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EU-Project number / Contract (GA) number
- 766118 (1)
Background
Serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT) is an indolamine platelet agonist, biochemically derived from tryptophan. 5-HT is secreted from the enterochromaffin cells into the gastrointestinal tract and blood. Blood 5-HT has been proposed to regulate hemostasis by acting as a vasoconstrictor and by triggering platelet signaling through 5-HT receptor 2A (5HTR2A). Although platelets do not synthetize 5-HT, they take 5-HT up from the blood and store it in their dense granules which are secreted upon platelet activation.
Objective
To identify the molecular composite of the 5-HT uptake system in platelets and elucidate the role of platelet released 5-HT in thrombosis and ischemic stroke. Methods: 5-HT transporter knockout mice (5Htt\(^{-/-}\)) were analyzed in different in vitro and in vivo assays and in a model of ischemic stroke.
Results
In 5Htt\(^{-/-}\) platelets, 5-HT uptake from the blood was completely abolished and agonist-induced Ca2+ influx through store operated Ca\(^{2+}\) entry (SOCE), integrin activation, degranulation and aggregation responses to glycoprotein VI (GPVI) and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) were reduced. These observed in vitro defects in 5Htt\(^{-/-}\) platelets could be normalized by the addition of exogenous 5-HT. Moreover, reduced 5-HT levels in the plasma, an increased bleeding time and the formation of unstable thrombi were observed ex vivo under flow and in vivo in the abdominal aorta and carotid artery of 5Htt\(^{-/-}\) mice. Surprisingly, in the transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) model of ischemic stroke 5Htt\(^{-/-}\) mice showed nearly normal infarct volume and the neurological outcome was comparable to control mice.
Conclusion
Although secreted platelet 5-HT does not appear to play a crucial role in the development of reperfusion injury after stroke, it is essential to amplify the second phase of platelet activation through SOCE and plays an important role in thrombus stabilization.
A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ...
Aside from the established immune-mediated etiology of multiple sclerosis (MS), compelling evidence implicates platelets as important players in disease pathogenesis. Specifically, numerous studies have highlighted that activated platelets promote the central nervous system (CNS)-directed adaptive immune response early in the disease course. Platelets, therefore, present a novel opportunity for modulating the neuroinflammatory process that characterizes MS. We hypothesized that the well-known antiplatelet agent acetylsalicylic acid (ASA) could inhibit neuroinflammation by affecting platelets if applied at low-dose and investigated its effect during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model to study MS. We found that oral administration of low-dose ASA alleviates symptoms of EAE accompanied by reduced inflammatory infiltrates and less extensive demyelination. Remarkably, the percentage of CNS-infiltrated CD4\(^+\) T cells, the major drivers of neuroinflammation, was decreased to 40.98 ± 3.28% in ASA-treated mice compared to 56.11 ± 1.46% in control animals at the disease maximum as revealed by flow cytometry. More interestingly, plasma levels of thromboxane A\(_2\) were decreased, while concentrations of platelet factor 4 and glycoprotein VI were not affected by low-dose ASA treatment. Overall, we demonstrate that low-dose ASA could ameliorate the platelet-dependent neuroinflammatory response in vivo, thus indicating a potential treatment approach for MS.
The receptor EMMPRIN is involved in the development and progression of cardiovascular diseases and in the pathogenesis of myocardial infarction. There are several binding partners of EMMPRIN mediating the effects of EMMPRIN in cardiovascular diseases. EMMPRIN interaction with most binding partners leads to disease progression by mediating cytokine or chemokine release, the activation of platelets and monocytes, as well as the formation of monocyte-platelet aggregates (MPAs). EMMPRIN is also involved in atherosclerosis by mediating the infiltration of pro-inflammatory cells. There is also evidence that EMMPRIN controls energy metabolism of cells and that EMMPRIN binding partners modulate intracellular glycosylation and trafficking of EMMPRIN towards the cell membrane. In this review, we systematically discuss these multifaceted roles of EMMPRIN and its interaction partners, such as Cyclophilins, in cardiovascular disease.
