoziiert ist. Die Bestimmung der T-Zell-Aktivierung (CD3/CD8/CD38/HLA-DR) wurde mit einer durchflusszytometrischen Analyse durchgeführt. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass HIV-Patienten hochsignifikant häufiger homozygot für das 10-repeat Allel des Dopamin-Transporter-Polymorphismus sind als nicht-infizierte Personen (57,1 % bzw. 26,8 %, p = 0,001, OR = 3,93, 95 % CI 1,72 – 8,96, direkte logistische Regression). HIV-Patienten und nicht-infizierte Personen mit diesem Genotyp weisen eine signifikant höhere Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor auf als Personen mit dem 9/10-Genotyp (p = 0,03) und eine signifikant geringere Expression des Dopamin-Transporters auf PBMCs (p = 0,05). Der DAT 10/10-Genotyp ist im Gegensatz zu anderen Genotypen in HIV-Patienten jedoch weder mit unterschiedlichen CD4+-Zellzahlen und Viruslasten noch mit einer veränderten Häufigkeit von HAND verbunden.
Zusätzlich weisen deutsche und südafrikanische nicht-infizierte und HIV-infizierte Personen mit dem DAT 10/10-Genotyp eine signifikant höhere MCP-1-Konzentration im Plasma auf als Personen mit anderen DAT-Genotypen (p = 0,0076). Keiner der Immunmarker ist mit der Dopamin-Verfügbarkeit assoziiert. Dennoch ist die Immunaktivierung in südafrikanischen HIV-Patienten im Vergleich zu nicht-infizierten Südafrikanern signifikant erhöht: HIV-Patienten zeigen im Vergleich zu nicht-infizierten Personen eine stärkere T-Zell-Aktivierung (p = 0,0001), eine erhöhte Plasma-Konzentration von MCP-1 (p = 0,0014), eine gesteigerte sCD14-Konzentration (p = 0,0004) und eine vermehrte suPAR-Konzentration im Plasma (p = 0,006). In der vorliegenden Arbeit konnte kein Nachweis erbracht werden, dass die erhöhte Immunaktivierung in den südafrikanischen HIV-Patienten durch die Koinfektion mit Echinoccocus oder durch genetische Polymorphismen bei Chemokinen hervorgerufen wird. Eine chronisch erhöhte Immunaktivierung stellt eine treibende Kraft für die Virusreplikation dar und kann letztendlich zu einer Erschöpfung des Immunsystems führen.
Der 10/10-Genotyp des DAT VNTR könnte einen Risiko-Faktor für die HIV-Infektion darstellen, da dieser eine erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nach sich zieht. Dopamin aktiviert HIV in chronisch infizierten T-Lymphoblasten und führt zudem zu einer erhöhten Expression und Sezernierung von TNF-α, das wiederum die Expression von HIV induziert. Diese Ergebnisse untermauern den Zusammenhang von Dopamin und HIV. Es ist jedoch nicht völlig geklärt, ob die erhöhte Dopamin-Konzentration ausschließlich durch den Genotyp hervorgerufen oder auch durch die HIV-Infektion begünstigt wird.
A CD8+ cell-mediated host defense relies on cognate killing of infected target cells and on local inflammation induced by the secretion of IFN-g. Using assays of single cell resolution, it was studied to what extent these two effector function of CD8+ cells are linked. Granzyme B (GzB) is stored in cytolytic granules of CD8+ cells and its secretion is induced by antigen recognition of these cells. Following entry into the cytosol GzB induces apoptosis in the target cells. It was measured whether GzB release by individual CD8+ cells is accompanied by the secretion of IFN-gƒnƒnand of other cytokines. HIV peptide libraries were tested on bulk peripheral blood mononuclear cells and on purified CD4+ and CD8+ cells obtained from HIV infected individuals. The library included a panel of previously defined HLA class I restricted HIV peptides and an overlapping 20-mer peptide-series that covered the entire gp120 molecule. To characterize the in vivo differentiation state of the T-cells, freshly isolated lymphocytes were tested in assays of 24h duration. The data showed that only ~20% of the peptides triggered the release of both GzB and IFN-g from CD8+ cells. The majority of the HIV peptides induced either GzB or IFN-g, ~40% in each category. The GzB positive, IFN-g negative CD8+ cells did not produce IL-4 or IL-5, which suggests that they do not correspond to Tc2 cells but represent a novel Tc1 subclass, which was termed Tc1c. Also the IFN-g positive, GzB negative CD8+ cell subpopulation represents a yet undefined CD8+ effector cell lineage that was termed Tc1b. Tc1b and Tc1c cells are likely to make different, possibly antagonistic contributions to the control of HIV infection. Since IFN-g activates HIV replication in latently infected macrophages, the secretion of this cytokine by Tc1b cells in the absence of killing may have adverse effects on the host defense. In contrast, cytolysis by Tc1c cells in the absence of IFN-g production might represent the protective class of response. Further studies in the field of Tc1 effector cell diversity should lead to valuable insights for management of infections and developing rationales for vaccine design.
