Refine
Has Fulltext
- yes (46)
Is part of the Bibliography
- yes (46) (remove)
Year of publication
- 2010 (46) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (46) (remove)
Keywords
- Taufliege (9)
- Drosophila melanogaster (4)
- Signaltransduktion (4)
- Assoziatives Gedächtnis (3)
- Bioinformatik (3)
- Bruchpilot (3)
- Drosophila (3)
- Genexpression (3)
- Genmutation (3)
- Knochen-Morphogenese-Proteine (3)
Institute
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (46) (remove)
The phylum Tardigrada consists of about 1000 described species to date. The animals live in habitats within marine, freshwater and terrestrial ecosystems allover the world. Tardigrades are polyextremophiles. They are capable to resist extreme temperature, pressure or radiation. In the event of desiccation, tardigrades enter a so-called tun stage. The reason for their great tolerance capabilities against extreme environmental conditions is not discovered yet. Our Funcrypta project aims at finding answers to the question what mechanisms underlie these adaption capabilities particularly with regard to the species Milnesium tardigradum. The first part of this thesis describes the establishment of expressed sequence tags (ESTs) libraries for different stages of M. tardigradum. From proteomics data we bioinformatically identified 144 proteins with a known function and additionally 36 proteins which seemed to be specific for M. tardigradum. The generation of a comprehensive web-based database allows us to merge the proteome and transcriptome data. Therefore we created an annotation pipeline for the functional annotation of the protein and nucleotide sequences. Additionally, we clustered the obtained proteome dataset and identified some tardigrade-specific proteins (TSPs) which did not show homology to known proteins. Moreover, we examined the heat shock proteins of M. tardigradum and their different expression levels depending on the actual state of the animals. In further bioinformatical analyses of the whole data set, we discovered promising proteins and pathways which are described to be correlated with the stress tolerance, e.g. late embryogenesis abundant (LEA) proteins. Besides, we compared the tardigrades with nematodes, rotifers, yeast and man to identify shared and tardigrade specific stress pathways. An analysis of the 50 and 30 untranslated regions (UTRs) demonstrates a strong usage of stabilising motifs like the 15-lipoxygenase differentiation control element (15-LOX-DICE) but also reveals a lack of other common UTR motifs normally used, e.g. AU rich elements. The second part of this thesis focuses on the relatedness between several cryptic species within the tardigrade genus Paramacrobiotus. Therefore for the first time, we used the sequence-structure information of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) as a phylogenetic marker in tardigrades. This allowed the description of three new species which were indistinguishable using morphological characters or common molecular markers like the 18S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) or the Cytochrome c oxidase subunit I (COI). In a large in silico simulation study we also succeeded to show the benefit for the phylogenetic tree reconstruction by adding structure information to the ITS2 sequence. Next to the genus Paramacrobiotus we used the ITS2 to corroborate a monophyletic DO-group (Sphaeropleales) within the Chlorophyceae. Additionally we redesigned another comprehensive database—the ITS2 database resulting in a doubled number of sequence-structure pairs of the ITS2. In conclusion, this thesis shows the first insights (6 first author publications and 4 coauthor publications) into the reasons for the enormous adaption capabilities of tardigrades and offers a solution to the debate on the phylogenetic relatedness within the tardigrade genus Paramacrobiotus.