Clopidogrel hat sich als potentes Medikament zur Verhinderung kardiovaskulärer Ereignisse sowohl bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom ohne ST-Hebung (non-STE-ACS) als auch bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) erwiesen (CURE- und COMMIT-Studie). Insbesondere der Nutzen einer Vorbehandlung mit Clopidogrel bei perkutaner Koronarintervention ist bei Patienten mit non-STE-ACS und STEMI gut belegt (PCI-CURE- und PCI-CLARITY-Studie). Ein beträchtlicher Anteil der Patienten zeigt allerdings kein adäquates Ansprechverhalten auf Clopidogrel. Wir etablierten deswegen zusätzlich zu einem bereits bestehenden FACS-Assay, der den Effekt von Clopidogrel anhand der Phosphorylierung des Proteins VASP quantitativ bestimmt, einen neuartigen auf dem gleichen Prinzip beruhenden enzyme-immuno assay (EIA). In einer Doppelblindstudie mit gesunden Probanden spiegelten im systematischen Vergleich von VASP-EIA, VASP-FACS und anderer verbreiteter Verfahren (Aggregation, p-Selektin Expresssion, PFA100) sowohl die VASP-Assays als auch die Aggregation die Plättchen-Inhibition deutlich wider. Demgegenüber waren weder die p-Selektin Expression noch der PFA100 ein Indikator für den Clopidogrel-Effekt. Die VASP-Assays zeichneten sich im Vergleich zur Aggregation durch bessere Quantifizierbarkeit und eine enge Abhängigkeit von der Zielstruktur des Clopidogrels, dem P2Y12-Rezeptor, aus. So hatte eine Medikation mit Acetylsalicylsäure keinen Einfluss auf die VASP-Assays, verminderte allerdings die Aggregation. Weiterhin konnten wir im Rahmen der Probandenstudie durch Verwendung PAR- (protease activated receptor) spezifischer Peptide (SFFLRN, AYPGKF) und dem stabilen Thromboxan A2 Analog U46619 in ex-vivo Versuchen nachweisen, dass die antithrombozytären Eigenschaften des Clopidogrels zum Teil auf der indirekten Hemmung der Thrombin- und Thromboxan-induzierten Plättchenaktivierung beruhen. Diese Ergebnisse betonen die zentrale Bedeutung Galpha(i)-vermittelter Signalwege in Thrombozyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit strebten wir an, neue Substrate der cGMP-abhängigen Proteinkinase zu identifizieren und das bekannte Substrat VASP weiter zu charakterisieren. Die Plättchenadhäsion und -aktivierung an der Zellwand sind initiale Ereignisse der arteriellen Thrombose. Prostacyclin und NO erhöhen die intrazelluläre Konzentration zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP). Dies führt zu einer umfassenden Inhibition der Thrombozyten, hauptsächlich durch Aktivierung der cAMP- bzw. cGMP-abhängige Proteinkinase (cAK, cGK). Es liegt bisher kein schlüssiges Bild davon vor, wie die Substrate der cAK und cGK die Plättcheninhibition regulieren. Wir identifizierten zunächst das adenylylcyclase-associated protein (CAP1) anhand der Analyse des humanen Plättchen-Phosphoproteoms als neues Substrat der cGK, das innerhalb von Sekunden nach SNP-Stimulation phosphoryliert wird. Die Separation des Phosphoproteoms erfolgte durch 2D-Gelelektrophorese. Wildtyp-CAP1 und Mutanten, bei denen an putativen Phosphorylierungsstellen Serin bzw. Threonin durch Alanin ausgetauscht wurde, wurden anschließend in PtK2-Zellen exprimiert. Bisher konnte die Ko-Transfektion von PtK2-Zellen mit CAP1 und cGK eine Phosphorylierung von CAP1 durch die cGK nicht bestätigen. Weitere Anstrengungen werden nötig sein, CAP1 als cGK-Substrat zu etablieren. Flusskammerversuche zeigten, dass die Hemmung der Thrombusformation durch SNP bei VASP-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) ineffektiv ist und belegen, dass die Inhibition der Agonisten-induzierten Thrombusformation durch den NO/cGMP-Signalweg in VASP-defizienten Plättchen gestört ist. VASP hatte in unseren Experimenten keinen signifikanten Einfluss auf die GPIIbIIIa-Aktivierung (gemessen mit dem monoklonalen Antikörper JON/A), die Serotonin-Sekretion (delta-Granula) und die p-Selektin-Expression (alpha-Granula). Die Ergebnisse legen nahe, dass die VASP-Deletion zu subtilen Störungen von Thrombozytenfunktionen führt, die erst in Experimenten deutlich zu Tage treten, die ihr Zusammenspiel abbilden.
Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI.
Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis.
First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level.
Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice.
In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation.
Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.
