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Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Genexpression in Vertebraten-Zellen - Funktionsanalyse von Genen mittels gezielter Keimbahn-Mutagenese in Mäusen - Zellkooperation bei der Immunreaktion - Die transkriptionelle Kontrolle von Lymphokin-Genen - Selenocystein-tRNA und die Funktion von Selen in menschlichen Zellen - Start und Stopp der DNA-Replikation: Wie Gene kontrolliert verdoppelt werden - Antigenerkennung durch T-Lymphozyten - Genexpression und Tumorentstehung: Zuviel des Guten? - Molekularbiologie humaner Coronaviren - Molekulare Mechanismen persistierender Masernvirusinfektionen - Polyomavirus-Infektionen im zentralen Nervensystem - Molekulare Mechanismen von intrazellulären Bakterien - Über "simple" und "komplexe" Retroviren - Hilfe für die Zelle im Kampf mit dem AIDS-Virus u.a.
Die Melanomentstehung bei Rückkreuzungshybriden des Zahnkarpfens Xiphophorus wird durch die Überexpression des geschlechtschromosomalen Xmrk Onkogens verursacht. Im Wildtyp ist die Aktivität von Xmrk durch einen autosomalen Regulatorlocus R unterdrückt. Ziel dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die Expressionsregulation des Xmrk Onkogens zu gewinnen. Dazu wurden einerseits Experimente zur Kartierung von R durchgeführt, die eine Positionsklonierung des Gens erlauben würden. Zum anderen konnte durch die Analyse verschiedener Xmrk Mutanten ein genregulatorisches Element im Xmrk Onkogen identifiziert werden.
Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk
(2003)
Überexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus führt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung führt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden können, scheinen somit über entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellulären Signaltransduktion verfügen zu müssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu gehören die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu können, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchimäre HER-mrk, deren extrazellulärer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellulärer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abhängigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen führt zu IL-3 unabhängigem Wachstum und zu Langzeitüberleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeitüberleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeitüberleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer höheren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verkürzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß für die Auslösung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, während für eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und für Langzeitüberleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf für die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine führt, während der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß für die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber möglicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verstärken. Für die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das für ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schwächere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, während der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 führen. Da diese Mutante kein Langzeitüberleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend für Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeitüberleben zu sichern. Expression der Rezeptorchimäre HER-mrk in murinen Melanozyten führt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivität von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, während STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivität aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein ähnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen führt (Wellbrock, unveröffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend für die Antiapoptose von Melanomen zu sein.
Die Kenntnis der Transkriptionsregulationsmechanismen stellt eine wichtige biochemische Grundlage für das Verständnis der molekularen Ereignisse, die der Krebsentstehung zugrunde liegen, dar. Eine Schlüsselrolle in der transkriptionellen Kontrolle der Genexpression spielen hierbei die Transkriptionsfaktoren. Diese sind nukleäre Proteine, die mit spezifischen DNA-Elementen interagieren und so die Transkription eines in cis-Position lokalisierten Zielgens regulieren. Da der “microphthalmia associated” Transkriptionsfaktor Mitf-M spezifisch in Melanozyten und Melanomzellen exprimiert wird, scheint er eine wichtige Rolle in der melanomspezifischen transkriptionellen Aktivierung zu spielen und war deshalb im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Das Xiphophorus Melanomsystem, ein genetisch gut charakterisiertes Modell, wurde herangezogen, um unter zu Hilfenahme des Tyrosinasegens des mit Xiphophorus nahe verwandten Medaka (Oryzias latipes) die Transkriptionsregulation im Melanom näher zu untersuchen. Zuerst wurde gezeigt, dass der Medaka Tyrosinasepromotor spezifisch in einer Melanomzellinie von Xiphophorus (PSM Zellen) aktiviert wird. Eine 3,2 kb lange Sequenz, die 5´ zum Transkriptionsstart liegt, reicht dabei aus, eine extrem hohe, melanomspezifische Promotoraktivität zu erreichen. Dabei sind die Regionen, die sogenannte E-Boxen (CANNTG) enthalten, von besonderer Wichtigkeit für die Promotoraktivität in der Melanomzellinie, während sie in embryonalen Xiphophoruszellen (A2, als Kontrollzellen eingesetzt) keinen Einfluß auf die Expression haben. An diese E-Box-Sequenzen binden sogenannte b-HLH-Leuzinzipper Transkriptionsfaktoren. Es konnte auf indirektem Wege bewiesen werden, dass es das Protein Mitf sein muß, das an die E-Boxen im Tyrosinasegenpromotor bindet und somit die transkriptionelle Aktivierung ausübt. In EMSA Studien wurde gezeigt, dass die E-Boxen ein Kernprotein aus PSM-Zellen binden, und das dieses spezifisch an diese 6 bp lange Sequenz bindet, da Mutationen der zentralen Oligonukleotid-Sequenz die Bindung zerstörten. Ein weiterer indirekter Beweis für die Bindung von Mitf an diese E-Boxen konnte durch Co-Transfektionsexperimente erbracht werden. Auch in Säugerfibroblastenzellen konnte ektopisch eingebrachtes Mitf-M die Medaka Tyrosinasegenpromotorkonstrukte durch Bindung an E-Boxen aktivieren und das Luciferasegen zur Expression bringen. Das heißt also, dass Mitf-M ausreicht um sogar in nicht-Melanomzellen den Tyrosinasegenpromotor zu transaktivieren. Aufgrund dieser verschiedenen Experimente konnte gefolgert werden, dass diese Mitf-Bindungsstellen essentiell für eine hohe melanom- oder pigmentzellspezifische Promotoraktivität sind. Die Bindungsstelle A, die nahe der Basalpromotorregion im Medaka Tyrosinasegen liegt (-126/-131), scheint hierbei besonders wichtig für die Promotoraktivität und vor allem auch für die Vermittlung der Zelltypspezifität zu sein. Promotorkonstrukte mit den drei E-Boxen A (-126/-131), B (-2651/-2656) und C (-2866/-2871) zeigten eine gegenüber dem Konstrukt nur mit der A-Bindungsstelle höhere Aktivität. Es scheint sich ein additiver Effekt der Mitf-Bindungsstellen auszuwirken. Es konnte allerdings auch gezeigt werden, dass die E-Boxen nicht alleine verantwortlich für die Melanom- bzw. Pigmentzellspezifität sind. Neben den Mitf-Bindungsstellen gibt es noch weitere Elemente im Tyrosinasegenpromotor, die an der Bestimmmung der Spezifität beteiligt sind, und die zwar durch Deletionsreihen im Promotor eingegrenzt, dennoch noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die Wichtigkeit des Transkriptionsfaktors Mitf bzw. seiner Funktionen spiegelt sich auch in seiner starken Konservierung im Laufe der Evolution wider. Vergleichende Studien zeigten dass der Transkriptionsfaktor mit seinen verschiedenen Isoformen in Säugern wie in Vertebraten gut konserviert wurde. Nähere Analysen konnten das Vorhandensein zweier separater Gene für Mitf-M und Mitf-B bei Teleostiern nachweisen, während bei Säugetieren und Vögeln nur ein einziges Gen für die unterschiedlichen Mitf Proteine kodiert. Für das Verständnis der molekularen Prozesse bei der Melanombildung von Xiphophorus war es wichtig die Rolle von Mitf in der Signaltransduktion zu analysieren. Es war möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der in PSM Zellen exprimierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk, dem Genprodukt des Tumor-induzierenden Onkogens von Xiphophorus, und dem Transkriptionsfaktor Mitf nachzuweisen und seine Regulation über Signaltransduktionswege näher zu klären. Die Regulation von Mitf über den MAPkinase-Weg, konnte durch Inhibitorexperimente nachgewiesen werden. Aufgrund der zahlreichen Aktivitäten von Mitf innerhalb der Melanozyten, und seiner Aktivierungsfunktion für verschiedene Zielgene, ist dieser Transkriptionsfaktor von großer Bedeutung für sowohl Differentierung/Pigmentierung wie auch Proliferation/Überleben der Tumorzellen.
T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
Das maligne Melanom ist ein Tumor der Hautpigmentzellen mit weltweit steigender Inzidenz. Aufgrund seiner frühzeitigen lymphogenen und hämatogenen Metastasierung zählt das maligne Melanom zu den prognostisch sehr ungünstigen Tumorerkrankungen. Nach erfolgter Metastasierung werden mit den derzeitig etablierten Therapieschemata noch keine ausreichenden Prognoseverbesserungen erzielt. Einen möglichen neuen Therapieansatz stellt die Blockade der Tumorangiogenese dar. Besondere Bedeutung wird dabei der zyto- bzw. chemokinvermittelten Angiogenese zugemessen. In den letzten Jahren zeigten verschiedene diesbezügliche Studien richtungsweisende und erfolgversprechende Ergebnisse. Trotzdem besteht weiterhin hoher Bedarf an Verbesserung des Verständnisses der zugrundeliegenden Regulationsmechanismen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Sekretion acht angiogenetisch wirksamer Zyto- und Chemokine in vitro durch hoch- und niedrigmaligne Melanomzellen unter normalen Kulturbedingungen sowie unter Hypoxie, Serum- und Glukosemangel zu erfassen. Diese Stressbedingungen dienten als vereinfachtes in vitro-Modell der Mangelbedingungen, die in schnell wachsenden bzw. Nekrosezonen angrenzenden Tumorarealen vorherrschen. Mittels ELISA wurden die abgegeben Mengen der Zytokine VEGF, b-FGF, Angiogenin, PDGF und TGF-ß sowie der Chemokine IL-8, Gro-α und GM-CSF in den Zellüberständen bestimmt. Dabei zeigten die verschiedenen Melanomzelllinien für alle getesteten Zyto- bzw. Chemokine außer GM-CSF charakteristische Sekretionsverhalten unter bestimmten Kulturbedingungen. Insbesondere unter Hypoxie und nach Reoxigenierung ließen sich signifikante Veränderungen im Sekretionsverhalten der verschiedenen Melanomzelllinien feststellen. Eine signifikante Steigerung in der Freisetzung der Zyto- bzw. Chemokine durch Melanomzellen unter Hypoxie ließ sich nur für VEGF, b-FGF, Angiogenin und IL-8 feststellen. Zudem unterschieden sich hochmaligne Melanomzelllinien signifikant von niedrigmalignen Zelllinien in ihrer Sekretion von VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen Kulturbedingungen und unter Hypoxie (Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). In weiterführenden Experimenten wurde das Sekretionsverhalten von normalen Melanozyten, Endothelzellen und Fibroblasten untersucht. Dabei wiesen differenzierte Melanozyten im Vergleich zu den Melanomzellen signifikante Unterschiede in den abgegebenen Zyto-/ Chemokinmengen für VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α unter normalen bzw. hypoxischen Kulturbedingungen auf. Differenzierte Melanozyten unterschieden sich also von Melanomzellen in ihrer Sekretion bei den selben Zyto- bzw. Chemokinen wie niedrigmaligne von hochmalignen Melanomzelllinien (VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-α). Im Sekretionsverhalten für VEGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α ähnelten Fibroblasten und Endothelzellen (bzgl. VEGF nur HMEC-1) den Melanomzellen. Der Einfluss dieser vier Zyto- und Chemokine und b-FGF auf das in-vitro-Wachstumsverhalten von Endothelzellen wurde mit einem BrD-U-Proliferationsassay untersucht. Sowohl mikrovaskuläre (HMEC-1) als auch makrovaskuläre (HUVEC) Endothelzellen steigerten ihre Proliferation unter dem Einfluss von VEGF, b-FGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-α signifikant. HMEC-1 reagierten dabei mit einem tendenziell stärkeren Ansprechen auf die Stimulation als HUVEC. In weiteren Versuchen zeigten HUVEC eine erhöhte Sensibilität für Zytokine (insbesondere für b-FGF) unter Serummangelbedingungen, nicht jedoch für Chemokine (IL-8 und Gro-α). Am deutlichsten fiel die Proliferationssteigerung unter dem Einfluss der einzelnen Zyto- und Chemokine aus, wenn HUVEC in nonadhärentem Zustand stimuliert wurden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte erstmalig bzw. zeitgleich mit anderen Publikationen gezeigt werden, dass Melanomzellen unter Hypoxie nicht nur VEGF, sondern auch Angiogenin und IL-8 deutlich vermehrt sezernieren, dass diese Sekretionssteigerung nach Reoxigenierung weiter anhält und Melanomzellen signifikant von differenzierten Melanozyten unterscheidet. Jedes dieser Zyto- und Chemokine stimulierte die Endothelzellproliferation in vitro. Dabei erhöhten Serummangel und vor allem initial fehlende Zell-Zellkontakte die Zyto- bzw. Chemokinwirkung. Im Gegensatz zu dem bisher intensiver untersuchten VEGF sezernierten hochmaligne Melanomzellen unter Hypoxie signifikant mehr Angiogenin und IL-8 als niedrigmaligne Melanomzellen. Nur für Angiogenin zeigte sich darüber hinaus eine gegensätzliche Sekretionsregulation unter Hypoxie aller Melanomzellen im Vergleich zu normalen Melanozyten. Dies könnte für IL-8 und im Besonderen für Angiogenin auf eine mögliche Schlüsselfunktion in der Melanom-induzierten Angiogenese hindeuten. Inwieweit Rückschlüsse auf die in vivo-Verhältnisse und eine klinische Relevanz zulässig sind, werden weitere Untersuchungen und ggf. Therapiestudien zeigen müssen.
Die Anpassung des Aktinzytoskeletts an extrazelluläre Gewebsstrukturen ist Voraussetzung für die Interaktion mit der extrazellulären Matrix und für die Zellbewegung, einschließlich der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen. Wir untersuchten bei invasiven B16/F1 GFP-Aktin Mausmelanomzellen, ob und wie sich Zellform, Art und Effizienz der Bewegung an physikalisch unterschiedlich beschaffene kollagenöse Umgebungen anpassen: 1) mit Kollagen-Monomeren beschichtete 2D Objektträger, 2) 2D Oberfläche einer fibrillären Kollagenmatrix und 3) Zellen, die in einer 3D Kollagenmatrix eingebettet waren. Zur Darstellung des Aktinzytoskeletts wurden Zellen eingesetzt, die GFP-Aktin Fusionsprotein exprimierten, und mittels Zeitraffer-Videomikroskopie und Konfokalmikroskopie untersucht. Im direkten Vergleich waren Struktur und Dynamik des Aktinzytoskelett wie auch Zellform und Art der Migration unterschiedlich in den verschiedenen Umgebungen. Auf 2D planer Oberfläche erfolgte eine rasche Adhäsion und Abflachung der Zellen (Spreading) mit nachfolgender Migration mit Bildung fokaler Adhäsionszonen, in die kabelartige Aktinstrukturen (Stress fibers) einstrahlten. Dagegen entwickelte sich in 3D Kollagenmatrices eine spindelförmige, fibroblastenähnliche Zellform (mesenchymal) mit zylindrischen fingerförmigen vorderen Pseudopodien, die Zug der Zelle nach vorne bewirken und hochdynamisches polymeres Aktin, nicht jedoch Stress Fibers enthielten. Eine ähnliche Zellform und Struktur des Zytoskeletts entwickelte sich in Zellen auf 2D fibrillärem Kollagen. Die Kontaktfindung und Migrationseffizienz auf oder in fibrillären Matrices war im Vergleich zu 2D kollagenbeschichteter Oberfläche erschwert, die Migrationseffizienz verringert. In Kontrollversuchen wurden Migration und polarisierte Bildung von Aktindynamik durch Inhibitoren des Aktinzytoskeletts (Cytochalasin D, Latrunculin B, Jasplakinolide) stark gehemmt. Diese Befunde zeigen , dass die Struktur und Dynamik des Aktinzytoskeletts sowie die Art der Migration in Tumorzellen stärker als bisher angenommen durch die umgebende Kollagenstruktur bestimmt wird. Während 3D Kollagenmatrices in vivo ähnliche bipolare Zytoskelettstruktur fördern, müssen Abflachung der Zellen mit Bildung von Stress Fibers als spezifische Charakteristika von 2D Modellen angesehen werden.
Ein Tumor stellt nicht nur eine Ansammlung entarteter Zellen dar, sondern ist vielmehr ein komplexes Pseudoorgan, das aus Tumorzellen und aus mit ihnen assoziierten „normalen“ Zelltypen, wie Fibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen, den sogenannten Tumorstromazellen, besteht. Die Tumorstromazellen wurden von den Tumorzellen dahingehend konditioniert, dass sie das Tumorwachstum und -progression fördern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von zwei Oberflächenmolekülen, nämlich CD147 und CD28, für solche im Tumorstroma stattfindenden Interaktionen im syngenen murinen B16 Melanommodell untersucht. Rolle von CD147 für MMP Expression, Neoangiogenese und Metastasierung CD147, das von Tumorzellen exprimiert wird, wird als ein Faktor angesehen, der auf benachbarten Stromazellen die Expression von MMPs induziert. MMPs sind essentiell für den Umbau der extrazellulären Matrix und der Basalmembranen und somit für die Invasion und Metastasierung des Tumors essentiell. Daneben gibt es erste Hinweise, dass CD147 auch die Induktion von vascular endothelial growth factor (VEGF) vermittelt und damit die Tumorangiogenese fördert. In dem eingesetzten Melanommodell war überraschenderweise kein Unterschied hinsichtlich der Expression von MMP-2, MMP-9 und MT1-MMP in Abhängigkeit von der CD147 Expression nachweisbar. Die in vitro Kokultur der Melanomzellen mit unterschiedlichen murinen Fibroblasten zeigte zudem, dass weder CD147+ noch CD147- Melanomzellen die Expression von MMP-2 oder MMP-9 in den Fibroblasten veränderten. Als eindeutige Effekte des CD147 knock downs wurde aber eine reduzierte VEGF Expression in vivo einhergend mit einer gehemmten Tumorangiogenese, sowie einer reduzierten Metastasierung festgestellt. Es konnte somit die Funktion von CD147 in dem gewählten Modell als angiogenetischer, jedoch als MMP unabhängiger, Metastasierungsfaktor demonstriert werden. Einfluss von CD28 auf antitumorale Immunantworten CD28 ist ein kostimulatorisches Molekül, das zusammen mit dem TCR für eine effiziente Stimulation von T-Lymphozyten wesentlich ist. In CD28 k.o Mäusen fand sich im Vergleich zu Wildtyp Kontrolltieren eine verminderte Effektivität von prophylaktischen anti-Tumor Impfungen, die sich in einem beschleunigten Tumorwachstum sowie einer erhöhten Tumorlast auswirkten. Die Frequenz von Vakzine induzierten TRP-2180-188 /Kb reaktiven CD8+ T-Zellen in TIL von Tumoren war aber in beiden Genotypen gleich. Dagegen war die Anzahl IFN- produzierender TRP-2180-188 /Kb reaktiver T-Zellen sowie die Fähigkeit der TRP-2180-188 /Kb reaktiven T-Zellen zu lysieren, in den CD28-defizienten Mäusen deutlich geringer. Diese Beobachtungen legen nahe, dass CD28-vermittelte kostimulatorische Signale im gewählten Modell weniger für die initiale Expansion als für die Differenzierung funktioneller tumorspezifischer CD8+ T-Effektorzellen eine wesentliche Funktion einzunehmen scheinen.
Induktion von Epifokalen Kontaktekzemen in Kombination mit Dacarbazin zur Behandlung des Melanoms
(2007)
Seit etwa 30 Jahren wird die iatrogene Induktion eines allergischen Kontaktekzems über Hautmetastasen des Melanoms durch topische Anwendung des obligaten Kontaktallergens Dinitrochlorbenzol (DNCB) in Kombination mit einer systemischen Chemotherapie mit Dacarbazin (DTIC) angewendet. Über die Wirksamkeit liegen bislang nur wenig größere, statistisch einwandfreie Überprüfungen vor. Wir führten daher in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie (ADO) eine deutschlandweite retrospektive Analyse für derart behandelte Patienten durch. Aus 9 Zentren wurden insgesamt 72 Patienten, die in dem Zeitraum von 1993 bis 2002 mit DNCB/DTIC behandelt worden waren, eingeschlossen. Ergebnisse: Die Therapie führte im klinischen Stadium III zu einer bemerkenswert hohen therapeutischen Ansprechrate von 62% mit zum Teil lang andauernden Remissionen, während sie im Stadium IV nur eine geringe Ansprechrate von 9% bei einigen dauerhaften Remissionen hervorrief. Schlußfolgerung: Bei multiplen, einer Operation nicht mehr zugänglichen lokoregionären Metastasen stellt die kombinierte Therapie mit DNCB (bzw. DCP) und DTIC eine einfache, effektive und kostengünstige Therapieoption dar.
Die Bedeutung der genomischen Instabilität in humanen melanocytischen Läsionen ist Gegenstand vieler dermatologischer Studien und bis heute ungeklärt. Ist die Mikrosatelliteninstabilität bloße Begleiterscheinung der unkontrolliert proliferierenden Tumorzellen oder wird ihr ein pathogenetischer Mechanismus zuteil? In Fischen der Gattung Xiphophorus können durch klassische Kreuzungsexperimente melanocytische Läsionen verschiedener Malignitätsgrade induziert werden. Diese Läsionen sind auf Grund ihres genetisch kontrollierten Hintergrundes eindeutig definiert und reproduzierbar - und damit im Vorteil gegenüber der unsicheren Klassifikation humaner Hautläsionen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich der Frage nachgegangen, ob MIN+ ein obligates molekulares Ereignis für die Progression von Melanomen bis zum terminalen Stadium darstellt. Dieser Fragestellung wurde unter Verwendung PCR-basierter Mikrosatellitenanalysen sowie Multilocus DNA-Fingerprint Analysen nachgegangen. 23 Tumoren unterschiedlicher Malignität wurden im Vergleich zum tumorfreien Normalgewebe desselben Fisches an 12 Genloci unbekannter chromosomaler Lokalisation auf Mikrosatelliteninstabilität untersucht. Es wurde insgesamt eine Zahl von 263 informativen Loci erzielt, von denen sich nur 20 ( = 7.6%) als instabil erwiesen. Mittels der Multilocus-Fingerprint Analysen wurden 8 Melanome und deren korrespondiere Normalgewebe mit drei Sonden hybridisiert. Nur einer von 12 analysierbaren MLFPs zeigte eine genetische Aberration in Form einer Deletion einer einzelnen Bande im Tumorgewebe. Mit diesem Ergebnis wurde das in der Mikrosatellitenanalyse erhaltene Resultat einer nicht signifikanten Mikrosatelliteninstabilität im Xiphophorus-Melanom-Modell System bestätigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Abwesenheit eines MIN+-Phänotypen in den Melanomen von Xiphophorus darauf hinweist, daß der Erwerb von MIN weder ein notwendiges Kriterium für die Initiation eines Tumors noch für seine Progression darstellt. Ein anderer Pfad der Tumorinitiation ist die direkte Schädigung oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, von in Mismatch Repair involvierten Genen oder durch die Transformation von Proto-Onkogenen zu Onkogenen. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Genen, die in der Regulation des Zellzyklus Schlüsselrollen spielen (rb, p53, cdkn2a), sowie einer Komponente des MMR-Systems (MSH2) auf RNA-Ebene untersucht. Ihre Expressionsstärke wurde in folgenden Geweben miteinander verglichen: Maligne Melanome, benigne Läsionen, tumorfreie Kontrollgewebe und die Xiphophorus-Melanomzellinie (PSM). MSH2 und p53 wurden in allen untersuchten Geweben auf gleichem Niveau exprimiert. Die vergleichende Expressionsanalyse des vermeintlichen "melanoma susceptibility gene" cdkn2a im Melanom-Modell und der PSM-Zellinie bestätigte die bereits vorbeschriebene Überexpression des Zellzyklusinhibitors in malignen Melanomen von Xiphophorus-Hybriden. Die Untersuchung des Expressionsmusters von Rb in den oben genannten Geweben ergab eine verminderte Transkription dieses Gens in malignen Melanomen. Eine mögliche Interpretation dieses Ergebnisses wäre, einen Defekt in Rb oder pRB zu Grunde zu legen und die Hochregulation von cdkn2a entsprechend einer negativen Rückkopplungsschleife als physiologische Konsequenz anzusehen.
Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte.
Die vorliegende Arbeit zeigt eine Möglichkeit auf, die bisher meist erfolglose Chemotherapie des malignen Melanoms zu verbessern: Durch Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-kB, der für die Regulation vieler tumorrelevanter Gene verantwortlich ist, konnten die Tumorzellen gegenüber der Wirkung von Zytostatika sensibilisiert werden. Zunächst wurden acht verschiedene Melanomzellen in Bezug auf ihre NF-kB-Aktivität und der Expression NF-kB-regulierter Proteine vergleichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Melanomzellen über konstitutive Aktivität von NF-κB verfügt. Dabei bestand kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Expression NF-kB-regulierter Proteine und der Aktivität dieses Transkriptionsfaktors im Kern, was komplexe Regulationsmechanismen bei der Transkription und Translation vermuten lässt. Anhand einer ausgewählten Melanomzelllinie konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene NF-kB-Inhibitoren, der Proteasom-Inhibitor Bortezomib und der neue IKK-Inhibitor KINK-1 die Aktivität von NF-kB deutlich hemmen. Beim Vergleich beider NF-kB-Inhibitoren ließen sich unerwartet verschiedene molekulare Wirkungsmechanismen nachweisen: Während Bortezomib konzentrationsabhängig eine sehr starke Induktion von NOXA, eine Induktion von p53 sowie eine Abnahme von Cyclin D1 bewirkte, zeigte KINK-1 seine Effekte vor allem in der Reduktion von Chemokinen wie IL-8 und MCP-1. Passend zur Veränderung der Expression zellzyklus-relevanter Proteine hatte Bortezomib einen stärkeren Effekt auf den Zellzyklus als KINK-1. Beide Inhibitoren wurden mit verschiedenen Zytostatika kombiniert und konnten einerseits die Apoptoseinduktion durch Zytostatika verstärken und andererseits die durch Zytostatika reduzierte Invasion weiter reduzieren. Allerdings zeigte sich bei der Untersuchung tumorrelevanter Chemokine, dass KINK-1 im Gegensatz zu Bortezomib synergistische Effekte mit Camptothecin und Doxorubicin aufweist. Trotz molekularer Unterschiede bewirkten beide NF-kB-Inhibitoren vergleichbare funktionelle Effekte auf zellulärer Ebene. Dies galt auch für ein präklinisches in-vivo-Modell, in dem die experimentelle Lungenmetastasierung von B16F10-Melanomzellen in Mäusen ermittelt wurde: Hier wurden die Mäuse mit Camptothecin, KINK-1 und Bortezomib allein im Vergleich zu den jeweiligen Kombinationen aus Zytostatikum und NF-kB-Inhibitor behandelt. Beide Kombinationen zeigten eine signifikante Reduktion des Lungengewichts im Vergleich zu Camptothecin allein. Diese Arbeit konnte also den Nutzen aus NF-kB-Inhibition in Kombination mit Zytostatika für die hier verwendeten Substanzen bekräftigen und dabei einige molekulare Unterschiede aufdecken.
Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten.
Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen.
