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Institut
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (315) (entfernen)
Sonstige beteiligte Institutionen
- Boston Children's Hospital (1)
- Center for Computational and Theoretical Biology (CCTB), Universität Würzburg (1)
- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
Die Calcineurin/NFAT-Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie. Im Zytoplasma von Kardiomyozyten wird die Phosphatase Calcineurin nach Stimulierung der Zellen, z. B. durch Dehnungsreize, Angiotensin II (Ang II) oder Endothelin I (ET-1), und einen daraus folgenden intrazellulären Ca2+-Strom aktiviert. Dies führt zur Dephosphorylierung von NFAT und zu dessen nukleärer Translokation. In früheren Arbeiten von Ritter et al. wurden sowohl eine nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) als auch eine nukleäre Exportsequenz (NES) innerhalb von Calcineurin identifiziert, die den Transport von Calcineurin zwischen dem Zytoplasma und dem Nukleus ermöglichen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde das Import Blocking Peptid (IBP) entwickelt. Dieses Peptid entspricht der NLS von Calcineurin und blockiert die Calcineurin-Bindungsstellen des Shuttleproteins (Karyopherins) Importin β1. So wird die Translokation von Calcineurin in den Nukleus unterbunden und die Signalkaskade zur Aktivierung von Hypertrophie-Genen in Kardiomyozyten unterbrochen. Dabei blieb die Phosphatase-Aktivität von Calcineurin unbeeinflusst. Eines der Ziele dieser Arbeit war, IBP weiter zu optimieren und den „proof of principle“ auch in vivo zu führen. Hierfür wurden u. a. ein geeignetes Lösungsmittel bestimmt (biokompatibel und an die Peptidcharakteristika angepasst), die Peptidstruktur modifiziert (Erhöhung der Spezifität/Wirksamkeit) und die erforderliche Dosis weiter eingegrenzt (Belastungs- und Kostenreduktion). Unter Verwendung einer TAMRA-markierten Wirkstoffvariante konnten der Weg des Peptids in Mäusen nachverfolgt und die Ausscheidung quantifiziert werden.
Aufbauend auf den Ergebnissen von Burkard et al., die die Entstehung einer konstitutiv-aktiven und nukleären Calcineurin-Isoform nach proteolytischer Spaltung durch Calpain nachwiesen, wurde die Rolle von Calcineurin im Zellkern genauer untersucht. Außerdem sollte die Frage beantwortet werden, wie (über Calcineurin?) die Herzmuskelzelle zwischen Calciumschwankungen im Zuge der Exzitations-Kontraktions-Kopplung (ECC) und vergleichsweise schwachen Calciumsignalen zur Transkriptionsteuerung unterscheidet. Mit Hilfe von nukleären Calcineurin-Mutanten, die einen Defekt in der Ca2+-Bindung aufwiesen, konnte die Bedeutung von Calcineurin als Calciumsensor für die NFAT-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Im Mausmodell waren unter Hypertrophie-Bedingungen die Ca2+-Transienten in der nukleären Mikrodomäne signifikant stärker als im Zytosol, wodurch die Hypothese, dass die Aktivierung der Calcineurin/NFAT-Signalkaskade unabhängig von zytosolischem Ca2+ erfolgt, gestützt wird. Messungen von nukleären und zytosolischen Ca2+-Transienten in IP3-Sponge-Mäusen zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen keine Erhöhung des Ca2+-Spiegels während der Diastole, was auf eine Rolle von Inositoltrisphosphat (IP3) in der Signalkaskade deutet. Außerdem zeigten isolierte Zellkerne ventrikulärer adulter Kardiomyozyten eine erhöhte Expression des IP3-Rezeptors 2 (IP3R2) nach Ang II-Stimulierung. Diese gesteigerte Expression war abhängig von der Calcineurin/NFAT-Kaskade und bestand sogar
3 Wochen nach Entfernung des Ang II-Stimulus fort. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nukleäres Calcineurin als ein Ca2+-Sensor agiert, dass die lokale Ca2+-Freisetzung im Kern über IP3-Rezeptoren detektiert wird und dass dies im Zusammenspiel mit NFAT die Transkription von Hypertrophiegenen initiiert.