Cyclophilin a is not acetylated at lysine-82 and lysine-125 in resting and stimulated platelets
(2022)
Cyclophilin A (CyPA) is widely expressed by all prokaryotic and eukaryotic cells. Upon activation, CyPA can be released into the extracellular space to engage in a variety of functions, such as interaction with the CD147 receptor, that contribute to the pathogenesis of cardiovascular diseases. CyPA was recently found to undergo acetylation at K82 and K125, two lysine residues conserved in most species, and these modifications are required for secretion of CyPA in response to cell activation in vascular smooth muscle cells. Herein we addressed whether acetylation at these sites is also required for the release of CyPA from platelets based on the potential for local delivery of CyPA that may exacerbate cardiovascular disease events. Western blot analyses confirmed the presence of CyPA in human and mouse platelets. Thrombin stimulation resulted in CyPA release from platelets; however, no acetylation was observed—neither in cell lysates nor in supernatants of both untreated and activated platelets, nor after immunoprecipitation of CyPA from platelets. Shotgun proteomics detected two CyPA peptide precursors in the recombinant protein, acetylated at K28, but again, no acetylation was found in CyPA derived from resting or stimulated platelets. Our findings suggest that acetylation of CyPA is not a major protein modification in platelets and that CyPA acetylation is not required for its secretion from platelets.
Platelet interaction with the subendothelium is essential to limit blood loss after tissue injury. However, upon rupture of atherosclerotic plaques, this interaction may result in blood vessel occlusion leading to life threatening diseases such as myocardial infarction or stroke. Among the subendothelial matrix proteins, collagen is considered to be the most thrombogenic component as it directly activates platelets. Platelets interact with collagen, either indirectly through glycoprotein (GP) Ib-V-IX receptor complex, or directly through the major collagen receptor on the platelet surface, GPVI. The work presented here focused on studying the cellular regulation of GPVI. In addition, a possible role for GPVI in thrombus formation induced by atherosclerotic plaque material was investigated and it was found that GPVI plays an important role in this process. Using a recently published mitochondrial injury model, it was found that GPVI contains a cleavage site for a platelet-expressed metalloproteinase. Further studies showed that platelet activation by CRP, or thrombin induced down-regulation of GPIb, but not GPVI. In parallel, cellular regulation of GPV was studied and it was found that GPV is cleaved in vitro by the metalloproteinase ADAM17. In previous studies it was shown that injection of mice with the anti-GPVI mAb, JAQ1, induces GPVI down-regulation, which is associated with a strong, but transient, thrombocytopenia. Using new anti-GPVI mAbs, which bind different epitopes on the receptor, it is shown in this study that GPVI down-regulation occurs in an epitope-independent manner. Further experiments showed that antibody treatment induces a transient, but significant increase in bleeding time. Using different genetically modified mice, it is shown that, upon antibody injection, GPVI is both, shed from the platelet surface and internalized into the platelet. Signaling through the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) of the FcR chain is essential for both processes, while LAT and PLC2 are essential for the shedding process only. Antibody-induced increase in bleeding time and thrombocytopenia were absent in LAT deficient mice, showing that it is possible to uncouple the associated side effects from the down-regulation process. As antibody-induced GPVI internalization still occurs in LAT and PLC2 deficient mice, this suggests a novel signaling pathway downstream of GPVI that has not been described so far.
Integrin αIIbβ3 plays a central role in the adhesion and aggregation of platelets and thus is essential for hemostasis and thrombosis. Integrin activation requires the transmission of a signal from the small cytoplasmic tails of the α or β subunit to the large extracellular domains resulting in conformational changes of the extracellular domains to enable ligand binding. Hydrogen peroxide-inducible clone-5 (Hic-5), a member of the paxillin family, serves as a focal adhesion adaptor protein associated with αIIbβ3 at its cytoplasmic tails. Previous studies suggested Hic-5 as a novel regulator of integrin αIIbβ3 activation and platelet aggregation in mice. To assess this in more detail, we generated Hic-5-null mice and analyzed activation and aggregation of their platelets in vitro and in vivo. Surprisingly, lack of Hic-5 had no detectable effect on platelet integrin activation and function in vitro and in vivo under all tested conditions. These results indicate that Hic-5 is dispensable for integrin αIIbβ3 activation and consequently for arterial thrombosis and hemostasis in mice.
Background
Platelets are anuclear cell fragments derived from bone marrow megakaryocytes that safeguard vascular integrity, but may also cause pathological vessel occlusion. Reorganizations of the platelet cytoskeleton and agonist-induced intracellular Ca2+-mobilization are crucial for platelet hemostatic function. EF-hand domain containing 2 (EFhd2, Swiprosin-1) is a Ca2+-binding cytoskeletal adaptor protein involved in actin remodeling in different cell types, but its function in platelets is unknown.