Protein phosphatases can be classified into at least three major families based on amino acid sequences at their active sites. A newly emerging phosphatase family contains the active site sequence DXDX(T/V), and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases, a ubiquitous and evolutionarily conserved enzyme family. Although the existence of 58 human HAD enzymes has been predicted by database analysis, our understanding of their biological functions remains rudimentary.By database mining amd phylogenetic analysis of human HAD phosphatases, we have found a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading onfibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration. a previously unidentified enzyme with homology to Chronophin, a cytoskeletal regulatory HAD phosphatase. We have cloned and characterized this novel enzyme and named it AUM,for actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase. By Northern blot, real-time PCR and Western blot analysis, we show that AUM is broadly expressed in all major human and mouse tissues with highest levels found in testis. Using immunohistochemistry, we can show that AUM is specifically expressed in maturing germ cells and that its expression peaks during spermiogenesis. To characterize the substrate preference of AUM, we have conducted an in vitro phosphatase substrate screen with 720 phosphopeptides derived from human phosphorylation sites. AUM exclusively dephosphorylates phosphotyrosine (pTyr)-containing peptides. Furthermore, only 17 pTyr peptides (~2% of all pTyr peptides investigated) acted as AUM substrates, indicating a high degree of substrate specificity. Putative AUM substrates include proteins involved in cytoskeletal dynamics and tyrosine kinase signaling.In accordance with the phosphopeptide screen, phosphatase overlay assays employing whole-cell extracts of pervanadate-treated HeLa cells show that AUM dephosphorylates only a limited number of tyrosyl-phosphorylated proteins.The role of AUM for cellular signaling was investigated in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation in a spermatogonial cell line (GC-1 spg). The overexpression of AUM reduces, whereas the RNAi-mediated depletion of endogenous AUM increases EGF inducedtyrosine phosphorylation, including changes in the phosphorylation of the EGF receptor itself. Interestingly, in vitro kinase/phosphatase assays with purified Src and AUM indicate that AUM can activate Src, which in turn phosphorylates and inactivates AUM. Although it is at present unclear how Src and AUM regulate each other, our initial findings suggests that AUM enhances Src kinase activity independently of its phosphatase activity, whereas Src diminishes AUM phosphatase activity in a kinase dependent manner. On a cellular level, AUM-depleted cells are characterized by altered actin cytoskeletal dynamics and adhesion, as indicated by stabilized actin filaments, enlarged focal adhesions,a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading on fibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration.
Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.
All animals learn in order to cope with challenges imposed on them by their environment. This is true also for both larval and adult fruit flies as exemplified in pavlovian conditioning. The focus of this Thesis is on various aspects of the fruit flies learning ability. My main project deals with two types of learning which we call punishment-learning and pain-relief learning. Punishment learning happens when fruit flies are exposed to an odour which is followed by electric shock. After such training, flies have learned that that odour signals pain and consequently will avoid it in the future. If the sequence of the two stimuli is reversed such that odour follows shock, flies learn the odour as a signal for relief and will later on approach it. I first report a series of experiments investigating qualitative and parametric features of relief-learning; I find that (i) relief learning does result from true associative conditioning, (ii) it requires a relatively high number of training trials, (iii) context-shock training is ineffective for subsequent shock-odour learning. A further question is whether punishment-learning and pain-relief learning share genetic determinants. In terms of genetics, I test a synapsin mutant strain, which lacks all Synapsin protein, in punishment and relief-learning. Punishment learning is significantly reduced, and relief-learning is abolished. Pan-neuronal RNAi-mediated knock-down of Synapsin results in mutant-like phenotypes, confirming the attribution of the phenotype to lack of Synapsin. Also, a rescue of Synapsin in the mushroom body of syn97 mutants restores both punishment- and relief-learning fully, suggesting the sufficiency of Synapsin in the mushroom body for both these kinds of learning. I also elucidate the relationship between perception and physiology in adult fruit flies. I use odour-shock conditioning experiments to identify degrees of similarity between odours; I find that those similarity measures are consistent across generalization and discrimination tasks of diverse difficulty. Then, as collaborator of T. Völler and A. Fiala, I investigate how such behavioural similarity/dissimilarity is reflected at the physiological level. I combine the behaviour data with calcium imaging data obtained by measuring the activity patterns of those odours in either the sensory neurons or the projection neurons at the antennal lobe. Our interpretation of the results is that the odours perceptual similarity is organized by antennal lobe interneurons. In another project I investigate the effect of gustatory stimuli on reflexive behaviour as well as their role as reinforcer in larval learning. Drosophila larvae greatly alter their behaviour in presence of sodium chloride. Increasing salt concentration modulates choice behaviour from weakly appetitive to strongly aversive. A similar concentration-behaviour function is also found for feeding: larval feeding is slightly enhanced in presence of low salt concentrations, and strongly decreased in the presence of high salt concentrations. Regarding learning, relatively weak salt concentrations function as appetitive reinforcer, whereas high salt concentrations function as aversive reinforcer. Interestingly, the behaviour-concentration curves are shifted towards higher concentrations from reflexive behaviour (choice behaviour, feeding) as compared to associative learning. This dissociation may reflect a different sensitivity in the respective sensory-motor circuitry.
