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Foamyviren (FVs) sind die genetisch stabilsten Viren der Retrovirus-Familie. Dies steht im Gegensatz zur Fehlerrate, die für die rekombinante FV Reverse Transkriptase (RT) gefunden wurde. Um die Genauigkeit der FV Genomreplikation in vivo zu ermitteln, analysierten wir das Auftreten von Mutationen nach FV-Vektortransfer in einer einzigen Replikationsrunde. Die Sequenzanalyse von mehr als 90000 Nukleotiden ergab 39 Mutationen. Dies entspricht einer Fehlerrate von ungefähr 4 x 10-4 pro Base und Replikationszyklus, wobei alle Mutationen Transitionen von G zu A waren. Eine schwache Expression von APOBEC-Enzymen in den vektorproduzierenden Zellen konnte als wahrscheinlichste Ursache für diesen Typ an Mutationen nachgewiesen werden. Das akzessorische FV Bet Protein wirkt APOBEC entgegen. Kotransfektion von Zellen mit einem bet-Expressionsplasmid resultierte in einer signifikanten Reduktion an Mutationen bei über 170000 zusätzlich sequenzierten Basen. Zwei Mutationen konnten nicht der APOBEC-Aktivität zugeschrieben werden, deshalb postulieren wir eine idealisierte FV-Mutationsrate von angenähert 7,5 x 10-6 pro Base und Replikationszyklus. Im Gegensatz zu in vitro-Analysen wurde nur eine einzige Deletion und keine Insertion bei mehr als 260000 sequenzierten Basen identifiziert. Die Analyse der Rekombinationsrate von FV-Vektorgenomen ergab mehr als ein zusätzliches Template-Switching-Ereignis pro reverser Transkription. Wir konnten auch zeigen, dass ein bestimmtes FV-Partikel in der Lage zum Crosstransfer eines heterologen FV-Genoms ist, jedoch mit einer reduzierten Effizienz als bei Verwendung des homologen Vektors. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einerseits, dass das Kopieren des FV-Genoms mit höherer Genauigkeit geschieht als bisher angenommen, auf der anderen Seite ist Rekombination bei FV-Genomen wahrscheinlich.
Machbarkeitsstudie bezüglich der Einführung Hochaktiver Antiretroviraler Therapie (HAART) in Namibia/Afrika. 1) Es erfolgt eine Dokumentation des Projektes(Therapieregime, örtliche Gegebenheiten, Personal, Einschluss-und Ausschlusskriterien) und 2) eine statistische Auswertung verschiedener Laborparameter (Leukozyten, Hb, Gewicht/BMI, CD4) unter der Therapie. 3) Untersuchung der Todesfälle mit der Frage nach prognostischer Vorhersagekraft verschiedener Parameter. 4) Ergebniss: Verbesserung von Lebensqualität und Lebensdauer betroffener Patienten durch die Therapie. Die weitere Einführung von HAART in afrikanischen Ländern wird ausdrücklich empfohlen.
Foamyviren gehören zur Familie der Retroviren und sind in vielen verschiedenen Primaten-Spezies prävalent. Auch einzelne Foamyvirus-Infektionen des Menschen sind nach engem Kontakt zu Primaten beschrieben worden. Untersuchungen auf molekularer Ebene lagen bisher nur für Foamyviren der Altweltaffen vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die komplette Nukleotidsequenz des Neuweltaffen-Foamyvirus des Klammeraffens (SFVspm) entschlüsselt und molekular charakterisiert. DNA wurde aus SFVspm infizierten Zellen isoliert. Ausgehend von einem 425 bp langen bekannten Abschnitt des Integrase-Gens wurde das foamyvirale Genom mithilfe der Polymerasekettenreaktion in fünf Abschnitten amplifiziert. Die Primer wurden anhand konservierter Sequenzen im SFV-Genom generiert. Die Genomabschnitte des 5’-Endes bis zum Integrase-Gen von SFVspm wurden in Plasmidvektoren kloniert und anschließend sequenziert, die Genomabschnitte vom Integrase-Gen zum 3’-Ende wurden direkt nach der PCR-Amplifikation sequenziert. Die Sequenzen der einzelnen SFVspm-Fragmente wurden zu einem zusammenhängenden Genom zusammengesetzt, wobei die Consensus-Sequenz aus mindestens drei unabhängigen Sequenzierungen pro Nukleotid ermittelt wurde. Anhand von Homologie-Vergleichen konnte das SFVspm mit einer Größe von 12212 bp als komplexes Retrovirus der Unterfamilie der Spumaretrovirinae identifiziert werden. Es besitzt alle konservierten Protein-Domainen, die charakteristisch für Primaten-Foamyviren sind. SFVspm stellt somit das erste vollständig sequenzierte und molekulargenetisch charakterisierte Neuweltaffen-FV dar. Zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zum Nachweis einer SFVspm-Infektion wurde ein 765 bp langer Abschnitt des gag-Gens als Antigen exprimiert und ein Antikörper im Kaninchen-Serum generiert. In einem Western Blot zeigte sich für eine Detektion von SFVspm-Gag-Antigen bzw. Anti-SFVspm-Gag eine gute Spezifität und Sensitivität. Die auf Western Blot basierte Methodik wurde schließlich in Kombination mit einer PCR des Integrase-Gens zum Nachweis einer Infektion mit Neuweltaffen-Foamyvirus in Callithrix spp. angewandt. Es wurden Seren und Lymphozyten-DNA zwölf verschiedener Callithrix-Affen, sowie Gewebeproben aus Milz, Leber und Mundschleimhaut untersucht, wobei in keinem Tier eine SFV-Infektion nachgewiesen werden konnte. Da Foamyviren aufgrund ihrer genetischen Stabilität interessante Marker für phylogenetische Untersuchungen sind, wurden anhand der Kenntnis der Genomsequenz von SFVspm und fünf Altweltaffen-FV phylogenetische Stammbäume basierend auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzen und der Maximum-Likelihood-Methode gezeichnet und SFVspm evolutionär eingeordnet. SFVspm zeigte sich als das evolutionär divergenteste Foamyvirus aus der Teilordnung der Primaten-Foamyviren. Dies spiegelt die phylogenetische Auftrennung ihrer Wirte, der Altweltaffen und Neuweltaffen, wider und bekräftigt eine gemeinsame Evolution von Foamyviren und ihren Wirten.
Dies ist ein Lehrbuch über die HIV-1 Replikation, Pathogenese und Therapie. Es richtet sich an Studenten der Biologie und der Medizin, die etwas mehr über HIV erfahren wollen und stellt neben virologischen Themen auch die zellulären Grundlagen dar. Es umfasst den Viruseintritt, die reverse Transkription, Genom-Integration, Transkriptionsregualtion, die Kotrolle des Spleißens, der Polyadenylierung und des RNA-Exportes. Die Darstellung wird abgerundet mit Kapiteln zum intrazellulärem Transport, zu Nef und zum Virusassembly. In zwei weiteren Kapitel wird die HIV-1 Pathogenese und die Therapie besprochen. Zur Lernkontrolle sind den Kapiteln Fragen und auch Klausurfragen angefügt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist.
Die Integration der viralen DNA in die des Wirtsgenoms ist ein essentieller Schritt im Lebenszyklus der Retroviren. Das wissenschaftliche Interesse an der Analyse von retroviralen Integrationsmustern ist, vor allem in Hinblick auf die Anwendung von retroviral basierten Vektoren in der somatischen Gentherapie, neu angefacht worden. Entgegen der Annahme, dass die retrovirale Integration dem Zufallsprinzip folgend stattfindet, konnten in den letzten Jahren für verschiedene Genera der Retroviren virusspezifische Integrationsmuster enthüllt werden, die auf eine Bevorzugung von bestimmten chromosomalen Regionen hindeuten, deren Mechanismen noch nicht ausreichend geklärt sind. Für die Sicherheit von therapeutisch anwendbaren Vektoren ist die Analyse von retroviralen Intgerationsmuster daher unerlässlich geworden. Foamyvirus (FV)-basierte Vektoren besitzen ein großes Potential, in der somatischen Gentheraphie ihre Anwendung zu finden, so dass eine Analyse ihrer Integrationsmuster im humanen Genom erforderlich ist. Hierfür wurden humane 293-Zellen mit FV-basierten Vektoren transduziert und mittels inverser PCR 628 FV-Integrationsstellen kloniert, die zur Analyse von verschieden Aspekten des foamyviralen Integrationsmusters im humanen Genom lokalisiert wurden. Als Vergleich und als Kontrolle wurden 141 Murine Leukämie Virus-(MLV)- und 87 Humane Immundefiziens Virus-(HIV)-Integrationsstellen ebenfalls kloniert und analysiert. Im Vergleich zu HIV, welches die Integration in Gene bevorzugt, und MLV, welches eine starke Präferenz zur Integration in regulatorische Bereiche in der Nähe von Transkriptionsstartstellen (TSS) von Genen besitzt, konnten mit den hier ermittelten FV-Daten weder Präferenzen zur Integration in Gene, noch starke Präferenzen für regulatorische Bereiche beobachtet werden. Eine leichte Bevorzugung zur Integration in der Nähe der TSS war zu erkennen, die allerdings deutlich schwächer ausfiel als bei MLV. Weiterhin wurden bei der Betrachtung der Basenzusammensetzungen in der Umgebung der FV-Integrationsstellen statistisch signifikante Präferenzen für bestimmte Basen an bestimmten Positionen beobachtet, die ein schwaches Palindrom bildeten, dessen Symmetrieachse sich im Zentrum der nach der Integration duplizierten zellulären Sequenz sich befand. Eine aktive Teilnahme von mit der viralen Integrase (IN) interagierenden zellulären Proteinen an der retroviralen Integrationsreaktion in vivo und an der Wahl der retroviralen Integrationsstellen ist sehr wahrscheinlich. Solche mit der IN interagierende zelluläre Proteine sind für FV noch unbekannt, so dass hierfür ein experimentelles Testsystem etabliert wurde. Mit Hilfe von humanen Zellen, welche mittels retroviralem Gentransfer stabil C-terminal mit einem FLAG-Peptid fusionierte FV IN-Proteine expremierten, wurden in Pull-down-Experimenten und Maldi-Tof-Massenspektrometrie zwei zelluläre Proteine (NF90 und ADAR1) identifiziert, welche mit dem FV IN-Protein interagieren und aufgrund ihrer Spezifitäten potentzielle Kofaktoren der foamyviralen Integration darstellen könnten. Eine RNAi-basierte Runterregulierung der Expression beider Proteine konnte, aufgrund der essentiellen Rolle beider Proteine an der Regulation der Zellteilung, keine experimentellen Daten liefern, die eine Analyse über die Funktion beider Proteine an der Integrationsreaktion von FV zulassen. Die Funktion beider Proteine muss in biochemischen Versuchen noch evaluiert werden und könnte einen interessanten Einblick in die Wechselwirkungen von FV mit ihrem Wirt liefern. Neben der Identifikation der zwei mit der IN interagierenden zellulären Proteine zeigen die hier präsentierten Daten zusammenfassend, dass das Integrationsmuster der FV sich von MLV und HIV-1 unterscheidet und nahezu dem Zufallsprinzip folgt. Aufgrund der im Vergleich zu MLV deutlich schwächeren Präferenz zur Integration in der Nähe von regulatorischen Bereichen und der im Vergleich von HIV-1 überhaupt nicht vorhandene Bevorzugung zur Integration in Gene stellen FV-basierte Vektoren interessante alternative Vektorsysteme für die somatische Gentheraphie dar.
Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert.