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ResearcherID
- D-1221-2009 (1)
- J-8841-2015 (1)
- N-2030-2015 (1)
Originally renowned for their spectacular epigaeic raids, army ants have captured scientific attention for almost two centuries. They now belong to one of the best studied group of ants. However, most of our knowledge about army ants was derived from the study of the minority of specialized, epigaeicly active species. These species evolved probably rather recently from hypogaeic ancestors. The majority of army ant species still leads a hypogaeic life and is almost completely unknown in its entire sociobiology. It thus remained speculative, whether the assumed 'general' characteristics of army ants represent an adaptation to epigaeic activity or apply also to the majority of hypogaeic species. Based on the recent observation that the hypogaeic Asian army ant Dorylus (Dichthadia) laevigatus recruits predictably to palm oil baits, I developed and tested an oil-baiting method for the study of hypogaeic (army)ants. Prior to my study, nothing was known about the sociobiology of the assumed rare D. laevigatus. Throughout my work, I showed D. laevigatus to be very common and abundant in a wide range of habitats in West-Malaysia and on Borneo. Investigating its foraging behavior, I revealed D. laevigatus to differ from epigaeicly active species in several ways. Never demonstrated for any of the epigaeic species, D. laevigatus established stable trunk trail systems. Such a trail system contradicted the perception of army ant foraging, which was believed to be characterized by raids with constantly alternating trail directions. The trunk trail system further enabled a near omnipresence of D. laevigatus within its foraging area, which was also believed to be atypical for an army ant. Raids differed in structure and composition of participating workers from those of epigaeic species. Also, bulky food sources could be exploited over long periods of time. The foraging system of D. laevigatus resembled in several ways that of e.g. leaf-cutter and harvester ants. Likewise contrary to the assumptions, D. laevigatus had a wide food spectrum and showed only little effect on local arthropod communities, even falling itself prey to other ants. Strong aggressive behavior was observed only towards ant species with similar lifestyles, enabling me to provide the first detailed documentation of interspecific fights between two sympatric Dorylus species. Similar to foraging habits or ecological impact, nothing was known about colony size and composition, nesting habits, or worker polymorphism for D. laevigatus or any other hypogaeic Dorylus species prior to my work. By observing and eventually excavating a colony, I showed D. laevigatus to have a much smaller colony size and to lack the large sized workers of epigaeic Dorylus species. Similar to epigaeic Dorylinae, I showed D. laevigatus to have a non-phasic brood production, to emigrate rarely, and to alter its nest form along with habitat conditions. Detailed morphological and geographical descriptions give an impression of the Asian Dorylus species and are expected to aid other researchers in the difficult species identification. The genetic analysis of a male collected at a light trap demonstrated its relation to D. laevigatus. Confirming the male and queen associations, D. laevigatus is now one of five Dorylus species (out of a total of 61), for which all castes are known. In cooperation with D. Kistner, I provide a morphological and taxonomical description of nine Coleopteran beetles associated with D. laevigatus. Behavioral observations indicated the degree of their integration into the colony. The taxonomic position of the beetles further indicated that D. laevigatus emigrated from Africa to Asia, and was accompanied by the majority of associated beetles. The diversity of D. laevigatus guests, which included a number of unidentified mites, was rather low compared to that of epigaeic species. Overall, I demonstrated the developed baiting containers to effectively enable the study of hypogaeic ants. I showed several other hypogaeic ant species to be undersampled by other methods. Furthermore, the method enabled me to documented a second hypogaeic Dorylus species on Borneo. A detailed description of this species' morphology, ecology, and interactions with D. laevigatus is provided. My study indicated D. laevigatus to be an ecologically important species, able to influence soil structure and organisms of tropical regions in many ways. Relating the observed traits of D. laevigatus to epigaeicly active species, I conclude that our assumption of 'general' army ant behavior is erroneous in several aspects and needs to be changed. The oil-baiting method finally provides a tool enabling the location and study of hypogaeic (army)ant species. This opens a broad field for future studies on this cryptic but nonetheless important group of ants.
The number of males in animal groups is an essential determinant of male and female reproductive strategies. Females may benefit from living with several males, whereas males generally strive to monopolize a group of females. Due to male intrasexual competition, the sex ratio of groups of anthropoid primates is generally female-biased. Gregarious Malagasy lemurs deviate from theoretical expectations derived from sexual selection theory and from patterns found among anthropoids because they live in relatively small groups with an even or male-biased adult sex ratio and lack sexual dimorphism. The aim of this thesis was to investigate sex-specific reproductive strategies relating to the unusual group composition of redfronted lemurs (Eulemur fulvus rufus) by combining behavioral, demographic and endocrinological data. In the first of a set of four studies I investigated the applicability of non-invasive endocrine measurements for monitoring ovarian function in wild redfronted lemur females in order to evaluate the degree of estrus synchrony. Further, I tested the prediction that males living in multi-male groups rely on indirect mechanisms of intrasexual competition, such as physiological suppression of testicular function. Several possible benefits gained from living with many males have been proposed and the hypothesis that additional males improve social thermoregulation was tested in the third study. Finally, I examined the proximate determinants of the unusual sex ratio within groups, the variation in the adult sex ratio as well as possible social benefits of the high number of males for both sexes. The study was conducted in Kirindy Forest, Madagascar, between April 1999 and July 2000. I recorded >3000 hours of focal animal data on social and sexual behavior of all adult members of five groups. Additionally, >2200 fecal samples of males and females were collected for subsequent hormone analysis using enzymeimmunoassay (EIA). Further, I analyzed demographic data from seven Eulemur fulvus rufus groups collected between 1996 and 2002. The analyses of fecal estrogen and progestogen excretion in wild and captive females revealed that monitoring ovarian function is principally possible in redfronted lemurs, as demonstrated by the analysis of samples from captive females. Characterization of ovarian cycles in wild females, however, was not possible, because of a high day-to-day variability in excreted hormones. Nevertheless, the study provided reliable information on gestation and cycle length as well as endocrine changes associated with gestation. Additionally, I established a method for prenatal sex determination using maternal fecal samples collected during late gestation. The excretion pattern of androgens in samples of males revealed no differences between dominant and subordinate males, indicating that dominant males did not suppress the endocrine function of subordinate rivals. High frequencies of matings in combination with large testes size suggest that male reproductive competition relies at least partly on sperm competition. Females did not benefit from the high number of males in their groups in terms of improved thermoregulation because surplus males did not participate frequently in huddling groups with females. Analysis of the demographic data revealed that birth and mortality rates were not sex-biased and that males migrated considerably more frequently than females, providing no proximate explanation for the unusual sex ratio. Females in this study may proximately regulate group composition by synchronizing their fertile periods, which were inferred indirectly from the temporal distribution of births within groups. Both males and females benefit from the high number of co-resident males because reduced male group size seemed to be the main predictor of take-over rate, and thus, infanticide risk. The results of these studies suggest that certain life history traits (fast maturation, short inter-birth intervals) may ultimately determine the high number of males and the lack of single-male groups seen in redfronted lemurs. An accelerated male life history may facilitate joint group transfers and take-overs of male coalitions without a transitional time outside bisexual groups. Because males and females both benefit from a high number of males the conflict of interests between the sexes is considerably defused.
The first goal of this study was to develop cell lines with a stable expression of bio-fluorescent topo II and topo I. This was successfully achieved using a bicistronic vector system. Control experiments showed that proteins of expected size were expressed, and that GFP-tagged topos I, IIa, and IIb were active in the cells and fully integrated in the endogenous pools of the enzymes. These cell-lines provided a novel tool for investigating the cell biology of human DNA topoisomerases. Our most important finding was, that both types of mammalian topoisomerases are entirely mobile proteins that are in continuous and rapid flux between all compartments of the nucleus and between the cytososl and the chromosomes of mitotic cells. This was particularly surprising with regard to topo II, which is considered to be a structural component of the nuclear matrix and the chromosome scaffold. We must conclude that if this was the case, then these architectural structures appear to be much more dynamic than believed until now. In this context it should also be mentioned, that the alignment of topo II with the central axes of the chromosome arms, which has until now been considered a hall-mark of the enzyme’s association with the chromosomal scaffold, is not seen in vivo and can be demonstrated to be to some extent an artefact of immunohistochemistry. Furthermore, we show that the two isoforms of topo II (a and b) have a different localisation during mitotic cell division, supporting the general concept that topo II functions at mitosis are exclusively assigned to the a-form, whereas at interphase the two isoenzymes work in concert. Despite unrestricted mobility within the entire nuclear space, topoisomerases I and II impose as mostly nucleolar proteins. We show that this is due to the fact that in the nucleoli they are moving slower than in the nucleoplasm. The decreased nucleolar mobility cannot be due to DNA-interactions, because compounds that fix topoisomerases to the DNA deplete them from the nucleoli. Interestingly, the subnucleolar distribution of topoisomerases I and II was complementary. The type II enzyme filled the entire nucleolar space, but excluded the fibrial centers, whereas topo I accumulated at the fibrial centers, an allocation directed by the enzyme’s N-terminus. During mitosis, it also mediates association with the nucleolar organising regions of the acrocentric chromosomes. Thus, topo I stays associated with the rDNA during the entire cell-cycle and consistently colocalizes there with RNA-polymerase I. Finally, we show that certain cancer drugs believed to act by stabilising covalent catalytic DNA-intermediates of topoisomerases, do indeed immobilize the enzymes in living cells. Interestingly, these drugs do not target topoisomerases in the nucleoli but only in the nucleoplasm.
Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy.
Virulenz-attenuierte Bakterien sind geeignete Vektoren für den Transport von Vakzine-DNA in das Zytosol von Antigen-präsentierenden Zellen ("DNA delivery"). In dieser Arbeit wurde dazu das intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes verwendet, welches sich im Zytosol von Zellen vermehrt und fortbewegt. Ausgestattet mit einer intrazellulären Lysis-Kassette kann Listeria in vitro effektiv Plasmid-DNA in das Zytosol verschiedener Zelltypen freisetzen. Zur Virulenz-Attenuierung wurde das Gen iap im Chromosom des Bakteriums deletiert. Der daraus resultierte Stamm, in Folgenden als iap bezeichnet, erwies sich als hoch attenuiert im Modell der murinen Listeriose. Diese Attenuation konnte auf einen Defekt in der Beweglichkeit der Bakterien innerhalb von Wirtszellen zurückgeführt werden, da sich bei diesem Stamm das Protein ActA, das essentiell für die Aktin-basierte Motilität von L. monocytogenes ist, fehlerhaft auf der Oberfläche der Bakterien anordnet. Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass iap in der Zellteilung beeinträchtigt ist und deshalb eine veränderte Morphologie aufweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein so genanntes "Balanced-lethal" System etabliert. Dazu wurde das essentielle Gens trpS im Chromosom deletiert, während gleichzeitig eine trpS-Expressions-Kassette auf einem Vakzine-Plasmid inseriert wurde. Dieses System gewährleistet, dass das Trägerbakterium dieses Plasmid weder in vitro noch in vivo verliert. Dies ist besonders wichtig im Hinblick auf eine bakteriolytische Lysis-Kassette, welche ebenfalls auf diesem Plasmid kodiert ist. Es wurden verschiedene Lysis-Kassetten, die alle aus einem Listeria-spezifischen Phagenlysin und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor zusammengesetzt waren, miteinander verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass die für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen wirksamste Phagenlysin-Kassette (PactA-ply118) die Bakterien in vitro nur partial abtötet, während sie in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führt. Unter Verwendung dieses "DNA delivery" Systems wurden Mäuse oral mit Listerien infiziert, die ein DNA-Vakzine-Plasmid zur Expression des Leishmania Antigens KMP-11 trugen. Dabei konnte bei 27 % aller Tiere, die zweimal mit diesen Listerien infiziert worden sind, eine KMP-11 spezifische, proliferative Immunantwort gemessen werden. Listerien, die einen Defekt in ihrer Motilität besitzen (delta-iap, delta-actA), erwiesen sich darin beeinträchtigt, Plasmid-DNA im Zytosol von Zellen freizusetzen. Anhand dieser Stämme konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit von L. monocytogenes, sich innerhalb von Zellen zu bewegen und in benachbarte Zellen einzudringen eine wichtige Voraussetzung für einen effizienten Transfer von Plasmid-DNA in vitro darstellt.
Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher größten überzähligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies ermöglichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergewöhnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen über die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie könnte zukünftig auch auf andere Länder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzbänderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergewöhnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und spät replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten hauptsächlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv über die beiden Arme der überzähligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven überzähligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information über B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie für die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution überzähliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des größten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten überzähligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms, allerdings unter Tötung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation über das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest“) vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, können so schnell und zuverlässig auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch künftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der überzähligen Chromosomen auf die nächste Generation zu studieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden Fusionsprodukte aus verschiedenen nukleolären Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen (GFP und dsRed: rot fluoreszierendes Protein) in lebenden Zellen von Säugern und Xenopus laevis exprimiert und lokalisiert. Dadurch standen "Marker" für die drei Hauptkomponenten des Nukleolus zur Verfügung. Die dynamischen Eigenschaften dieser Fusionsproteine wurden quantitativ mit Hilfe von "Photobleaching"-Experimenten analysiert (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). Im einzelnen wurde durch die Untersuchung von RNA-Polymerase I der rDNA Transkriptionsort im fibrillären Zentrum des Nukleolus bestätigt. Die kinetischen Analysen von zwei pol I-Untereinheiten (RPA194 und RPA53) durch FRAP in transkriptionell aktiven und inaktiven Nukleoli erlaubten direkte Rückschlüsse auf die Transkriptionsdauer der rRNA-Gene in vivo. Die individuellen pol I-Untereinheiten bewegen sich rasch zwischen Nukleoplasma und Nukleolus und interagieren in den fibrillären Zentren mit dem rDNA-Promoter. Dann werden sie in produktive Transkriptionskomplexe integriert, die während der Elongationsphase, die bei Raumtemperatur etwa fünf Minuten dauert, stabil bleiben und erst nach der Termination dissoziieren. Zumindest ein Teil der Untereinheiten wandert anschließend in das Nukleoplasma. Die Ergebnisse widersprechen Modellen, welche die dichte fibrilläre Komponente als Transkriptionsort ansehen oder immobile RNA Polymerase I-Moleküle postulieren. Die Identifizierung des fibrillären Zentrums als rDNA-Transkriptionsort wurde durch die Koexpression der pol I-Untereinheiten mit Fibrillarin, einem Leitprotein der dichten fibrillären Komponente, ermöglicht. Durch die Expression der beiden Proteine als unterschiedlich fluoreszierende Fusionsproteine konnten die Orte der Transkription (die fibrillären Zentren) und die Orte der ersten Prozessierungsschritte, an denen Fibrillarin beteiligt ist (die dichte fibrilläre Komponente), in lebenden Zellen als direkt benachbarte, aber räumlich getrennte Kompartimente identifiziert werden. Die Rolle der granulären Komponente als Ort späterer Prozessierungschritte und Integration ribosomaler Proteine wurde durch die Expression von B23 und der ribosomalen Proteine L4, L5 und L10 verdeutlicht. Dabei wurde die nukleoläre Lokalisation von L10 erstmals belegt. In der Literatur wurde bisher angenommen, L10 würde erst im Cytoplasma mit Ribosomen assoziieren. Dies ist nicht der Fall, wie insbesondere Experimente mit Leptomycin B gezeigt haben. Diese Droge hemmt den CRM1-abhängigen Kernexport und führte zu einer deutlichen Akkumulation von L10-haltigen Präribosomen im Nukleoplasma von menschlichen Zellen. Schließlich sollte ein neues nukleoläres Protein von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, das mit verschiedenen Antikörpern in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert wurde. Durch massenspektrometrische Analysen nach zweidimensionaler Gelelektrophorese wurden die Antigene überraschenderweise als Cytokeratin-Homologe identifiziert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden drei bisher unveröffentlichte Cytokeratin 19 Isoformen von Xenopus kloniert, sequenziert und als GFP-Fusionsproteine exprimiert. Diese wurden allerdings wie reguläre Cytokeratine in cytoplasmatische Intermediärfilamente integriert und konnten, auch nach Translokation in den Zellkern durch ein experimentell eingefügtes Lokalisationssignal, nicht im Nukleolus nachgewiesen werden. Nach der Kotransfektion mit verschiedenen Zellkern-Proteinen wurde Cytokeratin 19 mit diesen in den Zellkern und mit nukleolären Proteinen in den Nukleolus transportiert. Obwohl diese Versuche auf einen "Huckepack"-Transportmechanismus für ein normalerweise cytoplasmatisches Protein hinweisen, konnte Cytokeratin 19 nicht spezifisch in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert werden. Daher konnte bisher, trotz intensiver Bemühungen, die Identität des in der Immunfluoreszenz nachgewiesenen nukleolären Proteins leider nicht aufgeklärt werden.
Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a multifunctional cytokine that is engaged in regulating versatile cellular processes that are pivotal for development and homeostasis of most tissues in multicellular organisms. TGF-ß signal transduction is initially propagated by binding of TGF-ß to transmembrane serine/threonine kinase receptors, designated TßRI and TßRII. Upon activation, the receptors phosphorylate Smad proteins which serve as downstream mediators that enter the nucleus and finally trigger transcriptional responses of specific genes. During the past years, it became evident that signaling cascades do not proceed in a linear fashion but rather represent a complex network of numerous pathways that mutually influence each other. Along these lines, members of the TGF-ß superfamily are attributed to synergize with neurotrophins. Together, they mediate neurotrophic effects in different populations of the nervous system, suggesting that an interdependence exists between TGF-ßs on the one hand and neurotrophins on the other. In the present work, the crosstalk of NGF and TGF-ß/Smad signaling pathways is characterized in rat pheochromocytoma cells (PC12) which are frequently used as a model system for neuronal differentiation. PC12 cells were found to be unresponsive to TGF-ß due to limiting levels of TßRII. However, stimulation with NGF results in initiation of Smad-mediated transcription independent of TGF-ß. Binding of NGF to functional TrkA receptors triggers activation of Smad3. This NGF-dependent Smad activation occurs by a mechanism which is different from being induced by TGF-ß receptors in that it provokes a different phosphorylation pattern of R-Smads. Together with an inferior role of TßRI, Smad3 is proposed to serve as a substrate for cellular kinases other than TßRI. Based on the presented involvement of components of both, the MAPK/Erk and the TAK1/MKK6 cascade, signal mediators of these pathways rank as candidates to mediate direct activation of Smad3. Smad3 is subsequently translocated to the nucleus and activates transcription in a Smad4-dependent manner. Negative regulation is provided by Smad7 which was found to act as a potent inhibitor of Smad signaling not only in TGF-ß- but also in NGF-mediated cascades. The potential of NGF to activate the Smad pathway independent of TGF-ß might be of special importance in regulating expression of genes that are essential for the development and function of neuronal cells or of other NGF-sensitive cells, in particular those which are TGF-ß-resistant.
Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden.
Characterization of memories and ignorant (S6KII) mutants in operant conditioning in the heat-box
(2002)
Learning and memory processes of operant conditioning in the heat-box were analysed. Age, sex, and larval desity were not critical parameters influencing memory, while low or high activity levels of flies were negatively correlated with their performance. In a search for conditioning parameters leading to high retention scores, intermittent training was shown to give better results than continuous training. As the memory test is the immediate continuation of the conditioning phase just omitting reinforcement, we obtain a memory which consists of two components: a spatial preference for one side of the chamber and a stay-where-you-are effect in which the side preference is contaminated by the persistence of heat avoidance. Intermittent training strengthens the latter. In the next part, memory retention was investigated. Flies were trained in one chamber and tested in a second one after a brief reminder training. With this direct transfer, memory scores reflect an associative learning process in the first chamber. To investigate memory retention after extended time periods, indirect transfer experiments were performed. The fly was transferred to a different environment between training and test phases. With this procedure an after-effect of the training was still observed two hours later. Surprisingly, exposure to the chamber without conditioning also lead to a memory effect in the indirect transfer experiment. This exposure effect revealed a dispositional change that facilitates operant learning during the reminder training. The various memory effects are independent of the mushroom bodies. The transfer experiments and yoked controls proved that the heat-box records an associative memory. Even two hours after the operant conditioning procedure, the fly remembers that its position in the chamber controls temperature. The cAMP signaling cascade is involved in heat-box learning. Thus, amnesiac, rutabaga, and dunce mutants have an impaired learning / memory. Searching for, yet unknown, genes and signaling cascades involved in operant conditioning, a Drosophila melanogaster mutant screen with 1221 viable X-chromosome P-element lines was performed. 29 lines with consistently reduced heat avoidance/ learning or memory scores were isolated. Among those, three lines have the p[lacW] located in the amnesiac ORF, confirming that with the chosen candidate criteria the heat-box is a useful tool to screen for learning and /or memory mutants. The mutant line ignP1 (8522), which is defective in the gene encoding p90 ribosomal S6 kinase (S6KII), was investigated. The P-insertion of line ignP1 is the first Drosophila mutation in the ignorant (S6KII) gene. It has the transposon inserted in the first exon. Mutant males are characterized by low training performance, while females perform well in the standard experiment. Several deletion mutants of the ignorant gene have been generated. In precise jumpouts the phenotype was reverted. Imprecise jumpouts with a partial loss of the coding region were defective in operant conditioning. Surprisingly, null mutants showed wild-type behavior. This might indicate an indirect effect of the mutated ignorant gene on learning processes. In classical odor avoidance conditioning, ignorant null mutants showed a defect in the 3-min, 30-min, and 3-hr memory, while the precise jumpout of the transposon resulted in a reversion of the behavioral phenotype. Deviating results from operant and classical conditioning indicate different roles for S6KII in the two types of learning.
Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein.
Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens führt jedoch zu einem sehr frühen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare Körperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und Rückenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisläsion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unverändert. In vitro zeigte sich jedoch eine erhöhte Resitenz von Motoneuronen gegenüber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verzögerung einer späten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der größten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in Mäusen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings hängt das Cre/loxP System von der Verfügbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und –kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in Körnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebellären Purkinje-, aber nicht Körnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 für das Überleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente Überlebensfaktoren für embryonale und lädierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren für andere neurotrophe Faktoren, führt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 für den Überlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht für das Überleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve für CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erhöhter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erhöhten Zelltod nach Fazialisläsion. Diese Neurone können wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenläsion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen gehören Reg-2, ein Mitogen für Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle für das Überleben nach Läsion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht während der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich während der Entwicklung und reifung des Organismus verändern können.
Lamin C2
(2000)
In der Kernlamina von Spermatozyten von Nagetieren sind die Lamin A-Genprodukte, Lamin A und C, durch eine meiosespezifische Splicingvariante ersetzt. Dieses Lamin C2 unterscheidet sich auffallend von den somatischen Varianten in Struktur, Menge und Verhalten. Durch eine ektopische Expression von Lamin C2 als EGFP-Lamin C2-Fusionsprotein in einer somatischen Zellinie zeigte sich, daß eine neuartige Hexapeptidsequenz (GNAEGR) am N-terminalen Ende des Proteins anstelle der C-terminal gelegenen CaaX-Box somatischer Lamine für die Interaktion mit der Kernhülle verantwortlich ist. So ermöglicht eine posttranslationelle Myristylierung des ersten Glycins ein Membrantargeting, bei dem der hydrophobe Myristinsäurerest vergleichbar dem hydrophoben Farnesylrest am Cystein der Caax-Box mit den Fettsäureresten der Kernmembran interagiert. Die Deletion des Hexapeptids im Fusionsprotein EGFP-Lamin C2 und die seine N-terminale Insertion in das Fusionsprotein EGFP-Lamin C - es besitzt keine Caax-Box - bestätigt, daß allein das Hexapeptid das Membrantargeting steuert: Die Deletionsmutante EGFP-Lamin C2 bleibt diffus im Kern verteilt, während sich die Insertionsmutante EGFP-Lamin C im Bereich der Kernperipherie anreichert. Eine weitere Besonderheit stellt die Verteilung von Lamin C2 innerhalb der Kernhülle dar, denn es verteilt sich nicht gleichmäßig wie alle bisher bekannten Lamine, sondern bildet zahlreiche Aggregate. Nicht nur in der Kernhülle von Spermatozyten, sondern auch als Fusionsprotein in somatischen Zellen exprimiert, zeigt Lamin C2 diese Akkumulationen. Überraschenderweise treten die Synaptonemal-komplexenden nur im Bereich dieser Lamin C2-Aggregate mit der Kernhülle in Kontakt. Es wird daher postuliert, daß die Lamin C2-Aggregate der lokalen Verstärkung der Kernhülle dienen und wichtig für die auf die Prophase beschränkte Anheftung der SC an die Kernhülle sind. Da zudem in einer Kurzzeitkultur von Pachytänspermatozyten, in der die Prophase künstlich beschleunigt wird, gezeigt werden konnte, daß Lamin C2 mit Ende der Prophase I noch vor dem Auflösen der eigentlichen Kernhülle nicht mehr nachweisbar ist, scheint ein Zusammenhang zwischen Lamin C2 in der Kernhülle und der Umorganisation des genetischen Materials zu bestehen.
The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation.
OMB and ORG-1
(2002)
Members of the T-box gene family encode transcription factors that play key roles during embryonic development and organogenesis of invertebrates and vertebrates. The defining feature of T-box proteins is an about 200 aa large, conserved DNA binding motif, the T domain. Their importance for proper development is highlighted by the dramatic phenotypes of T-box mutant animals. My thesis was mainly focused on two Drosophila T-box genes, optomotor-blind (omb) and optomotor-blind related 1 (org-1), and included (i) a genetic analysis of org-1 and (ii) the identification of molecular determinants within OMB and ORG-1 that confer functional specificity. (i) Genetic analysis of org-1 initially based on a behavioral Drosophila mutant, C31. C31 is a X-linked, recessive mutant and was mapped to 7E-F, the cytological region of org-1. This pleiotropic mutant is manifested in walking defects, structural aberrations in the central brain, and "held-out" wings. Molecular analysis revealed that C31 contains an insertion of a 5' truncated I retrotransposon within the 3' untranslated transcript of org-1, suggesting that C31 might represent the first org-1 mutant. Based on this hypothesis, we screened 44.500 F1 female offspring of EMS mutagenized males and C31 females for the "held-out" phenotype, but failed to isolate any C31 or org-1 mutant, although this mutagenesis was functional per se. Since we could not exclude the possibility that our failure is due to an idiosyncracy of C31, we intended not to rely on C31 in further genetic experiments and followed a reverse genetic strategy . All P element lines cytologically mapping to 7E-7F were characterized for their precise insertion sites. 13 of the 19 analyzed lines had P element insertions within a hot-spot 37 kb downstream of org-1. No P element insertions within org-1 could be identified, but several P element insertions were determined on either side of org-1. The org-1 nearest insertions were used for local-hop experiments, in which we associated 6 new genes with P insertions, but failed to target org-1. The closest P elements are still 10 kb away from org-1. Subsequently, we employed org-1 flanking P elements to induce precise deletions in 7E-F spanning org-1. Two org-1 flanking P elements were brought together on a recombinant chromosome. Remobilization of P elements in cis configuration frequently results in deletions with the P element insertion sites as deficiency endpoints. In a first attempt, we expected to identify deficiencies by screening for C31 alleles. 8 new C31 alleles could be isolated. The new C31 chromosomes, however, did not carry the desired deletion. Molecular analysis indicated that C31 is not caused by aberrations in org-1, but by mutations in a distal locus. We repeated the P element remobilization and screened for the absence of P element markers. 