The Popeye domain containing (Popdc) gene family of membrane proteins is predominantly expressed in striated and smooth muscle tissues and has been shown to act as novel cAMP-binding proteins. In mice, loss of Popdc1 and Popdc2, respectively, affects sinus node function in the postnatal heart in an age and stress-dependent manner. In this thesis, I examined gene expression pattern and function of the Popdc gene family during zebrafish development with an emphasis on popdc2. Expression of the zebrafish popdc2 was exclusively present in cardiac and skeletal muscle during cardiac development, whereas popdc3 was expressed in striated muscle tissue and in distinct regions of the brain. In order to study the function of these genes, an antisense morpholino-based knockdown approach was used. Knockdown of popdc2 resulted in aberrant development of facial and tail musculature. In the heart, popdc2 morphants displayed irregular ventricular contractions with 2:1 and 3:1 ventricular pauses. Recordings of calcium transients using a transgenic indicator line Tg(cmlc2:gCaMP)s878 and selective plane illumination microscopy (SPIM) revealed the presence of an atrioventricular (AV) block in popdc2 morphants as well as a complete heart block. Interestingly, preliminary data revealed that popdc3 morphants developed a similar phenotype. In order to find a morphological correlate for the observed AV conduction defect, I studied the structure of the AV canal in popdc2 morphants using confocal analysis of hearts of the transgenic line Tg(cmlc2:eGFP-ras)s883, which outlines individual cardiac myocytes with the help of membrane-localized GFP. However, no evidence for morphological alterations was obtained. To ensure that the observed arrhythmia phenotype in the popdc2 morphant was based on a myocardial defect and not caused by defective valve development, live imaging was performed revealing properly formed valves. Thus, in agreement with the data obtained in knockout mice, popdc2 and popdc3 genes in zebrafish are involved in the regulation of cardiac electrical activity. However, both genes are not required for cardiac pacemaking, but they play essential roles in AV conduction. In order to elucidate the biological importance of cAMP-binding, wild type Popdc1 as well as mutants with a significant reduction in binding affinity for cAMP in vitro were overexpressed in zebrafish embryos. Expression of wild type Popdc1 led to a cardiac insufficiency phenotype characterized by pericardial edema and venous blood retention. Strikingly, the ability of the Popdc1 mutants to induce a cardiac phenotype correlated with the binding affinity for cAMP. These data suggest that cAMP-binding represents an important biological property of the Popdc protein family.
Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus.
Vaccinia virus plays an important role in human medicine and molecular biology ever since the 18th century after E. Jenner discovered its value as a vaccination virus against smallpox. After the successful eradication of smallpox, vaccinia virus, apart from its use as a vaccine carrier, is today mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes encoding therapeutic or diagnostic proteins to be expressed within the tumor. The emphasis in this study was the diagnosis of tumors using different vaccinia virus strains. Viruses with metal-accumulating capabilities for tumor detection via MRI technology were generated and tested for their usefulness in cell culture and in vivo. The virus strains GLV-1h131, GLV-1h132, and GLV-1h133 carry the gene encoding the two subunits of the iron storage protein ferritin under the control of three different promoters. GLV-1h110, GLV-1h111, and GLV-1h112 encode the bacterial iron storage protein bacterioferritin, whereas GLV-1h113 encodes the codon-optimized version of bacterioferritin for more efficient expression in human cells. GLV-1h22 contains the transferrin receptor gene, which plays an important role in iron uptake, and GLV-1h114 and GLV-1h115 contain the murine transferrin receptor gene. For possibly better iron uptake the virus strains GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156, and GLV-1h157 were generated, each with a version of a ferritin gene and a transferrin receptor gene. GLV-1h154 carries the genes that encode bacterioferritin and human transferrin receptor, GLV-1h155 the human ferritin H-chain gene and the human transferrin receptor gene. GLV-1h156 and GLV-1h157 infected cells both express the mouse transferrin receptor and bacterioferritin or human ferritin H-chain, respectively. The virus strains GLV-1h186 and GLV-1h187 were generated to contain a mutated form of the ferritin light chain, which was shown to result in iron overload and the wildtype light chain gene, respectively. The gene encoding the Divalent Metal Transporter 1, which is a major protein in the uptake of iron, was inserted in the virus strain GLV-1h102. The virus strain GLV-1h184 contains the magA gene of the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum, which produces magnetic nanoparticles for orientation in the earth’s magnetic field. Initially the infection and replication capability of all the virus strains were analyzed and compared to that of the parental virus strain GLV-1h68, revealing that all the viruses were able to infect cells of the human cancer cell lines A549 and GI-101A. All constructs exhibited a course of infection comparable to that of GLV-1h68. Next, to investigate the expression of the foreign proteins in GI-101A and A549 cells with protein analytical methods, SDS-gelelectrophoresis, Western blots and ELISAs were performed. The proteins, which were expressed under the control of the strong promoters, could be detected using these methods. To be able to successfully detect the protein expression of MagA and DMT1, which were expressed under the control of the weak promoter, the more sensitive method RT-PCR was used to at least confirm the transcription of the inserted genes. The determination of the iron content in infected GI-101A and A549 cells showed that infection with all used virus strains led to iron accumulation in comparison to uninfected cells, even infection with the parental virus strain GLV-1h68. The synthetic phytochelatin EC20 was also shown to enhance the accumulation of different heavy metals in bacterial cultures. In vivo experiments with A549 tumor-bearing athymic nude mice revealed that 24 days post infection virus particles were found mainly in the tumor. The virus-mediated expression of recombinant proteins in the tumors was detected successfully by Western blot. Iron accumulation in tumor lysates was investigated by using the ferrozine assay and led to the result that GLV-1h68-infected tumors had the highest iron content. Histological stainings confirmed the finding that iron accumulation was not a direct result of the insertion of genes encoding iron-accumulating proteins in the virus genome. Furthermore virus-injected tumorous mice were analyzed using MRI technology. Two different measurements were performed, the first scan being done with a seven Tesla small animal scanner seven days post infection whereas the second scan was performed using a three Tesla human scanner 21 days after virus injection. Tumors of mice injected with the virus strains GLV-1h113 and GLV-1h184 were shown to exhibit shortened T2 and T2* relaxation times, which indicates enhanced iron accumulation. In conclusion, the experiments in this study suggest that the bacterioferritin-encoding virus strain GLV-1h113 and the magA-encoding virus strain GLV-1h184 are promising candidates to be used for cancer imaging after further analyzation and optimization.
Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy
(2010)
Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy.
Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-α-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden.
Cooperation is beneficial for social groups and is exemplified in its most sophisticated form in social insects. In particular, eusocial Hymenoptera, like ants and honey bees, exhibit a level of cooperation only rarely matched by other animals. To assure effective defense of group members, foes need to be recognized reliably. Ants use low-volatile, colony-specific profiles of cuticular hydrocarbons (colony odor) to discriminate colony members (nestmates) from foreign workers (non-nestmates). For colony recognition, it is assumed that multi-component colony odors are compared to a neuronal template, located in a so far unidentified part of the nervous system, where a mismatch results in aggression. Alternatively, a sensory filter in the periphery of the nervous system has been suggested to act as a template, causing specific anosmia to nestmate colony odor due to sensory adaptation and effectively blocking perception of nestmates. Colony odors are not stable, but change over time due to environmental influences. To adjust for this, the recognition system has to be constantly updated (template reformation). In this thesis, I provide evidence that template reformation can be induced artificially, by modifying the sensory experience of carpenter ants (Camponotus floridanus; Chapter 1). The results of the experiments showed that template reformation is a relatively slow process taking several hours and this contradicts the adaptation-based sensory filter hypothesis. This finding is supported by first in-vivo measurements describing the neuronal processes underlying template reformation (Chapter 5). Neurophysiological measurements were impeded at the beginning of this study by the lack of adequate technical means to present colony odors. In a behavioral assay, I showed that tactile interaction is not necessary for colony recognition, although colony odors are of very low volatility (Chapter 2). I developed a novel stimulation technique (dummy-delivered stimulation) and tested its suitability for neurophysiological experiments (Chapter 3). My experiments showed that dummy-delivered stimulation is especially advantageous for presentation of low-volatile odors. Colony odor concentration in headspace was further increased by moderately heating the dummies, and this allowed me to measure neuronal correlates of colony odors in the peripheral and the central nervous system using electroantennography and calcium imaging, respectively (Chapter 4). Nestmate and non-nestmate colony odor elicited strong neuronal responses in olfactory receptor neurons of the antenna and in the functional units of the first olfactory neuropile of the ant brain, the glomeruli of the antennal lobe (AL). My results show that ants are not anosmic to nestmate colony odor and this clearly invalidates the previously suggested sensory filter hypothesis. Advanced two-photon microscopy allowed me to investigate the neuronal representation of colony odors in different neuroanatomical compartments of the AL (Chapter 5). Although neuronal activity was distributed inhomogeneously, I did not find exclusive representation restricted to a single AL compartment. This result indicates that information about colony odors is processed in parallel, using the computational power of the whole AL network. In the AL, the patterns of glomerular activity (spatial activity patterns) were variable, even in response to repeated stimulation with the same colony odor (Chapter 4&5). This finding is surprising, as earlier studies indicated that spatial activity patterns in the AL reflect how an odor is perceived by an animal (odor quality). Under natural conditions, multi-component odors constitute varying and fluctuating stimuli, and most probably animals are generally faced with the problem that these elicit variable neuronal responses. Two-photon microscopy revealed that variability was higher in response to nestmate than to non-nestmate colony odor (Chapter 5), possibly reflecting plasticity of the AL network, which allows template reformation. Due to their high variability, spatial activity patterns in response to different colony odors were not sufficiently distinct to allow attribution of odor qualities like ‘friend’ or ‘foe’. This finding challenges our current notion of how odor quality of complex, multi-component odors is coded. Additional neuronal parameters, e.g. precise timing of neuronal activity, are most likely necessary to allow discrimination. The lower variability of activity patterns elicited by non-nestmate compared to nestmate colony odor might facilitate recognition of non-nestmates at the next level of the olfactory pathway. My research efforts made the colony recognition system accessible for direct neurophysiological investigations. My results show that ants can perceive their own nestmates. The neuronal representation of colony odors is distributed across AL compartments, indicating parallel processing. Surprisingly, the spatial activity patterns in response to colony are highly variable, raising the question how odor quality is coded in this system. The experimental advance presented in this thesis will be useful to gain further insights into how social insects discriminate friends and foes. Furthermore, my work will be beneficial for the research field of insect olfaction as colony recognition in social insects is an excellent model system to study the coding of odor quality and long-term memory mechanisms underlying recognition of complex, multi-component odors.
Biodiversity may be investigated and explored by the means of genetic sequence information and molecular phylogenetics. Yet, with ribosomal genes, information for phylogenetic studies may not only be retained from the primary sequence, but also from the secondary structure. Software that is able to cope with two dimensional data and designed to answer taxonomic questions has been recently developed and published as a new scientific pipeline. This thesis is concerned with expanding this pipeline by a tool that facialiates the annotation of a ribosomal region, namely the ITS2. We were also able to show that this states a crucial step for secondary structure phylogenetics and for data allocation of the ITS2-database. This resulting freely available tool determines high quality annotations. In a further study, the complete phylogenetic pipeline has been evaluated on a theoretical basis in a comprehensive simulation study. We were able to show that both, the accuracy and the robustness of phylogenetic trees are largely improved by the approach. The second major part of this thesis concentrates on case studies that applied this pipeline to resolve questions in taxonomy and ecology. We were able to determine several independent phylogenies within the green algae that further corroborate the idea that secondary structures improve the obtainable phylogenetic signal, but now from a biological perspective. This approach was applicable in studies on the species and genus level, but due to the conservation of the secondary structure also for investigations on the deeper level of taxonomy. An additional case study with blue butterflies indicates that this approach is not restricted to plants, but may also be used for metazoan phylogenies. The importance of high quality phylogenetic trees is indicated by two ecological studies that have been conducted. By integrating secondary structure phylogenetics, we were able to answer questions about the evolution of ant-plant interactions and of communities of bacteria residing on different plant tissues. Finally, we speculate how phylogenetic methods with RNA may be further enhanced by integration of the third dimension. This has been a speculative idea that was supplemented with a small phylogenetic example, however it shows that the great potential of structural phylogenetics has not been fully exploited yet. Altogether, this thesis comprises aspects of several different biological disciplines, which are evolutionary biology and biodiversity research, community and invasion ecology as well as molecular and structural biology. Further, it is complemented by statistical approaches and development of informatical software. All these different research areas are combined by the means of bioinformatics as the central connective link into one comprehensive thesis.
The human gut is home for thousands of microbes that are important for human life. As most of these cannot be cultivated, metagenomics is an important means to understand this important community. To perform comparative metagenomic analysis of the human gut microbiome, I have developed SMASH (Simple metagenomic analysis shell), a computational pipeline. SMASH can also be used to assemble and analyze single genomes, and has been successfully applied to the bacterium Mycoplasma pneumoniae and the fungus Chaetomium thermophilum. In the context of the MetaHIT (Metagenomics of the human intestinal tract) consortium our group is participating in, I used SMASH to validate the assembly and to estimate the assembly error rate of 576.7 Gb metagenome sequence obtained using Illumina Solexa technology from fecal DNA of 124 European individuals. I also estimated the completeness of the gene catalogue containing 3.3 million open reading frames obtained from these metagenomes. Finally, I used SMASH to analyze human gut metagenomes of 39 individuals from 6 countries encompassing a wide range of host properties such as age, body mass index and disease states. We find that the variation in the gut microbiome is not continuous but stratified into enterotypes. Enterotypes are complex host-microbial symbiotic states that are not explained by host properties, nutritional habits or possible technical biases. The concept of enterotypes might have far reaching implications, for example, to explain different responses to diet or drug intake. We also find several functional markers in the human gut microbiome that correlate with a number of host properties such as body mass index, highlighting the need for functional analysis and raising hopes for the application of microbial markers as diagnostic or even prognostic tools for microbiota-associated human disorders.
Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert.
BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.
Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist.
This thesis consists of three major chapters, each of which has been separately published or under the process for publication. The first chapter is about anatomical characterization of the mushroom body of adult Drosophila melanogaster. The mushroom body is the center for olfactory learning and many other functions in the insect brains. The functions of the mushroom body have been studied by utilizing the GAL4/UAS gene expression system. The present study characterized the expression patterns of the commonly used GAL4 drivers for the mushroom body intrinsic neurons, Kenyon cells. Thereby, we revealed the numerical composition of the different types of Kenyon cells and found one subtype of the Kenyon cells that have not been described. The second and third chapters together demonstrate that the multiple types of dopaminergic neurons mediate the aversive reinforcement signals to the mushroom body. They induce the parallel memory traces that constitute the different temporal domains of the aversive odor memory. In prior to these chapters, “General introduction and discussion” section reviews and discuss about the current understanding of neuronal circuit for olfactory learning in Drosophila.
Die zellulären Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorgänge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrität. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenitätsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie gehörenden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden über ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox“ führte. Damit können heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zunächst die Gene für die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminosäurereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kulturüberstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivität der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles“ (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes“ (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der Stämme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-Stämme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen lässt, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP für RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse bestätigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abhängig Membranporen-bedingte Zellschädigungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernfärbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembranschädigung / Zytotoxizität nachgewiesen werden, nicht aber mit den Stämmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verstärkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrität über Adhäsionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-Stämmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Schädigung der Zellschichtintegrität führt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unverändert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu können und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden Mäuse mit deletierten Genen für RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt.