Objective
Based on the described functions of EFhd2 in immune cells, we tested the hypothesis that EFhd2 is a crucial adaptor protein for platelet function acting as a regulator of Ca2+-mobilization and cytoskeletal rearrangements.
Methods and Results
We generated EFhd2-deficient mice and analyzed their platelets in vitro and in vivo. Efhd2-/- mice displayed normal platelet count and size, exhibited an unaltered in vivo life span and showed normal Ca2+-mobilization and activation/aggregation responses to classic agonists. Interestingly, upon stimulation of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif-coupled receptor glycoprotein (GP) VI, Efhd2-/- platelets showed a slightly increased coagulant activity. Furthermore, absence of EFhd2 had no significant impact on integrin-mediated clot retraction, actomyosin rearrangements and spreading of activated platelets on fibrinogen. In vivo EFhd2-deficiency resulted in unaltered hemostatic function and unaffected arterial thrombus formation.
Conclusion
These results show that EFhd2 is not essential for platelet function in mice indicating that other cytoskeletal adaptors may functionally compensate its loss.
Die Volkskrankheit Adipositas zieht eine Reihe von kostenträchtigen Komplikationen mit sich wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 und kardiovaskuläre Erkrankungen. Der Endocannabinoidblocker Rimonabant ist hierbei ein viel versprechendes Medikament, mit dem nicht nur die Adipositas an sich, sondern zusätzlich auch ihre weit reichenden Komplikationen im kardiovaskulären Bereich reduziert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten an Hand 6 Monate alter diabetischer Ratten, welche für 10 Wochen mit Rimonabant behandelt wurden, aufgezeigt werden, dass Rimonabant auf verschiedenste Weise die Initialphase der Atherogenese positiv beeinflusst. Zum einen konnte die Anzahl der zirkulierenden Monozyten signifikant vermindert und auch die für die initiale Rekrutierung von Thrombozyten und Monozyten wichtigen Chemokine RANTES und MCP-1 reduziert werden. Zum anderen zeigten sich positive Effekte auf das Lipidprofil der Probanden. Ein besonderes Augenmerk lag auf dem Aktivitätszustand der Thrombozyten: Mit Rimonabant wurde sowohl die thrombozytäre Aktivierung minimiert als auch ein positiver Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion und -aggregation bestätigt. Folglich reduziert Rimonabant das kardiovaskuläre Risiko, indem es die pro-inflammatorischen und pro-atherosklerotischen Kaskaden vermindert.
Rac1 is a small Rho GTPase that is activated in platelets upon stimulation with various ligands, including collagen and thrombin, which are ligands for the glycoprotein VI (GPVI) receptor and the protease-activated receptors, respectively. Rac1-deficient murine platelets have impaired lamellipodia formation, aggregation, and reduced PLCγ2 activation, but not phosphorylation. The objective of our study is to investigate the role of Rac1 in GPVI-dependent human platelet activation and downstream signalling. Therefore, we used human platelets stimulated using GPVI agonists (collagen and collagen-related peptide) in the presence of the Rac1-specific inhibitor EHT1864 and analysed platelet activation, aggregation, spreading, protein phosphorylation, and GPVI clustering and shedding. We observed that in human platelets, the inhibition of Rac1 by EHT1864 had no significant effect on GPVI clustering on collagen fibres but decreased the ability of platelets to spread or aggregate in response to GPVI agonists. Additionally, in contrast to what was observed in murine Rac1-deficient platelets, EHT1864 enhanced GPVI shedding in platelets and reduced the phosphorylation levels of PLCγ2 following GPVI activation. In conclusion, Rac1 activity is required for both human and murine platelet activation in response to GPVI-ligands, but Rac1’s mode of action differs between the two species.
