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Brustkrebs ist, verbunden mit einem Lebenszeitrisiko von 12.5 % daran zu erkranken, die häufigste maligne Erkrankung der Frau in der westlichen Welt. Das LIM- und SH3-Domänen Protein LASP-1 wurde erstmalig 1995 als spezifisch in fokalen Kontakten akkumulierendes Protein in humanen Brustkrebszellen beschrieben. Eine eigene Patientenstudie (n = 83) ergab, dass LASP-1 in 55.4 % der untersuchten invasiven Mammakarzinome eindeutig überexprimiert wird und die LASP-1-Expressionshöhe signifikant positiv mit der Tumorgröße (p < 0.05) und der Wahrscheinlichkeit für Nodalpositivität (p < 0.01) korreliert. Als Actin-bindendes Protein mit ubiquitärer Expression interagiert LASP-1 mittels seiner SH3-Domäne auch mit Zyxin. Zyxin ist ein Signalprotein, das zwischen fokalen Kontakten und dem Zellkern pendelt und an der Regulation von Transcription, Zellzyklus und Zellbewegung beteiligt ist. In dieser Doktorarbeit untersuchte ich die Funktion von LASP-1 in verschiedenen humanen Brustkrebszelllinien und einer humanen Ovarkarzinomzelllinie unter Verwendung der RNA-Interferenz zum sequenzspezifischen knock-down von LASP-1. Die Transfektion der Zellen mit LASP-1-spezifischer small-interfering-RNA (siRNA) senkte die Proteinexpression um ca. 50 - 58 %, was zu einer Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase führte und die Proliferation der Brust- und Eierstockkrebszellen um 30 - 50 % reduzierte. Apoptotische und nekrotische Prozesse wurden dabei durch Caspase-3 Western-blots und Trypan-Blau-Färbungen ausgeschlossen. Außerdem verringerte der knock-down von LASP-1 die Migration der Krebszellen, wohingegen die Überexpression von LASP-1 in PTK2- (Potorous tridactylis kidney) Zellen, welche kein endogenes LASP-1 exprimieren, in einer signifikanten Steigerung der Migration resultierte. Immunfluoreszenzfärbungen zeigten, dass der knock-down von LASP-1 von einer verringerten Konzentration seines Interaktionspartners Zyxin an fokalen Kontakten begleitet wird, ohne dabei das Actin-Zytoskelett oder die Morphologie der fokalen Kontakte zu verändern. Die Transfektion der Brust- und Eierstockkrebszellen mit einer Kontroll-siRNA (scrambled Neuropilin1) beeinflusste hingegen keinen der genannten Parameter. Diese Daten unterstreichen die wichtige Rolle von LASP-1 für die Tumorzellproliferation und -migration. LASP-1 könnte daher in Interaktion mit Zyxin an der molekularen Karzinogenese von Brust- und Eierstockkrebs beteiligt sein und in der Zukunft als viel versprechender Prognosemarker dienen.
Untersuchung des Wirkmechanismus von AEZS 126 auf drei triple negative Mammakarzinomzelllinien HCC1937, HCC1806 und MDA-MB468 und eine Oestrogenrezeptor positive Zelllinie MCF-7 mittels Kristallviolett assay, FACS und Western Blot. Es konnte gute Antitumorwirkung des Inhibitors in vitro gezeigt werden.
Brustkrebs ist die häufigste maligne Erkrankung der Frau. Die Therapie setzt sich in der Regel individuell aus den Bausteinen der chirurgischen Tumorexzision, der Bestrahlung und der systemischen Therapie zusammen. Daneben gewinnt die ketogene Diät als supportiver Therapieansatz immer mehr an Aufmerksamkeit und Forschungsinteresse. Diese Ernährungsform imitiert durch starke Restriktion der Kohlenhydratzufuhr den Fastenstoffwechsel, da Blutzucker- und konsekutiv auch Insulinspitzen im Blut vermieden werden. Eine tragende Rolle kommt dabei der Bildung von Ketonkörpern, allen voran Betahydroxybutyrat, zu, die sowohl in den Tumorstoffwechsel als auch in immunologische Prozesse eingreifen können. In dieser Arbeit wurde ausgewählten Brustkrebszellen 3 mM Betahydroxybutyrat zugesetzt und ihr Wachstumsverhalten, ihre Chemo- und Radiosensitivität im Vergleich zu Kontrollzellen erfasst. Die Kontrollzellen wurden identisch behandelt, jedoch wurde Ihnen kein Betahydroxybutyrat zugefügt. Es zeigte sich dabei kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zellgruppen.
Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
Für die Diagnose und Therapie von Brustkrebs existiert die nationale evidenz- und konsensbasierte S3-Leitlinie. Die klinischen Krebsregister stellen sektor- und facharztübergreifende Diagnose- und Therapiedaten zur Qualitätssicherung bereit. Bislang fehlen jedoch Daten bezüglich patient-reported outcome measures (PROMs). Aufgrund des demographischen Wandels werden Brustkrebserkrankungen vor allem in ländlichen Regionen weiter zunehmen, weshalb Versorgungsstrukturen für alle Patientinnen erreichbar sein sollten. Es wurde ein patientenorientiertes Registerkonzept (Breast Cancer Care for patients with metastatic disease (BRE-4-MED)) für den metastasierten Brustkrebs entwickelt und hinsichtlich vordefinierter Machbarkeitskriterien pilotiert. An der BRE-4-MED-Pilotstudie nahmen 31 Patientinnen (96.8% weiblich) teil. Die bayernweite Erreichbarkeit zu brustkrebsspezifischen Versorgungsstrukturen wurde mithilfe einer Geographic Information System (GIS)-Analyse untersucht. Anhand von Leitlinienempfehlungen und Ergebnissen der BRE-4-MED-Pilotstudie wurden relevante Versorgungsstrukturen identifiziert. Die Ergebnisse der Pilotstudie zeigen, dass die Integration von Primär- und Sekundärdaten aus verschiedenen Quellen in ein zentrales Studienregister machbar ist und die erforderlichen organisatorischen Prozesse (z. B. data linkage mit Krebsregister) funktionieren. Die Ergebnisse der Erreichbarkeitsanalyse verdeutlichen, dass es keine bayernweite Erreichbarkeit zu brustkrebsspezifischen Versorgungsstrukturen gibt. Am stärksten war dieser Zusammenhang in grenznahen Regionen ausgeprägt. Die vorliegende Arbeit zeigt Chancen für eine patientenorientierte, qualitätsgesicherte Brustkrebsversorgung unabhängig vom Wohnort auf.
Hintergrund: Mikrokerne sind Chromosomenfragmente, die nicht in den Hauptkern integriert wurden und im Zytoplasma von proliferierenden Zellen nach ionisierender Strahlung oder Behandlung mit mutagensierenden Substanzen zu finden sind. In vielen Fällen konnte gezeigt werden, dass die Mikrokernfrequenz als Indikator für den strahleninduzierten Schaden dienen kann. Humane Lymphozyten und Fibroblasten von Patientinnen mit Brustkrebs nach Brusterhaltender Therapie wurden bestrahlt, im Mikrokerntest ausgewertet und die Ergebnisse mit den klinischen Akutreaktionen verglichen. Methode: Beide Zelltypen der 24 Patientinnen mit dem selben Bestrahlungsproceder (50 Gy + 10 Gy Boost) und ohne Chemotherapie wurden untersucht. Die Normalgewebsreaktionen wurden unter Verwendung der RTOG-Kriterien bestimmt. Die Zellen wurden in vitro mit 0-, 1-, 2-Gy-Einmaldosis-Bestrahlung (Lymphozyten) bzw. 0-, 2-, 4-Gy-Einmaldosis-Bestrahlung behandelt, über 72 h kultiviert, auf Objektträgern fixiert und bei 400 - 1000facher Vergrößerung (Fluoreszenzmikroskop) ausgewertet. Die Zellteilung der Lymphozyten wurde mittels Cytochalasin B (Cyt B) inhibiert. Ergebnisse: Es konnte keine signifikante Korrelation der in-vitro-Strahlenempfindlichkeit und den Normalgewebsreaktionen beobachtet werden. Des weiteren wurde kein Zusammenhang zwischen der Strahlenempfindlichkeit der lymphozyten und den Fibroblasten, die vom selben Spender gewonnen wurden, beobachtet. Zusammenfassung: Die Daten unterstützen nicht den Nutzen des Mikrokern-Testes in der Vorhersage von Normalgewebsreaktionen auf die Strahlentherapie bei Malignompatienten.
Zur Entscheidungshilfe in der Therapiefindung des Mammakarzinoms haben sich bezüglich der Indikation zur Chemotherapie neben den klinischen und histopathologischen Kriterien in den letzten Jahren vorrangig Multigentests etabliert. In der vorliegenden Arbeit wurden Zusammenhänge zwischen dem Oncotyp DX® und 18 immunhistochemischen Markern aus der Tumorbiologie für 78 Fälle hormonrezeptorpositiver, Her2/neu negativer Mammafrühkarzinome mit niedrigem Lymphknotenstatus untersucht. Es erfolgten immunhistochemische Färbungen an Microtissue-Arrays der Tumorproben. Für die Marker AMACR, Cyclin D1, p53, MDM2 und PDL1 ergab sich eine klare statistisch signifikante Korrelation zum Recurrence-Score®des Oncotyp DX® und mit Einschränkungen auch für CDK4. Die Marker p27, Bcl2 und Glut 1 erreichten ein etwas niedrigeres Signifikanzniveau in der statistischen Analyse. Der immunhistochemische Routinemarker Ki67% zeigte eine hochsignifikante Korrelation mit dem Recurrence-Score®. Hierdurch ergeben sich neue Perspektiven zur Risikostratifizierung des Mammakarzinoms, wie beispielsweise die konsekutive Entwicklung eines immunhistochemischen Scores mit prädiktivem Wert für den Recurrence-Score® mit klinischer Anwendung als Prätest oder als eigenständiges Stratifizierungstool bei Brustkrebs.
Taxane (wie Paclitaxel oder Cabazitaxel) sind bewährte Arzneimittel in den systemischen Therapieschemata vieler bösartiger Erkrankungen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebs. Sie fördern die Stabilisierung der Mikrotubuli, was zu einem Stillstand des Zellzyklus während der Mitose führt, auf den die Apoptose folgt. Neben dieser antimitotischen Wirkung von Taxanen ist seit einiger Zeit auch eine gefäßverändernde Wirkung von Taxanen bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Taxane tatsächlich Störungen in der Gefäßarchitektur verursachen, indem sie den Kalziumeinstrom über TRPC6, einen unselektiven Kationenkanal, auslösen. Der erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel bewirkt eine Rundung der Endothelzellen, was zu einer Störung des endothelialen Monolayers, Serumausfluss und Gefäßkollaps führt.
In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Gefäßbetten von peripheren Organen wie dem Herzen oder der Niere in Abhängigkeit vom Tumorstadium und der Taxol-Behandlung. Die Organe wurden mit immunhistochemischen Techniken angefärbt, um Veränderungen in der Architektur und Morphologie der Blutgefäße zu untersuchen.
Wir fanden Veränderungen in der Morphologie der Kapillaren des Herzens und darüber hinaus Veränderungen in der Expression endothelialer Antigene in Abhängigkeit vom Tumorstadium, insbesondere eine zunehmende endotheliale Expression von TRPC6 in Abhängigkeit vom Tumorstadium.
Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse für das Verständnis der systemischen Auswirkungen maligner Erkrankungen und tragen dazu bei, Folgeerkrankungen bei Patienten mit fortgeschrittenem Krebs zu verhindern.
Untersuchungen zur Informationsweitergabe in Familien mit erblichem Brust- und Eierstockkrebs
(2021)
Für die hier beschriebene Studie wurde ein Fragebogen erstellt, welcher von 80 Trägerinnen und Trägern einer pathogenen Mutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 ausgefüllt wurde. Die Befragung sollte untersuchen, ob den Befragten das Risiko ihrer Verwandten, ebenso Mutationsträger zu sein, bewusst war. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob sie die jeweiligen Risikopersonen darüber informierten. Es zeigte sich, dass den meisten Befragten dieses Risiko bekannt war. Einigen Personen schienen jedoch nicht genau zu wissen, welche Verwandten als „Risikopersonen“ zählen. Insbesondere war nicht allen Befragten die Möglichkeit bewusst, dass auch Männer die Mutation tragen und an ihre Kinder weitergeben sowie selbst an Brustkrebs erkranken können. Weiterhin gaben mehr als ein Viertel der Befragten an, dass sie mindestens ein Familienmitglied, obwohl es ihnen als Risikoperson bekannt war, nicht informierten. Als häufigste Grund hierfür wurde mangelnder Kontakt genannt. Vor dem Hintergrund der Angaben der Befragten sowie der aktuellen Forschungslage werden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten diskutiert, wie die Anzahl der informierten Angehörigen verbessert werden könnte.
In dieser Arbeit wird anhand eines Würzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Abschätzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tatsächlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammbäume der Probanden auf Angehörige 1. und 2. Generation gekürzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied.