Termites are the most important soil ecosystem engineers of semi‐arid and arid habitats. They enhance decomposition processes as well as the subsequent mineralisation of nutrients by bacteria and fungi. Through their construction of galleries, nests and mounds, they promote soil turnover and influence the distribution of nutrients and also alter texture and hydrological properties of soils, thereby affecting the heterogeneity of their ecosystem. The main aim of the present thesis was to define the impact of termites on ecosys‐tem functioning in a semi‐arid ecosystem. In a baseline study, I assessed the diversity of termite taxa in relation to the amount of precipitation, the vegetation patterns and the land use systems at several sites in Namibia. Subsequently, I focussed on a species that is highly abundant in many African savannas, the fungus growing and mound building species Macro‐termes michaelseni (Sjöstedt, 1914). I asked how this species influences the spatial hetero‐geneity of soil and vegetation patterns. From repeated samplings at 13 sites in Namibia, I obtained 17 termite taxa of 15 genera. While the type of land use seems to have a minor effect on the termite fauna, the mean annual precipitation explained 96% and the Simpson index of vascular plant diversity 81% of the variation in taxa diversity. The number of termite taxa increased with both of these explanation variables. In contrast to former studies on Macrotermes mounds in several regions of Africa that I reviewed, soil analyses from M. michaelseni mounds in the central Namibian savanna revealed that they contain much higher nitrogen contents when compared to their parent material. Further analyses revealed that nitrate forms a major component of the nitrogen content in termite mounds. As nitrate solves easily in water, evaporation processes are most probably responsible for the transport of solved nitrates to the mound surface and their accumulation there. The analysed mounds in central Namibia contained higher sand propor‐tions compared to the mounds of the former studies. Through the higher percentage of coarse and middle sized pores, water moves more easily in sandy soils compared to more clayey soils. In consequence, evaporation‐driven nitrate accumulation can occur in the studied mounds at high rates. Hochgerechnet auf den Gesamtumfang der Hügel bedeckte das pro Jahr von einem bewohnten Hügel erodierte Material theoretisch einen 1 m breiten Kreisring um den Schwemmkegel des Hügels 2,4 mm hoch. Der entsprechende Wert für unbewohnte Hügel betrug 1,0 mm. To assess the amount of soil that erodes from termite mounds, I fastened four strong, 65 cm wide plastic bags at 14 mounds each and collected the soil that eroded during five rainfall events. Projected to the total mound circumference, the amount of soil eroded covers theoretically a 1 m wide circular ring around the pediment of an inhabited mound up to a height of 2.4 mm per year. For uninhabited mounds, the height of this soil layer would be 1.0 mm. Per hectare, roughly 245 kg eroded per year from the mounds. However, as the erosion rate depends on several factors such as rainfall intensity, soil texture and point of time within the rainy season, this is only a vague estimate. In order to determine up to which distance the soil erosion from the mounds still influences the chemical characteristics of the adjacent topsoil, I took samples from depth of 0–10 cm at 1, 5 and 25 m distances, respectively, from four different mounds and from the mounds themselves. The non‐metric multidimensional scaling of the soil properties showed strong differences between mound and off‐mound samples. Soil characteristics within the samples from the mounds did not differ largely. Similarly, I found no strong differences between the samples taken from the different distances from the mound. From these results I conclude that through the construction of foraging galleries and sheetings (soil constructions with which some termite species cover their food items), the soil eroding from termite mounds is quickly mixed with deeper soil layers. In consequence, mound material does not accumulate in the mound’s vicinity. In order to reveal how plant growth is influenced by termite mound material, we assessed the number of grass and herb individuals as well as the biomass of plants growing in situ on the base of mounds compared to adjacent sites. While the numbers of both grass and herb individuals were significantly lower compared to adjacent sites, the total biomass of plants growing on the base of mounds was significantly higher. Reverse results were obtained by pot experiments with radish (Raphanus sativus subsp. sativus) and sorghum (Sorghum sp.) growth. Both species grew significantly weaker on mound soil compared to adjacent soil. The contradictory results concerning the biomass of in situ and pot experi‐ments are most probably caused by the disturbance of the original soil structure during the potting process. The material was subsequently compacted through watering the plants. In contrast, Macrotermes mounds are pervaded by many macropores which seem to be essential for the plant roots to penetrate the soil. In the last part of this thesis, I