Charakterisierung von angeborenen Hörstörungen mit Hilfe von Hochdurchsatz-Sequenziermethoden
(2020)
Fast 500 Millionen Menschen weltweit sind von einer Hörstörung betroffen. Es wird sogar angenommen, dass diese Anzahl laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) noch steigen und 2050 jeder zehnte Mensch eine Hörstörung aufweisen wird. Mindestens in 50% aller Fälle ist die Hörstörung genetisch bedingt. Durch die jüngsten Fortschritte der Sequenzierungstechnologien hat die genetische Analyse von Hörstörungen an Bedeutung gewonnen, vor allem hinsichtlich Familienplanung, geeigneter Therapien und zukünftiger möglichen Therapieansätzen, um das Hörvermögen wiederherzustellen. Die folgende Arbeit stellt 155 familiäre Fälle vor, die genetisch untersucht wurden. Diese Fälle konnten in zwei Kohorten unterteilt werden. Eine Kohorte (n = 74) umfasste Patienten mit kaukasischem Hintergrund, während die andere Kohorte (n = 81) Patienten beinhaltete, die aus dem Iran rekrutiert wurden. Für die Untersuchung wurde zum einen eine Panel-Analyse mit dem TruSight One Panel (Illumina, San Diego, USA) und zum anderen eine Exom-Sequenzierung durchgeführt. Anschließend wurden die Daten mit Analyse-Programmen wie GensearchNGS (PhenoSystems, Wallonia, Belgien) ausgewertet. Insgesamt konnte für 55% aller Fälle eine pathogene oder wahrscheinlich pathogene Variante durch Next Generation Sequencing diagnostiziert werden. Die meisten der gelösten Fälle (ca. 73%) stammten aus der iranischen Kohorte, was durch elterliche Blutsverwandtschaft und erhöhte Inzidenz von Hörstörungen im Iran zu erklären ist. 27% der gelösten Fälle gehörten der zweiten Kohorte an. Mutationen in den Genen MYO15A, LHFPL5, TECTA und SLC26A4 konnten überwiegend bei iranischen Patienten identifiziert werden. Varianten im Gen TECTA als auch im Gen SLC26A4 wurden ebenfalls in der kaukasischen Kohorte identifiziert. Beide Ethnien wiesen jeweils ein eigenes Mutationsspektrum auf. Jedoch wurden in beiden Gruppen Überschneidungen im klinischen Bild durch pathogene Varianten in einer Vielzahl von Hörstörungsgenen, sowie unterschiedliche klinische Phänotypen, deren Ursache pathogene Varianten im gleichen Hörstörungsgen zugrunde liegen, und familiäre Locus-Heterogenität beobachtet.. In dieser Arbeit konnte eine De Novo Mutation im CEACAM16-Gen (DFNA4B) bestätigt und der Effekt von einer wiederholt betroffenen Aminosäure im S1PR2-Gen (DFNB68) beschrieben werden. Darüber hinaus wurden mehrere Patienten mit X-chromosomalem Hörverlust aufgrund von Defekten im POU3F4-Gen (DFNX2) und Deletionen im SMPX-Gen (DFNX4) diagnostiziert. Zusätzlich konnte mit Hilfe einer Exom-basierten Copy Number Variation-Analyse eine Deletion im OTOA-Gen (DFNB22) gefunden werden, welche sich bis in die Tandempseudogenregion erstreckte.
Diese Untersuchung zeigt die enormen Möglichkeiten zur Detektion von Mutationen bei heterogenen Erkrankungen durch Anwendung von Next Generation Sequencing. Weiterhin konnte eine intragenische Deletion im Gen COL9A1 identifiziert werden, die im Zusammenhang mit einer scheinbar isolierten Hörstörung steht und durch den komplexen Umlagerungsmechanismus FoSTeS/MMBIR (Fork Stalling und Template Switching/Microhomology-mediated Break-induced Replication) entstand, der so bei Hörstörungen noch nicht beschrieben wurde. Auf der Suche nach Genen, die bisher noch nicht mit Hörstörungen assoziiert werden konnten, wurden acht Familien in eine Kandidatengenuntersuchung miteinbezogen und eine Exom-weite Analyse durchgeführt. Bei fünf Familien konnte noch keine ursächliche Variante identifiziert werden. Jedoch wurde bei drei Familien mit einer autosomal dominanten Schwerhörigkeit eine genetische Ursache identifiziert und TECTB, ATP11A und THBS2 konnten als Kandidatengene ermittelt werden. Diese Arbeit zeigt, wie wichtig es ist, die kausale Variante bei Hörstörungspatienten zu detektieren. Eine genetische Diagnostik ermöglicht eine endgültige Diagnose eines Syndroms, ist für die Klassifizierung der Hörstörung notwendig und trägt zu einer zukünftigen Therapie der Patienten bei.
Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können.
Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können.
Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens.
Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen.
Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom
(2020)
Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht.
In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen.
Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird.
Angesichts des dramatischen, weltweiten Anstiegs der Prävalenz von Demenzerkrankungen und der aktuellen, unzureichenden Therapieansätze ist die Bereitstellung neuer, wirkungsvoller Behandlungsoptionen von größter Bedeutung. Technologische, pharmakologische und verhaltensbasierte Verfahren des Memory Enhancement könnten zur Lösung dieses Problems beitragen: Hierzu zählt die Stammzelltransplantation, die in mehreren Tierstudien zu einer Verbesserung der Gedächtnisfunktion führte. Zudem wird seit Längerem an einer Impfung gegen die Alzheimer-Krankheit mittels β-Amyloid-Antikörpern geforscht. Ein weiterer therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit besteht in der optogenetischen Stimulation spezifischer hippocampaler Engramm-Zellen, durch die bei einem Maus-Modell verloren gegangene Erinnerungen wiederhergestellt werden konnten. Unkonventionelle Pharmazeutika wie Erythropoetin führten in Tierstudien und bei Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu einer Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten und des Gedächtnisses. Eine Modifikation der Ernährung und der Einsatz von Pro- und Präbiotika beeinflussen das Gedächtnis über eine Manipulation der Darm-Hirn-Achse. Verhaltensbasierte Maßnahmen wie körperliche Aktivität und der Einsatz von Mnemotechniken stellen effektive Ansätze des Memory Enhancement dar, welche bereits heute von gesunden Individuen implementiert werden können. Für die Anwendung von Augmented Reality (AR) konnten kognitionsfördernde Wirkungen beim Lernen neuroanatomischer Themen und dem Zusammenbau von Objekten nachgewiesen werden. Besonders vielversprechend stellt sich die Entwicklung einer Gedächtnisprothese dar, durch die vergessene Informationen bei Personen mit stattgehabtem Schädel-Hirn-Trauma und apoplektischem Insult reaktiviert werden könnten. Memory Enhancement ist prinzipiell bereits heute bei gesunden und kranken Individuen anwendbar und verspricht wirksame zukünftige Präventions- und Therapieoptionen. Ein realer Einsatz in der klinischen Praxis ist in naher Zukunft jedoch noch nicht zu erwarten.
Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz
(2020)
In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen.
In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht.
In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte.
Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie.
Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen.
Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen.
Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio-
¬molekülen unter physiologischen Bedingungen.
Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran-
¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff-
Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine.
Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert
werden.
Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin-
Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von
Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden.
Das menschliche Gehirn ist ein Organ, das aufgrund seiner Komplexität und zellulären Diversität noch am wenigsten verstanden ist. Eine der Ursachen dafür sind zahlreiche Herausforderungen in diversen neurobiologischen Bild-gebungsverfahren. Erst seit der Erfindung der hochauflösenden Fluoreszenz-mikroskopie ist es möglich, Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze zu visua-lisieren und somit eine maximale Auflösung von bis zu 20 nm zu erreichen. Zusätzlich hängt die Fähigkeit, biologische Strukturen aufzulösen, von der Markierungs-größe und -dichte ab. Derzeit ist die häufigste Methode zur Proteinfärbung die indirekte Antikörperfärbung, bei der ein Fluorophor-markierter Sekundärantikörper an einen Epitop-spezifischen Primärantikörper bindet. Dabei kann der Abstand von Zielstruktur und Fluorophor bis zu 30 nm betragen, was eine Auflösungs-verminderung zur Folge haben kann. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit alternative Markierungsmethoden getestet, um postsynaptische Proteine sicht-bar zu machen.
Zunächst wurde der postsynaptische N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor mit Hilfe konventioneller indirekter Antikörperfärbung markiert. Hier war die NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors von besonderem Interesse, da diese in der Autoimmunerkrankung Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis invol-viert ist.
Patienten dieser seltenen Krankheit bilden Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit, wodurch ein schneller reversibler Verlust der NMDA-Rezeptoren auf der Postsynapse induziert wird. Wichtige Informationen können nicht mehr ausreichend weitergegeben werden, was psychiatrische und neurologi-sche Störungen zur Folge hat. In dieser Arbeit wurden sowohl kommerzielle NR1-Antikörper, als auch rekombinante monoklonale NR1-Antikörper von Patien-ten mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis getestet. In konfokalen und in hochaufgelösten SIM- (engl. structured illumination microscopy) und dSTORM- (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) Messun-gen konnten kommerzielle NR1-Antikörper keine erfolgreichen Färbungen erzielen. Dagegen erwiesen sich die rekombinanten monoklonalen NR1-Patientenantikörper als sehr spezifisch, sowohl in primären Neuronen als auch im Hippocampus von murinen Gehirnschnitten und lieferten gute Kolokalisati-onen mit dem postsynaptischen Markerprotein Homer.
Um die optische Auflösung zu verbessern, wurde eine neue Markierungs-methode mit sog. „Super-Binde-Peptiden“ (SBPs) getestet. SBPs sind modifi-zierte Peptide, die erhöhte Affinitäten und Spezifitäten aufweisen und mit ei-ner Größe von ~ 2,5 nm wesentlich kleiner als Antikörper sind. In dieser Arbeit bestätigte sich ein kleines hochspezifisches SPB, das an den Fluoreszenzfarb-stoff Tetra-
methylrhodamin (TMR) gekoppelt ist, als effektiver Marker für das Ankerpro-tein Gephyrin. Gephyrin ist für die Lokalisation und Verankerung einiger post-synaptischer Rezeptoren zuständig, indem es sie mit dem Cytoskelett der Zelle verbindet. SIM-Messungen in primären Neuronen zeigten eine bessere Clus-terrepräsentation bei der Färbung von Gephyrin mit SBPs, als mit Antikörper-färbung. Zusätzlich wurden Kolokalisationsanalysen von Gephyrin zusammen mit dem inhibito-rischen präsynaptischen vesikulären GABA-Transporter VGAT durchgeführt.
Eine weitere Färbemethode stellte die bioorthogonale Click-Färbung durch die Erweiterung des eukaryotischen genetischen Codes (engl. genetic code ex-pansion, GCE) dar. Dabei wurde eine unnatürliche, nicht-kanonische Amino-säure (engl. non-canonical amino acid, ncAA) ins Zielprotein eingebaut und in Kombination mit der Click-Chemie ortsspezifisch mit organischen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten angefärbt. Organische Fluorophore haben den Vorteil, dass sie mit einer Größe von 0,5 – 2 nm sehr klein sind und damit die natürli-chen Funktionen der Proteine in der Zelle kaum beeinflussen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der tetramere postsynaptische NMDA-Rezeptor durch die Amber-Supres-sionsmethode bioorthogonal angefärbt werden konnte. Aus sieben verschiede-nen Amber-Mutanten der NR1-Untereinheit stellte sich die Y392TAG-NR1-Mutante als diejenige mit der besten Proteinexpression, Färbeeffizienz und rezeptorfunktionalität heraus. Dies konnte durch Fluoreszenzmikroskopie- und Whole-Cell Patch-Clamp-Experimenten gezeigt werden. Die bioorthogo-nale Click-Färbung durch GCE eignete sich für die Färbung des NMDA-Rezeptors in verschiedenen Zelllinien, mit unterschiedlichen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten und für Lebendzellexperimente. In dSTORM-Messungen erwies sich das Tetrazin-Cy5-Farbstoff-Konjugat als ideal aufgrund seiner Grö-ße, Photostabilität, Helligkeit und seines geeigneten Blinkverhaltens, sodass eine homogene NMDA-Rezeptorverteilung auf der Zellmembran gezeigt wer-den konnte. NR1-Antikörperfärbungen wiesen dagegen starke Clusterbildun-gen auf. Die Ergebnisse konnten belegen, dass kleinere Farbstoffe eine deut-lich bessere Zugänglichkeit zu ihrem Zielprotein haben und somit besser für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind.
Thema dieser Thesis ist die Analyse sekretorischer Vesikelpools auf Ultrastrukturebene in unterschiedlichen biologischen Systemen. Der erste und zweite Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Analyse synaptischer Vesikelpools in neuromuskulären Endplatten (NME) im Modellorganismus Caenorhabditis elegans. Dazu wurde Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution angewandt, um eine unverzügliche Immobilisation der Nematoden und somit eine Fixierung im nahezu nativen Zustand zu gewährleisten. Anschließend wurden dreidimensionale Aufnahmen der NME mittels Elektronentomographie erstellt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden junge adulte, wildtypische C. elegans Hermaphroditen mit Septin-Mutanten verglichen. Um eine umfassende Analyse mit hoher Stichprobenzahl zu ermöglichen und eine automatisierte Lösung für ähnliche Untersuchungen von Vesikelpools bereit zu stellen wurde eine Software namens 3D ART VeSElecT zur automatisierten Vesikelpoolanalyse entwickelt. Die Software besteht aus zwei Makros für ImageJ, eines für die Registrierung der Vesikel und eines zur Charakterisierung. Diese Trennung in zwei separate Schritte ermöglicht einen manuellen Verbesserungsschritt zum Entfernen falsch positiver Vesikel. Durch einen Vergleich mit manuell ausgewerteten Daten neuromuskulärer Endplatten von larvalen Stadien des Modellorganismus Zebrafisch (Danio rerio) konnte erfolgreich die Funktionalität der Software bewiesen werden. Die Analyse der neuromuskulären Endplatten in C. elegans ergab kleinere synaptische Vesikel und dichtere Vesikelpools in den Septin-Mutanten verglichen mit Wildtypen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden neuromuskulärer Endplatten junger adulter C. elegans Hermaphroditen mit Dauerlarven verglichen. Das Dauerlarvenstadium ist ein spezielles Stadium, welches durch widrige Umweltbedingungen induziert wird und in dem C. elegans über mehrere Monate ohne Nahrungsaufnahme überleben kann. Da hier der Vergleich der Abundanz zweier Vesikelarten, der „clear-core“-Vesikel (CCV) und der „dense-core“-Vesikel (DCV), im Fokus stand wurde eine Erweiterung von 3D ART VeSElecT entwickelt, die einen „Machine-Learning“-Algorithmus zur automatisierten Klassifikation der Vesikel integriert. Durch die Analyse konnten kleinere Vesikel, eine erhöhte Anzahl von „dense-core“-Vesikeln, sowie eine veränderte Lokalisation der DCV in Dauerlarven festgestellt werden.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht ob die für synaptische Vesikelpools konzipierte Software auch zur Analyse sekretorischer Vesikel in Thrombozyten geeignet ist. Dazu wurden zweidimensionale und dreidimensionale Aufnahmen am Transmissionselektronenmikroskop erstellt und verglichen. Die Untersuchung ergab, dass hierfür eine neue Methodik entwickelt werden muss, die zwar auf den vorherigen Arbeiten prinzipiell aufbauen kann, aber den besonderen Herausforderungen der Bilderkennung sekretorischer Vesikel aus Thrombozyten gerecht werden muss.
Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen N-Myc und Aurora-A im MYCN-amplifizierten Neuroblastom
(2019)
Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, eines Mitglieds der MYC-Onkogenfamilie, mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Der von dem Gen kodierte Transkriptionsfaktor N-Myc ist für die Proliferation der MYCN-amplifizierten Neuroblastomzelllinien notwendig und seine Depletion oder Destabilisierung führen zum Proliferationsarrest (Otto et al., 2009). Da N-Myc auf Proteinebene durch die Interaktion mit der mitotischen Kinase Aurora-A stabilisiert wird, bewirkt deren Depletion oder die Hemmung der Interaktion der beiden Proteine mittels spezieller Aurora- A-Inhibitoren (z.B. MLN8054 und MLN8237) ebenso eine Hemmung der Proliferation – in vitro und in vivo (Brockmann et al., 2013). Bisher ist jedoch unklar, über welchen Mechanismus Aurora-A die Stabilisierung von N-Myc erreicht, die Kinaseaktivität spielt hierbei jedoch keine Rolle (Otto et al., 2009). Eine Möglichkeit stellt die Rekrutierung von Usps dar, die das angehängte Ubiquitinsignal so modifizieren, dass die Erkennung und der Abbau des Proteins durch das Proteasom verringert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Usp7 und Usp11 auf die Stabilität von N-Myc untersucht. Für beide konnte in Immunpräzipitationen die Interaktion mit N-Myc gezeigt werden. Ebenso erhöhten beide Proteasen in Überexpressionsexperimenten die vorhandene Menge an NMyc. Die Depletion von Usp7 mittels shRNAs führte in IMR-32 zu einem Arrest in der G1-Phase und zur Differenzierung der Zellen. Gleichzeitig wurden stark erniedrigte mRNA- und Proteinmengen von N-Myc und Aurora-A nachgewiesen. Es konnte jedoch nicht eindeutig gezeigt werden, ob die beobachteten zellulären Effekte durch eine vermehrte proteasomale Degradation von N-Myc begründet sind oder ob dabei die veränderte Regulation weiterer Zielproteine von Usp7 eine Rolle spielt. Die Depletion von Usp11 mit shRNAs bewirkte eine Abnahme der N-Myc-Mengen auf posttranslationaler Ebene. Somit stellen beide Usps vielversprechende Angriffspunkte einer gezielten Therapie in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen dar und sollten deshalb Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein. Über welche Proteindomäne in N-Myc die Interaktion mit Aurora-A stattfindet ist nicht bekannt. Eine mögliche Pseudosubstratbindungssequenz in Myc-Box I (Idee Richard Bayliss, University of Leicester) wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Durch Mutation dieser Sequenz sollte die Bindung von Aurora-A unmöglich gemacht werden. Allerdings wurde die erwartete Abnahme der Stärke der Interaktion von Aurora-A und N-Myc durch die Mutation ebensowenig beobachtet wie eine verringerte Stabilität. Die Regulation der Phosphorylierung von N-Myc im Verlauf des Zellzyklus wurde durch die Mutation beeinträchtigt. Wie diese Veränderung exakt zu begründen ist bedarf weiterer Experimente
