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Aufbauend auf einen Datensatz von etwa 70 antimalaria-aktiven Verbindungen wurde mit Hilfe des CoMSIA-Verfahrens ein QSAR(Qantitative Structure Activity Relationship)-Modell erstellt, das in der Lage ist antiplasmodiale Aktivitäten von Verbindungen aus der Substanzklasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide vorherzusagen. Da die behandelten Strukturen ein sehr kompliziertes konformatives Verhalten aufweisen, mussten für ein möglichst flexibles Alignment (unter Verwendung von FLEXS und GASP) eigene Abläufe entwickelt werden, die schließlich weitestgehend automatisiert werden konnten. Das erstellte Modell erlaubte es darüber hinaus, die für die Aktivität verantwortlichen strukturellen Merkmale zu identifizieren und so entscheidende Anregungen zur Vereinfachung des relativ komplizierten Grundgerüsts zu geben. Die Vorschläge wurden zu einem großen Teil bereits synthetisch verwirklicht, wobei die anschließend experimentell gefundenen Aktivitäten die vorher berechneten sehr gut bestätigten. Die neu entwickelten Substanzen befinden sich derzeit im Patentprüfungsverfahren.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung und Synthese von Inhibitoren der Deoxyhypusin-Hydroxylase (DOHH), die einen wichtigen Schritt in der Aktivierung des eukaryotischen Translationsinitiations-Faktors-5A (eIF-5A) katalysiert. Die Hemmung dieses Metalloenzyms durch kleine Moleküle, die mit dem katalytischen Eisenatom im aktiven Zentrum der DOHH einen Chelatkomplex bilden, hat einen antiproliferativen Effekt auf parasitäre Erreger, wie Plasmodien, Trypanosomen und Leishmanien zur Folge. Ausgehend von den antiplasmodial wirksamen Eisenkomplexbildnern und Pyridon-Derivaten Ciclopirox und Mimosin wurden besser wirksame 2,6-Diaryl-4-oxopiperidincarbonsäuremono- und -diester-Derivate abgeleitet, deren 4-Piperidon-Grundgerüst als Leitstruktur für die Entwicklung von antiplasmodialen und antitrypanosomalen Wirkstoffen fungierte. Entsprechend dieser Leitstrukturen gelang im Zuge dieser Arbeit durch verschiedene Modifikationen der Doppel-Mannich-Reaktion die Erstellung einer weitreichenden Bibliothek 52 strukturell diverser 4-Hydroxytetrahydropyridin-3,5-dicarbonsäurediester 1 – 6, darunter auch erstmals Derivate mit t-Butyl-esterfunktionen und 4-Hydroxytetrahydropyridin-3-carbonsäuremonoester 7 – 8. Dabei konnten vor allem Derivate mit der gewünschten nitroaromatischen Substitution in den Positionen 2 und 6 synthetisiert werden. Darüber hinaus wurden vielfältige Strukturabwandlungen dieser Substanzen in Form von verschiedenen 4-Piperidonderivaten ohne Esterfunktionen, deren Oximen sowie von 4-Hydroxychinoloncarbonsäureestern syn-thetisiert. Die hergestellten Derivate wurden In-vitro-Testungen an Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei brucei und Leishmania major unterzogen. Zusätzlich wurde die Zytotoxizität an der Makrophagen-Zelllinie J774.1 ermittelt.
Im Rahmen der Zusammenarbeit des Missionsärztlichen Instituts in Würzburg mit dem Sacred Heart Hospital (Nigeria) wurden vor Ort im Hinblick auf das Problem der Arzneimittelfälschungen in Nigeria und dem Auftreten von einzelnen Resistenzen gegen Artemisinin-Derivate Untersuchungen bezüglich der aktuellen Situation im Kampf gegen Malaria im Großraum Abeokuta durchgeführt. Der Kenntnisstand über Malaria und das Gesundheitsverhalten einer für die nigerianische Bevölkerung möglichst repräsentativen Probandengruppe (n=100) wurden mithilfe eines Fragebogens erfasst. Ebenfalls mithilfe eines Fragebogens wurden die Therapiestrategien der einheimischen Ärzte (n=34) gegen Malaria untersucht und die Verfügbarkeit und Qualität von Artemisinin- Derivaten im Untersuchungsgebiet durch den Erwerb von Medikamenten-Samples (n=29) und anschließende Labortests überprüft. Die Befragung der Bevölkerung ergab, dass Wissen bezüglich der Ursachen, Symptome und Prävention der Malaria durchaus vorhanden ist, wobei große Unterschiede abhängig vom Bildungsstand bestanden. Vor allem ältere Menschen verfügten über wesentlich geringere Schulbildung und verließen sich deshalb sehr viel mehr auf die traditionelle Medizin. Darüber hinaus war eine oftmalige Bagatellisierung der Malaria auffällig, weshalb viele Probanden (53%) sich im Krankheitsfall gegen das Aufsuchen eines Krankenhauses entschieden. Die Befragung bezüglich der Therapiestrategien der einheimischen Ärzte zeigte, dass die Richtlinien der WHO bezüglich der Verwendung von ACT offensichtlich optimal angenommen und angewandt werden. Als mögliches Problem stellte sich die von 76,7% der Ärzte nur selten angewandte Labordiagnostik dar, eine Tatsache, die Fehldiagnosen begünstigt. Bei der Testung der Medikamente erwiesen sich 14,3% der Proben als minderwertig oder sogar gefälscht, was offiziellen Angaben entspricht. Zudem handelte es sich bei 37,9% der Arzneimittelproben um Monopräparate, was im Hinblick auf Resistenzbildung mehr als bedenklich ist. Diese Resultate weisen darauf hin, dass im Südwesten Nigerias die Malaria-Problematik noch immer nicht adäquat gelöst ist. Immer noch erhalten viel zu wenige Menschen eine optimale Therapie, was zu einem großen Teil an fehlendem Wissen und damit verbundenem falschem Gesundheitsverhalten, an dem großen Einfluss der traditionellen Medizin und an der Präsenz von gefälschten, wirkungslosen Arzneimitteln auf dem Markt liegt.
Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis.
It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards.
In den Jahren 1998 bis 2004 wurden auf der Insel Flores (Indonesien) vereinzelt klinische und laborchemische Untersuchungen auf Malaria bei Kindern und Jugendlichen durchgeführt, dabei wurde eine Malariaprävalenz zwischen 59 % und 81 % festgestellt. Vor diesem Hintergrund entstand aus der Kooperation der lokalen Stiftung YASPEM, dem Missionsärztlichen Institut Würzburg und Misereor e.V. ein groß angelegtes Malariakontrollprogramm, das im Herbst 2007 seine Arbeit aufnahm. Ziel des Programms war es, die Malariaprävalenz erneut zu überprüfen und diese durch ein umfassendes Konzept mit Aufklärungskampagnen, flächendeckenden Blutuntersuchungen, medizinischer Behandlung und Vektorkontrollmaßnahmen nachhaltig zu senken. Ziel dieser Dissertation ist dabei, eine Evaluation der gewonnenen Daten durchzuführen und anhand dieser Handlungsempfehlungen für Folgeprojekte herauszuarbeiten. In der Evaluation zeigte sich, dass die tatsächliche Prävalenz weit unter den zuvor angegebenen Raten lag: Im Dorf Waiara war die Prävalenz mit 13,2 % am höchsten, in den übrigen untersuchten Dörfern (Namang Kewa, Geliting, Kopong, Iantena, Umagera) lag sie zwischen 1,2 % und 3,5 %. Zurückzuführen ist diese Diskrepanz auf verschieden Ursachen. Zum einen wird die Diagnose „Malaria“ häufig klinisch gestellt, es subsummieren sich viele andere fieberhafte Erkrankungen unter dieser Diagnose. Des Weiteren zeigte sich eine hohe Rate an falsch positiven Befunden des Labors des lokalen Krankenhauses im Vergleich zu den Laborergebnissen des Malariakontrollprogramms. In der weiteren Evaluation konnten geographische, demographische und jahreszeitliche Schwerpunkte für die Malariaarbeit auf Flores herausgearbeitet werden: •Es gab eine signifikante Häufung der Malariafälle in geographisch besonders prädestinierten Gebieten. •Zudem waren signifikant mehr Kinder und Jugendliche von Malaria betroffen als Erwachsene. •Die Malariainfektionen traten vornehmlich in der Regenzeit auf, in der Trockenzeit sank die Prävalenz in allen untersuchten Gebieten ab. Durch das umfassende Malariakontrollprogramm konnte in stark betroffenen Regionen ein Erfolg im Sinne eines signifikanten Rückgangs der Prävalenz verzeichnet werden.
Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann.
In Deutschland starben im Jahr 2016 knapp 6 000 Menschen an den Folgen des Multiplen Myeloms. Die Zahl der Todesopfer dieser Krebsart ist in den letzten 16 Jahren um ca. 20% gestiegen. Da das Multiple Myelom mit einem Durchschnittsalter von 73 Jahren bei Erstdiagnose zu den Erkrankungen des höheren Lebensalters zählt, ist der Anstieg der Inzidenz und Todesfälle am ehesten auf eine höhere Lebenserwartung der Menschen durch umfassende medizinische Versorgung zurückzuführen. Auch die Behandlungsmöglichkeiten des Multiplen Myeloms wurden in den letzten zwei Jahrzehnten kontinuierlich verbessert und bieten in Form von medikamentösen Therapien für alle Erkrankten und Knochenmarktransplantationen speziell für Patienten unter 70 Jahren die Chance auf eine Verlängerung der beschwerdefreien Krankheitsphase. Nach wie vor verläuft das Multiple Myelom jedoch tödlich, sodass die Erforschung und Entwicklung neuer potenter Wirkstoffe zur Verbesserung der Prognose oder zur vollständigen Heilung essentiell ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Biotinylierung von Dioncochinon B, einem natürlich vorkommenden Naphthochinon, erstmals isoliert aus Kallus-Kulturen von T. peltatum, das eine gute Aktivität (IC50 = 11 µM) gegen Zellen des Multiplen Myeloms aufweist. Der Affinitätsmarker Biotin sollte dabei über einen kurzen Linker an die 7- oder 8-Position des Naturstoffs angebracht werden. Nach der Etablierung einer geeigneten Syntheseroute sollten nanoLC-MS/MS-Analysen Aufschluss über mögliche Wirkstoff-Target-Interaktionen liefern.
Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Synthese von 7,8'-gekuppelten Naphthylisochinolin-Alkaloiden im Allgemeinen und von Yaoundamin A und dessen M-Atropisomer im Speziellen untersucht.
Die Naturstoffklasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide ist neben ihrer strukturellen Vielfalt vor allem wegen ihrer Aktivitäten gegen eine Vielzahl an Erregern von Infektionskrankheiten, wie z. B. der Malaria, der Afrikanischen Schlafkrankheit oder der Leishmaniose interessant. Strukturell sind Naphthylisochinolin-Alkaloide unter anderem durch eine meist rotationsgehinderte Biaryl-Achse gekennzeichnet. Der synthetische Aufbau dieser Verbindungsachse zwischen Naphthalin- und Isochinolin-Baustein war in der Literatur bereits ausführlich behandelt worden. Da die Darstellung eines 7,8'-verknüpften Naphthyldihydroisochinolin-Alkaloids allerdings noch nie beschrieben worden war, war das Ziel dieser Arbeit die erste Totalsynthese eines Naturstoffs dieses Typs.
Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen des SFB 630 „Erkennung, Gewinnung und funktiona-le Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten“ erstellt worden ist, beschäftigt sich mit der Entwicklung und Synthese der bisquartären Bisnaphthalimide und deren antimikro-biellen Eigenschaften, speziell gegen Erreger tropischer Infektionskrankheiten, wie Plasmo-dien und Trypanosomen aber auch Bakterien wie Staphylococcus aureus. Erste Testungen einer kleinen Bibliothek verschiedener mono- und bisquartärer Phthal- und Naphthalimide im SFB 630 offenbarten deren antimikrobielles Potenzial. Daher war es das Hauptziel dieser Arbeit, durch systematische Variation der verschiedenen Strukturbestandteile diese Bibliothek zu erweitern. Dazu mussten zuerst die entsprechenden Naphthalin-1,8-dicarbonsäure-Anhydride hergestellt werden. Im nächsten Schritt wurden diese mit einem N,N-Dimethylaminopropylamin-Derivat zum Imid kondensiert und abschließend mit einem Alkyl-Linker zur bisquartären Verbindung alkyliert. So konnte die Bibliothek um 25 Verbin-dungen erweitert werden. Dabei umfassten die Variationen die Alkylkettenlänge zwischen den quartären Stickstoffen mit 3–14 Methylen-Einheiten, das aromatische Substitutionsmuster mit Amino- bzw. Nitrogruppen und symmetrische, wie asymmetrische Bisnaphthalimide. Durch anschließende antimikrobielle Testung und qualitativen Vergleich der ermittelten IC50-Werte konnten verschiedene strukturelle Merkmale der Bisnaphthalimide identifiziert werden, die einen positiven Einfluss auf die Aktivität gegen den untersuchten Mikroorganismus haben.
Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen tötet. Die zunehmende Resistenzbildung gegenüber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell für den Parasiten sind, böten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, während Pdx2 als Glutaminase-Partner das benötigte Ammoniumion für den heterocyclen Ring bereitstellt. Zusätzlich dazu verfügt der Parasit auch über einen salvage pathway um PLP zu „recyclen“, in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schlüsselfunktion zufällt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 für eine optimale Entwicklung der Blutstadien benötigt wird, nicht jedoch für deren Überleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell für das Überleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung während des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteldärmen als auch in den Speicheldrüsen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell für das Überleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch für keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplementären Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur für Genmanipulationen nicht zugänglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erhöhte Expression der PfPdxK, während sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht veränderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollständig zu kompensieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivität des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminosäuren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Darüber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung für die Glutaminaseaktivität ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivität in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zusätzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu bestätigen. Ebenso war es nicht möglich, das vollständige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungeklärt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalität dieses ORFs überprüft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminosäuren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Phänotyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht möglich, Teile des Proteins für Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalität des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungeklärt.
In Säugetieren existieren im wesentlichen zwei Abwehrsysteme gegen oxidativen Streß, in welchen die Glutathionreduktase (GR) und Thioredoxinreduktase (TrxR) Schlüsselenzyme sind. Ein einzelnes Gen der Taufliege, genannt dmtrxr-1, kodiert sowohl für die durch alternatives Splicing entstehende cytoplasmatische und mitochondriale Form der DmTrxR-1. Zum Teil innerhalb des dmtrxr-1-Gens findet sich auf dem Komplementärstrang ein weiteres Gen, welches sniffer genannt wurde. In Kooperation wurde nachgewiesen, daß dieses Gen essentiell zur Verhinderung alterungsbedingter Neurodegeneration ist. Durch biochemische Charakterisierung konnte das rekombinant hergestellte Produkt dieses Gens in der vorliegenden Arbeit als Carbonylreduktase, ein zu den Kurzketten-Dehydrogenasen (short-chain dehydrogenases) gehörendes Enzym, identifiziert werden. Sniffer weist das für Carbonylreduktasen typische Substratspektrum mit Phenanthrenequinone als bestem Substrat auf und wird von Flavonoiden wie Quercetin und Rutin sowie Hydroxymercuribenzoat gehemmt. In verschiedenen Ansätzen konnten Kristalle des rekombinanten Proteins gewonnen werden, die inzwischen in Kooperation vermessen wurden und so zu einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,7 Angström führten. Durch diese Arbeiten konnte zum ersten Mal eine Verbindung zwischen einem charakterisierten Gen (snifffer), oxidativem Streß und neurodegenerativen Effekten auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Parasiten haben während ihres Lebenszyklus einen hohen Bedarf an Energie und sind abhängig von einer starken Syntheseleistung. Zur Bewältigung dieses Stresses benötigen sie hohe Aktivitäten an Adenylatkinase (AK; ATP + AMP  2 ADP) und GTP-AMP-Phosphotransferase (GAK; GTP + AMP  GDP + ADP). Beide Enzyme wurden in Blutstadien des Malariaparasiten Plasmodium falciparum identifiziert und die entsprechenden Gene der PfAK und PfGAK auf den Chromosomen 10 und 4 respektive lokalisiert. Klonierung und heterologe Expression in E. coli ergab enzymatisch aktive Proteine mit einer Größe von 28,9 (PfAK), bzw. 28,0 kDa (PfGAK). Das rekombinante Protein der PfAK entspricht in seinen biochemischen Charakteristika denen der authentischen PfAK. Dies gilt auch für eine mögliche Assoziation mit einem stabilisierenden Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa und der hohen Substratspezifität für das Monophosphat-Nukleotid AMP. Die Spezifität für das Triphosphat-Substrat ist weniger stringent. Das beste Triphosphat-Substrat ist ATP mit einem Vmax-Wert von 75 U/mg und einem kcat von 2800 min-1. Die Sequenz der PfAK enthält eine amphiphatische Helix, welche als notwendig für die Translokation zytosolischer Adenylatkinasen in den Intermembranraum der Mitochondrien beschrieben wurde. Die PfGAK bevorzugt GTP und AMP als Substrat (100 U/mg; kcat = 2800 min-1 bei 25°C) und zeigt als Besonderheit keine messbare Aktivität mit ATP. Im Gegensatz zu ihrem Ortholog im Menschen (AK3) enthält die Sequenz der PfGAK ein Zinkfinger-Motiv und bindet Eisenionen. Erste Immunfluoreszenz-Analysen lokalisieren die PfGAK in den Mitochondrien. PfAK und PfGAK werden von den Dinukleosid-Pentaphosphat-Verbindungen AP5A beziehungsweise GP5A gehemmt. Die Ki-Werte liegen mit ca. 0.2 µM ungefähr 250-fach niedriger als die KM-Werte der entsprechenden Nukleotidsubstrate. Zur Lösung der vor allem im Rahmen einer rationalen Medikamentenentwicklung notwendigen Kristallstruktur des Zielmoleküls konnten bereits Kristalle der PfGAK erhalten werden.