posed the question how mounds of M. michaelseni are distributed and what factors might be responsible for this pattern. Former studies showed that mound size is correlated with the size of its inhabiting colony. With several multi‐scale analyses, I revealed that larger inhabited mounds were regularly distributed. Additionally, mounds which were closer together tended to be smaller than on average. This indicates that intraspecific competition controls the distribution and size of colonies and their mounds. Former studies concerning Odontotermes mounds substantiated that they are local hotspots of primary productivity and animal abundance. Based on these findings, simulations revealed that a regular distribution of these mounds leads to a greater ecosystem‐wide productivity compared to a random arrangement. As in the present study, plant biomass was higher at the mounds compared to off‐mound sites, this might hold true for M. michaelseni mounds. From the results of this thesis, I draw the conclusion that through their mound building activities, M. michaelseni strongly influences the distribution patterns of soil nutrients within the central Namibian savanna. These termites create sharp contrasts in nutrient levels and vegetation patterns between mound soils and off‐mound soils and enhance the heterogeneity of their habitats. Former studies revealed that habitat hetero‐geneity is important in generating species diversity and species richness in turn is correlated positively with biomass production and positively affects ecosystem services. In conclusion, the present thesis underlines the importance of M. michaelseni for ecosystem functioning of the central Namibian savanna.
Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf.
Mapping Bushfire Distribution and Burn Severity in West Africa Using Remote Sensing Observations
(2010)
Fire has long been considered to be the main ecological factor explaining the origin and maintenance of West African savannas. It has a very high occurrence in these savannas due to high human pressure caused by strong demographic growth and, concomitantly, is used to transform natural savannas into farmland and is also used as a provider of energy. This study was carried out with the support of the BIOTA project funded by the German ministry for Research and Education. The objective of this study is to establish the spatial and temporal distribution of bushfires during a long observation period from 2000 to 2009 as well as to assess fire impact on vegetation through mapping of the burn severity; based on remote sensing and field data collections. Remote sensing was used for this study because of the advantages that it offers in collecting data for long time periods and on different scales. In this case, the Moderate Resolution Imaging Spectroradiometer (MODIS) satellite instrument at 1km resolution is used to assess active fires, and understand the seasonality of fire, its occurrence and its frequency within the vegetation types on a regional scale. Landsat ETM+ imagery at 30 m and field data collections were used to define the characteristics of burn severity related to the biomass loss on a local scale. At a regional scale, the occurrence of fires and rainfall per month correlated very well (R2 = 0.951, r = -0.878, P < 0.01), which shows that the lower the amount of rainfall, the higher the fire occurrence and vice versa. In the dry season, four fire seasons were determined on a regional scale, namely very early fires, which announce the beginning of the fires, early and late fires making up the peak of fire in December/January and very late fires showing the end of the fire season and the beginning of the rainy season. Considerable fire activity was shown to take place in the vegetation zones between the Forest and the Sahel areas. Within these zones, parts of the Sudano-Guinean and the Guinean zones showed a high pixel frequency, i.e. fires occurred in the same place in many years. This high pixel frequency was also found in most protected areas in these zones. As to the kinds of land cover affected by fire, the highest fire occurrence is observed within the Deciduous woodlands and Deciduous shrublands. Concerning the burn severity, which was observed at a local scale, field data correlated closely with the ΔNBR derived from Landsat scenes of Pendjari National Park (R2 = 0.76). The correlation coefficient according to Pearson is r = 0.84 and according to Spearman-Rho, the correlation coefficient is r = 0.86. Very low and low burn severity (with ΔNBR value from 0 to 0.40) affected the vegetation weakly (0-35 percent of biomass loss) whereas moderate and high burn severity greatly affected the vegetation, leading to up to 100 percent of biomass loss, with the ΔNBR value ranging from 0.41 to 0.99. It can be seen from these results that remotely sensed images offer a tool to determine the fire distribution over large regions in savannas and that the Normalised Burn Ratio index can be applied to West Africa savannas. The outcomes of this thesis will hopefully contribute to understanding and, eventually, improving fire regimes in West Africa and their response to climate change and changes in vegetation diversity.