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Die Zahnwerkstoffe HEMA (Hydroxyethylmethacrylat) und TEGDMA (Triethylenglycol-dimethacrylat) gehören zu den so genannten Restmonomeren. Sie liegen nach der Polymerisation noch ungebunden vor und werden anschließend freigesetzt. Sie gelangen in den Organismus über die Pulpa, die Gingiva oder über den Speichel und können biologisch wirksam werden. Bisherige Studien zeigen dosisabhängige mutagene Effekte in tierischen und menschlichen Zellen. HEMA und TEGDMA führen zu DNA-Strangbrüchen, Mikrokernbildung, Apoptosen und nehmen Einfluss auf den Zellzyklus (G1- und G2-Verzögerung). Ebenso wurden ein allergenes Potential und eine toxische Wirkung auf die Niere beschrieben. In dieser Arbeit wurden genotoxische Effekte von HEMA und TEGDMA in humanen Lymphozyten in Konzentrationsbereichen überprüft, wie sie auch im Körper auftreten können. Hierfür wurden die Lymphozyten 24 Stunden mit 10 µM, 100 µM und 1 mM HEMA und mit 1 µM, 10 µM und 100 µM TEGDMA behandelt. Mit dem Comet Assay werden DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche sowie die Reparatur zuvor induzierter DNA-Schäden erfasst. Durch die Modifikation des Comet Assay mit dem Fpg-Protein werden zusätzlich oxidativ geschädigte Basen mit hoher Sensitivität nachgewiesen. Der Mikrokerntest weist manifeste DNA-Schäden auf DNA-Ebene in Form von Mikrokernen nach. Daneben lassen sich auch andere zelluläre Reaktionen wie Mitosen und Apoptosen sowie die Proliferationsrate der Zellen bestimmen. Der Chromosomen-aberrationstest dient zum Nachweis von Veränderungen in der Struktur und/oder in der Anzahl von Chromosomen eines Genoms. Mit dem Schwesterchromatidaustauschtest werden ebenfalls Chromosomenmutationen nachgewiesen. Durchflusszytometrische Methoden werden zum Nachweis von Apoptosen und zur Zellzyklusanalyse eingesetzt. Im herkömmlichen Comet Assay zeigen HEMA und TEGDMA keine signifikante Wirkung auf die DNA (OTM < 2). Es kann aber gezeigt werden, dass die Behandlung mit Fpg zu einer Verdoppelung des OTM führt. Bei 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA wird dadurch das OTM auf > 2 angehoben. HEMA und TEGDMA wirken sich nicht auf die Mikrokernbildung aus, jedoch wird durch den Mikrokerntest ab 1 mM HEMA und 100 µM TEGDMA eine Einflussnahme auf die Proliferation gezeigt. Die Rate früher (< 10%) und später Apoptosen Apoptosen (< 4 %) bleibt im Durchschnitt weitgehend konstant. Eine Ausnahme sind 1 mM HEMA, die die frühen Apoptosen auf > 10 % anheben. Eine Einflussnahme auf den Zellzyklus, in Form einer Verzögerung, üben 1 mM HEMA in der S-Phase und 100 µM TEGDMA in der G1-Phase aus. In den Chromosomentests werden einerseits ein dosisabhängiger Anstieg der Aberrationen und andererseits vermehrte Chromatidaustausche beobachtet. In dieser Arbeit wird die Verbindung von HEMA und TEGDMA zu oxidativen Stress im Comet Assay mit Fpg gezeigt. Da die tatsächlich in vivo erreichbaren Konzentrationen unter 100 µM liegen, ist zu schließen, dass HEMA und TEGDMA in diesem niedrigen Konzentrationsbereich keine nachteiligen Effekte ausüben, denn nur die hohen Konzentrationen (1 mM HEMA, 100 µM TEGDMA) sind in der Lage eine genotoxische Wirkung zu entfalten. Jedoch kann das Auslösen von Mutationen mit dem Chromosomenaberrationstest und Schwesterchromatidaustauschtest bestätigt werden. Um das Schädigungsprofil dieser häufig eingesetzten Zahnwerkstoffe detaillierter beschreiben zu können, müssen Untersuchungen auf Chromatidebene intensiviert werden.