Das Mammakarzinom ist die häufigste Neoplasie bei Frauen und jede 11. Frau in Deutschland erkrankt im Lauf ihres Lebens an Brustkrebs. Die Überlebensaussichten haben sich in den letzten Jahrzehnten deutlich verbessert, was auf sensiblere Untersuchungsmethoden und die Therapieoptimierung zurückzuführen ist. Eine große Rolle spielt auch der Einsatz verschiedener Prognosefaktoren. Insbesondere Alter, Lymphknotenstatus, Tumorgröße, Histologie, Hormonrezeptor- und Her2-neu-Status kommen heute routinemäßig zum Einsatz. Trotz allen Fortschritts ist Brustkrebs weiterhin die führende Todesursache unter den Krebserkrankungen bei Frauen. Große Hoffnung wird in neue Therapiemethoden gesetzt, die in den Glukosestoffwechsel eingreifen. In letzter Zeit erlangten Glykolysemarker, die als Indikatoren für den veränderten Kohlenhydratstoffwechsel in Tumorzellen dienen, wachsendes Interesse. Obwohl Brustkrebs eine bereits häufig untersuchte Tumorentität ist, ist der Einfluss des Glukosestoffwechsels auf die Fähigkeit zur Metastasierung und die Überlebenszeit unbekannt. Für diese Studie wurde eine Gruppe von 160 Patientinnen ausgewählt, die vor mehr als 13 Jahren wegen einer Brustkrebsneuerkrankung behandelt wurden. Das bei der Operation entnommene Gewebe des primären Mammakarzinoms wurde immunhistochemisch auf die Expression von Tumor-M2-PK und pAkt, zweier ausgewählter Schlüsselenzyme der Tumorglykolyse, untersucht. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper, die spezifisch an die dimere Isoform der M2-PK und das pAkt binden, wurden von jeder Probe der Expressionsgrad dieser beiden Marker sowie der immunreaktive Score bestimmt. Die Ergebnisse der Färbungen wurden mit klinisch-pathologischen- und Überlebensdaten der Patientinnen abgeglichen, um Informationen über die prognostische Relevanz dieser Marker zu erhalten. Eine Überexpression konnte in 58% der Fälle für M2-PK- und in 70% für pAkt nachgewiesen werden. Die übermäßig starke Expression der dimeren M2-Pyruvatkinase konnte als unabhängiger Prognosefaktor für das Langzeitüberleben beim Mammakarzinom identifiziert werden und die Mortalitätsrate bei Patientinnen mit positivem M2-PK/cut-off war deutlich geringer. Bei Frauen unter 52 Jahren und im Zusammenhang mit negativem Östrogenrezeptorstatus wurde häufiger die konstitutive Akt-Aktivierung beobachtet. Die routinemäßige Bestimmung der M2-PK könnte in Zukunft bei der Entwicklung individueller Behandlungskonzepte zum Einsatz kommen und die pAkt könnte als prädiktiver Faktor für die adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms dienen.
In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv Daten von 321 Fällen eines fortgeschrit-
tenen Mammakarzinoms ausgewertet. Beobachtungsdaten lagen bis einschließlich Juli
1998 vor. Ein Fokus dieser Arbeit lag auf der Trichotomie der HER2-Ausprägung und
deren prognostischen Wert im Verlauf einer metastasierten Brustkrebserkrankung. In
einer neueren Entwicklung wurde HER2-low als Nomenklatur einer Subgruppe etabliert
für jene Mammakarzinome, die als IHC 1+ oder IHC 2+ gelten und ein negatives ISH-
Ergebnis aufweisen. Neue Studien-Ergebnisse zeigten einen signifikanten klinischen
Vorteil der Therapie mit HER2-basierten Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten für HER2-low
Patientinnen (91).
Der Anteil der HER2-low Mammakarzinome nahm im Laufe einer fortgeschrittenen
Brustkrebserkrankung kontinuierlich zu und lag bei 39,3 % im Primärtumor, bei 47,7 %
im ersten Rezidiv und bei 47,8 % in einer zweiten Fernmetastase. Parallel vergrößerte
sich die HER2-positive Subgruppe, wobei sich die HER2-negative Kohorte folglich ver-
kleinerte. Es konnte entsprechend der aktuellen Literatur (117,156) eine Assoziation (p
< 0.001) des HER2-low Subtypen und HR-positiven Mammakarzinomen gezeigt werden.
