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Sonstige beteiligte Institutionen
- Boston Children's Hospital (1)
- Center for Computational and Theoretical Biology (CCTB), Universität Würzburg (1)
- Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institue, Frederick (USA) (1)
- Fraunhofer IGB - Institutsteil Würzburg Translationszentrum Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankungen (1)
- Lehrstuhl für Chemie, Brooklyn College, City University of New York, Brooklyn (1)
- Lehrstuhl für Physiologische Chemie (1)
- Lehrstuhl für Translationale Onkologie (1)
- Siemens Corporate Technology, Erlangen (1)
- Technische Hochschule Wildau (1)
- Universitätsklinikum Düsseldorf, Institut für Toxikologie (1)
Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann.
1. Zusammenfassung Lösliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die “TNF homology domain” (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekundärem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekundärem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdomäne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekundärem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Moleküls enthält, die die THD von der Transmembrandomäne trennt, nach sekundärem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivität der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdomäne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDomäne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandomäne gewährleistet wird, könnte demnach für mTRAIL für eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion nötig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion für die Aktivität dieser Liganden hin und bietet die Möglichkeit, rekombinante lösliche Liganden der TNF-Familie mit erhöhter Aktivität zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann für die Behandlung von Tumorzellen nützlich sein. Es wurde jedoch kürzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorfördernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu schützt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabhängigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NFкB-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabhängig, die Aktivierung des NFкB- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabhängig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um mögliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.
Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen.
Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio-
¬molekülen unter physiologischen Bedingungen.
Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran-
¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff-
Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine.
Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert
werden.
Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin-
Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von
Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden.
In dieser Arbeit sollte die Funktion von RSK in Motoneuronen von Drosophila untersucht
werden. Mutationen im RSK2-Gen verursachen das Coffin-Lowry-Syndrom (CLS), das durch
mentale Retardierung charakterisiert ist. RSK2 ist hauptsächlich in Regionen des Gehirns
exprimiert, in denen Lernen und Gedächtnisbildung stattfinden. In Mäusen und Drosophila, die
als Modellorganismen für CLS dienen, konnten auf makroskopischer Ebene keine
Veränderungen in den Hirnstrukturen gefunden werden, dennoch wurden in verschiedenen
Verhaltensstudien Defekte im Lernen und der Gedächtnisbildung beobachtet.
Die synaptische Plastizität und die einhergehenden Veränderungen in den Eigenschaften der
Synapse sind fundamental für adaptives Verhalten. Zur Analyse der synaptischen Plastizität
eignet sich das neuromuskuläre System von Drosophila als Modell wegen des stereotypen
Innervierungsmusters und der Verwendung ionotroper Glutamatrezeptoren, deren
Untereinheiten homolog sind zu den Untereinheiten der Glutamatrezeptoren des AMPA-Typs
aus Säugern, die wesentlich für die Bildung von LTP im Hippocampus sind.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass RSK in den Motoneuronen von Drosophila an der
präsynaptischen Seite lokalisiert ist, wodurch RSK eine Synapsen-spezifische Funktion
ausüben könnte. Morphologische Untersuchungen der Struktur der neuromuskulären Synapsen
konnten aufzeigen, dass durch den Verlust von RSK die Größe der neuromuskulären Synapse,
der Boutons sowie der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder reduziert ist. Obwohl mehr
Boutons gebildet werden, sind weniger Aktive Zonen und Glutamatrezeptorfelder in der
neuromuskulären Synapse enthalten. RSK reguliert die synaptische Transmission, indem es die
postsynaptische Sensitivität, nicht aber die Freisetzung der Neurotransmitter an der
präsynaptischen Seite beeinflusst, obwohl in immunhistochemischen Analysen eine
postsynaptische Lokalisierung von RSK nicht nachgewiesen werden konnte. RSK ist demnach
an der Regulation der synaptischen Plastizität glutamaterger Synapsen beteiligt.
Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass aktiviertes
ERK an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist und diese synaptische Lokalisierung von RSK
reguliert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass durch den
Verlust von RSK hyperaktiviertes ERK in den Zellkörpern der Motoneurone vorliegt. RSK
wird durch den ERK/MAPK-Signalweg aktiviert und übernimmt eine Funktion sowohl als
Effektorkinase als auch in der Negativregulation des Signalwegs. Demnach dient RSK in den
Zellkörpern der Motoneurone als Negativregulator des ERK/MAPK-Signalwegs. Darüber
hinaus könnte RSK die Verteilung von aktivem ERK in den Subkompartimenten der
Motoneurone regulieren.
Da in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte, dass ERK an der Regulation der
synaptischen Plastizität beteiligt ist, indem es die Insertion der AMPA-Rezeptoren zur Bildung
der LTP reguliert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden, ob der Einfluss von RSK auf die
synaptische Plastizität durch seine Funktion als Negativregulator von ERK zustande kommt.
Untersuchungen der genetischen Interaktion von rsk und rolled, dem Homolog von ERK in
Drosophila, zeigten, dass die durch den Verlust von RSK beobachtete reduzierte Gesamtzahl
der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder der neuromuskulären Synapse auf die Funktion
von RSK als Negativregulator von ERK zurückzuführen ist. Die Größe der neuromuskulären
Synapse sowie die Größe der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder beeinflusst RSK
allerdings durch seine Funktion als Effektorkinase des ERK/MAPK-Signalwegs.
Studien des axonalen Transports von Mitochondrien zeigten, dass dieser in vielen
neuropathologischen Erkrankungen beeinträchtigt ist. Die durchgeführten Untersuchungen des
axonalen Transports in Motoneuronen konnten eine neue Funktion von RSK in der Regulation
des axonalen Transports aufdecken. In den Axonen der Motoneurone von RSK-Nullmutanten
wurden BRP- und CSP-Agglomerate nachgewiesen. RSK könnte an der Regulation des
axonalen Transports von präsynaptischem Material beteiligt sein. Durch den Verlust von RSK
wurden weniger Mitochondrien in anterograder Richtung entlang dem Axon transportiert, dafür verweilten mehr Mitochondrien in stationären Phasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass
auch der anterograde Transport von Mitochondrien durch den Verlust von RSK beeinträchtigt
ist.
Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist ein zentrales Enzym der NO/cGMP-Signalkaskade, das über die Aktivierung von NO zur Bildung des second messangers cGMP führt. Die NO-GC setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, sodass zwei Isoformen des Enzyms gebildet werden können (α1β1 und α2β1). Da die genaue Verteilung der beiden Isoformen im Colon nicht bekannt ist, wurde diese im ersten Teil dieser Arbeit charakterisiert. Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zeigten die Expression beider Isoformen sowohl in der glatten Muskelschicht als auch in der Submukosa und Lamina propria. Dabei war die α1β1-Isoform ubiquitär, die α2β1-Isoform dagegen hauptsächlich im Bereich des myenterischen Plexus vorzufinden.
In der glatten Muskelschicht des Colons ist die NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) sowie Fibroblasten-ähnliche Zellen (FLC) exprimiert und hauptsächlich in die Modulation der gastrointestinalen Motilität involviert. Zur spezifischen Charakterisierung der Funktion der NO-GC in den einzelnen Zelltypen wurden Knockout-Mäuse generiert, denen die NO-GC global (GCKO) oder spezifisch in SMC (SMC-GCKO), ICC (ICC-GCKO) oder beiden Zelltypen (SMC/ICC-GCKO) fehlt. Anhand dieser Mausmodelle sollten im zweiten Teil dieser Arbeit die modulatorischen Effekte der NO-GC auf die spontanen Kontraktionen des Colons bestimmt werden. Zur Charakterisierung der spontanen Kontraktionen der zirkulären Muskelschicht wurden Myographiestudien mit 2,5 mm langen Colonringen durchgeführt. Hierbei konnten drei verschiedene Kontraktionen gemessen werden: Kleine, hochfrequente Ripples, mittlere Kontraktionen und große Kontraktionen. Die detaillierte Analyse der einzelnen Kontraktionen zeigte einerseits eine NO-unabhängige Regulation der Ripples, andererseits eine NO-abhängige Modulation der mittleren und großen Kontraktionen über die NO-GC in SMC und ICC. Die NO-GC in SMC beeinflusst die Kontraktionen vermutlich vor allem über die Regulation des Muskeltonus der zirkulären Muskelschicht. Die NO-GC in ICC dagegen modifiziert die spontanen Kontraktionen möglicherweise über eine Veränderung der Schrittmacheraktivität. Allerdings führt erst ein Funktionsverlust des NO/cGMP-Signalweges in beiden Zelltypen zu einem sichtbar veränderten Kontraktionsmuster, das dem von globalen Knockout-Tieren glich. Dies weist auf eine kompensatorische Wirkung der NO-GC im jeweils anderen Zelltyp hin.
Zur Analyse der propulsiven Kontraktionen entlang des gesamten Colons wurden Videoaufnahmen der Darmbewegungen in Kontraktionsmusterkarten transformiert. Zudem wurde der Darm durchspült und die Ausflusstropfen aufgezeichnet, um die Effektivität der Kontraktionen beurteilen zu können. Hierbei zeigte sich, dass eine Beeinträchtigung des NO/cGMP-Signalweges eine verminderte Effektivität der Kontraktionen zur Folge hat und vermutlich durch eine beeinträchtige Synchronisation der Kontraktionen erklärt werden kann. In diesem Regulationsmechanismus konnte vor allem der NO-GC in SMC eine übergeordnete Rolle zugewiesen werden.
Der dritte Teil der Arbeit thematisierte den Befund, dass SMC-GCKO-Tiere ca. 5 Monate nach Tamoxifen-Behandlung Entartungen der Mukosa entwickelten. Diese Entartung war lediglich in Tamoxifen-induzierten Knockout-Tieren vorzufinden. Histologische Analysen identifizierten die Entartungen als tubulovillöses Adenom. Die Genexpressionsanalyse von Mukosafalten von SMC-GCKO- und heterozygoten Kontrolltieren zeigte eine Vielzahl von Genen, welche spezifisch bei colorectalem Karzinom differenziell exprimiert sind. Einer dieser Faktoren war der BMP-Antagonist Gremlin1. Dieser Faktor erschien von besonderem Interesse, da er in Zellen der Lamina muscularis mucosae und kryptennahen Myofibroblasten exprimiert wird. Immunhistochemische Analysen ließen vermuten, dass diese Zellen sowohl die NO-GC als auch die Cre-Rekombinase unter dem SMMHC-Promotor exprimieren. Diese Arbeit liefert demnach Hinweise darauf, dass die NO-GC einen wichtigen Regulator innerhalb der Stammzellnische bildet. Die Deletion der NO-GC führt vermutlich zu einer verstärkten Bildung bzw. Sekretion von Gremlin1, was die Homöostase der mukosalen Erneuerung stört und somit zur Entwicklung von Adenomen führt.
Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse.
Die Meiose ist eine besondere Art der Zellteilung, die während der Keimzellreifung stattfindet. Sie umfasst zwei aufeinander folgende Zellteilungen mit nur einer DNA-Repli-kationsrunde, wodurch aus einer diploiden Ausgangszelle vier haploide Gameten entstehen. In der ersten meiotischen Teilung werden die homologen Chromosomen miteinander rekombiniert und voneinander getrennt, in der Meiose II findet die Trennung der Schwesterchromatiden statt. Für den korrekten Ablauf dieser Prozesse musste sich eine spezielle molekulare Architektur des meiotischen Chromosoms entwickeln welche die Synapse der homologen Chromosomen durch den Synaptonemalkomplex (SC) beinhaltet. SCs sind evolutionär hochkonservierte, meiosespezifische Proteinkomplexe, die eine zentrale Bedeutung für Synapse, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen haben. Ein SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs), die den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert sind, einer zentralen Region (CR) und einem zentralen Element (CE). Eine Hauptstrukturkomponente der LEs in Vertebraten ist das Synaptonemalkomplexprotein, SYCP3. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP3 für die Zusammenlagerung der LE aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP3, exprimiert in somatischen Zellen, erforscht. In diesem experimentellen Ansatz polymerisierte SYCP3 autonom zu stabilen, höher geordneten, filamentösen Strukturen. Die „Coiled-Coil“-Domäne und die flankierenden, evolutionär konservierten Motive sind dabei notwenig, und nach Deletion des weniger konservierten N-terminalen Bereichs auch ausreichend für die Bildung der höher geordneten Strukturen. Der N-Terminus hingegen spielt eine Rolle in der Stabilität der Polymärstrukturen, welche durch Phosphorylierung zweier Serinreste im N-terminalen Bereich beeinflusst werden könnte. Obwohl die Struktur des SC in der Evolution hochkonserviert ist, sind die Protein-komponenten auf Aminosäuresequenzebene sehr unterschiedlich und weisen wenn überhaupt eine strukturelle Homologie in ihrer Domänenorganisation auf. Um den SC-Aufbau und dessen Funktion besser verstehen zu können, wurden die orthologen SC-Proteine zwischen taxonomisch entfernten Spezies Ratte und Medaka verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass trotz der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen die sich in den letzen 450 Millionen Jahren zwischen Fisch- und Säugern-SYCP3 akkumuliert haben, die Eigenschaften der Proteine vergleichbar sind, und das sie unter experimentellen Bedingungen miteinander interagieren und zu höher geordneten Strukturen kopolymerisieren können.
Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe.
Die Regulation der Genexpression steht am Anfang vieler zellbiologischer Prozesse wie beispielsweise dem Zellwachstum oder der Differenzierung. Gene werden an Promotoren transkribiert, wobei ein Promotor selbst aus vielen logischen Einheiten aufgebaut ist, den Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBSs). Diese können sehr nah beieinander liegen, aber auch weit entfernt voneinander sein. Sie werden spezifisch von Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden, die die Transkritptionsrate z.B. verstärken (Enhancer) oder schwächen (Silencer) können. Zwei oder mehr dieser TFBSs mit bestimmtem Abstand werden als "Module" zusammengefasst, die über Spezies hinweg konserviert sein können. Typischerweise findet man Module in Zellen mit einem Zellkern. Spezies mit gemeinsamen Modulen können ein Hinweis auf die gemeinsame phylogenetische Abstammung darstellen, aber auch gemeinsame Funktionsmechanismen von TFs über Gene hinweg aufdecken. Heutzutage sind verschiedene Anwendungen verfügbar, mit denen nach TFBSs in DNA gesucht werden kann. Zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit sind aber nur zwei kommerzielle Produkte bekannt, die nicht nur TFBSs, sondern auch Module erkennen. Deshalb stellen wir hier die freie und quelloffene Lösung "AIModules" vor, die diese Lücke füllt und einen Webservice zur Verfügung stellt, der es erlaubt nach TFBSs sowie nach Modulen auf DNA- und auf RNA-Abschnitten zu suchen. Für die Motivesuche werden entweder Matrizen aus der Jaspar Datenbank oder Matrizen vom Anwender verwendet. Darüberhinaus zeigen wir, dass unser Tool für die TF Suche nur Sekunden benötigt, wohingegen conTraV3 mindestens eine Stunde für dieselbe Analyse braucht. Zusätzlich kann der Anwender bei unserem Tool den Grad der Konserviertheit für TFs mit angeben und wir zeigen, dass wir mit unserer Lösung, die die Jaspar Datenbank heranzieht, mehr Module finden, als ein kommerziell verfügbares Produkt. Weiterhin kann mit unserer Lösung auch auf RNA-Sequenzen nach regulatorischen Motiven gesucht werden, wenn der Anwender die dafür nötigen Matrizen liefert. Wir zeigen dies am Beispiel von Polyadenylierungsstellen. Zusammenfassend stellen wir ein Werkzeug vor, das erstens frei und quelloffen ist und zweitens entweder auf Servern veröffentlicht werden kann oder On-Site auf einem Notebook läuft. Unser Tool erlaubt es Promotoren zu analysieren und nach konservierten Modulen sowie TFBSs in Genfamilien sowie nach regulatorischen Elementen in mRNA wie z.B. Polyadenylierungsstellen oder andere regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancern oder Silencern in genomischer DNA zu suchen.
Die Identifikation der Bindungsspezifitäten von Proteininteraktionsdomänen und damit letztlich auch die Fähigkeit potentielle Bindungspartner dieser in vivo vorherzusagen bildet ein grundlegendes Element für das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Domänen. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit solche Vorhersagen bezüglich der SH3-Domäne – als Beispiel für eine Proteininteraktionsdomäne – mithilfe von Support-Vector-Machines (SVMs) möglich sind, wenn diesen als Informationsquelle ausschließlich die innerhalb der Aminosäuresequenz der Domäne konservierten Informationen zur Verfügung stehen. Um den SVM-basierten Klassifikator zu trainieren und zu validieren, wurde ein Satz aus 51 SH3-Domänen verwendet, die zuvor entsprechend ihrer Ligandenpräferenz in ein System aus acht verschiedenen Klassen eingeteilt worden waren. Da die innerhalb der Aminosäuresequenzen konservierten Informationen in abstrakte Zahlenwerte konvertiert werden mussten (Voraussetzung für mathematisch basierte Klassifikatoren wie SVMs), wurde jede Aminosäuresequenz durch ihren jeweiligen Fisher-Score-Vektor ausgedrückt. Die Ergebnisse erbrachten einen Klassifikationserror, welcher weit unterhalb des Zufallsniveaus lag, was darauf hindeutet, dass sich die Bindungsspezifität (Klasse) einer SH3-Domäne in der Tat von seiner Aminosäuresequenz ableiten lassen dürfte. Mithilfe klassenspezifisch emittierter, artifizieller Sequenzen, implementiert in den Trainingsprozess des Klassifikators, um etwaigen nachteiligen Auswirkungen von Overfitting zu entgegenzuwirken, sowie durch Berücksichtigung taxonomischer Informationen des Klassensystems während Training und Validierung, ließ sich der Klassifikationserror sogar noch weiter senken und lag schließlich bei lediglich 35,29% (vergleiche Zufall: 7/8 = 87.50%). Auch die Nutzung von Feature Selections zur Abmilderung Overfitting-bedingter, negativer Effekte lieferte recht vielversprechende Ergebnisse, wenngleich ihr volles Potential aufgrund von Software-Beschränkungen nicht ausgenutzt werden konnte.
Die Analyse der Positionen im Sequence-Alignment, welche für den SVM- basierten Klassifikator am relevantesten waren, zeigte, dass diese häufig mit Positionen korrelierten, von denen angenommen wird auch in vivo eine Schlüsselrolle bei der Determination der Bindungsspezifität (Klasse) zu spielen. Dies unterstreicht nicht nur die Reliabilität des präsentierten Klassifikators, es gibt auch Grund zur Annahme, dass das Verfahren möglicherweise auch als Supplement anderer Ansätze genutzt werden könnte, welche zum Ziel haben die Positionen zu identifizieren, die die Ligandenpräferenz in vivo determinieren. Informationen, die nicht nur für ein besseres Verständnis der SH3-Domäne (und möglicherweise auch anderer Proteininteraktionsdomänen) von grundlegender Bedeutung sind, sondern auch aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse sein dürften.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005).
Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen.
Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter
Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist
über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER)
unter 150
· cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte
von mehr als 1500
· cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die
Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick
auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial
von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier
das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der
BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann.
Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten
Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren
Bedingungen bereitzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden
in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A)
zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit
Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen
TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die
Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt
wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten
Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente
NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs
für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt.
Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren,
wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs
und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen.
Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der
neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten
die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten
Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte
von bis zu 2500
· cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter
Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für
weiterführende Studien ausgewählt.
Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin,
Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller
Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.
Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von
FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die
BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung
der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit
Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt.
Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten:
Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac
werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie
Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen
wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer
Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt.
Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen
an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke
konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen
ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening
von Medikamenten denkbar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro-
Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die
Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse,
eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen
einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt.
Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten
eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung
genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen
und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen
zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden.
Volumenregulatorische Transportwege von anorganischen und organischen Osmolyten in Säugetierzellen
(2014)
Die Aufrechterhaltung des Zellvolumens unter variablen osmotischen Bedingungen stellt für nahezu alle tierischen Zellen eine essenzielle Aufgabe dar. Um regulatorische Volumenanpassungen vorzunehmen besitzen sie daher effektive Mechanismen, mit deren Hilfe der zelluläre Gehalt an organischen und anorganischen Osmolyten erhöht (= regulatorische Volumenzunahme; RVI) oder gesenkt (= regulatorische Volumenabnahme; RVD) werden kann. Trotz langjähriger Forschung auf diesem Gebiet konnten die hieran beteiligten Transportwege für Osmolyte bisher nur unvollständig aufgeklärt werden.
Insbesondere bei T-Lymphozyten sind wichtige Zellfunktionen wie die Proliferation, Migration und die T-Zell-Aktivierung eng mit volumenregulatorischen Mechanismen verbunden. Bei all diesen Prozessen sind u. a. unterschiedliche Kaliumkanäle beteiligt, die insbesondere für die pharmakologische Manipulation von Immunsystemprozessen von wissenschaftlichem Interesse sind. Bisherige Modelle der hypotonen Volumenregulation von T-Lymphozyten berücksichtigen lediglich den spannungsabhängigen KV1.3 sowie den Ca2+-aktivierten IKCa1-Kanal, die zur Klasse der 6TM/P-K+-Kanäle gehören.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine potentielle Rolle von kürzlich entdeckten Zwei-Poren Domänen Kaliumkanälen (K2P) am RVD von murinen und humanen primären CD4+-T-Lymphozyten untersucht. In einem kombinierten genetischen und pharmakologischen Ansatz mittels knockout-Tiermodellen und dem Einsatz kanalspezifischer Inhibitoren konnte mithilfe zellvolumetrischer Analysen gezeigt werden, dass die K2P-Vertreter TASK1, TASK2, TASK3 und TRESK maßgeblich am schwellungsaktivierten Efflux von K+ beteiligt sind. Beurteilt an den Ergebnissen dieser Untersuchung sind der spannungsabhängige TASK2- und der Ca2+-aktivierte TRESK-Kanal für die hypotone Volumenregulation in T-Zellen deutlich bedeutender als TASK1 und TASK3. Der Beitrag der Kanäle TASK2 und TRESK am RVD-Prozess war über dies vergleichbar mit dessen des bisher bekannten KV1.3-Kanals. In dieser Arbeit wurde damit erstmals eine Beteiligung der K2P-Kanäle am RVD muriner und humaner CD4+-Lymphozyten identifiziert. Aufgrund der engen Verbindung zwischen T-Zell-Funktion und der Volumenregulation können Zwei-Poren Domänen K+-Kanäle damit in den engeren Kreis potentieller immunmodulierende Angriffspunkte aufgefasst werden.
Im zweiten und umfangreicheren Teil dieser Arbeit wurden darüber hinaus die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte (small organic osmolytes; SOOs) untersucht. SOOs stellen chemisch inerte Verbindungen dar, zu denen vor allem Polyole (Sorbitol, myo-Inositol), Methylamine (Betain, α-Glycerophosphocholin) sowie Aminosäuren (α- bzw. β-Alanin und Prolin) und deren Derivate (Taurin) zählen. Da SOOs weder die zelluläre Struktur noch die Funktion von Makromolekülen beeinträchtigen, sind sie wichtige Instrumente der Volumenregulation, die sich in hohen Konzentrationen im Zytosol nahezu aller Zellen wiederfinden. Werden tierische Zellen mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, dann ist bei nahezu allen Zellen die Freisetzung organischer Osmolyte zu beobachten, wodurch die zelluläre Osmolarität unabhängig von Elektrolyten angepasst werden kann. Trotz der wichtigen Funktion der SOOs in der Osmoregulation tierischer Zellen konnte die molekulare Identität beteiligter Effluxwege (Kanäle bzw. Transporter) bisher nicht aufgeklärt werden.
Ungeachtet der molekularen Identität der SOO-Effluxwege war es aus zahlreichen biotechnologischen Anwendungen zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte eine größenselektive Permeabilität für eine Reihe monomerer Zucker und verwandter Verbindungen aufweisen. Um diese Größenselektivität näher zu charakterisieren, wurde im ersten Schritt die schwellungsaktivierte Membranpermeabilität für eine Reihe strukturell homogener Polyethylenglykole unterschiedlicher Polymerlänge (PEG200–1500; hydrodynamische Radien zwischen ~0,5-1,5 nm) unter iso- und hypotonen Bedingungen in Jurkat-Lymphozyten untersucht. Unter milden hypotonen Bedingungen (200 mOsm) war die Plasmamembran der untersuchten Lymphozyten für PEG300-1500 undurchlässig, was aus der Fähigkeit der Zellen zur hypotonen Volumenregulation geschlossen werden konnte. Darüber hinaus wurde RVD in stark hypotonen Lösungen (100 mOsm) mit PEG600-1500 beobachtet, während PEG300-400 unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen die Volumenregulation der Zellen inhibierten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass starkes hypotones Zellschwellen der Lymphozyten zur Permeabilisierung der Plasmamembran für PEG300-400, nicht jedoch für PEG600-1500, führt. Anhand der hydrodynamischen Radien Rh der verwendeten PEGs konnte ein cutoff-Radius von ~0,74 nm für schwellungsaktivierte Transportwege organischer Osmolyte bestimmt werden. Da diese schwellungsaktivierten Transportwege vielfältig für Zellbeladungstechniken verwendet werden, könnte dieses Ergebnis für zahlreiche biotechnologische und biomedizinische Anwendungen von Interesse sein.
Im zweiten Schritt wurde der Versuch unternommen, potentielle Transportwege für organische Osmolyte im RVD-Prozess molekular zu identifizieren. Da es grundlegend ungeklärt war, wie viele unterschiedliche Transporter bzw. Kanäle am Efflux der zahlreichen organischen Osmolyte beteiligt sind, erfolgte zunächst die vergleichende Analyse des schwellungsaktivierten Membrantransports strukturell verschiedener SOOs einschließlich der Aminosulfonsäure Taurin und des Polyols myo-Inositol. Hierbei wurde erstmals gezeigt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für Taurin und myo-Inositol deutlich unterschiedliche Aktivitätsprofile aufweisen. Während der Taurintransport bereits unter milden hypotonen Bedingungen, d.h. nach einer geringen Absenkung der Osmolalität von 300 auf ~230 mOsm, aktiviert wurde, erfolgte die Aktivierung der Membranpermeabilität für myo-Inositol bei einer viel niedrigeren Osmolalität von ~150 mOsm. Darüber hinaus wiesen die beiden Transportwege unter vergleichbarem hypotonen Stress von 100 mOsm deutlich unterschiedliche Aktivitätsdauern auf (Transport von Taurin ~95 min und myo-Inositol ~40 min). Somit deuteten diese Ergebnisse erstmals auf substrat-spezifische Transportwege für SOOs hin, die voneinander stark abweichende osmotische Aktivierungsprofile besitzen.
Als aussichtsreiche Kandidaten für diese Transportwege wurden zwei Mitglieder der Gruppe der Solute Carrier (SLC) untersucht, die klare Übereinstimmungen mit den gesuchten Transportern für SOOs aufweisen. Daher wurde im Weiteren eine RVD-Beteiligung dieser Transportergruppe mit einer Kombination aus molekularbiologischer und konventioneller bzw. hochaufgelöster mikroskopischen Techniken überprüft. Die semiqantitativen RT-PCR-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dabei, dass die Gentranskription der potentiellen SOO-Transporter SLC5A3 und SLC6A6 in den untersuchten Zelllinien Jurkat, HEK wie auch HepG2-Zellen durch hypotone Bedingungen deutlich verstärkt wird. Hierbei nimmt der zelluläre mRNA-Gehalt der Gene SLC5A3 zwischen 20-60% und SLC6A6 um 30-100% innerhalb von 10-20 min zu, was auf eine potentielle RVD-Beteiligung von SLC-Transportern hindeutet. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde daraufhin die zelluläre Lokalisation des SLC5A3-Transporters unter isotonen und hypotonen Bedingungen mikroskopisch untersucht. Wie anhand der konfokalen lasermikroskopischen Untersuchung zu erkennen ist, findet unter hypotoner Stimulation eine zelluläre Umverteilung des mit EGFP fluoreszenzmarkierten Proteins SLC5A3 statt. Innerhalb von 10 min wird der Transporter dabei von intrazellulären Regionen in Richtung Plasmamembran verlagert. Darüber hinaus konnte mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Technik dSTORM gezeigt werden, dass der Transporter SLC5A3 unter hypotoner Stimulation verstärkt mit der Plasmamembran assoziiert vorliegt. Diese verstärkte Membranassoziation des SLC5A3-Proteins deutet damit auf einen schwellungsinduzierten exozytotischen Einbau des Transporters hin.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit erstmals, dass SLC-Transporter wie SLC5A3, SLC6A6 und vermutlich andere Vertreter der SLC-Superfamilie potentiell am Mechanismus der hypotonen Volumenregulation beteiligt sind. Da SLC-Transporter als wichtige Transportsysteme für Therapeutika angesehen werden und die Mechanismen der Volumenregulation bereits in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen implementiert sind, könnte der hier aufgedeckte Zusammenhang einen Erkenntnisgewinn für zahlreiche biomedizinische Forschungsgebiete darstellen.
No abstract available.
Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen für Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenitätsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenitätsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Domínguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die größtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. Für die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in ähnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Domínguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch für L. ivanovii sind. Für die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies führte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde für fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abhängig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene während einer Infektion differentiell transkribiert werden und möglicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames bestätigte, dass diese Gene PrfA-unabhängig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene läßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abhängigkeit der Genexpression. Es konnte bestätigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verstärkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene.
Im Katabolismus methylverzweigter Fettsäuren spielt die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase eine wichtige Rolle, indem sie die (R)- und (S)-Isomere von alpha-methylverzweigten Fettsäuren als Coenzym A Thioester racemisiert. Methylverzweigte Fettsäuren entstehen beim Abbau von Isoprenoiden und werden darüber hinaus auch von vielen Organismen, wie z.B. Mycobakterien, synthetisiert. Die Hauptaufgabe der Racemase ist aber vermutlich in der Biosynthese von Gallensäuren zu sehen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase aus humanem Gewebe zu reinigen und zu charakterisieren sowie ihre physiologische Rolle im Katabolismus verzweigtkettiger Fettsäuren und der Gallensäurebiosynthese zu untersuchen. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase wurde aus humanem Gewebe zur Homogenität gereinigt, umfassend biochemisch charakterisiert und zur genauen molekularbiologischen Analyse in E.coli kloniert. Die Aktivität der Racemase wurde anhand der [³H]H2O-Freisetzung aus [alpha-³H]-a-Methylacyl-CoAs bestimmt. Die humane Racemase ist in der aktiven Form ein monomeres Protein und besteht aus 382 Aminosäuren. Als Substrate akzeptiert das Enzym ein breites Spektrum von alpha-Methylacyl-CoAs. Neben den Coenzym A-Thioestern alpha-methylverzweigter Fettsäuren, wie Pristansäure, werden auch CoA-Ester von Steroidderivaten, z.B. des Gallensäureintermediats Trihydroxycoprostansäure, und aromatischen Phenylpropionsäuren, wie dem Analgetikum Ibuprofen, umgesetzt. Freie Fettsäuren, geradkettige oder beta-methylverzweigte Acyl-CoAs werden nicht racemisiert. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase ist im Menschen zu ca. 80 Prozent auf die Peroxisomen und ca. 20 Prozent auf die Mitochondrien verteilt, wobei entsprechende peroxisomale (PTS 1) und mitochondriale (MTS) Transportsignale die Lokalisation bestimmen. Die vollständige cDNA-Sequenz der humanen a-Methylacyl-CoA-Racemase hat eine Gesamtlänge von 2039 Basenpaaren mit einem offenen Leseraster von 89 - 1237 bp. Das Startcodon ATG ist in eine klassische Kozak-Sequenz zum Translationsstart eingebettet. Die Protein endet am C-Terminus mit dem Sequenzmotiv –KASL, das dem peroxisomalen Transportsignal (PTS I) einiger Säugetierkatalasen entspricht. Aufgrund alternativer Polyadenylierung sind in allen untersuchten menschlichen Geweben Transkripte von 1,6 kb bzw. 2,0 kb zu finden. Es liegt keine gewebsabhängige Polyadenylierung vor, die Racemase wird aber gewebsspezifisch exprimiert (besonders stark in Leber und Niere). Das humane Racemasegen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 5 nahe am Centromer (5p1.3), im Intervall von D5S651 (46,6 cM) und D5S634 (59.9 cM).