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Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt
Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die einer malignen Erkrankung zugrunde liegen, ist der Schlüssel zur Entwicklung zielgerichteter und effektiver therapeutischer Möglichkeiten. Für das LIM und SH3 Domänen Protein 1, LASP1, konnte im Kontext zahl-reicher Tumorerkrankungen wie dem Mamma-Karzinom, dem Prostata-Karzinom oder dem Ovarial-Karzinom eine Überexpression ebenso wie eine Korrelation mit Aggressivität und Prognose der Tumorerkrankung gezeigt werden. Bisher war eine Relevanz von LASP1 jedoch nur für solide Tumorerkrankungen nachgewiesen worden. Kürzlich allerdings wurde lasp1 als eines von 6 Genen identifiziert, die eine exaktere Vorhersage von Krankheitsprogress und -rezidiv bei Patienten mit einer chronischen myeloischen Leukämie (CML) zulassen sollen. Zudem konnte, wie bereits bei zahlreichen anderen, soliden Tumorerkrankungen, eine signifikante Überexpression des lasp1-Gens in CML-Zellen nachgewiesen werden.Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen beschäftigte ich mich im Rahmen dieser Arbeit mit der Frage, welche Funktion LASP1 im Netz der einer CML zugrunde liegenden, molekularen Mechanismen übernimmt. Mittels verschiedener Interaktionsassays konnte LASP1 als ein neuer, phosphorylierungs-abhängiger Bindungspartner von CrkL, dem wohl prominentesten Substrat der BCR-ABL-Kinase, identifiziert werden. Dabei impliziert das Attribut „phosphorylierungs-abhängig“ sowohl den Phosphorylierungsstatus von LASP1 als auch des Interaktionspartners CrkL. Wie in Vorarbeiten gezeigt, stellt das Tyrosin 171 in der Aminosäurensequenz von LASP1 eine Phosphorylierungsstelle für die BCR-ABL-Kinase dar; mit LASP1 wurde somit auch ein neues Substrat dieser konstitutiv aktiven Tyrosinkinase entdeckt. Phosphoryliert an Tyrosin 171 kann LASP1 an die SH2-Domäne von CrkL, genauer an das FLVR-Motif innerhalb dieser, binden. Jedoch selbst an Tyrosin 207 durch die BCR-ABL-Kinase phosphoryliert, blockiert CrkL die eigene SH2-Domäne durch intramolekulare Wechselwirkungen für andere Protein-Protein-Interaktionen in gewissem Umfang. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse liefern ein weiteres Puzzlestück zum Verständnis des molekularen Netzwerks, das einer CML-Erkrankung zugrunde liegt und tragen so dazu bei, die Therapieoptionen dieser stetig zu verbessern.
Die Phosphoglykolat-Phosphatase PGP (früher auch als AUM bezeichnet) wurde in unserem Labor als Mitglied der HAD-Typ-Phosphatasen identifiziert. Die genetische Inaktivierung des Enzyms im gesamten Mausorganismus führt ab E8.5 zu einer Wachstumsverzögerung muriner Embryonen und bis E12.5 schließlich zu deren Tod. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einer PGP-Inaktivierung in hämatopoetischen Zellen und im Endothel lebensfähig und phänotypisch unauffällig. Neue Erkenntnisse schreiben dem Enzym neben einer Aktivität gegenüber Phosphoglykolat auch Aktivitäten gegenüber Glycerin-3-phosphat (G3P), P-Erythronat und P-Lactat zu. Da diese Phosphatase-Aktivitäten Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel nahelegen, wurde in der vorliegenden Arbeit mittels massenspektrometrischer Methoden der Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten untersucht.
Nach Inaktivierung der PGP im gesamten Organismus wurden in E8.5-Embryonen erhöhte Diacylglycerin (DG)-, Triacylglycerin (TG)- und Sphingomyelin (SM)-Spiegel gemessen, während niedrigere Phosphatidylcholin (PC)-Level vorlagen.
In PGP-inaktivierten Lymphozyten waren G3P-, DG-, TG-, PC- und SM-Level nicht verändert. Dafür kam es zu signifikanten Erhöhungen der Phosphatidylglycerol (PG*)- und Cardiolipin (CL)-Spiegel.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die PGP in unterschiedlichen Geweben differenzielle Effekte auf die Spiegel verschiedener Lipide hat. Dies deckt neue Funktionen der PGP für die Regulation des Lipidmetabolismus auf. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen über die genauen Ursachen und Folgen dieser Regulation dar und lässt auf eine wichtige Rolle der PGP als metabolische Phosphatase im Organismus schließen.
Natrium-Glukose Transporter (SGLT) gehören zur „solute carrier 5“ (SLC5) Familie, die sich durch einen sekundär aktiven, natriumabhängigen Transport von Zuckern und an-deren Molekülen nach intrazellulär auszeichnen. Die durch das Gen SLC5A4 kodierte Isoform SGLT3 transportiert dagegen keinen Zucker, sondern verhält sich als Glukosesensor, der nach Bindung seiner Liganden eine Membrandepolarisation induziert. In genomweiten Exomsequenzierungsstudien (whole exome sequencing, WES) mehrerer erweiterter Stammbäume mit hoher Prävalenz des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndroms (ADHS) wurde im Vorfeld eine ATG-Tripletdeletion in SLC5A4 identifiziert, die zum Verlust einer Aminosäure (ΔM500) in SGLT3 führt und zumindest partiell mit dem klinischen Phänotyp kosegregiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zentralnervöse Expression von SGLT3 auf RNA- Ebene mittels Reverse-Transkriptase PCR sowie real-time PCR aus humanen Gesamt-RNAs nachgewiesen. Dabei konnte eine ubiquitäre Expression im Gehirn mit relativ erhöhter Expression unter anderem in Striatum und Hypothalamus, deren Dysfunktion in der Pathogenese des ADHS impliziert wurde, gezeigt werden. Da Mutationen in homologen Domänen der eng strukturverwandten Isoformen SGLT1 und SGLT2 sowohl intestinale als auch renale Funktionen schwer beeinträchtigen, wurden in dieser Arbeit funktionelle Charakteristika sowohl des wildtypischen als auch der ΔM500 und der benachbarten ΔI501 Deletionsvariante von SGLT3 mittels Zwei-Elektroden Spannungs- und Stromklemme in entsprechend cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten untersucht. Der hochpotente SGLT3-spezifische Iminozuckeragonist 1-Desoxynojirimycin (DNJ) induzierte an SGLT3-exprimierenden Oozyten in sauren Bedingungen etwa dreifach größere Kationeneinströme als D-Glukose, was sowohl im Spannungsklemmen-, und anhand einer entsprechenden Membrandepolarisation im Stromklemmenmodus gezeigt wurde. Die mit der ΔM500 bzw. ΔI501 Variante injizierten Oozyten dagegen zeigten in den maximalen Aktivierungsbedingungen um 92% bzw. 96% (p<0,01) reduzierte Kationeneinströme, sodass diese als hochgradig schädliche „Loss of Function“ Mutationen in SGLT3 charakterisiert wurden. Dieser Befund wurde mittels bioinformatischer in-silico Effektvorhersage validiert.
Um Konsequenzen der Sequenzalteration auf den Membraneinbau der Transporter zu untersuchen, wurden die mit einem gelb fluoreszierenden Farbstoff (YFP) markierten Transporter in Oozytenmembranen mittels Laser-Scanning Mikroskop nachgewiesen und die jeweiligen Mengen der Konstrukte anhand der Fluoreszenzintensitäten quantifiziert. Dabei zeigte sich eine um 53% bzw. 42% (p<0,01) reduzierte Menge der mutierten Konstrukte ΔM500 bzw. ΔI501 in der Membran, was zusätzliche schädliche Effekte der Mutationen auf das sogenannte Membrantargeting der Transporter belegt.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die ΔM500 Variante von SGLT3, welcher in ADHS-relevanten Hirnarealen exprimiert wird, dessen sub-stratinduzierte Natriumleitfähigkeit aufhebt und den Membraneinbau beeinträchtigen könnte, was in Wechselwirkung mit anderen genetischen ADHS Risikovarianten das Risiko für ADHS in Mutationsträgern beeinflussen kann.
Herzschrittmachersysteme sind eine weitverbreitete Möglichkeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. Wegen der natürlichen Reaktion des Immunsystems auf Fremdkörper, erfolgt aber eine fortschreitende Verkapselung der Herzschrittmacherelektrode. Die Folge ist eine ansteigende Verminderung der Stimulationseffizienz durch Erhöhung der Anregungsschwelle. Die Integration der Elektrode in das Gewebe ist dabei mangelhaft und wird bestimmt durch Implantateigenschaften wie Größe, Flexibilität und Dimensionalität. Um die Integration zu verbessern, stellen dreidimensionale (3D) bzw. gewebeartige Elektroden eine Alternative zu den derzeit verwendeten planaren Metallelektroden dar. Zur Entwicklung einer leitfähigen, 3D und faserförmigen Elektrode wurden in dieser Arbeit Kohlenstoff-Nanofaser-Scaffolds über Elektrospinnen hergestellt. Durch die Modifikation des Fasergerüstes mit Natriumchlorid (NaCl) während der Scaffoldherstellung, konnte das Fasernetzwerk aufgelockert und Poren generiert werden. Die Kohlenstofffaser-Elektroden zeigten einen effizienten Energieübertrag, welcher vergleichbar mit heutigen Titannitrid (TiN) -Elektroden ist. Die Auflockerung des Fasergewebes hatte eine verbesserte Flexibilität des Faserscaffolds zu Folge. Neben der Flexibilität, konnte auch die Infiltration von Zellen in das poröse Faserscaffold erheblich verbessert werden. Dabei konnten Fibroblasten durch das gesamte Scaffold migrieren. Die Kompatibilität mit kardialen Zellen, die Grundvoraussetzung von Herzschrittmacherelektroden, wurde in vitro nachgewiesen. Durch die Kombination aus dem 3D-Elektrodengerüst mit einer Co-Kultur aus humanen Kardiomyozyten, mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten, erfolgte eine Einbettung der Elektrode in funktionelles kardiales Gewebe. Dadurch konnte ein lebender Gewebe-Elektroden-Hybrid generiert werden, welcher möglicherweise die Elektrode vor Immunzellen in vivo abschirmen kann. Eine Zusammenführung der hybriden Elektrode mit einen Tissue-Engineerten humanen kardialen Patch in vitro, führte zu Bildung einer nahtlosen Elektronik-Gewebe-Schnittstelle. Die fusionierte Einheit wurde abschließend auf ihre mechanische Belastbarkeit getestet und konnte über einen Elektroden-Anschluss elektrisch stimuliert werden.
Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden.
Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert.
In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist.
Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente.
Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden.
Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden.
Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern.
Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein
inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs,
welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von
Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2-
defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie,
sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2-
Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle,
sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen
der Mitochondrien gekennzeichnet.
Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu
beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte
Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese
Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären
Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein
könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher
Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen
abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an
Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende
(E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2-
KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5-
Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das
Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als
Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die
Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten
Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des
lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich
in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als
Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die
Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht.
Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine
Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt.
Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel
durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat
zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von
SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins
VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer
verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der
Vesikel in Einklang bringt.
Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System
durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen
Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen
werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und
das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2-
defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine
gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt.
Biologische Marker für Aufmerksamkeitsverzerrungen bei sozialer Ängstlichkeit und deren Modifikation
(2019)
Diese Dissertationsschrift beschäftigt sich mit biologischen Korrelaten von Aufmerksamkeits-verzerrungen und eruiert deren Modifikation in einem längsschnittlich angelegten Experiment. Hierfür wurden über 100 sozial-ängstliche Teilnehmer mit Hilfe einer Screening-Prozedur gewonnen und hinsichtlich der Ausprägung einer ereigniskorrelierten Lateralisation namens „N2pc“ untersucht.
Während der ersten Labormessung indizierte die N2pc bei der Bearbeitung eines Dot Probe Paradigmas einen mittelgroßen, statistisch hochbedeutsamen Attentional Bias hin zu wütenden Gesichtern im Vergleich zu neutralen. Das hierfür klassischerweise verwendete Maß von Reaktionszeitunterschieden hingegen konnte diese Verzerrung der Aufmerksamkeit nicht abbilden. Ferner zeigten weder die elektrophysiologische noch die behaviorale Messgröße einen Zusammenhang mit Fragebögen sozialer Angst, was teilweise auf ein Fehlen interner Konsistenz zurückgeführt werden kann.
Im weiteren Verlauf absolvierten die überwiegend weiblichen Teilnehmer an acht unterschiedlichen Terminen über zwei bis vier Wochen fast 7000 Durchgänge eines Aufmerksamkeitsverzerrungsmodifikationstrainings oder einer aktiven Kontrollprozedur. Daraufhin zeigte sich eine Auslöschung der ereigniskorrelierten Lateralisation, allerdings in einem späteren Zeitfenster als erwartet. Dieses Verschwinden des Attentional Bias blieb bis elf Wochen nach Ende der Trainingsprozedur stabil. Außerdem trat dieselbe Modifikation ebenfalls für die Kontrollgruppe auf. Die selbstberichtete Schwere der Symptomausprägung veränderte sich zwar nicht, allerdings konnte eine Reduktion des Persönlichkeitsmerkmals Neurotizismus verzeichnet werden, welches konzeptuell mit dem Begriff der Ängstlichkeit eng verwoben ist.
Durch explorative Folgeanalysen konnte eine stärkere Modulation der rechten Großhirnhälfte, also durch Reize im linken visuellen Halbfeld aufgedeckt werden. Eine Neuberechnung des Attentional Bias separat für jede Hemisphäre scheint daher auch für künftige Untersuchungen angebracht. Ferner wurde als Träger der Modifikation über die Zeit eine Veränderung der Hyperpolarisation nach der N2-Komponente identifiziert. Ob durch eine Anpassung der Prozedur eine Modulation einer früheren ereigniskorrelierten Komponente erzielt werden kann, bleibt zum aktuellen Zeitpunkt unbeantwortet.
Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen
mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser
Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens
untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um
Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von
Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu
identifizieren und zu validieren.
Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS)
ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach
einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche
Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk
erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können
(Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und
rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität
verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker
BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im
nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus
Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der
Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung
konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten
passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu
bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren
substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden.
Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden
folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt:
1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv
durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu
vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein
Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten
Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren
von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten
Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink
zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze
Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des
Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der
positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da
das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende
Identifizierung der Peptide mit sich bringt.
2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren
Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach
diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass
quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit
18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8
Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann
während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden
mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich
heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die
Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der
Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung
für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre.
3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden
auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen
nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das
Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE,
die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten
Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der
Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert
und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der
Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen
gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die
Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist
jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50
Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer
Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216
(CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen
Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu
identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der
Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet.
Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets
aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten
Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die
angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer
geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl
Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine
spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR
und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und
Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms
(MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α-
acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er
zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets
signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl
Aminocarboxamide dar.
Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat
angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende-
und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für
das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren
3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende
Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin
A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst.
Der Hörsinn ist für uns Menschen von entscheidender Bedeutung, um mit der Umwelt kommunizieren zu können. Hörstörungen werden dabei in sensorineurale Erkrankungen der neuronalen Strukturen und nicht-sensorineurale Schallleitungsschwerhörigkeiten unterschieden.
In der vorliegenden Studie sollte es darum gehen zu untersuchen, inwiefern ein neues konditionelles Mausmodell, die Brn3.1 IRES Cre Maus, und ein bestehendes Mausmodell, die pmn-Maus, sich eignen, um die Erkrankung der auditorischen Neuropathie nachzubilden. Die Brn3.1 IRES Cre Maus wurde zur Evaluation der Expression von Cre-Rekombinase unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors mit gefloxten Reporter-Mauslinien verkreuzt. Die pmn-Maus ist ein anerkanntes Modell einer Motoneuronerkrankung, hatte aber in vorherigen Untersuchungen erhöhte Hörschwellen gezeigt.
Alle verwendeten Mauslinien wurden mittels ABR und DPOAE frequenzspezifisch untersucht, um die Funktion der Haarzellen im Corti´schen Organ zu evaluieren. Bei der pmn-Linie wurden die audiologischen Untersuchungen wöchentlich zwischen P21 und P35 durchgeführt. Zusätzlich wurde das Corti´sche Organ zu diesen Zeitpunkten morphologisch untersucht.
Es zeigte sich, dass alle verwendeten Mauslinien unauffällige Hörschwellen verglichen zur Backgroundlinie C57BL/6 hatten sowie DPOAE-Antworten zeigten. Die Verkreuzung der Brn3.1 IRES Cre Linie mit den beiden Reporterlinien zeigte eine nachweisbare Cre-Rekombinase-Expression unter der Aktivität des Brn3.1 Promotors nur an den postnatalen Tagen P14 und P21. Diese Expression erfolgte mosaikartig in den äußeren Haarzellen. Mit Hilfe einer RT-PCR wurde eine Diskrepanz zwischen Genotyp und Expression des Reporterproteins im Gewebe festgestellt. Dies ließ vermuten, dass die Expression von Cre-Rekombinase durch gene silencing Prozesse unterdrückt wurde und Brn3.1 als Promotor nicht leistungsstark genug war, um eine Cre-Rekombinase-Expression steuern zu können.
Die pmn-Linie zeigte in ABR-Untersuchungen bereits zum Zeitpunkt P21 erhöhte Hörschwellen in allen untersuchten Frequenzen im Vergleich zum Wildtyp. DPOAE-Antworten waren in der pmn-Linie nur bedingt auslösbar. Es zeigte sich in der morphologischen Evaluation ein Verlust von äußeren Haarzellen über die gesamte Länge des Corti´schen Organes. Durch einen TUNEL-Assay konnte das Absterben dieser Zellen durch apoptotische Vorgänge nachgewiesen werden. Der pmn-Phänotyp entsteht durch eine Mutation im TBCE Gen. Dieses Gen kodiert für ein Protein, welches einen stabilisierenden Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli hat. Die TBCE-Verteilung im Corti´schen Organ zeigte, dass dieses hauptsächlich in den äußeren Haarzellen und inneren Stützzellen exprimiert wird und damit wahrscheinlich einen bedeutenden Einfluss auf die Erhaltung der Haarzellen hat. Eine Analyse des Hörnervs zeigte einen Verlust von Mikrotubuli.
Neben diesen in vivo Untersuchungen sollte außerdem eine gliazellfreie Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen etabliert werden. Hierfür wurden mehrere Faktoren einer Primärzellkultur in Bezug auf ihren Einfluss auf die Gesamtzellzahl, den prozentualen Neuronanteil und die Axonlänge der Neurone untersucht. Das Medium, die Beschichtung des Zellkulturgefäßes, die Gabe von Neurotrophinen/Zytokinen und der Einsatz eines Zytostatikums wurden separat untersucht. Es zeigte sich, dass das Medium, die Beschichtung und Neurotrophin-/Zytokingabe hauptsächlich einen Einfluss auf das axonale Längenwachstum von Neuronen haben. Den Prozentsatz der Neurone beeinflusste nur der Einsatz des Zytostatikums Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) signifikant. Die Ergebnisse wurden auch im Zusammenhang mit der reellen Neuronanzahl in Kultur gesehen.
Es ergab sich weiterhin eine Präferenz für DMEM- über NB-Medium sowie für zusätzliche Lamininbeschichtung, für den Einsatz des Zytokins LIF gegenüber den neurotrophen Faktoren BDNF und NT-3 und die Gabe des Zytostatikums AraC ab Tag 2 nach Ausplattierung in einer Konzentration von 5-10 µM. Ein kombinatorischer Einsatz dieser Präferenzen spiegelte in Summe die Ergebnisse der Versuchsreihen Neurotrophine/Zytokin und AraC wieder. Der Anteil der Neurone in der Kultur konnte im Durchschnitt auf 10-12 % gesteigert werden. Eine Verschiebung des Glia-/Neuronenanteils zugunsten letzterer ist vermutlich nur durch den Einsatz weiterer Faktoren oder anderer Methoden möglich.
Die untersuchten Mausmodelle zeigten auf Grund der Untersuchungsergebnisse nur teilweise Ähnlichkeiten mit der Erkrankung der auditorischen Neuropathie. Die Erkenntnisse zur pmn-Mauslinie über das frequenzspezifische Hörvermögen und die morphologische Degeneration im Corti´schen Organ im altersabhängigen Verlauf können aber hilfreich sein, um neben der motorischen auch die sensorische Degeneration dieser Pathologie besser zu verstehen. Zudem konnten auch umfassende Erkenntnisse für die Kultur von dissoziierten auditorischen Neuronen der Maus in Bezug auf verschiedene Variablen erhalten werden.
Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Abhängig von der betroffenen ZNS-Region kann es zu vielfältigen Symptomen kommen. Neben neurologischen Symptomen verursacht durch ZNS-Läsionen leidet ein Großteil der MS-Patienten auch unter gastrointestinalen Funktionsstörungen. Diese gastrointestinalen Symptome wurden bisher eher auf Läsionen im Rückenmark zurückgeführt und nicht direkt in Verbindung mit der autoimmunen Ätiologie der Erkrankung gebracht.
In dieser Studie wurde das enterische Nervensystem (ENS) in einem B-Zell- und Antikörper-abhängigen Mausmodell der MS untersucht. Dafür wurde der Autoimmunprozess durch Immunisierung mit MP4, einem Fusionsprotein aus dem Myelin-Basischen-Protein (MBP) und dem Proteolipid-Protein (PLP), ausgelöst. Das ZNS und ENS wurden in den unterschiedlichen Erkrankungsstadien immunhistochemisch und elektronenmikroskopisch analysiert. Neben der Immunpathologie des ZNS konnte dabei eine Degeneration des ENS schon vor dem Einsetzen der ersten neurologischen Defizite nachgewiesen werden. Die ENS-Pathologie war antikörper-mediiert und ging einher mit einer verringerten gastrointestinalen Motilität sowie mit einer Gliose und Neurodegeneration des ENS.
Mithilfe von Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten im ENS vier mögliche Zielstrukturen des Autoimmunprozesses identifiziert werden, was auf sog. epitope spreading hindeutet. Auch im Plasma von MS-Patienten konnten Antikörper gegen drei dieser Antigene nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigten sich in Kolon-Resektaten von MS-Patienten erste Ansätze einer Neurodegeneration und Gliose des ENS.
In dieser Studie wurde zum ersten Mal ein direkter Zusammenhang zwischen der Autoimmunreaktion gegen das ZNS und einer simultanen Reaktion gegen das ENS gezeigt. Dies kann einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Immunpathogenese der MS anstoßen und neue therapeutische und diagnostische Ansätze initiieren.
Unterschiede in Frontaler Kortex Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der Alzheimer Demenz
(2019)
Die verbesserte medizinische Versorgung führt zu einer zunehmenden Lebenserwartung unserer Gesellschaft. Damit steigt auch die sozioökonomische Relevanz neurodegenerativer Erkrankungen kontinuierlich. Für die Alzheimer Demenz (AD), die dabei die häufigste Ursache darstellt, stehen bisher keine krankheitsmodifizierenden Behandlungsoptionen zur Verfügung. Die lange präklinische Phase der Erkrankung birgt jedoch großes Potential für die Entwicklung neuer Behandlungsoptionen. Das Untersuchen von Risikogruppen ist für die Identifikation von Prädiktoren einer späteren AD Manifestation von besonderem Interesse. In diesem Zusammenhang werden insbesondere das Vorliegen genetischer Risikokonstellationen, wie dem Apolipoprotein E (APOE) Ɛ4-Allel, sowie kognitiver Risikofaktoren, wie der „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (MCI), diskutiert. Die Identifikation präklinischer Aktivierungsunterschiede in relevanten Gehirnregionen von Risikogruppen kann als Basis für die Entwicklung neurofunktioneller Früherkennungs-Marker dienen. Der präfrontale Kortex (PFC), welcher mit der Steuerung von Exekutivfunktionen assoziiert wird, hat sich in diesem Zusammenhang in bisherigen Studien als eine relevante Schlüsselregion manifestiert. Aufgrund der aufwendigen und kostenintensiven bildgebenden Untersuchungsmethoden, sind die genauen Prozesse jedoch noch unklar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Unterschiede in der PFC Oxygenierung in zweierlei Risikogruppen der AD mit einer kostengünstigeren Bildgebungsmethode, der funktionellen Nahinfrarot Spektroskopie (fNIRS), zu untersuchen. Dafür wurde in einem ersten Schritt, der Trailmaking Test (TMT), ein weitverbreiteter neuropsychologischer Test zur Erfassung exekutiver Funktionen, für fNIRS implementiert. Als Grundlage für die Untersuchung frühpathologischer Prozesse, wurden zunächst gesunde Alterungsprozesse betrachtet. Der Vergleich von jungen und älteren Probanden (n = 20 pro Gruppe) wies neben der Eignung der Testimplementierung für fNIRS auf eine spezifische bilaterale PFC Oxygenierung hin, welche bei jungen Probanden rechtshemisphärisch lateralisiert war. Ältere Probanden hingegen zeigten bei vergleichbaren Verhaltensdaten insgesamt mehr signifikante Kanäle sowie eine Abnahme der Lateralisierung. Dies kann als zusätzlicher Bedarf an Ressourcen in gesunden Alterungsprozessen interpretiert werden.
Im Rahmen der Hauptstudie wurden anschließend insgesamt 604 ältere Probanden im Alter von 70 bis 76 Jahren untersucht. Zunächst wurde die genetische Risikogruppe der Ɛ4-Allel-Träger (n = 78) mit den neutralen Ɛ3-Allel-Trägern (n = 216) und den Trägern des als protektiv geltenden Ɛ2-Allels (n = 50) verglichen. Hierbei zeigte sich eine geringere Oxygenierung der Risikogruppe bei geringer Aufgabenschwierigkeit, während sich ein erhöhter Oxygenierungsanstieg im medialen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit zeigte. Dies deutet auf einen erhöhten Bedarf an neuronalen Kontrollmechanismen der Risikogruppe zur Bewältigung der steigenden Aufgabenschwierigkeit hin. Die protektive Gruppe zeigte hingegen eine erhöhte Oxygenierung im ventralen PFC mit steigender Aufgabenschwierigkeit, was möglicherweise auf einen präventiven Effekt hindeuten könnte.
Weiterführend wurden MCI-Patienten mit gesunden Probanden (n = 57 pro Gruppe) hinsichtlich des kognitiven Risikofaktors verglichen. Hierbei zeigte sich ein punktuell reduzierter Oxygenierunganstieg der MCI Patienten mit steigender Aufgabenschwierigkeit vor allem im ventralen PFC bei ebenfalls stabiler Verhaltensleistung. Die gefundene Reduktion könnte ein Zeichen für eine aufgebrauchte kognitive Reserve sein, welche Einbußen auf Verhaltensebene voranzugehen scheint.
Diese charakteristischen Unterschiede in den frontalen Oxygenierungsmustern von Risikogruppen (APOE, MCI) könnten als Biomarker zur Früherkennung von AD noch vor dem Auftreten kognitiver Einbußen dienen. Die fNIRS-Untersuchung während der Durchführung des TMT hat sich in diesem Zusammenhang als potentielles Instrument zur Frühdiagnose der präklinischen Phase der AD als geeignet erwiesen. Die Ergebnisse werden unter Einbezug des wissenschaftlichen Kontexts interpretiert und Implikationen für weitere notwendige Studien sowie die klinische Anwendbarkeit diskutiert.
Das humane Schädeldach besteht aus fünf Schädelplatten, die durch intramembranöse Ossifikation entstehen. Wenn diese in der Embryonalentwicklung aufeinandertreffen, bilden sich Schädelnähte aus, die eine Fusion der Schädelplatten verhindern und damit ein Schädelwachstum parallel zu Gehirnentwicklung ermöglichen. Für diesen Prozess ist eine Balance aus Zellproliferation und Differenzierung nötig, deren Aufrechterhaltung wiederum durch eine komplexe Regulation von verschiedenen Signalwegen gewährleistet wird. Störungen in diesem regulatorischen System können zu einer vorzeitigen Fusion der Schädelplatten, Kraniosynostose genannt, führen. Die Kraniosynostose ist eine der häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen beim Menschen. Durch kompensatorisches Wachstum an den nicht fusionierten Suturen entstehen charakteristische Schädeldeformationen, die sekundär einen erhöhten intrakranialen Druck zur Folge haben können. Eine vorzeitige Fusion der Suturen kann sowohl isoliert als auch syndromal zusammen mit weiteren klinischen Auffälligkeiten vorliegen. Bisher sind über 150 verschiedene Kraniosynostose Syndrome beschrieben und insgesamt 25-30% aller Kraniosynostose Patienten sind von einer syndromalen Form betroffen. Da die klinischen Merkmale der Kraniosynostose Syndrome variabel sind und zum Teil überlappen, ist eine klare klinische Diagnose häufig erschwert. Sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische Veränderungen können die Ursache für Kraniosynostosen sein. Vor allem bei syndromalen Kraniosynostosen wurden genetische Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen in den Genen FGFR2, FGFR3, TWIST1 und EFNB1, identifiziert. Darüber hinaus wurden chromosomale Veränderungen wie partielle Monosomien von 7p, 9p oder 11p sowie partielle Trisomien von 5q, 13q oder 15q mit Kraniosynostose assoziiert. Trotzdem ist in über 50% der Fälle die genetische Ursache unbekannt und die Pathogenese von Kraniosynostosen noch nicht vollständig geklärt.
Ziel dieser Arbeit war es neue genetische Ursachen bei Kraniosynostose Patienten zu identifizieren und so zur Aufklärung der Pathogenese beizutragen. Es wurde die genomische DNA von 83 Patienten molekulargenetisch durch Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH) oder durch ein speziell entworfenes Next Generation Sequencing (NGS) Genpanel untersucht. Bei 30% der Patienten konnte eine potentiell pathogene Veränderung identifiziert werden. Davon waren 23% chromosomale Aberrationen wie unbalancierte Translokationen, isolierte interstitielle Verluste und ein Zugewinn an genomischen Material. Bei zwei Patienten wurden unbalancierte Translokationen mit partieller 5q Trisomie nachgewiesen. Das Gen MSX2 liegt innerhalb des duplizierten Bereichs, sodass möglicherweise eine MSX2 Überexpression vorliegt. Für ein normales Schädelwachstum ist jedoch die richtige Menge an MSX2 kritisch. Des Weiteren wurde eine partielle Deletion von TCF12 detektiert, die in einer Haploinsuffizienz von TCF12 resultiert. TCF12 Mutationen sind mit Koronarnahtsynosten assoziiert. In einem anderen Fall lag das Gen FGF10 innerhalb der duplizierten 5p15.1-p12 Region. Das Gen kodiert für einen Liganden des FGF Signalwegs und wurde bisher noch nicht mit Kraniosynostose assoziiert. Aufgrund dessen wurden Analysen im Tiermodell Danio rerio durchgeführt. Eine simulierte Überexpression durch Injektion der fgf10a mRNA in das 1-Zell Stadium führte zu schweren Gehirn-, Herz- und Augendefekten.
Mittels NGS wurden 77% der potentiell pathogenen genetischen Veränderungen identifiziert. Hierfür wurde in dieser Arbeit ein Genpanel erstellt, das 68 Gene umfasst. Es wurden sowohl bekannte Kraniosynostose- als auch Kandidaten-Gene sowie Gene, die mit der Ossifikation assoziiert sind, in die Analyse eingeschlossen. Das Genpanel wurde durch die Sequenzierung von fünf Kontrollproben mit bekannten Mutationen erfolgreich validiert. Anschließend wurde die genomische DNA von 66 Patienten analysiert. Es konnten 20 (potentiell) pathogene Varianten identifiziert werden. Neben bereits bekannten Mutationen in den Genen FGFR1, FGFR2, FGFR3 und TWIST1, konnten zusätzlich 8 neue, potentiell pathogene Varianten in den Genen ERF, MEGF8, MSX2, PTCH1 und TCF12 identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei das Mutationsspektrum dieser Gene zu erweitern. Bei zwei der Varianten handelte es sich um potentielle Spleißvarianten. Für diese konnte in einem in vitro Spleißsystem gezeigt werden, dass sie eine Änderung des Spleißmusters bewirken. Der Nachweis von zwei seltenen Varianten in den Genen FGFR2 und HUWE1 hat außerdem dazu beigetragen die Pathogenität dieser spezifischen Varianten zu bekräftigen. Eine Variante in POR, die aufgrund bioinformatischer Analysen als potentiell pathogen bewertet wurde, wurde nach der Segregationsanalyse als wahrscheinlich benigne eingestuft. Zusammenfassend konnten bei etwa einem Drittel der Patienten, die mit dem NGS Genpanel analysiert wurden, eine genetische Ursache identifiziert werden. Dieses Genpanel stellt somit ein effizientes diagnostisches Tool dar, das zukünftig in der genetischen Routine-Diagnostik von Kraniosynostose-Patienten eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl eine Untersuchung auf CNVs als auch auf Sequenzänderungen bei Kraniosynostose Patienten sinnvoll ist.
Kürzlich wurden bei immunvermittelten Neuropathien Autoantikörper gegen Proteine
des paranodalen axoglialen Komplexes beschrieben. Deren Charakteristika,
Prävalenzen, pathophysiologische Relevanz sowie Bedeutung für Diagnostik
und Therapie sind jedoch noch nicht abschließend erforscht.
In dieser Studie wurden daher Seren und Plasmapheresematerial (PE-Material)
von 150 Patienten mit inflammatorischen Neuropathien, nämlich 105 mit chronisch
inflammatorischer demyelinisierender Polyneuropathie (CIDP), 21 mit Guillain-
Barré-Syndrom (GBS) und 24 mit multifokaler motorischer Neuropathie
(MMN), welche etablierte diagnostische Kriterien der jeweiligen Krankheit erfüllen,
sowie 74 Kontrollen mittels immunhistochemischen Färbungen an murinen
Zupfnervenpräparaten und/oder ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
auf Autoantikörper gegen die paranodalen Proteine Caspr, Contactin-1 und Neurofascin-
155 untersucht. Bei positivem Ergebnis wurde deren Spezifität mittels
immunhistochemischen Färbungen an transfizierten HEK (Human embryonic kidney)-
293-Zellen und Präinkubationsversuchen bestätigt. Es wurden die IgG-Subklassen
und die Antikörpertiter bestimmt und das Komplementbindungsverhalten
unter Zugabe von intravenösen Immunglobulinen (IVIG) mit zellbasierten und
ELISA-basierten Methoden analysiert. Klinische Merkmale und das Therapieansprechen
Antikörper-positiver Patienten wurden ermittelt und mit den experimentellen
Ergebnissen in Zusammenhang gesetzt.
IgG-Autoantikörper gegen Contactin-1 konnten bei vier Patienten mit CIDP nachgewiesen
werden, IgG-Autoantikörper gegen Caspr bei einem Patienten mit
CIDP und einer Patientin mit GBS. Es konnten keine weiteren Autoantikörper bei
CIDP-Patienten, GBS-Patienten, MMN-Patienten oder bei den Kontrollen detektiert
werden. Die Prävalenz von Autoantikörpern gegen axogliale paranodale Proteine
liegt somit in dieser Studie bei jeweils 4,76% bei CIDP und GBS und 0%
bei MMN. Die Antikörper gehörten bei Patienten in der akuten Erkrankungsphase
(zwei der CIDP-Patienten mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern und eine GBS-Patientin mit Anti-Caspr-Autoantikörpern) hauptsächlich den Subklassen IgG1
und IgG3 an, bei Patienten in der chronischen Phase (zwei der CIDP-Patienten
mit Anti-Contactin-1-Autoantikörpern, ein CIDP-Patient mit Anti-Caspr-Autoantikörpern)
überwog die Subklasse IgG4. Experimentell kam es zur Komplementbindung
und -aktivierung abhängig vom Gehalt der Subklassen IgG1-3, nicht
aber IgG4; diese konnte durch die Zugabe von IVIG dosisabhängig gemindert
werden. Alle Autoantikörper-positiven CIDP-Patienten zeigten einen GBS-artigen
Beginn mit einer schweren motorischen Beteiligung. Anti-Contactin-1-positive
Patienten kennzeichnete klinisch zusätzlich das Vorkommen einer Ataxie und eines
Tremors, Anti-Caspr-positive Patienten das Vorkommen starker neuropathischer
Schmerzen. Elektrophysiologisch standen neben Hinweisen auf eine Leitungsstörung
Zeichen einer axonalen Schädigung im Vordergrund. Als histopathologisches
Korrelat lagen eine nodale Architekturstörung und ein Axonverlust
vor. Die Patienten zeigten nur in der Anfangsphase der Erkrankung ein Ansprechen
auf IVIG. Bei drei CIDP-Patienten mit IgG4-Autoantikörpern (zwei Patienten
mit Anti-Contactin-1-Antikörpern und ein Patient mit Anti-Caspr-Antikörpern)
wurde eine Therapie mit Rituximab durchgeführt. Diese führte zu einer Titerreduktion
und zur zeitgleichen klinischen und elektrophysiologischen Befundbesserung
bei zwei Patienten.
Die in dieser Arbeit angewandten Screeningmethoden führten zum erfolgreichen
Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale axogliale Proteine. Die Patienten
mit positivem Autoantikörpernachweis definieren eine kleine Untergruppe mit
ähnlichen klinischen Merkmalen im Kollektiv der Patienten mit inflammatorischen
Polyneuropathien. Histopathologische Merkmale sowie das Therapieansprechen
auf antikörperdepletierende Therapie sprechen in Kombination mit den Ergebnissen
weiterer Studien zu paranodalen Autoantikörpern für eine pathogenetische
Relevanz der Autoantikörper. Mit einem charakteristischen, am Schnürring ansetzenden
Pathomechanismus könnten Neuropathien mit Nachweis von paranodalen
Autoantikörpern der kürzlich eingeführten Entität der Nodo-Paranodopathien
angehören. Die Komplementaktivierung und das Therapieansprechen der Patienten auf IVIG stehen möglicherweise in Zusammenhang mit der prädominanten
IgG-Subklasse. Diese könnte auch in Bezug auf die Chronifizierung eine
Rolle spielen. Der Nachweis von Autoantikörpern gegen paranodale Proteine hat
wohlmöglich in Zukunft direkte Konsequenzen auf das diagnostische und therapeutische
Prozedere bei Patienten mit CIDP und GBS; weitere klinische und experimentelle
Daten aus größeren, prospektiven Studien sind jedoch zum weiteren
Verständnis und zur Charakterisierung dieser Entität notwendig.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von Furcht und Angsterkrankungen stellt, neben der Furchtkonditionierung, die Generalisierung der konditionierten Furcht einen wesentlichen Mechanismus dar. Die der Generalisierung zugrunde liegenden psychologischen und biologischen Prozesse sind jedoch beim Menschen bisher nur wenig untersucht.