In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Hochdosis-GC-Pulstherapie im Zusammenhang mit akuten Schüben von MS-Patienten anhand des Tiermodells der MS, der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), untersucht. Die EAE wurde in C57Bl/6 Mäusen und diversen GR-defizienten Mäusen durch Immunisierung mit Myelinoligodendrozytenglykoprotein (MOG35-55) induziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Dexamethason (Dex) den Krankheitsverlauf dosisabhängig verbessert. Die Untersuchung heterozygoter GR Knock-out Mäuse und hämatopoetischer Stammzellchimären verdeutlichte, dass der zytosolische GR (cGR) für die Vermittlung therapeutischer GC-Effekte von sehr großer Bedeutung ist. Der Einsatz zelltyp-spezifischer GR-defizienter Mäuse zeigte auf zellulärer Ebene, dass für die Vermittlung von GC-Wirkungen die Expression des GR vor allem in T-Zellen unabdingbar ist, wohingegen die GR-Expression in myeloiden Zellen in diesem Kontext keine Bedeutung hat. Durch die Analyse des molekularen Mechanismus konnte festgestellt werden, dass diese Effekte durch Apoptoseinduktion und Herunterregulieren von Adhäsionsmolekülen in peripheren, aber nicht ZNS-residenten T-Zellen erzielt wurden. Überdies wurde ersichtlich, dass Dex die T-Zellmigration in das ZNS verhinderte. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese, dass Dex durch Apoptoseinduktion und Immunmodulation hauptsächlich auf periphere T-Zellen wirkt und somit den ständigen Influx neuer Immunzellen in das ZNS verhindert. Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die therapeutische Gabe hochdosierten Methylprednisolons (MP) in diesem EAE-Modell ebenfalls zu einer dosisabhängigen Verbesserung der EAE führte. Diese beruhte auf einer reduzierten Lymphozyteninfiltration in das ZNS, war allerdings im Vergleich zur Dex-Therapie aufgrund geringerer Wirkpotenz weniger stark ausgeprägt. Im Gegensatz dazu führte die präventive MP-Applikation zu einem verstärkten EAE-Verlauf, der nach der Beeinflussung peripherer, hämatopoetischer Immunzellen auf eine verstärkte Proliferation autoreaktiver T-Zellen zurückzuführen ist. Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde als möglicher Ersatz für die Hochdosis-GC-Pulstherapie eine nicht-steroidale, antiinflammatorische Substanz im chronischen EAE-Modell der C57Bl/6 Maus etabliert. Erste tierexperimentelle Untersuchungen mit Compound A (CpdA) offenbarten eine lediglich geringe therapeutische Breite dieser Substanz, wobei innerhalb pharmakologischer Dosierungen dennoch therapeutische Wirkungen vermittelt werden konnten. Anhand von in vitro Experimenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass CpdA GR-unabhängig Apoptose induzierte, wobei Immunzellen und neuronale Zellen gegenüber CpdA besonders empfindlich reagierten. Der Einsatz T-Zell-spezifischer GR-defizienter Mäuse konnte zeigen, dass CpdA für die Vermittlung therapeutischer Wirkungen den cGR benötigt. Ferner wurde offensichtlich, dass CpdA in Abwesenheit des cGR in T-Zellen eine signifikante Verschlechterung der EAE verursachte. Durch die Anwendung physikochemischer Analysenmethoden, wie der Massenspektrometrie und 1H-NMR-Spektroskopie, konnte festgestellt werden, dass CpdA in vitro in gepufferten Medien in eine zyklische, chemisch sehr reaktive Verbindung (Aziridin) metabolisiert wird. Diese kann sehr wahrscheinlich für die Apoptose-Induktion in Zellen und die in Mäusen beobachteten neurotoxischen Ausfallerscheinungen verantwortlich gemacht werden. Durch chemische Analysen konnte in vitro in wässriger CpdA-Lösung ein weiterer Metabolit, das sympathomimetisch wirksame Synephrin, identifiziert werden. Um die Wirksamkeit adrenerger Substanzen in vivo zu testen, wurde das ß1/2-Sympathomimetikum Isoproterenol appliziert. Dieses verbesserte die EAE-Symptomatik, was sehr wahrscheinlich auf eine reduzierte Antigenpräsentation und einer damit verbundenen verminderten T-Zellinfiltration in das ZNS zurückzuführen ist.