Das hohe invasive Potential und die starke Resistenz gegen Radio-/Chemotherapie von Glioblastoma multiforme (GBM) Zellen machen sie zu dem tödlichsten Tumor ihrer Art. Es ist deshalb von großem Interesse die Grundlagen, welche der Migrationsfähigkeit und DNA Reparatur zu Grunde liegen, besser zu verstehen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zwei Algorithmen zur automatischen Analyse der Migration in der Einzelzellverfolgung und im Wundheilungsassay modifiziert. Die Auswertung der Daten konnte automatisch und somit schnell, effektiv und mit geringerem Arbeitsaufwand durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser automatischen Algorithmen wurde die Migrationsfähigkeit von zwei GBM-Zelllinien (DK-MG und SNB19) untersucht. Zusätzlich wurde die konfokale Laserscanning- sowie die hochauflösende dSTORM-Fluoreszenzmikroskopie verwendet um die, der Zellbewegung zu Grunde liegende, Struktur des F Aktin und der fokalen Adhäsionskinase (FAK) aufzulösen und darzustellen. Unter Anwendung dieser genannten Methoden sind die Effekte des dualen PI3K/mTOR Inhibitors PI-103 alleine und in Kombination mit dem Hsp90 Inhibitor NVP AUY922 mit und ohne Bestrahlung auf die Bewegung untersucht worden. Es konnte festgestellt werden, dass sich beide Zelllinien deutlich in ihrem migratorischem Potential in vitro unterscheiden und zudem auch markante Unterschiede in ihrer Morphologie aufweisen. Die weniger invasiven DK MG-Zellen besitzen eine polarisierte Zellstruktur, wohingegen SNB19-Zellen sich durch multipolare ungerichtete Bewegung auszeichneten. Zudem wurde die Migration, durch PI3K/mTOR Inhibition mit PI-103 bei den DK-MG-Zellen (p53 wt, PTEN wt), sehr effektiv unterdrückt. Wohingegen sich die SNB19-Zellen (p53 mut, PTEN mut) resistent gegen diesen Inhibitor zeigten. Hsp90 Inhibition offenbarte in beiden Zelllinien einen starken inhibitorischen Effekt auf die Migration der Zellen sowie die Reorganisierung des F Aktinskelettes.
In der zweiten Hälfte dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die DNA-DSB-Reparatur der GBM Zellen nach ionisierender Strahlung gelegt. Zunächst wurde eine automatische Analysesoftware „FocAn-3D“ entwickelt, mit dessen Hilfe die DNA Doppelstrangbruchreparaturkinetik untersucht werden sollte. Diese Software ermöglicht es die gesamten Zellkerne mit ihren γH2AX-Foci in 3D-cLSM-Aufnahmen zu untersuchen. Es konnte somit eine Verbesserung der Genauigkeit in der Auszählung der γH2AX-Foci erreicht werden, welche 2D beschränkter Software verwehrt bleibt. Mit FocAn-3D konnte der gesamte Verlauf der Induktions- und Abbauphase der γH2AX-Foci in DK MG- und SNB19-Zellen mit einem mathematischen Modell ausgewertet und dargestellt werden. Des Weiteren wurde die Nanometerstruktur von γH2AX- und pDNA-PKcs-Foci mittels hochauflösender dSTORM-Mikroskopie untersucht. Konventionelle Mikroskopiemethoden, begrenzt durch das Beugungslimit und einer Auflösung von ~200 nm, konnten die Nanometerstruktur (<100 nm) der Reparaturfoci bisher nicht darstellen. Mit Hilfe der beugungsunbegrenzten dSTORM-Mikroskopie war es möglich in DK MG- und SNB19-Zellen die Nanometerstruktur genannten Reparaturproteine in den Foci mit einer Auflösung von bis zu ~20 nm darzustellen. γH2AX-Foci zeigten sich als eine Verteilung aus einzelnen Untereinheiten („Nanofoci“) mit einem Durchmesser von ~45 nm. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich hier um die elementare Substruktur der Foci und somit der γH2AX enthaltenen Nukleosome handelt. DNA-PK-Foci wiesen hingegen eine diffusere Verteilung auf.
Die in dieser Arbeit ermittelten Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen rechtfertigen eine weitere präklinische Untersuchung der verwendeten Inhibitoren als potentielle Zelltherapeutika für die Behandlung von GBM. Zudem konnte sich dSTORM als machtvolles Hilfsmittel, sowohl zur Analyse der Migration zugrundeliegenden Zytoskelettstruktur und der Effekte der Hsp90 Inhibierung, als auch, der Nanostruktur der DNA-DSB-Reparaturfoci herausstellen. Es ist anzunehmen, dass beugungsunbegrenzte Mikroskopiemethoden sich als bedeutende Werkzeuge in der medizinischen und biologischen Erforschung der DNA-Reparaturmechanismen herausstellen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte ImageJ Plugin „FocAn-3D“ bewies sich ebenfalls als ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse der Reparaturkinetik. Mit Hilfe von „FocAn-3D“ sollte es somit möglich sein u.a. den Einfluss gezielter Inhibition auf den zeitlichen Verlauf der Induktion und des Abbaus der DNA-Reparaturmaschinerie genauer zu studieren.