Malaria is a challenging infection with increasing and wide-spread treatment failure risk due to resistance. With a estimated death toll of 1-3 Million per year, most cases of Malaria affect children under the age of five years in Sub-Saharan Africa. In this thesis, I analyse the current status of malaria control (focussing on diagnosis and therapy) in Burkina Faso to show how this disease burdens public health in endemic countries and to identify possible approaches to improvement. MB is discussed as a therapeutic option under these circumstances.
Burkina Faso is used as a representative example for a country in Sub-Saharan Africa with high endemicity for malaria and is here portrayed, its health system characterised and discussed under socioeconomic aspects.
More than half of this country’s population live in absolute poverty. The burden that malaria, especially treatment cost, poses on these people cannot be under-estimated.
A retrospective study of case files from the university pediatric hospital in Burkina Faso’s capital, Ouagadougou, shows that the case load is huge, and especially the specific diagnosis of severe malaria is difficult to apply in the hospital’s daily routine. Treatment policy as proposed by WHO is not satisfactorily implemented neither in home treatment nor in health services, as data for pretreatment clearly show.
In the face of growing resistance in malaria parasites, pharmacological combination therapies are important. Artemisinins currently are the last resort of malaria therapy. As I show with homology models, even this golden bullet is not beyond resistance development. Inconsidered mass use has rendered other drugs virtually useless before. Artemisinins should thus be protected similar to reserve antibiotics against multi-resistant bacteria.
There is accumulating evidence that MB is an effective drug against malaria. Here the biological effects of both MB alone and in combination therapy is explored via modeling and experimental data. Several different lines of MB attack on Plasmodium redox defense were identified by analysis of the network effects. Next, CQ resistance based on Pfmdr1 and PfCRT transporters as well as SP resistance were modeled in silico. Further modeling shows that MB has a favorable synergism on antimalarial network effects with these commonly used antimalarial drugs, given their correct application.
Also from the economic point of view MB shows great potential: in terms of production price, it can be compared to CQ, which could help to diminuish the costs of malaria treatment to affordable ranges for those most affected and struk by poverty.
Malaria control is feasible, but suboptimal diagnosis and treatment are often hindering the achievment of this goal. In order to achieve malaria control, more effort has to be made to implement better adjusted and available primary treatment strategies for uncomplicated malaria that are highly standardised. Unfortunately, campaigns against malaria are chronically underfinanced. In order to maximize the effect of available funds, a cheap treatment option is most important, especially as pharmaceuticals represent the biggest single matter of expense in the fight against malaria.
Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sehr einfache, flüssigchromatographische Methoden zur Qualitätsanalytik gebräuchlicher Antimalaria-Medikamente (Amodiaquin, Mefloquin, Proguanil sowie die Kombination Artemether/Lumefantrin) entwickelt, die nur wenige, günstig erhältliche Chemikalien (Phosphatpuffer, Methanol) sowie gewöhnliche, kommerzielle RP-18-Säulen benötigen. Sie sind insbesondere zur Anwendung in Laboratorien in Entwicklungsländern geeignet und erfordern keine komplexen HPLC-Instrumente wie beispielsweise Gradientenpumpen oder Säulenthermostate. Der Verzicht auf Ionenpaarreagenzien ermöglicht es, dass eine stationäre Phase für mehr als nur einen einzigen Einsatzzweck verwendet werden kann und dass langwierige Äquilibrier- bzw. Spülschritte nicht notwendig sind. Alle Methoden arbeiten im isokratischen Elutionsmodus und durch die Verwendung kurzer Säulen (125 mm) konnten die jeweiligen Analysenzeiten zusätzlich verringert werden. Hierdurch ist zudem eine Reduzierung des Fließmittelverbrauches möglich.
Während der Methodenentwicklung wurden charakteristische, aus dem Herstellungsweg des jeweiligen Arzneistoffes stammende potentielle Verunreinigungen berücksichtigt. Ihre Bestimmung erlaubt eine Aussage über die Herkunft eines Wirkstoffes bzw. eines Arzneimittels, da das Verunreinigungsmuster einer Substanz oftmals die Zuordnung zu einem bestimmten Herstellungs- bzw. Reinigungsprozess ermöglicht.