von Willebrand factor/ristocetin (vWF/R) induces GPIb-dependent platelet agglutination and activation of αIIbβ3 integrin, which also binds vWF. These conditions make it difficult to investigate GPIb-specific signaling pathways in washed platelets. Here, we investigated the specific mechanisms of GPIb signaling using echicetin-coated polystyrene beads, which specifically activate GPIb. We compared platelet activation induced by echicetin beads to vWF/R. Human platelets were stimulated with polystyrene beads coated with increasing amounts of echicetin and platelet activation by echicetin beads was then investigated to reveal GPIb specific signaling. Echicetin beads induced αIIbβ3-dependent aggregation of washed platelets, while under the same conditions vWF/R treatment led only to αIIbβ3-independent platelet agglutination. The average distance between the echicetin molecules on the polystyrene beads must be less than 7 nm for full platelet activation, while the total amount of echicetin used for activation is not critical. Echicetin beads induced strong phosphorylation of several proteins including p38, ERK and PKB. Synergistic signaling via P2Y12 and thromboxane receptor through secreted ADP and TxA2, respectively, were important for echicetin bead triggered platelet activation. Activation of PKG by the NO/sGC/cGMP pathway inhibited echicetin bead-induced platelet aggregation. Echicetin-coated beads are powerful and reliable tools to study signaling in human platelets activated solely via GPIb and GPIb-triggered pathways.
Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung.
Zn\(^{2+}\) deficiency in the human population is frequent in underdeveloped countries. Worldwide, approximatively 2 billion people consume Zn\(^{2+}\)-deficient diets, accounting for 1–4% of deaths each year, mainly in infants with a compromised immune system. Depending on the severity of Zn\(^{2+}\) deficiency, clinical symptoms are associated with impaired wound healing, alopecia, diarrhea, poor growth, dysfunction of the immune and nervous system with congenital abnormalities and bleeding disorders. Poor nutritional Zn\(^{2+}\) status in patients with metastatic squamous cell carcinoma or with advanced non-Hodgkin lymphoma, was accompanied by cutaneous bleeding and platelet dysfunction. Forcing Zn\(^{2+}\) uptake in the gut using different nutritional supplementation of Zn\(^{2+}\) could ameliorate many of these pathological symptoms in humans. Feeding adult rodents with a low Zn\(^{2+}\) diet caused poor platelet aggregation and increased bleeding tendency, thereby attracting great scientific interest in investigating the role of Zn\(^{2+}\) in hemostasis. Storage protein metallothionein maintains or releases Zn\(^{2+}\) in the cytoplasm, and the dynamic change of this cytoplasmic Zn\(^{2+}\) pool is regulated by the redox status of the cell. An increase of labile Zn\(^{2+}\) pool can be toxic for the cells, and therefore cytoplasmic Zn\(^{2+}\) levels are tightly regulated by several Zn\(^{2+}\) transporters located on the cell surface and also on the intracellular membrane of Zn\(^{2+}\) storage organelles, such as secretory vesicles, endoplasmic reticulum or Golgi apparatus. Although Zn\(^{2+}\) is a critical cofactor for more than 2000 transcription factors and 300 enzymes, regulating cell differentiation, proliferation, and basic metabolic functions of the cells, the molecular mechanisms of Zn\(^{2+}\) transport and the physiological role of Zn\(^{2+}\) store in megakaryocyte and platelet function remain elusive. In this review, we summarize the contribution of extracellular or intracellular Zn\(^{2+}\) to megakaryocyte and platelet function and discuss the consequences of dysregulated Zn\(^{2+}\) homeostasis in platelet-related diseases by focusing on thrombosis, ischemic stroke and storage pool diseases.
Stroke and myocardial infarction are the most prominent and severe consequences of pathological thrombus formation. For prevention and/or treatment of thrombotic events there is a variety of anti-coagulation and antiplatelet medication that all have one side effect in common: the increased risk of bleeding. To design drugs that only intervene in the unwanted aggregation process but do not disturb general hemostasis, it is crucial to decipher the exact clotting pathway which has not been fully understood yet. Platelet membrane receptors play a vital role in the clotting pathway and, thus, the aim of this work is to establish a method to elucidate the interactions, clustering, and reorganization of involved membrane receptors such as GPIIb/IIIa and GPIX as part of the GPIb-IX-V complex. The special challenges regarding visualizing membrane receptor interactions on blood platelets are the high abundancy of the first and the small size of the latter (1—3µm of diameter). The resolution limit of conventional