Der Nutzen von Therapeutischem Drug Monitoring (TDM) bei der Behandlung von HIV-infizierten Kindern in Ländern mit geringen finanziellen Ressourcen ist bisher nicht gründlich erforscht worden. Pharmakokinetische Studien antiretroviraler Medikamente haben bei Kindern eine hohe intra- und interpersonale Varianz gezeigt. Dies könnte den kontinuierlichen Prozessen von Reifung, Wachstum und Körperzusammensetzung geschuldet sein. Deswegen könnte TDM zu einer sichereren und erfolgreicheren Behandlung von HIV bei Kindern in Südafrika beitragen.
Diese Untersuchung einer pädiatrischen HIV-Kohorte zeigte, dass 73,5 % der Patienten innerhalb des empfohlenen therapeutischen Bereichs ihrer Medikamentenkonzentration waren.
Aufgrund einer hohen interpersonalen Varianz antiretroviraler Medikamentenkonzentrationen, eine großen Zahl an Komedikationen mit Interaktionspotential, das Risiko für Non-Adhärenz und Zeichen möglicher Arzneimittelnebenwirkungen, kann TDM die Effizienz und Sicherheit der antiretroviralen Kombinationstherapie von Kindern und Jugendlichen mit HIV verbessern.
Background
HIV-disease progression correlates with immune activation. Here we investigated whether corticosteroid treatment can attenuate HIV disease progression in antiretroviral-untreated patients.
Methods
Double-blind, placebo-controlled randomized clinical trial including 326 HIV-patients in a resource-limited setting in Tanzania (clinicaltrials.gov NCT01299948). Inclusion criteria were a CD4 count above 300 cells/μl, the absence of AIDS-defining symptoms and an ART-naïve therapy status. Study participants received 5 mg prednisolone per day or placebo for 2 years. Primary endpoint was time to progression to an AIDS-defining condition or to a CD4-count below 200 cells/μl.
Results
No significant change in progression towards the primary endpoint was observed in the intent-to-treat (ITT) analysis (19 cases with prednisolone versus 28 cases with placebo, p = 0.1407). In a per-protocol (PP)-analysis, 13 versus 24 study participants progressed to the primary study endpoint (p = 0.0741). Secondary endpoints: Prednisolone-treatment decreased immune activation (sCD14, suPAR, CD38/HLA-DR/CD8+) and increased CD4-counts (+77.42 ± 5.70 cells/μl compared to -37.42 ± 10.77 cells/μl under placebo, p < 0.0001). Treatment with prednisolone was associated with a 3.2-fold increase in HIV viral load (p < 0.0001). In a post-hoc analysis stratifying for sex, females treated with prednisolone progressed significantly slower to the primary study endpoint than females treated with placebo (ITT-analysis: 11 versus 21 cases, p = 0.0567; PP-analysis: 5 versus 18 cases, p = 0.0051): No changes in disease progression were observed in men.
Conclusions
This study could not detect any significant effects of prednisolone on disease progression in antiretroviral-untreated HIV infection within the intent-to-treat population. However, significant effects were observed on CD4 counts, immune activation and HIV viral load. This study contributes to a better understanding of the role of immune activation in the pathogenesis of HIV infection.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Therapeutischen Drug Monitorings (TDM) auf das klinische Management bei HIV-infizierten Kleinkindern in Südafrika untersucht. Hierbei wurden mittels HPLC gemessene Lopinavir(LPV)-Serumspiegel und die individuelle Situation der Patienten im klinischen Kontext ausgewertet. Ziel der Arbeit war, die Bedeutung des LPV-TDM in der antiretroviralen Therapie (ART) herauszuarbeiten und so Rückschlüsse über den Einsatz von TDM bei HIV-infizierten Kindern, insbesondere in Ressourcen-armen Ländern wie Südafrika zu ziehen.
Dafür lagen Daten zu 36 LPV-Konzentrationsmessungen bei 26 Patienten vor, deren Alter von fünf Monaten und 16 Tagen bis zu drei Jahren und einem Monat reichte.
Die Indikationen zur Durchführung eines TDM bestanden vorwiegend aus einem Verdacht auf mangelhafte Therapieadhärenz, dem Verdacht auf Medikamenteninteraktion, dem Verdacht auf Toxizität sowie Kontrolluntersuchungen nach einem zu hohen oder zu niedrigen LPV-Spiegel. Weniger häufige Indikationen waren virologisches Versagen, Probleme bei der Medikamentenapplikation und Kontrolluntersuchungen nach einer Dosisanpassung.