Alle Methoden wurden hinsichtlich der Linearität innerhalb des Arbeitsbereiches sowie der Wiederholpräzision charakterisiert. Es wurde eine gute Reproduzierbarkeit gefunden. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der untersuchten Verunreinigungen lagen bei einem Level von je 0.1 %. Durch gezielte Variation wurde der Einfluss wechselnder Trenntemperaturen sowie schwankender pH-Werte der jeweiligen mobilen Phase und die hieraus resultierenden Effekte untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Methoden sehr robust gegenüber diesen Einflussgrößen sind und somit für die Anwendung mit einfach ausgestatteten HPLC-Systemen sowie besonders für den Einsatz in tropische Gebieten mit wechselnden klimatischen Bedingungen gut geeignet sind.
Flüssigchromatographische Methoden spielen heute in der pharmazeutischen Analytik vor allem zur Bestimmung der Reinheit eines Arzneistoffes eine herausragende Rolle und sind in nahezu jeder Monographie der wichtigsten Arzneibücher (z. B. im Ph. Eur.) zu finden. Einfach durch-führbare Untersuchungsmethoden, wie beispielsweise die im GPHF-Minilab® angewandte Dünnschichtchromatographie, erfordern im Vergleich zur HPLC weniger komplexe und teure Instrumente und können selbst in entlegenen Gebieten ohne Laboratorium durchführt werden. Sie verfügen allerdings über eine nur sehr geringe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, da sowohl die praktische Durchführung als auch die anschließende Auswertung rein manuell bzw. visuell erfolgt und somit in hohem Maße einer Beeinflussung durch den jeweiligen Analytiker unterworfen ist. Die entwickelten HPLC-Methoden wurden mit dünnschichtchromatographischen Verfahren verglichen, hierbei besonders unter dem Aspekt der visuellen und der instrumentellen Auswertung der Chromatogramme zur Bestimmung des Gehaltes einer unbekannten Probe. Hierbei konnte aufgezeigt werden, dass die Dünnschichtchromatographie der Flüssigchromatographie eindeutig unterlegen ist, insbesondere wenn die Auswertung nicht mittels eines entsprechenden Scanners sondern rein visuell erfolgt: Nur in den wenigsten Fällen ist es möglich, eine annähernd präzise Aussage über den Gehalt zu treffen und zudem ist die Bestimmung der Verwandten Substanzen nur sehr bedingt möglich. Durch den Einsatz von Auftragegeräten bzw. Plattenscannern kann die Genauigkeit zwar signifikant erhöht werden, allerdings sind solche Instrumente im Verhältnis wesentlich teurer als einfache, modulare HPLC-Systeme und zählen heute in den wenigsten Laboratorien zum Standardinventar.
Vereinfachte chromatographische Methoden können ein wichtiges Hilfsmittel für Kontrolllaboratorien in Entwicklungsländern sein, wenn komplexe, etablierte Protokolle nur eingeschränkt angewendet werden können. Durch die Kombination aus dünnschichtchromatographischer Basisanalytik und einer flächendeckenden Untersuchung mittels HPLC lässt sich die Arzneimittelqualität sehr gut überprüfen, die regulatorischen Organe eines Landes entsprechend zu entlasten und die Versorgung der Bevölkerung mit qualitativ einwandfreien Medikamenten zu gewährleisten.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit der Stabilitätsanalytik individuell hergestellter, Noradrenalin-haltiger Injektionslösungen. Solche Rezepturen werden oftmals in Krankenhausapotheken im Rahmen der Defektur auf Vorrat durch Verdünnen der entsprechenden kommerzieller Fertigarzneimittel mit isotonischer Kochsalzlösung zubereitet, um z. B. für Notfallsituationen am Wochenende die Rezepturen vorrätig zu haben. Durch die Untersuchungen wurde geprüft, inwieweit der übliche Verdünnungsgrad von 0.1 % einen Einfluss auf die Stabilität des Noradrenalins hat und welche Lagerungsbedingungen für die Zubereitungen empfohlen werden können. Nach der Lagerung unter verschiedenen Bedingungen (gekühlt, bei Raumtemperatur sowie jeweils mit bzw. ohne Lichtschutz) konnte gezeigt werden, dass die Gehalte an Noradrenalin bei keiner der untersuchten Lagerungsbedingungen unter einen Wert von 99.0 % fielen. Individuell hergestellte Noradrenalin-Injektionslösungen können somit bis zu sieben Tage im Voraus hergestellt und für die Anwendung am Patienten bereit gehalten werden. Die Lösungen sollten dennoch gekühlt und unter Lichtschutz aufbewahrt werden, um den Abbau des Arzneistoffes und eine mikrobielle Kontamination zu minimieren.
Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds.