fluorescence microscopy and even super-resolution approaches prevents the successful differentiation of densely packed receptors from one another. Here, this issue is approached with the combination of a recently developed technique called Expansion Microscopy (ExM). The image resolution of a conventional fluorescence microscope is enhanced by simply enlarging the sample physically and thus pulling the receptors apart from each other. This method requires a complex sample preparation and holds lots of obstacles such as variable or anisotropic expansion and low images contrast. To increase ExM accuracy and sensitivity for interrogating blood platelets, it needs optimized sample preparation as well as image analysis pipelines which are the main part of this thesis. The colocalization results show that either fourfold or tenfold expanded, resting platelets allow a clear distinction between dependent, clustered, and independent receptor organizations compared to unexpanded platelets.Combining dual-color Expansion and confocal fluorescence microscopy enables to image in the nanometer range identifying GPIIb/IIIa clustering in resting platelets – a pattern that may play a key role in the clotting pathway
Die Rolle des Proteins VASP für die Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen
(2005)
Im Rahmen der Arbeit wurden in mehreren Teilprojekten die Eigenschaften und Funktionen des Vasodilatator stimulierenden Phosphoproteins (VASP) untersucht. Es wurde ein neuer Antikörper (5C6) charakterisiert, der für an Serin157 phosphoryliertes VASP spezifisch sein sollte. Es konnte gezeigt werden, dass der 5C6 Antikörper spezifisch VASP erkennt, welches an der Stelle Serin157 phosphoryliert ist. Auch konnten mit dem neuen Antikörper Ergebnisse bestätigt werden, die vorher mit anderen Methoden erhoben wurden, nämlich, dass Serin157 sowohl cAMP- als auch cGMP-vermittelt phosphoryliert wird. Der Antikörper 5C6 stellte sich als ein guter Marker für die Phosphorylierung von VASP an Serin157 durch die PKA dar und ermöglichte, die Zeitkinetik der VASP-Phosphorylierung zu beschreiben. In einem weiteren Projekt wurde die Rolle des Proteins VASP bei der Proliferation und Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu Megakaryozyten und Thrombozyten untersucht. Die Stammzellen wurden zusätzlich zu Wachstumsfaktoren mit unterschiedlichen Dosen eines cGMP-Analogons stimuliert. Es zeigte sich hierbei, dass 8-pCPT-cGMP einen dualen, konzentrationsabhängigen Effekt auf die Proliferation und die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen von Wildtypmäusen hat. Niedrige Dosen hemmten die Proliferation und förderten die Differenzierung, dagegen hatten höhere Konzentrationen einen proliferationsfördernden und differenzierungshemmenden Effekt auf die Stammzellen. Im Vergleich hierzu ergab eine Stimulation mit 8-pCPT-cGMP bei VASP knock out Mäusen immer einen proliferationsfördernden Effekt, hingegen einen hemmenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen. Bei den knock out Zellen führten höhere Konzentrationen lediglich zu einer stärkeren Reaktion als niedrige.
Die Analyse des Phosphoproteoms in ruhenden und in aktivierten humanen Plättchen führte zur Identifikation des PITPnm2-Proteins. Dieses Protein wird bei einer Stimulation von Thrombozyten mit dem Prostazyklinanalogon Iloprost phosphoryliert. Diese Ergebnisse gaben Anlass zu weiteren Untersuchungen zum Vorkommen und zur Funktion dieses Proteins in Thrombozyten. In der Arbeit wurde gezeigt, dass das PITPnm2-Protein das einzige Protein der PITP-Familie ist, welches in humanen Thrombozyten exprimiert wird. Die membranassoziierten Phosphatidylinositol-Transfer-Proteine PITPnm1 und PITPnm3 sind auf cDNA-Ebene nicht in Thrombozyten nachweisbar. Von den drei zur Zeit der Untersuchung bekannten Splicevarianten des PITPnm2-Proteins konnten zwei Varianten in Thrombozyten mittels RT-PCR identifiziert werden. Diese zwei Varianten unterscheiden sich durch ein unterschiedlich exprimiertes Exon, welches im zentralen Teil des Proteins liegt. Ein weiteres Spliceprodukt, dem die Aminosäuren 50 bis 328 im vorderen Teil des Proteins fehlen, wird nicht in Thrombozyten exprimiert. PITPNM2 (Splicevariante 1) wurde als Fusionsprotein mit einem sogenannten „Flag-Tag“ kloniert und in Eukaryonten exprimiert (pCMV-SC-CF, Stratagene). Mit dem rekombinanten Fusionsprotein wurden gegen PITPnm2 gerichtete Antikörper getestet. Der Vergleich mit Flag-Tag-spezifischen Antikörpern zeigte, dass der PITPnm2-spezifische Antikörper zahlreiche Banden detektiert und für weitere Untersuchungen nicht geeignet ist. Dieser PITPnm2-Klon wird auch in weiterführenden Arbeiten eingesetzt werden, die sich mit der Identifizierung der Interaktionspartner dieses Proteins, der subzellulären Lokalisierung und der Teilnahme des Proteins an spezifischen Zell-Signalwegen beschäftigen werden.