Deregulated MYC expression contributes to cellular transformation as well as progression and
maintenance of human tumours. Interestingly, in the absence of additional genetic alterations,
potentially oncogenic levels of MYC sensitise cells to a variety of apoptotic stimuli. Hence, MYC-induced
apoptosis has long been recognised as a major barrier against cancer development.
However, it is largely unknown how cells discriminate physiological from supraphysiological levels
of MYC in order to execute an appropriate biological response.
The experiments described in this thesis demonstrate that induction of apoptosis in mammary
epithelial cells depends on the repressive actions of MYC/MIZ1 complexes. Analysis of gene
expression profiles and ChIP-sequencing experiments reveals that high levels of MYC are required
to invade low-affinity binding sites and repress target genes of the serum response factor SRF.
These genes are involved in cytoskeletal dynamics as well as cell adhesion processes and are likely
needed to transmit survival signals to the AKT kinase. Restoration of SRF activity rescues MIZ1-
dependent gene repression and increases AKT phosphorylation and downstream function.
Collectively, these results indicate that association with MIZ1 leads to an expansion of MYC’s
transcriptional response that allows sensing of oncogenic levels, which points towards a tumour-suppressive
role for the MYC/MIZ1 complex in epithelial cells.
TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte.
Menschliche Mundschleimheut wurde ex-vivo gegenüber Schwermetallen (Blei) oder polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (Benzopyren) für Zeiten von 5Min. bis 360Min exponiert. Immunhistochemisch wurdne im Anschluss Marker für Apoptose, oxitaven und nitrogenen Stress untersucht. Hierbei zeigten sich jeweils charakteristische Veränderungen für aktive Caspase-3, 3-Nitrotyrosine und 8-epi-PGF2alpha. Proben von Rauchern wurden mit Nichtraucherproben verglichen und zeigten verminderte Werte für oxidativen und nitrogenen Stress.
Glucocorticoids (GCs) are small lipophilic compounds that mediate a plethora of biological effects by binding to the intracellular glucocorticoid receptor (GR) which, in turn, translocates to the nucleus and directly or indirectly regulates gene transcription. GCs remain the cornerstone in the treatment for a number of hematological malignancies, including leukemia, lymphoma and myeloma. Extensive literature suggests that the efficacy of GCs stems from their ability to mediate apoptosis. Despite the enormous strides made in our understanding of regulated cell death, the exact mechanism by which GCs cause apoptosis is still unknown. The data obtained so far provide strong evidence that gene transactivation by the GR underlies the initiation phase of GC-induced thymocyte apoptosis. Furthermore, the multicatalytic proteasome, several members of the Bcl-2 family, changes in calcium flux as well as caspases have been identified as important players in the execution phase of GC-mediated cell death. However, the exact sequence of events in this process still remains elusive. A major problem of the current discussion arises from the fact that different cell types, such as thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells are compared without acknowledging their different characteristics and gene expression profiles. Although it is generally assumed that GCs induce apoptosis via a conserved mechanism, this is not supported by any data. In other words, it is possible that thymocytes, peripheral T cells and lymphoma cells may undergo cell death along different pathways. We therefore wondered whether a unique signal transduction pathway is engaged by GCs to initiate and execute cell death in all types of T lymphocytes or whether distinct pathways exist. Therefore, we compared the role of the proteasome, various caspases, the lysosomal compartment and other factors in GC-induced apoptosis of murine thymocytes and peripheral T cells as well as T-ALL lymphoma cells. Our findings show that the initiation phase of GC-induced apoptosis is similar irrespective of the differentiation state of the cell. Apoptosis in both thymocytes and peripheral T cells is mediated by the GR and depends on gene transcription. In contrast, the execution phase significantly differs between thymocyte and peripheral T cells in its requirement for a number of signal transduction components. Whilst in thymocytes, the proteasome, caspases 3, 8 and 9 as well as cathepsin B play an important role in GC-induced apoptosis, these factors are dispensable for the induction of cell death in peripheral T cells. In contrast, changes in the expression and intracellular location of Bcl-2 family members do not appear to contribute to GC-induced apoptosis in either cell type. Importantly, our