Im Rahmen der Etablierung eines Bettnetzprojektes zur Prävention der Malaria wurden eine städtische (n=60) und eine ländliche Probandengruppe (n=60) in Nigeria im Großraum Abeokuta vor und ein Jahr nach Einführung von mit Insektizid behandelten Bettnetzen (ITN) untersucht. Dabei war das Ziel dieser Arbeit (1) die epidemiologische Malariasituation im Untersuchungsgebiet zu erfassen; (2) Wissen durch Informationsgespräche zu den Themen Prävention, Diagnostik und Therapie der Malaria zu vermitteln; (3), Akzeptanz und Gebrauch der ITN zu dokumentieren; (4), den Effekt von ITN am Verlauf klinischer und labortechnischer Parameter zu verfolgen und (5) die Prävalenz und Höhe von Antikörpern (NANP19) gegen das Circumsporozoiten (CS) Protein, ein Hauptoberflächenprotein der Sporozoiten vor Projektbeginn zu erfassen, sowie ihre Veränderung ein Jahr nach Einführung von ITN. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass Malaria eines der wichtigsten Gesundheitsprobleme der Region ist. Wissensvermittlung förderte die Akzeptanz und den regelmäßigen Gebrauch von ITN. Die klinischen und labortechnischen Untersuchungen bestätigen den protektiven Effekt durch Benutzung von ITN. Fast alle Parameter (Anzahl der Fieberepisoden/Jahr, Anzahl der arbeitsunfähigen Tage, Milzuntersuchung, Ausstrichuntersuchungen und Untersuchung auf Ak) zeigten für die Bettnetzbenutzergruppen Verbesserungen, von denen einige im Vergleich zum Vorjahr hochsignifikant waren. Die Resultate dieser Arbeit weisen darauf hin, dass im hochendemischen Südwesten Nigerias ITN effektiv zur Prävention der Malaria eingesetzt werden können. Der schwere Zugang zu medizinischer Versorgung für ländliche Bevölkerungsgruppen empfiehlt ihren Einsatz besonders in diesen Regionen. Hohe Infektionsraten mit der Gefahr rezidivierender Infektionen, besonders für Kinder, könnten dadurch gesenkt werden. Durch die gezeigte signifikante Reduktion der Krankeheitstage bei regelmäßiger ITN-Benutzung könnte ein zusätzlicher ökonomischer Benefit für Familien sein.
Trotz beträchtlicher Anstrengung Malaria zu kontrollieren bzw. zu eradizieren, stellt die Krankheit weiterhin eines der gravierendsten Gesundheitsprobleme unseres Jahrtausends dar. Malaria fordert jährlich zwischen 0,7 und 2,7 Millionen Menschenleben, beeinträchtigt schulische und soziale Entwicklung und hemmt erheblich das Wirtschaftswachstum der betroffenen Länder. In Burkina Faso, einem der ärmsten Länder der Welt, ist Malaria eines der größten Gesundheitsprobleme und ca. ein Drittel aller Todesfälle werden hier Malaria angelastet. Die sich weiter ausbreiteten Resistenzen gegen die gängigen Malariamedikamente machen die Bekämpfung der Malaria zunehmend schwierig. Artemisinin basierende Kombinationstherapien sind aktuell, trotz relativ hoher Therapiekosten und erster Resistenzen, die Erstlinien Behandlung. Effektive und billige neue Kombinationstherapien werden dringend benötigt. In dieser Doktorarbeit wurde das Resistenzpotential von Artemisinin modelliert. Die Homologiemodellierungen unterstützen die These von Krishna und Kollegen von SERCA als einzige Zielstruktur von Artemisinin. Des Weiteren wurde Methylenblau als neues altes Malariamittel evaluiert. Methylenblau ist das erste gegen Malaria eingesetzte Medikament, agiert als ein prooxidatives Agens und inhibiert selektiv und nicht-kompetitiv die P. falciparum Glutathion Reduktase. Die additiven und multiplen Zielprotein Effekte von Methylenblau wurden experimentell untersucht und hier in einem bioinformatischem Modell getestet. Unter dem Einfluss von Methylenblau werden einige Schlüsselenzyme des Redoxstoffwechsels in ihrer Aktivität beeinträchtigt und der Parasit wird verstärkt oxidativem Stress ausgesetzt. Des Weiteren konnte in dieser Dr. Arbeit eine starke Kooperationsbereitschaft der urbanen und ländlichen Bevölkerung an zukünftigen Malaria Projekten gezeigt werden.
The sexual phase of Plasmodium falciparum begins with the differentiation of intraerythrocytic sexual stages, termed gametocytes, in the human host. Mature gametocytes circulate in the peripheral blood and are taken up by the mosquito during the blood meal. These stages are essential for the spread of the malaria disease and form gametes in the mosquito midgut within minutes. A highly conserved family of six secreted proteins has been identified in Plasmodium falciparum. They comprise multiple adhesive domains and are termed PfCCp1 through PfCCp5, and PfFNPA. It was revealed in this work that PfCCp multi-domain adhesion proteins form protein complexes in gametocytes and on the surface of newly emerged macrogametes by adhesion domain-mediated binding. Co-Immunoprecipitation assays with activated gametocyte lysates show interactions between PfCCp proteins and indicate surface association via Pfs230 and Pfs25. Pfs230 is connected with the plasma membrane of the parasite by its interaction partner Pfs48/45. This protein is linked to the plasma membrane by a GPI anchor and presumably retains the multi-protein complex on the surface of newly emerged macrogametes in the mosquito midgut. A WD40 domain containing protein was identified to be part of this protein complex. It might serve as platform for the assembly of the multi protein complex or mediate the interplay among proteins, as suggested from known functions of the WD40 domain repeats. During egress from the host erythrocyte, the emerging gametes become vulnerable to factors of the human complement, which is taken up with the blood meal. In this thesis it was found that the complement system is active for about one hour post feeding. Macrogametes defend against complement-mediated lysis by co-opting the human complement regulators Factor H and FHL-1 from the blood-meal. These serum proteins bind via its SCR domains 5-7 to the surface of macrogametes. Once bound, they trigger complement inactivation of the alternative pathway, which prevents induction of complement lysis on the surface of the malaria parasite. Antibodies against Factor H are able to impair the sexual development in vitro and are able to block transmission to the mosquito. Interaction studies on endogenous proteins and immobilized recombinant proteins revealed the PfGAP50 protein as binding partner of Factor H and FHL-1. This protein was hitherto described as a glideosome-associated protein in invasive parasite stages, but has not yet been characterized in gametes. First localization studies indicate a relocation of PfGAP50 from the inner membrane complex to the surface of macrogametes. Malaria still persists as one of the deadliest infectious diseases worldwide. Investigations on the essential transmissive stages, gametocytes and gametes of Plasmodium falciparum, stood in the background of research for a long time. This work deciphered details on protein interactions on the surface of the malaria parasite and provides first information about coactions between the parasite and the human complement in the mosquito midgut.
In diesem Projekt wurde die Wechselwirkung des PPIase-Enzyms MIP mit Kollagen IV unter- sucht. MIP ist maßgeblich für die Infektiösität von Legionella pneumophila verantwortlich, einem Bakterium, welches im Menschen schwere Lungenentzündungen auslösen kann. Das Enzym zeigt eine hohe Affinität gegenüber einem kurzen Peptidsequenzabschnitt in Kolla- gen IV (genannt „P290”), welches unter anderem im Epithel der Lunge zu finden ist. Die Interaktionsoberfläche der Moleküle wurde durch den Einsatz eines paramagnetischen Spin-Labels in NMR-Experimenten charakterisiert. Mit Hilfe von Docking und Moleküldy- namiksimulationen konnte aus diesen Daten ein Modell des MIP-Kollagen-Komplexes be- rechnet werden. Es wurde gezeigt, dass MIP als Dimer in der Lage ist, nach Kollagen IV zu „greifen” und sich dann an das Molekül heranzuziehen. Wahrscheinlich dient dieser Mechanismus der Adhä- sion von L. pneumophila an die Wirtszelle. Neben der zuvor postulierten Destabilisierung von Kollagen IV durch MIP, welche hier nicht beobachtet wurde, könnte die Adhäsion ein wichtiger Faktor für die Virulenz von L. pneumophila sein. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des isolierten Peptids P290 auf die biologische PPIase-Aktivität von MIP untersucht. Durch NMR-Messungen und anschließenden Mole- küldynamiksimulationen konnte gezeigt werden, dass P290 sich stabil in die Bindungsta- sche von MIP einlagert und durch den Sequenzabschnitt -CYS130-PRO131---TRP134- das Enzym blockiert. Die übrigen Aminosäuren in P290 dienen der Stabilisierung des Kom- plexes und sorgen für die Selektivität von P290, welches, im Unterschied zu bekannten Wirkstoffen, das humane Homolog zu MIP nicht inhibiert. Die Vorhersagen der Simulatio- nen konnten durch ein Peptid Microarray und Messungen der enzymatischen Aktivität von MIP in PPIase-Assays bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden zur Optimierung von P290 eingesetzt, indem die Peptidsequenz durch den Austausch zweier Aminosäuren verändert und das Molekül zu einem Ring geschlossen wurde. Die entstandene Struktur besitzt deut- lich verbesserte Bindungseigenschaften und könnte künftig als Basis für eine neue Klasse von Wirkstoffen gegen L. pneumophila dienen. In diesem Projekt wurde eine Methode zur Aufklärung der Molekülstruktur neuartiger Wirkstoffe gegen Malaria im Komplex mit ihrem paramagnetischen Zielmolekül etabliert und weiterentwickelt. Die Vorgehensweise leitet intermolekulare Distanzinformationen aus der sog. paramagnetischen Relaxation ab, einem Effekt, der den Einsatz klassischer Me- thoden zur Molekülstrukturaufklärung mittels NMR verhindert. Es werden drei Parameter durch NMR-Spektroskopie bestimmt: 1. die longitudinale Relaxationszeit der Wasserstoff- atome in Wirkstoffmolekül, 2. die effektive Korrelationszeit des Komplexes und 3. der Spin- Zustand des Eisenions im Zielmolekül. Mit Hilfe dieser Messmethode konnte die Komplexstruktur mehrerer bekannter Medika- mente gegen Malaria aufgeklärt werden. Weiterhin wurden zwei neue Klassen von Wirkstof- fen untersucht, die C,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide und die N,C-gekoppelte Naphthylisoquinolin-Alkaloide. In Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen aus der Literatur lagern sich die Wirkstoffe stets um einen Winkel geneigt und in Richtung des Randes des Zielmoleküls verschoben an. Diese Konfiguration maximiert die attraktiven π- π-Wechselwirkungen zwischen den Molekülen. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse aus NMR, UV-Spektroskopie und Massenspektrome- trie konnte die Existenz eines bisher nicht bekannten Tetramer-Komplexes nachgewiesen werden, welcher eine wichtige Zwischenstufe in der Biokristallisation von Hämozoin durch die Malariaparasiten darstellen könnte, und Ansatzpunkte für den weiterhin nicht vollstän- dig bekannten Wirkmechanismus der meisten Antimalaria-Wirkstoffe liefert. Für die Naphthylisoquinolin-Alkaloide zeigte sich weiterhin, dass Wasser eine essenzielle Rolle in der Komplexbildung spielt. In Moleküldynamiksimulationen der N,C-gekoppelten Naphthylisoquinolin-Alkaloide konnte die Entstehung einer Wasserstoffbrücke zwischen Wirkstoff und Zielmolekül gezeigt werden, welche einen zusätzlichen Weg der Komplex- stabilisierung neben den bereits bekannten π-π-Wechselwirkungen aufzeigt. Die N,C-NIQs konnten erstmals auch bei einem pH-Wert von 5,6 beobachtet werden, einer chemischen Umgebung wie sie auch in-vivo in der Verdauungsvakuole des Malariaparasiten herrscht.