In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert.
Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt.
Die verfügbaren in vitro Genotoxizitätstests weisen hinsichtlich ihrer Spezifität und ihres Informationsgehalts zum vorliegenden Wirkmechanismus (Mode of Action, MoA) Einschränkungen auf. Um diese Mängel zu überwinden, wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt, die zu der Entwicklung und Etablierung neuer in vitro Methoden zur Prüfung auf Genotoxizität in der Arzneimittelentwicklung beitragen.
1. Etablierung und Bewertung einer neuen in vitro Genotoxizitätsmethode (MultiFlow Methode)
Die MultiFlow Methode basiert auf DNA-schadensassoziierten Proteinantworten von γH2AX (DNA-Doppelstrangbrüche), phosphorylierten H3 (S10) (mitotische Zellen), nukleären Protein p53 (Genotoxizität) und cleaved PARP1 (Apoptose) in TK6-Zellen. Insgesamt wurden 31 Modellsubstanzen mit dem MultiFlow Assay und ergänzend mit dem etablierten Mikrokerntest (MicroFlow MNT), auf ihre Fähigkeit verschiedene MoA-Gruppen (Aneugene/Klastogene/Nicht-Genotoxine) zu differenzieren, untersucht. Die Performance der „neuen“ gegenüber der „alten“ Methode führte zu einer verbesserten Sensitivität von 95% gegenüber 90%, Spezifität von 90% gegenüber 72% und einer MoA-Klassifizierungsrate von 85% gegenüber 45% (Aneugen vs. Klastogen).
2. Identifizierung mechanistischer Biomarker zur Klassifizierung genotoxischer Substanzen
Die Analyse 67 ausgewählter DNA-schadensassoziierter Gene in der QuantiGene Plex Methode zeigte, dass mehrere Gene gleichzeitig zur MoA-Klassifizierung beitragen können. Die Kombination der höchstrangierten Marker BIK, KIF20A, TP53I3, DDB2 und OGG1 ermöglichte die beste Identifizierungsrate der Modellsubstanzen. Das synergetische Modell kategorisierte 16 von 16 Substanzen korrekt in Aneugene, Klastogene und Nicht-Genotoxine. Unter Verwendung der Leave-One-Out-Kreuzvalidierung wurde das Modell evaluiert und erreichte eine Sensitivität, Spezifität und Prädiktivität von 86%, 83% und 85%. Ergebnisse der traditionellen qPCR Methode zeigten, dass Genotoxizität mit TP53I3, Klastogenität mit ATR und RAD17 und oxidativer Stress mit NFE2L2 detektiert werden kann.
Durch die Untersuchungen von posttranslationalen Modifikationen unter Verwendung der High-Content-Imaging-Technologie wurden mechanistische Assoziationen für BubR1 (S670) und pH3 (S28) mit Aneugenität, 53BP1 (S1778) und FANCD2 (S1404) mit Klastogenität, p53 (K373) mit Genotoxizität und Nrf2 (S40) mit oxidativem Stress identifiziert.
Diese Arbeit zeigt, dass (Geno)toxine unterschiedliche Gen- und Proteinveränderungen in TK6-Zellen induzieren, die zur Erfassung mechanistischer Aktivitäten und Einteilung (geno)toxischer MoA-Gruppen (Aneugen/Klastogen/ Reaktive Sauerstoffspezies) eingesetzt werden können und daher eine bessere Risikobewertung von Wirkstoffkandidaten ermöglichen.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne B-Zell-Erkrankung, welche von einer großen Heterogenität auf der biologischen und klinischen Ebene sowie in der Therapieantwort geprägt ist. Durch die biologische Interpretation von whole exome sequencing (WES)-Daten der Tumor- und Normalproben von fünf MM-Patienten und sechs MM-Zelllinien (ZL) sowie dem Einbezug von publizierten next generation sequencing (NGS)-Daten von 38 MM-Patienten konnten in dieser Dissertation sowohl somatische tumorrelevante Mutationen identifiziert als auch ein MM-spezifisches Signaltransduktionsnetzwerk definiert werden. Interessanterweise wurde in fast 100 % der MM-Patienten mindestens eine Mutation und in ~50 % der MM-Patienten sogar mehr als eine Mutation innerhalb dieses Netzwerkes beobachtet, was auf eine inter- und intra-individuelle Signalweg-Redundanz hinweist, die für die individuelle Therapieentscheidung möglicherweise von Bedeutung sein könnte. Außerdem konnte bestätigt werden, dass identische, positionsspezifische und genspezifische Mutationen im MM selten wiederholt auftreten. Als häufig mutierte Gene im MM konnten KRAS, NRAS, LRP1B, FAM46C, WHSC1, ALOX12B, DIS3 und PKHD1 identifiziert werden. Interessanterweise wurde die DIS3-Mutation in der MM-ZL OPM2 gemeinsam mit einer copy neutral loss of heterozygosity (CNLOH) im DIS3-Lokus detektiert, und in der MM-ZL AMO1 wurde eine noch nicht näher charakterisierte KRAS-Mutation in Exon 4 in Verbindung mit einem copy number (CN)-Zugewinn und einer erhöhten KRAS-Genexpression gefunden. DIS3 ist ein enzymatisch aktiver Teil des humanen RNA-Exosom-Komplexes und KRAS ein zentrales Protein im RTK-Signalweg, wodurch genetische Aberrationen in diesen Genen möglicherweise in der Entstehung oder Progression des MMs eine zentrale Rolle spielen. Daher wurde die gesamte coding sequence (CDS) der Gene DIS3 und KRAS an Tumorproben eines einheitlich behandelten Patientensets der DSMM-XI-Studie mit einem Amplikon-Tiefen-Sequenzierungsansatz untersucht. Das Patientenset bestand aus 81 MM-Patienten mit verfügbaren zytogenetischen und klinischen Daten. Dies ergab Aufschluss über die Verteilung der Mutationen innerhalb der Gene und dem Vorkommen der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen des Tumors. Des Weiteren wurde die Assoziation der Mutationen mit weiteren klassischen zytogenetischen Alterationen (z.B. Deletion von Chr 13q14, t(4;14)-Translokation) untersucht und der Einfluss der Mutationen in Haupt- und Nebenklonen auf den klinischen Verlauf und die Therapieantwort bestimmt. Besonders hervorzuheben war dabei die Entdeckung von sieben neuen Mutationen sowie drei zuvor unbeschriebenen hot spot-Mutationen an den Aminosäure (AS)-Positionen p.D488, p.E665 und p.R780 in DIS3. Es wurde des Weiteren die Assoziation von DIS3-Mutationen mit einer Chr 13q14-Deletion und mit IGH-Translokationen bestätigt. Interessanterweise wurde ein niedrigeres medianes overall survival (OS) für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation sowie auch eine schlechtere Therapieantwort für MM-Patienten mit einer DIS3-Mutation im Nebenklon im Vergleich zum Hauptklon beobachtet. In KRAS konnten die bereits publizierten Mutationen bestätigt und keine Auswirkungen der KRAS-Mutationen in Haupt- oder Nebenklon auf den klinischen Verlauf oder die Therapieantwort erkannt werden. Erste siRNA vermittelte knockdown-Experimente von KRAS und Überexpressionsexperimente von KRAS-Wildtyp (WT) und der KRAS-Mutationen p.G12A, p.A146T und p.A146V mittels lentiviraler Transfektion zeigten eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 von dem KRAS-Mutationsstatus.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Dissertation einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen des MMs, vor allem im Hinblick auf die Rolle von DIS3 und KRAS bei der Tumorentwicklung und dem klinischen Verlauf.
Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist ein zentrales Enzym der NO/cGMP-Signalkaskade, das über die Aktivierung von NO zur Bildung des second messangers cGMP führt. Die NO-GC setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, sodass zwei Isoformen des Enzyms gebildet werden können (α1β1 und α2β1). Da die genaue Verteilung der beiden Isoformen im Colon nicht bekannt ist, wurde diese im ersten Teil dieser Arbeit charakterisiert. Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten die Expression beider Isoformen sowohl in der glatten Muskelschicht als auch in der Submukosa und Lamina propria. Dabei war die α1β1-Isoform ubiquitär, die α2β1-Isoform dagegen hauptsächlich im Bereich des myenterischen Plexus vorzufinden.
In der glatten Muskelschicht des Colons ist die NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sowie Fibroblasten-ähnliche Zellen (FLC) exprimiert und hauptsächlich in die Modulation der gastrointestinalen Motilität involviert. Zur spezifischen Charakterisierung der Funktion der NO-GC in den einzelnen Zelltypen wurden Knockout-Mäuse generiert, denen die NO-GC global (GCKO) oder spezifisch in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) oder beiden Zelltypen (SMC/ICC-GCKO) fehlt. Anhand dieser Mausmodelle sollten im zweiten Teil dieser Arbeit die modulatorischen Effekte der NO-GC auf die spontanen Kontraktionen des Colons bestimmt werden. Zur Charakterisierung der spontanen Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht wurden Myographiestudien mit 2,5 mm langen Colonringen durchgeführt. Hierbei konnten drei verschiedene Kontraktionen gemessen werden: Kleine, hochfrequente Ripples, mittlere Kontraktionen und große Kontraktionen. Die detaillierte Analyse der einzelnen Kontraktionen zeigte einerseits eine NO-unabhängige Regulation der Ripples, andererseits eine NO-abhängige Modulation der mittleren und großen Kontraktionen über die NO-GC in SMC und ICC. Die NO-GC in SMC beeinflusst die Kontraktionen vermutlich vor allem über die Regulation des Muskeltonus der zirkulären Muskelschicht. Die NO-GC in ICC dagegen modifiziert die spontanen Kontraktionen möglicherweise über eine Veränderung der Schrittmacheraktivität. Allerdings führt erst ein Funktionsverlust des NO/cGMP-Signalweges in beiden Zelltypen zu einem sichtbar veränderten Kontraktionsmuster, das dem von globalen Knockout-Tieren glich. Dies weist auf eine kompensatorische Wirkung der NO-GC im jeweils anderen Zelltyp hin.
Zur Analyse der propulsiven Kontraktionen entlang des gesamten Colons wurden Videoaufnahmen der Darmbewegungen in Kontraktionsmusterkarten transformiert. Zudem wurde der Darm durchspült und die Ausflusstropfen aufgezeichnet, um die Effektivität der Kontraktionen beurteilen zu können. Hierbei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des NO/cGMP-Signalweges eine verminderte Effektivität der Kontraktionen zur Folge hat und vermutlich durch eine beeinträchtige Synchronisation der Kontraktionen erklärt werden kann. In diesem Regulationsmechanismus konnte vor allem der NO-GC in SMC eine übergeordnete Rolle zugewiesen werden.