Die Höhe der LPV-Spiegel reichte von unter der Nachweisgrenze bis 16 mg/l, der Mittelwert lag bei 3.86 ±5.13 mg/l. Die untere Nachweisgrenze der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Messmethode beträgt 0,1 mg/l. Als Talspiegel im therapeutischen Bereich gelten im allgemeinen LPV-Spiegel zwischen 1mg/l und 6 mg/l.
Lediglich neun der LPV-Konzentrationen (25%) lagen im therapeutischen Bereich. Bei diesen Patienten konnte von einer angemessen Dosierung und regelmäßigen Medikamenteneinnahmen ausgegangen werden.
Bei vier Patienten (11%) ging man aufgrund des TDM von einer inadäquaten Dosierung aus. Bei einem Patienten wurde daraufhin die Dosis reduziert, bei drei Patienten wurde sie erhöht.
Bei elf Patienten (30%) deutete das TDM-Resultat durch sehr niedrige LPV-Talspiegel auf eine ungenügende Therapieadhärenz oder eine Resorptionsstörung hin. Mit diesen Patienten wurde ein Beratungsgespräch über die Bedeutung regelmäßiger Medikamenteneinnahme geführt.
Bei drei gemessenen LPV-Serumspiegeln (8%) standen Probleme mit der Applikation der Medikamente im Vordergrund, was zu einer mangelhaften Aufnahme des LPV führte. Hier wurde ein intensives Training durchgeführt, um die Medikamenteneinnahme methodisch zu üben.
In sechs Fällen (17%) wurde aufgrund vorheriger subtherapeutischer Serumspiegel eine Wiederholung der LPV-Konzentrationsmessung veranlasst.
Es zeigte sich, dass bei Patienten, die eine enzyminduzierende Komedikation mit Rifampicin erhalten hatten, keine signifikant niedrigeren LPV-Serumspiegel vorlagen.
Weiterhin wurde deutlich, dass eine inadäquate Therapieadhärenz seltener vorkam, als klinisch vermutet wurde. Von den zwölf Patienten, bei denen der Verdacht auf eine Nicht-Adhärenz bestand, deuteten nur bei sieben dieser Patienten die Resultate der LPV-Serumspiegelbestimmungen auf eine inadäquate Therapieadhärenz hin.
Bei sechs Patienten bestand klinisch der Verdacht auf eine toxische Wirkung, jedoch konnte nur bei einem dieser Patienten tatsächlich ein LPV-Spiegel oberhalb des therapeutischen Bereichs nachgewiesen werden. Möglicherweise bestehen mit hohen LPV-Serumspiegeln assoziierte akute Nebenwirkungen seltener als klinisch erwartet.
Bei zwei von fünf Patienten, bei denen das TDM wegen virologischen Versagens durchgeführt wurde, lag der LPV-Spiegel im subtherapeutischen Bereich und könnte somit zur hohen Viruslast beigetragen haben.
Die vorliegende Untersuchung zeigt auch abseits einer kontrollierten Studiensituation die Bedeutung des Therapeutischen Drug Monitorings in der hochaktiven anti-retroviralen Therapie bei HIV-infizierten Kleinkindern. TDM ermöglicht in der klinischen Routine, bei insuffizienten Serumspiegeln frühzeitig in die Therapie einzugreifen und so einer Resistenzentwicklung vorzubeugen. Ebenso ist es möglich, bei Serumspiegeln im toxischen Bereich früh zu intervenieren, was gerade bei Kindern, welche besonders langfristig antiviral behandelt werden müssen, wichtig ist, um Langzeitschäden und Nebenwirkungen zu vermeiden.
Im Kontext vorangegangener Studien zeigt die vorliegende Untersuchung das Potential von LPV-Serumkonzentrationsbestimmungen für eine Optimierung des klinischen Managements der ART bei Kleinkindern, weshalb gerade in dieser Patientengruppe der Aufwand der Durchführung eines regelmäßigen Therapeutischen Drug Monitoring von Lopinavir zu rechtfertigen ist.
Immunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das Grün fluoreszierende Protein (GFP)-Transgen enthalten. Die Infektion mit dem VSV-G pseudotypisierten HIV-1-Vektor pGJ2 führte in allen getesteten Zelllinien und auch in primären humanen und murinen Zellen zur Transgenexpression. Ebenfalls konnte eine direkte Expression des Transgens in vivo nachgewiesen werden. Balb/c-Mäuse wurden in einem Vektoren- oder DNA-Prime und Vektoren-Boost-Verfahren immunisiert und die humorale und zelluläre Immunantwort wurde untersucht. Die Primärimmunisierung mit DNA und Boosting mit den lentiviralen Vektoren induzierte eine Gag-spezifische humorale Immunantwort, hohe Titer von VSV-G-neutralisierenden Antikörpern und eine Gag- und EGFP-spezifische zytotoxische T-Zell-Antwort. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl Strukturbestandteile des lentiviralen Vektors als auch die Transgenexpression zur Aktivierung der Immunantwort beitrugen. So machen die einzigartigen biologischen und immunologischen Eigenschaften der replikationsdefizienten HIV-Vektoren aus diesen Konstrukten wertvolle Werkzeuge, um weiter die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen HIV-Infektion und Krankheit bedeutsam sind, zu studieren. Im Rahmen der hierzu durchgeführten Arbeiten wurden außerdem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektoren hergestellt und analysiert. Um die Transkription der lentiviralen Vektor-Kassette durch das Vacciniavirus zu ermöglichen, wurde vor den Transkriptionsstart ein Vaccinia-Promotor gesetzt und an das 3’-Ende das Transkription-Stoppsignal angehängt. Obwohl die genomische Analyse eine erfolgreiche Herstellung der Hybridvektoren bestätigen konnte, muss die Produktion der lentiviralen Vektoren nach der Vaccinia-Infektion weiter optimiert werden. Nichtsdestotrotz könnte die Kombination von replizierenden Vacciniaviren und replikationsinkompetenten HIV-Vektoren ein neuartiges Impfkonzept darstellen. Die Expression von HIV-Strukturgenen würde in der ersten Phase der Infektion mit dem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektor zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen. Die Bildung von lentiviralen Vektoren würde diese Immunantwort weiter boosten, und falls die lentivirale Vektorkassette dann ein entsprechendes Transgen enthalten würde, würde dies weiter die Immunantwort verstärken und vor allem könnte diese Art des Impfstoffes eine langzeitige falls nicht dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort erzeugen.
Weltweit sind über 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert, täglich steigt die Zahl weiter an. Es liegt auf der Hand, dass die Forschung zur Bekämpfung der Replikation des Virus stetig weiter geführt werden muss. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen für einen neuartigen HIV-Therapieansatz geschaffen. Dabei steht nicht die Hemmung von Replikations-essentiellen Enzymen wie Protease, Reverse Transkriptase oder Integrase im Vordergrund, sondern die Aufrechterhaltung des humanen retroviralen Schutzes. Durch Hemmung der vif–Elongin-C-Interaktion mit Elongin-C-Inhibitoren bleibt der Organismus in der Lage, sich mithilfe von APOBEC3G auf natürlichem Wege vor dem HI-Virus zu schützen, unabhängig von viralen Mutationen. Aufgrund der Tatsachen, dass die Kristallstruktur von Elongin-C und der Bindemodus von vif in der essentiellen Bindetasche des Proteins aufgeklärt sind, konnten durch Docking-Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christoph Sotriffer in-silico Substanzen bestimmt werden, die theoretisch mit hoher Affinität in die Bindetasche binden und so vif aus dieser verdrängen. Basierend auf diesen Docking-Studien wurden im Rahmen dieser Arbeit ca. 50 potentielle Inhibitoren synthetisiert und weitere 27 Substanzen kommerziell erworben. Diese wurden anschließend zum größten Teil in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Axel Rethwilm in einer zellulären Testvariante auf Hemmung des APOBEC3G-Abbaus getestet. Dabei erwies sich die Substanz A19 (FM329, Abb. 7.1) als sehr effektiv. Zur Bestätigung dieses Testergebnisses wurde A19 weiterhin in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jochen Bodem auf Hemmung der Replikation der Viren untersucht. Auch hier hemmt A19 die Replikation des Virus bei einer Konzentration von 30 µM zu 100%. Da allerdings die Hemmung des Abbaus von APOBEC3G bzw. der Replikation des Virus kein Nachweis auf die tatsächliche postulierte Interaktion zwischen dem Inhibitor und der Bindetasche des Proteins ist, wurde im weiteren Verlauf versucht diese Interaktion nachzuweisen. Dazu wurde zunächst unter Anleitung von Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Dr. Caroline Kisker das Targetprotein exprimiert und isoliert. Damit konnten erste Versuche zur Bindungsaufklärung durchgeführt werden. Diese beliefen sich auf Mikrokalorimetrie-Experimente und Surface-Plasmon-Resonance Untersuchungen. Erste Indizien für eine Wechselwirkung zwischen dem Inhibitor und dem Protein konnten damit bereits ermittelt werden, ein eindeutig positives Ergebnis wurde allerdings noch nicht erzielt.