Die Malaria und andere Infektionskrankheiten sind immer noch die Haupttodesursache in Entwicklungsländern. Durch das jahrzehntelange Versäumnis, neue Wirkstoffe zu entwickeln, und durch die rasante Ausbreitung von Resistenzen gegen herkömmliche Medikamente sind in vielen Regionen der Erde besorgniserregende Zahlen über Neuinfektionen und Todesfälle zu beobachten. Die Suche nach neuen Wirkstoffen ist daher dringend erforderlich und die Hauptaufgabe des Sonderforschungsbereichs 630 an der Universität Würzburg. An diesem interdisziplinären Projekt beteiligt sich unsere Forschungsgruppe vor allem mit der Naturstoffklasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide. Neben ihren interessanten strukturellen Eigenschaften haben mehrere Vertreter dieser Sekundärmetabolite vielversprechende Aktivitäten gegen Plasmodien, Leishmanien und Trypanosomen. Dioncophyllin C (24), das bisher wirksamste Naphthylisochinolin gegen P. falciparum, zeigt nicht nur eine exzellente Aktivität in vitro, sondern auch in vivo. In Kooperation mit der Forschergruppe von K. Baumann (Braunschweig) führte man QSAR-Studien durch, um die für die biologische Wirkung entscheidenden Strukturmerkmale zu identifizieren und neue vereinfachte Analoga der Leistruktur 24 vorzuschlagen. Ziel der vorliegenden Arbeit war aufbauend auf Vorarbeiten in unserer Gruppe die Darstellung von strukturell vereinfachten Derivaten des Naturstoffs 24. Die Ergebnisse der biologischen Untersuchungen sollten ausgewertet und somit neue Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt werden. Weiterhin sollten auch Chinolinium-Salze, die man als Analoga der N,C-verknüpften Naphthylisochinoline ansehen kann, synthetisiert werden und innerhalb des SFB 630 und bei unseren Partnern am Schweizerischen Tropen- und Public-Health-Institut auf ihre biologische Aktivität untersucht werden. Man erhoffte sich neben möglichen antiinfektiven Eigenschaften auch Rückschlüsse auf Struktur-Wirkungs-Beziehungen. Zusätzlich sollte die synthetische und analytische chemische Expertise unseren Kooperationspartnern in zwei Projekten außerhalb des SFB 630 zur Verfügung gestellt werden. Dabei handelte es sich einerseits um die Strukturaufklärung von Biosyntheseintermediaten mit Hilfe der HPLC-NMR-Kopplung und andererseits um die Darstellung langkettiger Aldehyde für die biologische Untersuchung des Prä-Penetrationsprozesses eines getreideschädigenden Pilzes.
Infektionskrankheiten gehören weltweit immer noch zu den häufigsten Todesursachen, und auch wenn die Gefährdung in den Industriestaaten erheblich reduziert werden konnte, nimmt die Bedeutung von übertragbaren Krankheiten wieder zu. Verursacht wird dies zum einen durch die Fähigkeit der Keime gegen die eingesetzten Arzneistoffe verschiedenartige Resistenzmechanismen zu entwickeln, zum anderen auch dadurch, dass neuartige Infektionskrankheiten entstehen. Aus diesem Grund bleibt die Entwicklung neuer Medikamente ein ständiger Wettlauf mit der Anpassungsfähigkeit der Infektionserreger, und gerade dies spielt eine große Rolle für vernachlässigte und armutsassoziierte Krankheiten wie z.B. Tuberkulose, Malaria und HIV/AIDS, die in den Entwicklungsländern große Krankheitslasten und so auch hohen volkswirtschaftlichen Schaden verursachen. Protozoische Parasiten wie die Erreger der Malaria und der Leishmaniose sind besonders trickreich, denn sie wechseln zwischen Vektor (z.B. Mücke) und Wirt (z.B. Mensch) und durchleben so verschiedene Stadien eines komplexen Entwicklungszyklus, von denen sich jedes einzelne Stadium wie ein 'anderer' Organismus verhält. Hierdurch ist die therapeutische Behandlung erschwert, und für die dauerhafte Eradikation der Parasiten und für die Hemmung ihrer Transmission, um letztlich eine Resistenzentwicklung der Medikamente zu verhindern, müssen Wirkstoffe möglichst gegen alle Stadien ähnlich gut wirken. Die Konzeptionierung solcher Verbindungen, ihr strukturelles Design und schließlich ihre Synthesen waren Ziel der hier vorliegenden Arbeit, um neue aktive Vertreter gegen protozoische und bakterielle Erreger und Toxine bereitzustellen. Die Konzeptionierung und Synthese von Hybridmolekülen aus bewährten Arzneistoffen wurde als innovativer Ansatz zur Behandlung der Malaria verfolgt. Eine strukturell neue Wirkstoffklasse mit sehr guten spezifischen Aktivitäten und interessanten Struktur-Aktivitäts-Beziehungen gegen Promastigoten und gegen Amastigoten von L. major wurde entdeckt. Auf der Suche nach neuen Verbindungen, die binäre Toxine von Bacillus anthracis Anthrax-Toxin), Clostridium perfringens (Iota-Toxin) und Clostridium botulinum C2-Toxin) hemmen können, wurden neben 4-Aminochinolin-Verbindungen neue Aminochinolinium-Salze konzipiert, synthetisiert und in Target-basierten Assays durch Titrationsexperimente und Stromfluktuationsanalysen bzw. in In-vitro-Experimenten auf ihre Wirksamkeit getestet.