HER2-low nahm in HR-positiven/Her2-negativen Mammakarzinomen im Laufe der Me-
tastasierung zu (56,7 % - 64,1 % - 75,6 %). Der Anteil der HER2-low-Expression im
Triple-negativen Subtypen initial bei 14,6 % und vergrößerte sich konstant (48,2 % - 50
%). Ein Verlust der HER2-Ausprägung im Krankheitsverlauf korrelierte statistisch signi-
fikant mit einem besseren OS (Hazards Ratio 0,533, 95%-KI[0,316, 0,898], p = .018).
Die Gruppe mit einer HER2-Konversion zu einer schwächeren Ausprägung wies im di-
rekten Vergleich zur Gruppe mit einer Her2-Konversion zu einer stärkeren Ausprägung
ein 21,0 Monate längeres Überleben auf (p = 0.177). Die Entwicklung eines HER2-posi-
tiven Primärtumor zu einer HER2-low Metastase (Hazards Ratio 0,385, 95%-KI[0,17,
0.874], p = .023), eine Veränderung von einem HER2-0 Primärtumor zu einer HER2-low
Metastase (Hazards Ratio 0,124, 95%-KI[0,023, 0,655], p = .014) sowie die ausblei-
bende Veränderung eines HER2-low Primärtumor zu einer Fernmetastase (Hazards Ra-
tio 0,169, 95%-KI[0,035, 0,813], p = .027) wurden in dieser Analyse als weitere protektive
Faktoren nachgewiesen. Kein klinisch-pathologischer oder therapeutischer Faktor
konnte als signifikanter Einflussfaktor auf eine Konversion im HER2-Rezeptor identifi-
ziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen keine klare Aussage darüber treffen,
ob die Anpassung der tumorspezifischen Therapie nach einer Rezeptorkonversion das
OS verbessert.
Wichtiges Forschungsthema der letzten Jahre war die Entwicklung eines prädiktiven Testsystems zur Bestimmung der individuellen Strahlenempfindlichkeit von Tumorpatienten im Vorfeld einer Strahlentherapie. Ziel ist eine individuelle Dosisanpassung mit möglichst effizienter Tumorzerstörung bei maximaler Schonung des Normalgewebes. Standardmethode zur Messung der zellulären Strahlenempfindlichkeit ist der Koloniebildungstest, der sich jedoch für eine prädiktive Testung nicht eignet, da es mehrere Wochen, wenn nicht Monate dauert, bis die Resultate vorliegen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob der Comet Assay als prädiktiver Test zur Erfassung der Strahlenempfindlichkeit normaler Gewebe geeignet ist. Dazu wurden bestrahlte Hautfibroblasten und periphere Blutlymphozyten von 30 Brustkrebspatientinnen im Comet Assay analysiert und die Resultate mit den akuten radiogenen Hautreaktionen der Patientinnen verglichen. Vor allem die Versuche mit Lymphozyten ergaben eine gute Korrelation zwischen initialem DNS-Schaden bzw. Schaden nach 40minütiger Reparatur und den klinisch beobachteten frühen Normalgewebsnebenwirkungen. Anhand der in vitro-Ergebnisse konnte klar zwischen durchschnittlich und überdurchschnittlich strahlenempfindlichen Patientinnen unterschieden werden. Bei den Fibroblasten waren die Patientinnen mit durchschnittlichen Reaktionen und die mit stärkeren radiogenen Nebenwirkungen nur im Initialschaden deutlich voneinander verschieden. Der Comet Assay scheint demzufolge ein günstiger Test zu sein, um eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit zu erfassen, vor allem wenn Lymphozyten aus dem peripheren Blut analysiert werden. Er kann schnell und mit wenigen Zellen durchgeführt werden und ist bei standardisierten Versuchsbedingungen gut reproduzierbar. Mit dem Comet Assay ist es möglich, in kurzer Zeit mehrere Malignompatienten auf ihre Radiosensitivität hin zu untersuchen, wobei diese nur eine Blutprobe zur Lymphozytenisolation abgeben müssen. Im Hinblick auf die Anwendung als prädiktiver Test im klinischen Alltag ist die Kombination mit anderen Methoden wie z. B. dem Mikronukleus-Test und der FISH-Technik empfehlenswert, was die Zuverlässigkeit und Aussagekraft der Resultate noch steigern würde.
Die mitochondriale Entkopplung ist ein effektiver Weg, um die Thermogenese und basale metabolische Rate einer Zelle anzuheben. Im Versuchsaufbau mit malignen Zellen führte dies zu einer Apoptose.
2,4-DNP als spezifischer Entkoppler der Atmungskette zeigte in diesem Zusammenhang mittels LDH-Analysen an HACAT-, PA1-, BT20 und MDA-MB 231- Zellen eine dosisabhängige Wirkung auf die Zellproliferation in allen verwendeten Zelllinien, unter den verwendeten Tumorzellen am eindrucksvollsten bei den Ovarialkarzinom Zellen. Allen Zellarten gemeinsam war dabei eine Wachstumshemmung abhängig von der Länge der Inkubationszeit.
Die mikrokalorimetrischen Analysen wurden an HACAT-, BT20- und MDA-MB 231- Zellen durchgeführt. Eine höhere 2,4-DNP-Konzentration führte dabei ebenfalls zu einer gesteigerten Wärmefreisetzung, wobei eine positive Korrelation zwischen Einwirkdauer und Wärmefreisetzung bestand. Eine signifikante Zytotoxizität ließ sich bei hohen DNP-Konzentrationen und bei langer Inkubationszeit in den PA1- und MDA-MB 231- Zelllinien nachweisen. MDA-MB 231- Zellen reagierten dabei besonders sensibel.
In der aktuellen Tumortherapie bietet die Kombination von Alterationen der mitochondrialen und glykolytischen Abläufen neben den gängigen Behandlungsoptionen einen vielversprechenden Therapieansatz (8, 28). Durch den Einsatz von mitochondrialen Entkopplern als Ergänzung zu den herkömmlichen Therapieschemata könnte effektiv in den metabolischen Stoffwechsel der Zellen eingegriffen und neben der Tumorzellproliferation auch die Regression positiv beeinflusst werden. Das Ziel wäre, eine kontrollierte Apoptose bei möglichst wenigen systemischen Nebenwirkungen auszulösen. Hierzu werden im Rahmen der optimalen Dosisfindung für den Einsatz von 2,4-DNP jedoch weitere Versuchsansätze mit Inkubationszeiten von mindestens 48h benötigt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der psychischen Befindlichkeit und anderer gesundheitsbezogenen Konditionen der Frauen und Männer mit familiären Mamma- und Ovarialkarzinomrisiko sowie die Klärung hinsichtlich der Bewältigung und Auswirkung genetischer Risikoinformation. Es wurden Risikowahrnehmung, Informationsstand, Inanspruchnahme der Beratungsangebote sowie der Früherkennungsmaßnahmen, Einstellung gegenüber genetischer Brustkrebsdiagnostik und familiärer/sozialer Kommunikation untersucht. Die vollständig ausgefüllten Fragebögen von Ratsuchenden und Betroffenen, die an der Beratung und Befragung im Zentrum für „Familiären Brust-/Eierstockkrebs“ teilgenommen haben, wurden von uns ausgewertet. Für die beratenden Institutionen ist das Wissen der vielfältigen psychischen und sozialen Folgen bei den Testsuchenden und deren Familien sehr wichtig. Nur so kann das Betreuungskonzept und das Beratungsangebot verbessert werden.
In der vorliegenden Studie wurde ein Präventionskonzept zur Verhinderung von Osteonekrosen bei Patienten, die zur adjuvanten Therapie Bisphosphonate erhalten, entwickelt. Untersucht wurden 8 Patienten männlichen und weiblichen Geschlechts, die alle an einem Plasmozytom erkrankt waren (100%). Ein Patient (12,5%) von 8 entwickelte im Verlauf der Studie eine BRONJ. Vor Beginn der Bisphosphonattherapie sollten alle 8 Studienteilnehmer eine zahnärztliche Untersuchung erhalten. Anschließend wurde ein halbjährliches Recall durchgeführt, welches im Zeitraum von zwei Jahren insgesamt vier Mal erfolgte. Alle anamnestischen Daten und der Befund wurden dabei kontinuierlich aktualisiert. Im Rahmen der vorliegenden Studie konnte ein Prophylaxeprogramm etabliert werden, das nun in Form einer Bisphosphonatsprechstunde an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie des Universitätsklinikums Würzburg Anwendung findet. Die innerhalb des Prophylaxeprotokolls verwendeten Untersuchungs- und Präventionsmaßnahmen schenken den Risikofaktoren für eine Osteonekrose, insbesondere zahnärztlichen Interventionen wie Extraktionen, besondere Aufmerksamkeit.
Das duktale Carcinoma in situ (DCIS) der Mamma stellt eine Neoplasie mit sowohl heterogener Morphologie als auch variierendem biologischen Verhaltens dar. Dies führte in der Vergangenheit zur Etablierung zahlreicher pathohistologischer Klassifikationssysteme mit dem Ziel, das Risiko einer malignen Transformation in ein invasives Carcinom und die Wahrscheinlichkeit eines Lokalrezidivs nach Tumorektomie anhand histologischer Kriterien abzuschätzen. Zur Untersuchung solcher Klassifikationsparameter auf ihre Wichtigkeit sollte der genetische Hintergrund am Beispiel der chromosomalen Trisomie untersucht werden und mit diesen korreliert werden. Die Ergebnisse einer DNA-in situ-Hybridisierung an Paraffin-Material mit spezifischen Proben für die Chromosomen 1, 7, 8 und 18 zeigen, daß Trisomien in dieser Neoplasie ein häufiges Ereignis darstellen (56 Prozent aller Fälle) und daß diese mit den histologischen Parametern der Nekrose und einem hohen Kernatypiegrad korrelieren. Dieser Befund wird durch die Tatsache untermauert, daß solche Beziehungen sogar im gleichen Tumor gefunden werden, wenn dieser eine heterogene Morphologie aufwies. So läßt sich die große Bedeutung der Klassifikationsparameter Nekrose und Kern-Atypie auch durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstreichen. Eine Trisomie des Chromosoms 18 konnte nur in Fällen von einer Koinzidenz mit mikroinvasiven Herden detektiert werden. Dies deckt sich mit sämtlichen Angaben der Literatur, bei denen eine Trisomie 18 nie bei streng intraduktalem DCIS, sondern nur bei mikroinvasiven oder invasiven Mamma-Karzinomen gefunden wurde. Folglich wäre es wichtig, mit weiteren Untersuchungen die Bedeutung dieser Aberration im Invasionsgeschehen und in der Diagnosestellung einer Mikroinvasion des DCIS zu analysieren.
Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen.
Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein.
Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen.
Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen.
Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten.
Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden.
Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern.
In the context of this thesis, I investigated the molecular causes and functional consequences of genetic instability using a human inherited disease, Fanconi anemia. FA patients display a highly variable clinical phenotype, including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and a high cancer risk. The FA cellular phenotype is characterized by spontaneous and inducible chromosomal instability, and a typical S/G2 phase arrest after exposure to DNA-damaging agents. So far, 13 genes have been identified, whose biallelic (or, in the case of X-linked FANCB, hemizygous) mutations cause this multisystem disorder. The FA proteins interact in a multiprotein network, instrumental and essential in the cellular response to DNA damage. A more comprehensive summary of Fanconi anemia and its myriad clinical, cellular and molecular manifestations is provided in the introduction section of this thesis. The results of my experimental work are presented as published papers and manuscripts ready to be submitted. In the first publication, I investigated the connection between FA genes and bladder tumors. The question I tried to answer was whether a disruption of the FA/BRCA pathway may be a frequent and possibly causal event in bladder cancer, explaining the hypersensitivity of these cells to DNA-crosslinking agents. On the basis of my experimental data I arrived at the conclusion that disruption of the FA/BRCA pathway might be detrimental rather than advantageous for the majority tumor types by rendering them vulnerable towards DNA damaging agents and oxidative stress. The second publication deals with the gene coding for the core complex protein FANCE and tries to answer the question why FANCE is so rarely affected among FA-patients. The conclusion from these studies is that like FANCF, FANCE functions as a probable adaptor protein with a high tolerance towards amino acid substitutions which would explain the relative rareness of FA-E patients. I have also investigated the FANCL gene whose product functions as the catalytic subunit of the E3 ligase. The third publication addresses this issue by providing the first comprehensive description of genetic alterations and phenotypic manifestations in a series of three FA-L patients. The results of my study show that genetic alterations of FANCL are compatible with survival, these alterations may include large deletions such as so far common only in the FANCA gene, FA-L phenotypes can be mild to severe, and FANCL belongs to the group of FA genes that may undergo somatic reversion. The central protein of the FA/BRCA network, FANCD2, is the subject of the fourth publication presented in this thesis. Most importantly, we were able to show that there are no biallelic null mutations in FANCD2. Correspondingly, residual protein of both FANCD2-isotypes (FANCD2-S and FANCD2-L) was present in all available patient cell lines. This suggests that complete abrogation of the FANCD2 protein cannot be tolerated and causes early embryonic lethality. There are at least three FA proteins that are not required for the posttranslational modification of FANCD2. One of these proteins is the 5’-3’ helicase BRIP1 (BRCA1-interacting protein 1), a protein that interacts directly with the breast cancer susceptibility protein BRCA1. I participated in the identification of BRIP1 as the FA protein FANCJ. This discovery is described in the fifth publication of this thesis. The newly discovered protein BRIP1/FANCJ seems to act as one of the mediators of genomic maintenance downstream of FANCD2. Another protein identified downstream of FANCD2 is PALB2. PALB2 was originally discovered as “partner and localizer of BRCA2”. In a candidate gene approach we tested patients with early childhood cancers but without mutations in BRCA2 for mutations in PALB2 (publication 6). PALB2 was identified as a novel FA gene and designated FANCN. FA-N patients are very severely affected. The last publication included in my thesis describes the identification of the FA gene FANCI as the second monoubiquitinated member of the FA/BRCA pathway (publication 7). We identified biallelic mutations in KIAA1794 in four FA patients, thus proving the genuine FA-nature of this candidate sequence. The general discussion provides a synopsis of the results and conclusions of my work with the state of art of FA research.