Der dritte Teil der Arbeit thematisierte den Befund, dass SMC-GCKO-Tiere ca. 5 Monate nach Tamoxifen-Behandlung Entartungen der Mukosa entwickelten. Diese Entartung war lediglich in Tamoxifen-induzierten Knockout-Tieren vorzufinden. Histologische Analysen identifizierten die Entartungen als tubulovillöses Adenom. Die Genexpressionsanalyse von Mukosafalten von SMC-GCKO- und heterozygoten Kontrolltieren zeigte eine Vielzahl von Genen, welche spezifisch bei colorectalem Karzinom differenziell exprimiert sind. Einer dieser Faktoren war der BMP-Antagonist Gremlin1. Dieser Faktor erschien von besonderem Interesse, da er in Zellen der Lamina muscularis mucosae und kryptennahen Myofibroblasten exprimiert wird. Immunhistochemische Analysen ließen vermuten, dass diese Zellen sowohl die NO-GC als auch die Cre-Rekombinase unter dem SMMHC-Promotor exprimieren. Diese Arbeit liefert demnach Hinweise darauf, dass die NO-GC einen wichtigen Regulator innerhalb der Stammzellnische bildet. Die Deletion der NO-GC führt vermutlich zu einer verstärkten Bildung bzw. Sekretion von Gremlin1, was die Homöostase der mukosalen Erneuerung stört und somit zur Entwicklung von Adenomen führt.
Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils
(2018)
Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden.
Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann.
In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können.
Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde.
Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden.
Simkania negevensis (Sn) repliziert als Chlamydia-ähnliches obligat intrazelluläres Bakterium auch in einer membranumschlossenen Vakuole, die als SCV (engl. Simkania-containing vacuole) bezeichnet wird. Die SCV ist ein bis jetzt einzigartiges Kompartiment, das stark mit ER-Membranen assoziiert ist, wobei ER-Stress von den Bakterien blockiert wird. Die Morphologie der SCV scheint dabei in Epithelzellen (HeLa229, A549, HEp-2) als auch in Makrophagen (THP1) gleich zu sein. Die SCV stellt die erste intrazelluläre Berührungsfläche dar, an der Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen erfolgen, und dient gleichzeitig als Replikationsnische. Mithilfe der Identifizierung von humanen und bakteriellen Faktoren, die mit der ER-SCV-Membran assoziiert sind, sollten die Zusammensetzung der SCV sowie mögliche Interaktionen mit dem ER oder zellulären Transportwegen ermittelt werden. Vergleichsstudien von SCV-assoziierten Proteinen sollten Ähnlichkeiten zur chlamydialen Inklusion aufzeigen, für die bereits einige interagierende Wirtszellfaktoren beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurde ein Aufreinigungsprotokoll etabliert, das sowohl für ER-SCVMembranen aus HeLa229 als auch THP1 geeignet war und für spätere Proteom- oder Lipidomanalysen diente. Über markierungsfreie massenspektrometrische Messungen konnten 302 bakterielle und 1178 humane Proteine in ER-(SCV-) Membranen und 885 bakterielle Proteine in aufgereinigten Sn identifiziert werden. In ER-(SCV-) Membranen von nicht und Sn-infizierten HeLa229 Zellen befanden sich 51 unterschiedlich verteilte und 57 transportassoziierte humane Proteine, die auf infektionsinduzierte Unterschiede beim intrazellulären Proteintransport hindeuteten. Eine entgegengesetzte Regulation von retro- und anterograd transportierten Proteinen konnte mithilfe von RNA-Interferenz und dem Einsatz geeigneter Inhibitoren bestätigt werden, wobei sich zeigte, dass Clathrin-assoziierte und COPI-Vesikel eine zentrale Rolle spielen. Retro-Inhibitoren, die den retrograden Transport zwischen Endosomen zum Golgi oder zwischen frühen und späten Endosomen inhibieren, sowie Bafilomycin A1 (retrograd, späte Endosomen und Lysosomen) und Brefeldin A (anterograd, ER und Golgi), beeinflussten massiv die SCV-Ausbildung, SCV-Morphologie und den intrazellulären Lipidtransport. Über markierungsfreie massenspektrometrische und dünnschichtchromatographische Analysen konnten erste Unterschiede im Lipidvorkommen in Sn-infizierten Zellen, an ER-SCVMembranen und in aufgereinigten Sn im Vergleich zu nicht infizierten Zellen ermittelt werden. Dabei konnten neben An- und Abreicherungen in Gesamtzellextrakten sowie ER-SCVMembranen zwei infektionsspezifische Lipide, Cholesterol-ß-D-Glykosid und PE 30:0, identifiziert werden. Weiterführende umfangreiche RNA-Interferenzstudien weisen darauf hin, dass die Sn-Infektion vom Endosomen-zum-Golgi-Transport und vom Clathrin-assoziierten Vesikeltransport abhängig ist. Zusammenfassend konnten erste mögliche SCV-assoziierte Proteine und Lipide identifiziert werden, die mit der bakteriellen Infektion verbunden waren. Des Weiteren hängen eine stabile SCV-Ausbildung und Sn-Infektivität von verschiedenen retrograden Transportwegen und damit von dem Erwerb von Nährstoffen wie bspw. Lipiden ab.
Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren.
Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff.
Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%.
Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden.
Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen.
Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen.
Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern.
Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen.
Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten.
In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden.
In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann.