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Salivary gland tumors (SGTs) are a relevant, highly diverse subgroup of head and neck tumors whose entity determination can be difficult. Confocal Raman imaging in combination with multivariate data analysis may possibly support their correct classification. For the analysis of the translational potential of Raman imaging in SGT determination, a multi-stage evaluation process is necessary. By measuring a sample set of Warthin tumor, pleomorphic adenoma and non-tumor salivary gland tissue, Raman data were obtained and a thorough Raman band analysis was performed. This evaluation revealed highly overlapping Raman patterns with only minor spectral differences. Consequently, a principal component analysis (PCA) was calculated and further combined with a discriminant analysis (DA) to enable the best possible distinction. The PCA-DA model was characterized by accuracy, sensitivity, selectivity and precision values above 90% and validated by predicting model-unknown Raman spectra, of which 93% were classified correctly. Thus, we state our PCA-DA to be suitable for parotid tumor and non-salivary salivary gland tissue discrimination and prediction. For evaluation of the translational potential, further validation steps are necessary.
Parathyroid carcinoma (PC) is an orphan malignancy accounting for only ~1% of all cases with primary hyperparathyroidism. The localization of recurrent PC is of critical importance and can be exceedingly difficult to diagnose and sometimes futile when common sites of recurrence in the neck and chest cannot be confirmed. Here, we present the diagnostic workup, molecular analysis and multimodal therapy of a 46-year old woman with the extraordinary manifestation of abdominal lymph node metastases 12 years after primary diagnosis of PC. The patient was referred to our endocrine tumor center in 2016 with the aim to localize the tumor causative of symptomatic biochemical recurrence. In view of the extensive previous workup we decided to perform [18F]FDG-PET-CT. A pathological lymph node in the liver hilus showed slightly increased FDG-uptake and hence was suspected as site of recurrence. Selective venous sampling confirmed increased parathyroid hormone concentration in liver veins. Abdominal lymph node metastasis was resected and histopathological examination confirmed PC. Within four months, the patient experienced biochemical recurrence and based on high tumor mutational burden detected in the surgical specimen by whole exome sequencing the patient received immunotherapy with pembrolizumab that led to a biochemical response. Subsequent to disease progression repeated abdominal lymph node resection was performed in 10/2018, 01/2019 and in 01/2020. Up to now (12/2020) the patient is biochemically free of disease. In conclusion, a multimodal diagnostic approach and therapy in an interdisciplinary setting is needed for patients with rare endocrine tumors. Molecular analyses may inform additional treatment options including checkpoint inhibitors such as pembrolizumab.
MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Sie sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und werden als vielversprechende Kandidaten für eine neue Generation von Biomarkern gehandelt. Die Quantifizierung von miRNAs aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten verspricht eine frühe Diagnose verschiedener Krankheitsbilder. Dazu zählen neben zahlreichen Krebsformen unter anderem auch Autoimmun- oder Herz-Kreislauferkrankungen. Um diese Biomarker schnell, sensitiv und spezifisch detektieren zu können, werden geeignete Detektionssysteme benötigt. Dabei liegt ein besonderer Fokus auf der Entwicklung von Point-of-Care-Systemen, die eine automatisierte Durchführung mit einfacher Handhabung verlangen.
Mikrochips können als leistungsfähige technische Hilfsmittel für eine robuste und miniaturisierte Signalerfassung an biochemischen Grenzflächen dienen. Auf der Grundlage eines CMOS-Chips mit einem Sensorarray aus interdigitalen Gold-Elektroden sollte in dieser Arbeit eine quantitative und multiplexfähige miRNA-Detektionsmethode mit elektrochemischer Signaltransduktion entworfen und untersucht werden. Weitere wichtige Zielfaktoren waren eine einfache und schnelle Durchführbarkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Sensitivität bei gleichzeitigem Verzicht auf Amplifikation und Vormarkierung des Ausgangsmaterials.
Es wurden verschiedene Methoden entworfen, überprüft, untersucht, optimiert und weiterentwickelt. Das beste Ergebnis wurde letztlich mit einem als Sandwich-Ligations-Methode bezeichneten Verfahren erzielt. Dabei wird zunächst ein aus zwei doppelsträngigen Assay-Komponenten und der Ziel-miRNA bestehender dreiteiliger Hybridisierungskomplex gebildet, der eine beidseitige spezifische Ligation der miRNA mit einem auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängerstrang und einem enzymmarkierten Reporterstrang vermittelt. Durch einen anschließenden Waschschritt werden alle überschüssigen Markierungen vom Detektionsbereich entfernt, so dass bei der Detektion nur Reporterenzyme ausgelesen werden, die über die Ziel-miRNA kovalent mit dem immobilisierten Strang verbunden sind. Dieses Signal ist daher proportional zur Ausgangskonzentration der gesuchten miRNA.
Die Methode wurde mit Hilfe von synthetischen miRNAs etabliert und optimiert. Sie erreichte eine analytische Sensitivität von unter 1 pM Ziel-Nukleinsäure bei einer Gesamt-Versuchsdauer von nur 30 Minuten. Konzentrationsreihen demonstrierten einen linearen dynamischen Messbereich zwischen 1 pM und 1 nM, der eine verlässliche Quantifizierung der detektierten miRNAs in diesem Bereich ermöglicht. Die sehr gute Spezfifität des Assays zeigte sich bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener IsomiRs auf das Messergebnis sowie im Rahmen von Experimenten mit miRNAs der let-7-Familie. Dabei konnten Ziel-Nukleinsäuren mit Einzelbasenunterschieden klar differenziert werden. Die Multiplexfähigkeit der vorgestellten Methode wurde durch die gleichzeitige Quantifizierung von bis zu acht miRNAs auf einem CMOS-Chip demonstriert, zuzüglich Kontrollen.
Die Validierung der Detektionsmethode erfolgte mit Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblutproben. Dazu wurde ein kardiales Panel aus acht miRNAs, die auf Basis von Studien zu zirkulierenden miRNAs bei Herzerkrankungen ausgewählt wurden, festgelegt. Mit Hilfe der entsprechenden optimierten Detektionskomponenten wurden aus Spenderblut gewonnene endogene miRNAs analysiert. Dabei zeigte sich für fünf der acht Kandidaten sowohl eine solide Korrelation zwischen eingesetzter Gesamt-RNA-Menge und Messsignal, als auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Die Konzentrationen der übrigen drei miRNAs lagen nah am unteren Detektionslimit und lieferten daher keine verlässlichen Daten. Mit Hilfe sogenannter branched DNA zur Signalamplifikation könnte bei Bedarf die Sensitivität des Assays noch verbessert werden, was durch weitere Experimente dieser Arbeit demonstriert wurde.
Ein Vergleichsexperiment zwischen der Sandwich-Ligations-Methode und qRT-PCR zeigte nur eine schwache Korrelation der Messergebnisse. Dies ist jedoch konsistent mit anderen Studien zur Vergleichbarkeit unterschiedlicher Detektionsmethoden.
Abschließend wurden die miRNAs des kardialen Panels in Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblut von Herzinfarktpatienten und Kontrollen mit der entwickelten Detektionsmethode analysiert und die Ergebnisse verglichen. Dabei konnten Abweichungen in den Konzentrationen von miR-15a und miR-425 aufgedeckt werden. Eine entsprechende diagnostische Untersuchung mit der hier vorgelegten und validierten Detektionsmethode könnte eine Alternative oder Ergänzung zu aktuell eingesetzten proteinbasierten Tests bieten.