Das triple-negative Mammakarzinom ist Hormonrezeptor- und HER2 negativ und mit einer ungünstigen Prognose verbunden. Triple-negative Patientinnen sind unempfindlich gegen die endokrine Therapie und den HER-2/neu Antikörper Trastuzumab und deshalb auf die zytostatische Chemotherapie angewiesen. Lobaplatin ist ein Platinderivat mit wenigen Nebenwirkungen und guter Antitumorwirkung in vitro und deshalb möglicherweise auch für die Behandlung triple-negativer Tumoren geeignet. Für die vorliegende Arbeit haben wir zwei triple-negative und eine klassische Brustkrebszelllinie verwendet. Die beiden triple-negativen Zelllinien wurden anhand einer vorbeschriebenen Mutation identifiziert, um eine Verwechslung auszuschließen. Die Aktivität des p53 Gens wurde in allen drei Zelllinien überprüft, ein aktives p53 Gen jedoch nur in der hormonrezeptor-positiven MCF7 Zelllinie nachgewiesen. Ein Zusammenhang zwischen p53 Status und Ansprechen der Zellen auf Lobaplatin oder Cisplatin konnte nicht belegt werden. Wir haben die zytotoxische Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin verglichen. Lobaplatin war in unseren Untersuchungen ähnlich wirksam wie Cisplatin und bei der Behandlung der MCF7 Zelllinie und einer Cisplatin-resistenten Ovarialkarzinomzelllinie sogar dem Cisplatin überlegen. Lobaplatin wies in diesen Zellen keine komplette Kreuzresistenz zu Cisplatin auf. In einem nächsten Schritt wurden unterschiedliche Zytostatika mit Lobaplatin kombiniert. Additive Synergien zwischen den einzelnen Substanzen konnten nicht bewiesen werden, jedoch war ein gutes Zusammenwirken von Lobaplatin und dem in der klinischen Erprobung befindlichen Todesliganden TRAIL zu erkennen. Mittels Nachweis von Spaltprodukten haben wir gezeigt, dass Lobaplatin und Cisplatin eine Aktivierung von Caspasen bewirken. Die aktivierte Caspase 3 konnte allerdings nicht dargestellt werden. Die Begriffe Apoptose und Nekroptose wurden diskutiert und eine Beteiligung beider Prozesse an der Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin nachgewiesen. Veränderungen des Zellzyklus wurden untersucht. Die beiden Platinderivate führten zu einem Arrest in der G2-Phase und in höheren Konzentrationen teilweise zu einem G1-Arrest. Insgesamt sind an der zytotoxischen Wirkung von Lobaplatin und Cisplatin und der Entscheidung über Leben oder Tod viele wichtige Mechanismen in wechselnder Rangfolge beteiligt. In unseren Versuchen an zwei triple-negativen und einer klassischen Brustkrebszelllinie erweist sich Lobaplatin als ebenbürtiger Nachfahre des Cisplatin mit einer vergleichbaren Zytotoxizität, weniger schwerwiegenden Nebenwirkungen und der Fähigkeit, vorhandene Cisplatinresistenzen teilweise zu umgehen. Lobaplatin verspricht darüber hinaus in Kombination mit anderen Zytostatika interessante therapeutische Perspektiven, die bisher nur unzureichend erprobt sind.