observation that GC treatment of thymocytes leads to an activation of the lysosomal protease cathepsin B and that this is an essential step in the induction of cell death by GCs, is the first indication that a lysosomal amplification loop is involved in this process. Analysis of GC-induced apoptosis in several T-ALL cell lines further indicates that the signaling pathway induced by GCs in thymocytes but not in peripheral T cells is shared by all lymphoma cell-types analyzed. Given the therapeutic importance of high-dose GC-therapy for the treatment of hematological malignancies, this finding could potentially form a basis for new anti-cancer strategies in the future, which specifically target tumor cells whilst leaving peripheral T cells of patients untouched.
Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells
(2004)
The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970’s. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as ‘physiological’ or ‘regulated’ cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene.
Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden.
CD70-abhängige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten
(2014)
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antikörpers mit einer Fc-unabhängigen Zelltod-induzierenden Aktivität auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Domäne sowie aus einer TRAIL-Domäne bestehen.
Der CD70-spezifische monoklonale Antikörper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antikörper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist für den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellulärer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinität der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion führt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). Für die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Präferenz für den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Präferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellulären GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zusätzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalitätsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) bestätigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifität der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten löslichen TRAIL-Trimeren waren nur die
quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 höher als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizitätsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verstärkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte größtenteils erst nach Oligomerisierung überhaupt eine Bioaktivität bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verstärkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizitätsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizität der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verstärkte (Abb. 15, 17). In Übereinstimmung mit der verstärkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antikörpers führte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivität von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer stärkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss.
Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivität von löslichem TRAIL über ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerwünschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Darüber hinaus könnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die primär durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen über Funktionalität, Halbwertszeiten, sowie Effektivität und Verträglichkeit treffen zu können.
Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empfängers gegenüber ihr selbst, sondern übt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Phänomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen Dünndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / Dünndarmtransplantation für Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem – orientiert an den Verhältnissen beim Menschen – Leber (arterialisiert) und Dünndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation überprüft. Die dazu benötigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die für eine erfolgreiche isolierte Dünndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellulären Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. Während dieser Abstoßung sammeln sich überdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, hauptsächlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten Dünndarm an. Dieses Phänomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelfärbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen könnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erklären und den gleichzeitig transplantierten Dünndarm vor seiner Abstoßung bewahren.