4 lethal chromosomes could be isolated with a deletion of the org-1 locus. (ii) The consequences of ectopic org-1 were analyzed using UAS-org-1 transgenic flies and a number of different Gal4 driver lines. Misexpression of org-1 during imaginal development interfered with the normal development of many organs and resulted in flies with a plethora of phenotypes. These include a homeotic transformation of distal antenna (flagellum) into distal leg structures, a strong size reduction of the legs along their proximo-distal axis, and stunted wings. Like ectopic org-1, ectopic omb leads to dramatic changes of normal developmental pathways in Drosophila as well. dpp-Gal4/ UAS-omb flies are late pupal lethal and show an ectopic pair of wings and largely reduced eyes. GMR-Gal4 driven ectopic omb expression in the developing eye causes a degeneration of the photoreceptor cells, while GMR-Gal4/ UAS-org-1 flies have intact eyes. Hence, ectopic org-1 and omb induce profound phenotypes that are qualitatively different for these homologous genes. To begin to address the question where within OMB and ORG-1 the specificity determinants reside, we conceptionally subdivided both proteins into three domains and tested the relevance ofthese domains for functional specificity in vivo. The single domains were cloned and used as modules to assemble all possible omb-org-1 chimeric trans- genes. A method was developed to determine the relative expression strength of different UAS-transgenes, allowing to compare the various transgenic constructs for qualitative differences only, excluding different transgene quantities. Analysis of chimeric omb-org-1 transgenes with the GMR-Gal4 driver revealed that all three OMB domains contribute to functional specificity.
In this thesis, I examined honey bee nectar foraging with emphasis on the communication system. To document how a honey bee colony adjusts its daily nectar foraging effort, I observed a random sample of individually marked workers during the entire day, and then estimated the number and activity of all nectar foragers in the colony. The total number of active nectar foragers in a colony changed frequently between days. Foraging activity did not usually change between days. A honey bee colony adjusts its daily foraging effort by changing the number of its nectar foragers rather than their activity. I tested whether volatiles produced by a foraging colony activated nectar foragers of a non-foraging colony by connecting with a glass tube two colonies. Each colony had access to a different green house. In 50% of all experiments, volatile substances from the foraging colony stimulated nectar foragers of the non-foraging colony to fly to an empty feeder. The results of this study show that honey bees can produce a chemical signal or cue that activates nectar foragers. However, more experiments are needed to establish the significance of the activating volatiles for the foraging communication system. The brief piping signal of nectar foragers inhibits forager recruitment by stopping waggle dances (Nieh 1993, Kirchner 1993). However, I observed that many piping signals (approximately 43%) were produced off the dance floor, a restricted area in the hive where most waggle dances are performed. If the inhibition of waggle dances would be the only function of the brief piping signal, tremble dancers should produce piping signals mainly on the dance floor, where the probability to encounter waggle dancers is highest. To therefore investigate the piping signal in more detail, I experimentally established the foraging context of the brief piping signal, characterized its acoustic properties, and documented for the first time the unique behavior of piping nectar foragers by observing foragers throughout their entire stay in the hive. Piping nectar foragers usually began to tremble dance immediately upon their return into the hive, spent more time in the hive, more time dancing, had longer unloading latencies, and were the only foragers that sometimes unloaded their nectar directly into cells instead of giving it to a nectar receiver bee. Most of the brief piping signals (approximately 99%) were produced by tremble dancers, yet not all tremble dancers (approximately 48%) piped. This suggests that piping and tremble dancing have related, but not identical functions in the foraging system. Thus, the brief piping signals may not only inhibit forager recruitment, but have an additional function both on and off the dance floor. In particular, the piping signal might function 1. to stop the recruitment of additional nectar foragers, and 2. as a modulatory signal to alter the response threshold of signal receivers to the tremble dance. The observation that piping tremble dancers often did not experience long unloading delays before they started to dance gave rise to a question. A forager’s unloading delay provides reliable information about the relative work capacities of nectar foragers and nectar receivers, because each returning forager unloads her nectar to a nectar receiver before she takes off for the next foraging trip. Queuing delays for either foragers or receivers lower foraging efficiency and can be eliminated by recruiting workers to the group in shortage. Short unloading delays indicate to the nectar forager a shortage of foragers and stimulate waggle dancing which recruits nectar foragers. Long unloading delays indicate a shortage of nectar receivers and stimulate tremble dancing which recruits nectar receivers (Seeley 1992, Seeley et al. 1996). Because the short unloading delays of piping tremble dancers indicated that tremble dancing can be elicited by other factors than long unloading delays, I tested whether a hive-external stimulus, the density of foragers at the food source, stimulated tremble dancing directly. The experiments show that tremble dancing can be caused directly by a high density of foragers at the food source and suggest that tremble dancing can be elicited by a decrease of foraging efficiency either inside (e.g. shortage of receiver bees) or outside (e.g. difficulty of loading nectar) the hive. Tremble dancing as a reaction to hive-external stimuli seems to occur under natural conditions and can thus be expected to have some adaptive significance. The results imply that if the hive-external factors that elicit tremble dancing do not indicate a shortage of nectar receiver bees in the hive, the function of the tremble dance may not be restricted to the recruitment of additional nectar receivers, but might be the inhibition or re-organization of nectar foraging.
In the various groups of social bees, different systems of communication about food sources occur. These communication systems are different solutions to a common problem of social insects: efficiently allocating the necessary number of workers first to the task of foraging and second to the most profitable food sources. The solution chosen by each species depends on the particular ecological circumstances as well as the evolutionary history of that species. For example, the outstanding difference between the bumble bee and the honey bee system is that honey bees can communicate the location of profitable food sources to nestmates, which bumble bees cannot. To identify possible selection pressures that could explain this difference, I have quantified the benefits of communicating location in honey bees. I show that these strongly depend on the habitat, and that communicating location might not benefit bees in temperate habitats. This could be due to the differing spatial distributions of resources in different habitats, in particular between temperate and tropical regions. These distributions may be the reason why the mostly temperate-living bumble bees have never evolved a communication system that allows them to transfer information on location of food sources, whereas most tropical social bees (all honey bees and many stingless bees) are able to recruit nestmates to specific points in their foraging range. Nevertheless, I show that in bumble bees the allocation of workers to foraging is also regulated by communication. Successful foragers distribute in the nest a pheromone which alerts other bees to the presence of food. This pheromone stems from a tergite gland, the function of which had not been identified previously. Usage of a pheromone in the nest to alert other individuals to forage has not been described in other social insects, and might constitute a new mode of communicating about food sources. The signal might be modulated depending on the quality of the food source. Bees in the nest sample the nectar that has been brought into the nest. Their decision whether to go out and forage depends not only on the pheromone signal, but also on the quality of the nectar they have sampled. In this way, foraging activity of a bumble bee colony is adjusted to foraging conditions, which means most bees are allocated to foraging only if high-quality food sources are available. In addition, foraging activity is adjusted to the amount of food already stored. In a colony with full honeypots, no new bees are allocated to foraging. These results help us understand how the allocation of workers to the task of food collection is regulated according to external and internal nest conditions in bumble bees.
Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen für Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenitätsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenitätsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Domínguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die größtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. Für die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in ähnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Domínguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch für L. ivanovii sind. Für die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies führte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde für fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abhängig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene während einer Infektion differentiell transkribiert werden und möglicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames bestätigte, dass diese Gene PrfA-unabhängig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene läßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abhängigkeit der Genexpression. Es konnte bestätigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verstärkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene.
Wegener'sche Granulomatose
(2002)
Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entzündung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG gehört zur Gruppe der sog. “pauci-immunen” Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antikörpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. “klassischen” ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antikörperspiegel mit dem Krankheitsverlauf läßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen könnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gestützt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen äußert. c-ANCA können so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelschädigung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zunächst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde für die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten Mäusen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußkörpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die für PR3 und NE spezifische katalytische Aktivität, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antikörpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente Mäuse mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifität der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erfüllten somit die für c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifität. Wenn c-ANCA alleine hinreichend für die Induktion der für WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-Mäuse WG-ähnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intravenöser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter Mäuse ließ sich ein signifikanter Antikörperspiegel bei Verdünnungen von 1:2000 über den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Veränderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenwärtigen Modell für c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zusätzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten ermöglicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entzündungsmodell der Maus übertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entzündungsreaktion ausgelöst. Diese Entzündungsreaktion ließ sich schließlich durch intravenöse Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verstärken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis für die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epihänomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen könnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE können Proteine der extrazellulären Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entzündlicher Prozesse über verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entzündungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten Mäusen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivitätsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-Mäuse entwickelten dabei eine deutlich stärkere lokale Entzündung als NE/PR3-defiziente Mäuse. Weitere Studien sind nötig um die Frage zu klären, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Phänotyp hervorruft. Für einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verstärkung der enzymatischen Bruttoaktivität einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch geklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen über die Rolle der PR3 bei der Wegener’schen Granulomatose: PR3 dürfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entzündliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebeschädigung beitragen. Darüberhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antikörpern in der Maus nachgewiesen werden.