Zellmigration ist essentiell für die Invasion und Metastasierung maligner Tumore. Neben der Bewegung von Einzelzellen zeigen Tumore sowohl epithe¬lialen als auch mesenchymalen Ursprungs auch kollektive Migration und Invasion multizellulärer Zellverbände, die sich unter Beibehaltung von Zell-Zell-Adhäsionen koordiniert als Gruppe bewegen. Ziel der Arbeit war, primäre humane Melanomexplantate mittels organotypischer Kultur in 3D Kollagenmatrices einzusetzen, um mittels Zeit-raffermikroskopie und experimentellen Blockadestrategien die zellulären und molekularen Grundlagen kollektiver Migration darzustellen, insbesondere die Bedeutung von Zell-Matrix-Interaktionen und Integrinen. In 3D Explantatkulturen bildeten primäre Melanomexplantate reproduzierbar Invasionszonen und sich ablösende und kollektiv wandernde Zellcluster aus. Diese zeichneten sich durch eine ausgeprägte Polarität mit motiler Vorderfront mit zugartig reorientierten Kollagenfasern und nachgezogenem hinteren Teil der Gruppen aus, vergleichbar der Asymmetrie haptokinetisch migrierender Fibroblasten. β1 Integrine zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster mit Fokalisierung an Zell-Matrix-Interaktionen vor allem an der Vorderfront und linearer Anordnung entlang der Zell-Zell-Grenzen. Adhäsionsblockierende anti- β1 Integrin-Antikörper bewirkten nahezu vollständige Hemmung der kollektiven Migration, mit Verlust der Zellgruppenpolarität und Migrationspersistenz. Nach Integrinblockade zerfielen Zellverbände infolge Loslösung von Einzelzellen, die sich mittels β1 Integrin-unabhängiger, amöboider Migration durch die Kollagenmatrix bewegten. Der Übergang von β1 Integrin-abhängiger, kollektiver Migration zu amöboider Einzelzellwanderung (kollektiv-amöboide Transition) ist ein Beispiel für die Plastizität von Tumorzellwanderung, die in Anpassung an das Milieu einen Wechsel der Migrationsstrategie erlaubt. Die Plastizität der Tumorzellmigration muss bei der Entwicklung therapeutischer Konzepte, die auf Hemmung von Tumorinvasion und -metastasierung abzielen, berücksichtigt werden.
5.1 Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden Tumore bestehen nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM), und Stromazellen wie Fibroblasten (cancer-associated fibroblast; CAF) und Endothelzellen (tumor endothelial cell; TEC). Diese Stromazellen haben durch die Ausschüttung von Zytokinen, proteolytischen Enzymen, Wachstums- und Angiogenesefaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression. Sie unterscheiden sich von den Stromazellen der normalen Gewebe durch die Expression von sogenannten Tumorstroma-assoziierten Antigenen (TSAA). Damit sollten Therapien, die auf TSAA abzielen, universell einsetzbar und weniger anfällig gegenüber Resistenzentwicklungen (immune escape Mechanismen) sein, da Stromazellen im Gegensatz zu neoplastischen Zellen genetisch relativ stabil sind. Für eine Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden wählten wir die TSAA Endoglin und Fap, welche während der Wundheilung und im Tumorstroma induziert werden. Dabei sollte überprüft werden, ob prophylaktische Vakzinierungen in C57Bl/6j Mäusen Peptid-reaktive T-Zellen induzieren können, und das Wachstum von transplantieren Grm1-transgenen Tumoren reduziert werden kann. In der Tat konnten wir sowohl bei Endoglin- als auch bei Fap Peptid vakzinierten Tieren in vivo Peptid-reaktive Lymphozyten im Blut und zu einem geringeren Anteil auch in der Milz nachweisen, welche Peptid-gepulste syngene Milzzellen lysieren konnten. Allerdings konnte in beiden Fällen keine Reduktion des Tumorwachstums gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei der Fap-Peptid-vakzinierten Gruppe war das Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe sogar gesteigert. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Induktion Fap-Peptid-reaktiver T-Zellen tumorpromovierend wirkt. Möglicherweise könnte aber durch eine Modifikation des Vakzinierungsprotokolls bzw. durch eine Kombination mit anderen Immuntherapeutika ein verbessertes Ansprechen auf eine Endoglin bzw. Fap basierte Immuntherapie erzielt werden. 5.2 Immunsuppressive Mechanismen im Grm1-transgenen Melanom-Modell Grm1-transgene Mäuse entwickeln spontan kutane Melanome. Dieses Modell erlaubte es uns in der vorliegenden Arbeit spontane Immunantworten im Laufe der Melanomentstehung zu untersuchen. Hierfür analysierten wir sowohl ex vivo als auch in vitro aus Milz und Lymphknoten gewonnene Lymphozyten von Mäusen, welche keine Tumorläsionen bzw. eine niedrige oder hohe Tumorlast aufwiesen. Dabei konnten wir ex vivo einen Anstieg der Frequenz aktivierter CD4+ und CD8+ Lymphozyten mit zunehmender Tumorlast zeigen. Bei tumortragenden Tieren exprimierten jedoch hauptsächlich CD4+ T-Zellen Aktivierungsmarker nach in vitro Stimulation. Interessanterweise waren diese Zellen tumortragender Tiere auch funktionell beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Proliferationskapazität nach in vitro Stimulation zeigte. Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Frequenz regulatorischer T Zellen bei tumortragenden Tieren ein frühes Ereignis im Laufe der Tumorentstehung ist. Gleichzeitig konnte auch ein starker Anstieg der immunsupprimierenden Zytokine Tgf-β1 und Il-10 sowohl in den Lymphknoten als auch im Tumorgewebe beobachtet werden. Dabei war die Tgf-β1-Expression sowohl im Tumor als auch im tumor-drainierenden Lymphknoten erhöht, während Il-10 im Tumor nur moderat exprimiert wurde, was eine komplexere Regulation der Il-10-Expression nahe legt. Dies bedeutet, dass in Grm1-transgenen Mäusen ähnlich wie auch bei Melanompatienten zelluläre und zytokinabhängige Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen und dieses Modell daher geeignet ist, um präklinisch immunmodulierende Therapieansätze zu testen.