In this century new experimental and computational techniques are adding an enormous amount of information, revealing many biological mysteries. The complexities of biological systems still broach new questions. Till now the main approach to understand a system has been to divide it in components that can be studied. The upcoming new paradigm is to combine the pieces of information in order to understand it at a global level. In the present thesis we have tried to study infectious diseases with such a global ‘Systems Biology’ approach. In the first part the apoptosis pathway is analyzed. Apoptosis (Programmed cell death) is used as a counter measure in different infections, for example viral infections. The interactions between death domain containing proteins are studied to address the following questions: i) How specificity is maintained - showing that it is induced through adaptors, ii) how proliferation/ survival signals are induced during activation of apoptosis – suggesting the pivotal role of RIP. The model also allowed us to detect new possible interacting surfaces. The pathway is then studied at a global level in a time step simulation to understand the evolution of the topology of activators and inhibitors of the pathway. Signal processing is further modeled in detail for the apoptosis pathway in M. musculus to predict the concentration time course of effector caspases. Further, experimental measurements of caspase-3 and viability of cells validate the model. The second part focuses on the phagosome, an organelle which plays an essential role in removal of pathogens as exemplified by M. tuberculosis. Again the problem is addressed in two main sections: i) To understanding the processes that are inhibited by M. tuberculosis; we focused on the phospholipid network applying a time step simulation in section one, which plays an important role in inhibition or activation of actin polymerization on the phagosome membrane. ii) Furthermore, actin polymers are suggested to play a role in the fusion of the phagosome with lysosome. To check this hypothesis an in silico model was developed; we find that the search time is reduced by 5 fold in the presence of actin polymers. Further the effect of length of actin polymers, dimensions of lysosome, phagosome and other model parameter is analyzed. After studying a pathway and then an organelle, the next step was to move to the system. This was exemplified by the host pathogen interactions between Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica. The limited availability of quantitative information was the crucial factor behind the choice of the model type. A Boolean model was developed which was used for a dynamic simulation. The results predict important factors playing a role in Bordetella pathology especially the importance of Th1 related responses and not Th2 related responses in the clearance of the pathogen. Some of the quantitative predictions have been counterchecked by experimental results such as the time course of infection in different mutants and wild type mice. All these computational models have been developed in presence of limited kinetic data. The success of these models has been validated by comparison with experimental observations. Comparative models studied in chapters 6 and 9 can be used to explore new host pathogen interactions. For example in chapter 6, the analysis of inhibitors and inhibitory paths in three organism leads to the identification of regulatory hotspots in complex organisms and in chapter 9 the identification of three phases in B. bronchiseptica and inhibition of IFN-γ by TTSS lead us to explore similar phases and inhibition of IFN-γ in B. pertussis. Further an important significance of these models is to identify new components playing an essential role in host-pathogen interactions. In silico deletions can point out such components which can be further analyzed by experimental mutations.
Die Schlafkrankheit hat ihren Schrecken seit den Zeiten Robert Kochs und Paul Ehrlichs nicht verloren. Die zielgerichtete Entwicklung neuer Medikamente ist für die Menschen in den Endemiegebieten damals wie heute von elementarer Bedeutung. Die Naphtylisochinolin-Alkaloide stellen eine neue chemische Substanzklasse dar, die gute Kandidaten für die Entwicklung neuer Medikamente enthält. Mit GBAP 94 im speziellen liegt eine Substanz vor, die gute Startvorrausetzungen hierfür mitbringt. Diese sind eine sehr gute Wirksamkeit gegen Trypanosomen, gepaart mit einer hohen Selektivität durch einen sehr wahrscheinlich relativ spezifisch anti-trypanosomalen Wirkmechanismus. Die verwendeten Naphtylisochinolin-Alkaloide GBAP 94 und GBAP 146 wurden nach unterschiedlichen Gesichtspunkten ausgewählt. GBAP 94 wurde aufgrund seiner guten antitrypanosomalen Wirkung und seiner hohen Selektivität für Trypanosomen ausgewählt. Die IC50 liegt mit 0,383 µmol/l im Vergleich zu den aktuell verwendeten Medikamenten sehr niedrig. Die Selektivitätsindices (IC50 Trypanosoma brucei brucei / IC50 Makrophagen J774.1) mit 85,6 und (IC50 Try-panosoma brucei brucei / IC50 Leishmania major) mit 15,1 liegen in einem sehr günstigen Bereich. GBAP 146 wurde hauptsächlich wegen seiner guten Fluoreszenz-Eigenschaften ausgewählt. Die antitrypanosomale Aktivität ist mit einer IC50 von 0,289 µmol/l zwar sehr gut, eine große Selektivität ist aber nicht gegeben. Die beiden Alkaloide waren aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz gut fluoreszenz-mikroskopisch in den Parasiten zu detektieren. Nach 10 min war in den ersten Trypanosomen die Anreicherung der Wirkstoffe erkennbar. Nach 30 min war bei fast allen Parasiten eine Färbung erkennbar. Die Wirkstoffe reicherten sich zunächst in mehreren kleinen Vakuolen an. Bei längeren Inkubationszeiten zeigte sich eine fast homogene Verteilung innerhalb des kompletten Parasiten. Durch-gängig ausgespart blieb eine vakuolische Struktur. Diese entwickelte oder vergrößerte sich im Verlauf der Inkubationszeit im vorderen Drittel des Parasiten, etwa im Bereich des Kinetoplasten. Diese Vakuole konnte auch lichtmikroskopisch in der Giemsa-Färbung nachgewiesen werden. Der Anteil der veränderten Trypanosomen lag bei diesen Untersuchungen nach 1 h bei 25,4%, stieg bis zum Zeitpunkt 2 h auf 46,6% und stabilisierte sich nach 4 h bei 44,8%. Die vakuolische Struktur führte durch ihre Vergrößerung zur zunehmenden Verplumpung der Trypanosomen bis zu einer kugelförmigen Zellform mit geisselartig-wirkender Flagelle. Aufgrund der veränderten Form wurden die Zellorganellen verdrängt. Dies konnte durch die Fluoreszenzmarkierung des Mitochondriums mit Rodamine B Hexylester und der sauren Kompartimente, besonders des Lysosoms, mit LysoTracker® gezeigt werden. Die Vakuolisierung von Trypanosomen im Zusammenhang mit Apoptose ist bekannt. Die neu entstehende Vakuole konnte weder mit LysoTracker® green, noch mit dem endosomalen Farbstoff FM 4-64 angefärbt werden. Damit können eine lysosomale und eine endosomale Herkunft der Vakuole ausgeschlossen werden. Eine genaue Klärung der Genese der Vakuole steht noch aus. In den Untersuchungen mit Annexin V und Propidium-Jodid im FACS® konnte gezeigt werden, dass die Wirkung der NIQs sehr wahrscheinlich Apoptose induziert. Annexin V ist auch bei Trypanosomen als Marker für Apoptose etabliert. Zudem zeigte sich ein Anstieg der Anzahl apoptotischer Trypanosomen mit Periode von 6 h – 8 h. Diese Dauer entspricht ungefähr der Dauer des trypanosomalen Zellzyklus. Ein Eingriff der NIQs in den Zellzyklus ist somit sehr wahrscheinlich. Eine Hemmung von Teilen des Zellzyklus ist als Auslöser für Apoptose bekannt. Über die genaue Zielstruktur der NIQs kann allerdings nur spekuliert werden. Die apotose-induzierende Wirkung anderer Alkaloide auf Trypanosomen ist inzwischen nachgewiesen. Ein weiteres Indiz ist, dass die Ergebnisse von Ponte-Sucre mit den NIQs bei Leishmanien ebenfalls in Richtung Apoptose weisen.
Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungeklärt. Diese Arbeit zeigt, dass primäre, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufklärung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antikörpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber für den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.
SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits – GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant – the apoptosis – remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b−overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation.
Die Behandlung der Ovarial- und Endometriumkarzinomzellen mit Perifosin ruft eine Inhibition der AKT-Phosphorylierung und eine damit verbundene Hemmung der Zellproliferation hervor. In PTEN-defizienten Zellen, die mutmaßlich eine stärkere konstitutive AKT-Aktivität aufweisen, waren die zytostatischen Effekte von Perifosin stärker ausgeprägt. In allen Zelllinien wurde gezeigt, dass der Zelltod unabhängig von einer Inhibition der Caspasen erfolgen kann. Die Kombinationsbehandlung von Endometrium- und Ovarialkarzinomzelllinien mit Perifosin und Cisplatin demonstrierte additive Effekte. Daher scheint Perifosin ein guter Kandidat für eine Phase II Studie bei Patientinnen mit fortgeschrittenem Endometrium- und Ovarialkarzinomen zu sein und zwar sowohl als Monopräparat als auch in Kombination mit Platin-Derivaten.
In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.
Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.
Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.