Für Patienten mit malignem Melanom im Stadium der Fernmetastasierung gibt es bis heute lediglich Therapieoptionen mit sehr eingeschränkten Erfolgsaussichten. Diese Tatsache bestätigt die Notwendigkeit von Biomarkern zur Vorhersage des Erfolgs verschiedener Therapien. Der ATP-basierende ex vivo Chemosensitivitätsassay hat sich als erfolgreiche Methode zur individuellen Vorhersage eines Chemotherapieerfolgs herausgestellt. Tatsächlich zeigte der Assay ein heterogenes Sensitivitätsprofil gegen verschiedene Chemotherapeutika und ließ in getesteten Patienten ein ex vivo wirksames Chemotherapieregime identifizieren, das anschließend auch klinische Therapieerfolge bei Verwendung der Therapie mit dem besten individuellen Chemosensitivitätsindex(BICSI) zeigte. Um diesen sehr aufwendigen Assay zukünftig zu umgehen, sollten in der vorliegenden Arbeit prädiktive molekulare Biomarker der Chemosensitivität identifiziert werden. Hierfür wurden im Voraus durch einen Microarray die Kandidaten Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LOXL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicle-associated membrane protein 5 (VAMP5) und Serine protease inhibitor B1 (SERPINB1) als differentiell exprimierte Gene in chemosensitivem gegenüber chemoresistentem Gewebe identifiziert. Die relative Expression dieser Kandidatengene wurde daraufhin in bis zu 128 verschiedenen Melanomgeweben mit dem Chemosensitivitätsindex verschiedener Chemotherapeutika korreliert. Hierbei konnte eine signifikante Korrelation zwischen SerpinB1 mit der Chemosensitivität gegenüber der Therapiekombination mit Paclitaxel und Cisplatin auf Gen- aber nicht auf Proteinebene identifiziert werden. Weiterhin konnte eine differentielle Expression ebenfalls in chemosensitiven und -resistenten Melanomzelllinien nachgewiesen werden, die allerdings im Vergleich mit dem analysierten Gewebe in gegensätzlicher Richtung verlief. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SerpinB1 ein vielversprechender Marker für die Chemosensitivität gegenüber Paclitaxel und Cisplatin ist, dessen funktionelle Bedeutung aber unklar bleibt. Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und hoch aggressiver Tumor der mit dem Merkelzellpolyomavirus (MCV) in Zusammenhang steht. Da MCC Zelllinien zur Aufrechterhaltung ihrer Viabilität die MCV T-Antigene benötigen, könnte der Einsatz von Interferonen (IFN) ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krebserkrankung sein. In der vorliegenden Arbeit haben wir daher die Effekte von IFNs auf MCC Zelllinien, mit besonderer Berücksichtigung der MCV+ Linien, untersucht. IFNs vom Typ I (hier Multiferon, ein Mix verschiedener IFN α Subtypen, und IFN β) wirkten stark inhibierend auf die zelluläre Viabilität. Die Zellzyklusanalyse zeigte eine Erhöhung des sub-G Anteils der Zellen nach Behandlung mit IFN, was auf Apoptose als ausschlagebenden Grund schließen ließ. Diese Effekte waren für die Behandlung mit IFN β weniger stark ausgeprägt. Der inhibitorische Effekt von Typ I IFNs auf MCV+ MCC Zelllinien war assoziiert mit einer verringerten Expression des viralen großen T-Antigens (LTA) und einer Erhöhung in der Expression von promyelocytic leukemia protein (PML), das dafür bekannt ist, die Funktion des LTA störend zu beeinflussen. Zusätzlich führte die intratumorale Anwendung von Multiferon in vivo zu einer Regression im Wachstum von MCV+, aber nicht MCV- MCC Xenotransplantaten. Die Ergebnisse zeigen das Typ I IFNs einen starken antitumoralen Effekt haben, der zum Teil durch die Regulierung des LTA herbeigeführt wird. Neben diesen direkten Effekten der IFNs auf die Zellproliferation induzieren diese auch die Expression von MHC Klasse I Molekülen in MCC Zelllinien. Die Durchflusszytometrie zeigte eine Induktion der MHC Klasse I Expression in drei MHC I negativen MCC Zelllinien und eine Erhöhung der Expression, die vor der Behandlung eine geringe Menge an MHC I aufwiesen. Diese Effekte konnten auch in den in vivo Xenotransplantaten beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit IFN sowohl direkte als auch indirekte Effekte auf das MCC hat und eine breite Anwendung in Patienten mit MCV+ und MCV- Tumoren finden kann. Neben IFNs sind auch Artemisinin und seine Derivate bekannt für ihre antitumoralen und antiviralen Eigenschaften. Daher haben wir den Effekt des Artemisininderivats Artesunate auf MCV+ und MCV- MCC Zelllinien getestet. Tatsächlich konnten wir auch hier einen antiproliferativen Effekt des Stoffes nachweisen, der stärker auf MCV+ als auf MCV- Zelllinien wirkte und bei ersteren wiederum mit einer reduzierten LTA Expression einherging. Im Vergleich dazu blieben Fibroblasten von der Behandlung unbeeinflusst. Das verringerte Tumorwachstum konnte ebenfalls für in vivo Xenotransplantationsmodelle gezeigt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnis sollte eine genauere Untersuchung dieses alten Naturheilstoffes für die Behandlung von MCC Patienten in Betracht gezogen werden.
Bei Melanomen handelt es sich um die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate. Deshalb sind Untersuchungen dieser Hautkrebsart von immenser Bedeutung. Es ist bekannt, dass der AP-1-Transkriptionsfaktorkomplex eine große Rolle für Melanomentstehung und -progression spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der AP-1 Komponente FOSL1 in Melanomen untersucht.
Hierbei konnte zunächst ermittelt werden, dass die FOSL1 Expression im humanen Melanom durch den MAPK-Signalweg vermittelt wird und von den Onkogenen BRAF und NRAS abhängig ist. Dies wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass die Stabilität von FOSL1 durch MAPK reguliert wird.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass FOSL1 in vielen Melanomzellen die Proliferation verstärkt und auch an Migration beteiligt ist. Da diese Prozesse zur Krebsprogression beitragen, deutet dies darauf hin, dass FOSL1 bei der Melanomentwicklung eine wichtige Funktion besitzt. Weiterhin konnten SLUG, SNAI3, IL6 und MMP14 als FOSL1-Zielgene identifiziert werden, deren Regulierbarkeit durch FOSL1, jedoch abhängig von der jeweiligen Zelllinie war. Somit konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass FOSL1 nicht nur, wie zuvor für Brustkrebszellen beschrieben, an Migration beteiligt ist, sondern auch zur Proliferation humaner Melanome beiträgt. Zukünftige Arbeiten werden zeigen, ob die identifizierten Gene für die FOSL1-vermittelte Migration und Proliferation verantwortlich sind.
Die Therapiemöglichkeiten für Patienten im Melanom Stadium IV sind nach wie vor begrenzt und die Erkrankung nur selten heilbar. Eine mögliche Ziel¬struktur in der Melanom¬therapie der Zukunft könnte das im Melanom häufig genetisch wild¬typisch vorliegende p53 sein.
Für vorliegende Arbeit wurden humane Melanomzelllinien, welche stabil mit einem p53-Reportergenkonstrukt transduziert waren, hinsichtlich ihrer p53-Expression, -Akti-vität und -Akti¬vierbarkeit untersucht. Alle verwendeten Melanom¬zell¬¬¬linien exprimierten p53 un¬ab¬hängig vom p53-Mutations¬status. Drei der sieben untersuchten p53-wild¬typischen Melanomzelllinien zeigten keine oder nur sehr niedrige p53-Reporter¬gen¬aktivität. Die anderen vier p53-wildtypischen Zelllinien dagegen waren durch hohe, mittels p53-Knockdown unterdrückbare Reportergen¬expression gekennzeichnet. Die Proliferation dieser Zellen in Gegenwart von aktivem p53 belegt, dass Melanomzellen eine hohe Toleranz gegenüber diesem Tumor¬suppressor besitzen können. Eine weitere Steige¬rung der p53-Expression und -Aktivität durch die Hemmung von MDM2 (mouse double minute 2) mit der Substanz Nutlin-3a führte in den Zellen mit messbarer p53-Aktivität jedoch zu einem G1-Zell¬zyklusarrest. Dies belegt die prinzipielle Eignung von p53 als mögliche thera¬peutische Zielstruktur. Aufgrund ihrer schlechten Biover¬füg¬barkeit und hohen Toxizität gelten MDM2-Inhibitoren bisher aber als ungeeignet für den klinischen Einsatz.
Die Reduktion hoher therapeutischer Nebenwirkungen könnte durch eine Melanom-spezifische Reaktivierung von p53 gelingen. Eine mögliche negativ-modulierende Wirkung des Mela¬¬nom¬¬markers TRP2 (tyrosinase-related-protein 2) auf p53 wurde im Jahr 2010 von Sendoel et al. nach Unter¬suchungen am Fadenwurm C. elegans vorgeschlagen. TRP2 wird beim metastasierten Melanom in mehr als 80 % der Fälle exprimiert und wäre, handelte es sich beim Melanom um einen weit verbreiteten Regulationsmechanismus, ein interessantes Zielprotein, um die Aktivität von p53 zu steigern. Die dargestellten Ergeb¬nisse zeigen, dass TRP2 zwar in vier von fünf Melanomzelllinien exprimiert wurde, die Unterdrückung der TRP2-Expression jedoch weder spezifischen Einfluss auf die p53-Expression noch auf die p53-Reportergenaktivität zeigte. Auch das veränderte Wachs¬tums¬¬¬verhalten der Zellen nach Unterdrückung von TRP2 mittels drei unterschiedlicher shRNAs konnte im Rescue-Experiment, bei dem TRP nach seinem Knockdown ektop exprimiert wurde, keinem spezifischen Effekt von TRP2 auf die p53-Expression oder p53-Reporteraktivität zugeordnet werden. Auch in der TRP2-negativen Zelllinie führte die ektope TRP2-Expression nicht zu einer verminderten p53-Expression oder -Aktivität. Für das im Gegensatz zu MDM2 deutlich melanomspezifischere TRP2 konnte demensprechend kein sicherer regulatorischer Zusammenhang mit p53 dargestellt werden.
Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche Bedeutung wildtypischem p53 im Melanom zukommt und ob sich weitere mögliche p53-Regulatoren als therapeutische Angriffspunkte eignen.
Ziel der Arbeit war die Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen Lebensqualität bzw. sozialer Unterstützung und dem Bedürfnis nach bzw. der Inanspruchnahme von psychosozialer Unterstützung bei Tumorpatienten.
Die Datenerhebung erfolgte im Rahmen einer deutschlandweiten Multicenterstudie am Studienstandort Würzburg. Eingeschlossen wurden 128 Patienten mit Melanom, gynäkologischen und gastrointestinalen Tumoren. Die Studiendaten wurden mittels Fragebögen erhoben. Hierzu zählten der SF-12-Fragebogen zur Lebensqualität, der SSUK-8-Fragebogen zur sozialen Unterstützung und jeweils ein Fragebogen zum Bedürfnis und zur Inanspruchnahme psychosozialer Unterstützung.
Ein Zusammenhang ergab sich zwischen psychischer Lebensqualität und dem Bedürfnis nach psychosozialer Unterstützung. Patienten, die ein Bedürfnis nach psychosozialer Unterstützung äußerten, wiesen eine signifikant niedrigere psychische Lebensqualität auf. Ebenso konnte ein Zusammenhang zwischen der Inanspruchnahme psychosozialer Unterstützung und der Lebensqualität gesehen werden. Patienten, die psychosoziale Unterstützungsangebote in Anspruch genommen hatten, wiesen eine niedrigere körperliche und psychische Lebensqualität auf.
Es konnten keine Zusammenhänge zwischen positiver sozialer Unterstützung und dem Bedürfnis nach bzw. der Inanspruchnahme von psychosozialer Unterstützung gesehen werden.