Ziel dieser Arbeit war, anhand eines neu entwickelten experimentellen Paradigmas den Einfluss eines psychometrisch bestimmbaren angstspezifischen Faktors sowie der mit Furcht und Angst assoziierten Genotypen Stathmin1, COMT Val158Met und BDNF Val66Met auf die Furchtkonditionierung und Generalisierung konditionierter Furcht zu untersuchen und somit mögliche Risikofaktoren für die Entstehung von Angsterkrankungen zu bestimmen. Hierfür wurden N = 126 gesunde Versuchspersonen (n = 69 weiblich; mittleres Alter M = 23.05, SD = 3.82) für die genannten Polymorphismen genotypisiert und zu ängstlichen und affektiven Symptomen befragt. In einer Akquisitionsphase wurden den Probanden zwei neutrale weibliche Gesichter präsentiert (CS), von denen eines mit einem Schrei sowie einem ängstlichen Gesichtsausdruck (UCS) gepaart wurde. Der sich anschließende Generalisierungstest erfolgte anhand von vier Gesichtern, die in der Ähnlichkeit zwischen den beiden CS schrittweise übergingen. Die Furchtreaktion wurde über die Bewertung von Valenz, Arousal und Kontingenzerwartung sowie über die Hautleitfähigkeitsreaktion (SCR) erfasst.
Die Analyse der Fragebögen anhand einer Hauptachsenanalyse und anhand von Strukturgleichungsmodellen erbrachte eine zweifaktorielle Lösung, die die Konstrukte Depression und Angst abbildete. Nur der Faktor Angst war mit einer veränderten Furchtkonditionierung und Furchtgeneralisierung assoziiert: Hoch Ängstliche zeigten eine stärkere konditionierte Furchtreaktion (Arousal) und wiesen eine stärkere Generalisierung der Valenzeinschätzung und Kontingenzerwartung auf. Für den Stathmin1 Genotyp ergaben sich geschlechtsspezifische Effekte. Bei den männlichen Versuchspersonen zeigte sich in Folge der Akquisition ein stärkerer Abfall der Valenz für den CS+ in der Gruppe der Stathmin1 T Allelträger, die ebenfalls eine stärkere Generalisierung der Furchtreaktion, abgebildet in allen verbalen Maßen, aufwiesen. Ein gegenteiliger Befund ergab sich für die Gruppe der Frauen, insofern eine mit dem Stathmin1 C Allel assoziierte höhere Generalisierung der Valenz, des Arousals und der Kontingenzerwartung festgestellt werden konnte. Für den COMT Val158Met Genotyp ergaben sich keine Einflüsse auf die Akquisition der konditionierten Furcht. Für Träger des COMT 158Val Allels zeigte sich jedoch eine stärkere Generalisierung der Valenz und der Kontingenzerwartung. Auch für den BDNF Val66Met Genotyp konnte keine Veränderung der Furchtakquisition beobachtet werden. Es ergaben sich jedoch Hinweise auf eine erhöhte Generalisierung der Kontingenzerwartung in der Gruppe der BDNF 66Val Homozygoten. Für keinen der beschriebenen Faktoren konnte ein Einfluss auf die Furchtkonditionierung oder deren Generalisierung anhand der SCR abgebildet werden.
Unsere Ergebnisse weisen auf einen psychometrisch erfassbaren Faktor und genetische Einflüsse hin, die über den Prozess einer stärkeren Generalisierung der konditionierten Furcht das Risiko für die Entstehung von Angsterkrankungen erhöhen können. Jedoch sollten die Befunde in größeren Stichproben repliziert werden. Neben der frühzeitigen Identifikation von Risikofaktoren sollten in zukünftigen Studien darüber hinaus wirksame Maßnahmen zur Prävention und Intervention entwickelt werden, um diesem Risiko entgegen zu wirken.
Der Tumorsupressor APC ist in der Mehrzahl aller Fälle kolorektaler Karzinome bereits in
der initialen Phase der Karzinogenese mutiert. Diese Mutationen führen zu einer aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges sowie zu weiteren die Karzinogenese vorrantreibenden Aktivitäten, beispielsweise einem veränderten Migrationsverhalten. Dieser Dissertation
zu Grunde liegt die Idee, dass durch die Trunkierung des APC-Proteins aber auch Abhängigkeiten von Genaktivitäten entstehen, die zuvor entbehrlich waren. Solche synthetisch
letalen Gene sollten in einem high-content shRNA-Screen gefunden werden.
Für die Durchführung des Screens wurde ein von der SW480 Kolonkarzinomzelllinie
abgeleitetes, isogenes Zellsystem generiert, welches durch Induktion mit Doxyzyklin das
vollständige APC-Allel (FL-APC) exprimiert. Infolge dieser Expression zeigen die Zellen
einen weniger malignen Phänotyp. Dies spiegelt sich darin wider, dass die Zellen durch
FL-APC Expression in ihrer Wnt-Signalwegsaktivität eingeschränkt werden. Doxyzyklininduzierte Zellen sind schlechter in der Lage ohne Adhäsion zu proliferieren als nicht induzierte Zellen. Andererseits ist ihre Fähigkeit einem FKS-gradienten entlang zu migrieren
verbessert.
Der shRNA-Screen wurde mit der Decipher shRNA-Bibliothek durchgeführt. Diese
enthält 27.500 verschiedene shRNAs mit Interferenzaktivität gegen 5.000 mRNAs, die potentiell pharmakologisch inhibierbare Proteine kodieren. Die besten zwei Kandidaten für
eine synthetisch letale Interaktion mit trunkiertem APC, BCL2L1 und EIF2B5 wurden im
Verlauf einer Masterarbeit bzw. direkt in dieser Disseration validiert. EIF2B5 zeigte in vitro nach Depletion durch unterschiedliche shRNAs einen di erentiellen Proliferationse ekt
bei FL-APC induzierten im Vergleich zu kontrollbehandelten Zellen. Dieser di erentielle
E ekt konnte in einem weiteren Modellsystem, SW480 Zellen mit konstitutiver FL-APC
Expression, ebenfalls validiert werden.
Durch Expression einer shRNA mit Aktivität gegen EIF2B5 werden in beiden Zellsystem die unfolded protein response (UPR) Gene DDIT3 und splXBP1 aktiviert. Interessanterweise werden durch die Expression von FL-APC diese Gene reprimiert. Im Promotor
der EIF2B5-mRNA be ndet sich eine Bindestelle für MYC. Es ist denkbar, dass durch die
Expression von FL-APC eine globale Veränderung der Genexpression vorgenommen wird,
die einerseits eine Repression von EIF2B5 nach sich zieht aber andererseits eine hierdurch
ausgelöste ER-Stress Antwort verhindert. Eine Inhibition von EIF2B5 ohne diese Adaption
andererseits führt nach diesem Model zu einer UPR-aktivierten Apoptose.
In einem zweiten Projekt wurde das überraschende Verhalten von Kolonkarzinomzellen untersucht, die nach Zugabe von BEZ235, einem dualen PI3K/mTOR Inhibitor, trotz
gegenteiliger Erwartungen MYC-Proteinmengen erhöhen. Eine Repression wurde erwar-
tet, weil die Inhibition von PI3K einerseits zu einer proteasomalen Destabiliserung und
andererseits die mTOR Inhibition zu einer verringerten Synthese von MYC führen sollte.
Während bereits gezeigt werden konnte, dass durch einen FOXO-vermittelten Mechanismus MAPK-abhängig die MYC-Expression verstärkt wird, wurde in dieser Dissertation
die erwartete Translationsinhibition untersucht. BEZ235 inhibiert zwar CAP-abhängige
Translation, das MYC Protein wird jedoch aufgrund einer IRES-vermittelten Translation
weiterhin exprimiert. Silvestrol, ein Inhibitor der Helikase eIF4A andererseits interveniert
mit CAP- und IRES-abhängiger Translation und kann die MYC-Proteinkonzentrationen
verringern. Wir konnten zudem feststellen, dass die Applikation von Silvestrol auch in vivo
möglich und wirksam ist und zudem tolleriert wird. Dies gibt Anlass zur Ho nung, dass
eine Intervention der Translation auch im Menschen eine valide Strategie zur Behandlung
MYC-getriebener Tumore sein könnte.
Die Synthese der mRNA durch die RNA-Polymerase II ist der zentrale und kritische Prozess im Rahmen
der Transkriptionsregulation Protein-kodierender Gene. Viele Jahrzehnte der intensiven Erforschung brachten viele Details über diesen Mechanismus zu Tage, der von einer unglaublichen Komplexität und Dynamik geprägt ist. Dabei stellte sich heraus, dass der Mediatorkomplex eine zentrale Rolle bei der Regulation der Polymerase II-abhängigen Transkription spielt, im Besonderen der Initiation. In der Funktion einer Schnittstelle verknüpft er die allgemeine Transkriptionsmaschinerie mit den Gen- spezifischen Transkriptionsregulatoren. Durch die Interaktion des Schwanzmoduls mit diesen Regulatoren und der Interaktion des Kopfmoduls mit der Polymerase II verbindet er wie eine Brücke die oberhalb des Promotors liegenden Aktivatorsequenzen mit dem Kernpromotor und initiiert so die Ausbildung des Pre-Initiationskomplexes. Darüber hinaus mehren sich gerade in den letzten Jahren die Hinweise darauf, dass der Mediator auch noch an anderen Prozessen der Transkription beteiligt ist. Zu diesen gehören z.B. die Elongation, die Ausbildung von Genschlaufen oder auch der Umbau der Chromatinstruktur. In Anbetracht der Tatsachen, dass der Mediator (a) aus bis zu 25 Untereinheiten mit flexibler Zusammensetzung besteht, (b) eine flexible Struktur besitzt und (c) umfassend und dynamisch über posttranslationale Modifikationen modifiziert ist, erscheint es durchaus möglich, dass der Mediator all diese Funktionen ausfüllt und die Rolle einer allgemeinen Transkriptionsplattform einnimmt. Im Zusammenhang mit dieser Dissertationsschrift ist es gelungen, den Mediator innerhalb all dieser Funktionen „abzubilden“ und die bisher umfassendste Interaktomanalyse dieses Komplexes zu präsentieren. Durch die optimierten Bedingungen der Zelllyse und Co-Immunopräzipitation, gelang es auch transiente Interaktionspartner zu isolieren. Durch das metabolische Markieren der Wildtypkontrolle konnten außerdem unspezifische und spezifische Interaktionen eindeutig voneinander unterschieden werden. Über 400 Proteine wurden als signifikante Interaktionspartner des Mediators identifiziert. Viele dieser Proteine konnten als vollständige Komplexe zusammengefasst werden, z.B die RNA-Polymerase II, alle allgemeinen Transkriptionsfaktoren, der SAGA-Komplex, viele Komplexe des Chromatin Remodelings und stark acetylierte Histone. Viele weitere Interaktionspartner spielen zudem eine Rolle bei der co-transkriptionalen Prozessierung der mRNA, wie z.B dem Splicing, dem mRNA-decapping oder Abbau. Darüber hinaus gibt es starke Hinweise darauf, dass der Mediator auch mit der Polymerase I und III interagiert und an der ribosomalen Biogenese beteiligt ist. Weitere
Analysen zeigten, dass das Interaktom zudem hochdynamisch ist
G-Quadruplex (G4)-Strukturen sind sehr stabile und polymorphe DNA und RNA Sekundärstrukturen mit einem konservierten Guanin-reichen Sequenzmotiv (G4-Motiv). Sie bestehen aus übereinander gestapelten planaren G-Quartetts, in denen je vier Guanine durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden.
Da G4-Motive in Eukaryoten an bestimmten Stellen im Genom angereichert vorkommen, wird angenommen, dass die Funktion von G4-Strukturen darin besteht, biologische Prozesse positiv oder negativ zu regulieren. Aufgrund der hohen thermodynamischen Stabilität von G4 Strukturen ist davon auszugehen, dass Proteine in die Faltung, Stabilisierung und Entfaltung dieser Nukleinsäure-Strukturen regulatorisch involviert sind. Bis heute wurden viele Proteine in der Literatur beschrieben, die G4-Strukturen entwinden können. Jedoch konnten bisher nur wenige Proteine identifiziert werden, die in vivo die Faltung fördern oder G4-Strukturen stabilisieren.
Durch Yeast One-Hybrid (Y1H)-Screenings habe ich Zuo1 als neues G4 bindendes Protein identifiziert. In vitro Analysen bestätigten diese Interaktion und es stellte sich heraus, dass Zuo1 G4-Strukturen stabilisiert. Übereinstimmend mit den in vitro Daten konnte gezeigt werden, dass Zuo1 signifikant an G4-Motive im Genom von Saccharomyces ceresivisiae bindet. Genomweit überlappen G4-Motive, an die Zuo1 bindet, mit Stellen, an denen die DNA Replikation zum Stillstand kommt und vermehrt DNA Schäden vorkommen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zuo1 eine Funktion während der DNA Reparatur oder in Zusammenhang mit dem Vorankommen der DNA Replikationsgabel hat, indem G4-Strukturen stabilisiert werden. Diese Hypothese wird außerdem durch genetische Experimente gestützt, wonach in Abwesenheit von Zuo1 die Genominstabilität zunimmt. Aufgrund dieser Daten war es möglich ein Model zu entwickeln, bei dem Zuo1 während der S-Phase G4-Strukturen bindet und stabilisiert wodurch die DNA Replikation blockiert wird. Diese Interaktion findet neben Stellen schadhafter DNA statt und unterstützt somit DNA Reparatur-Prozesse wie beispielsweise die Nukleotidexzisionsreparatur.
Als weiteres potentielles G4-bindendes Protein wurde Slx9 in Y1H-Screenings identifiziert. In vitro Experimente zeigten zwar, dass Slx9 mit höherer Affinität an G4-Strukturen bindet im Vergleich zu anderen getesteten DNA Konformationen, jedoch wurde in S. cerevisiae genomweit keine signifikante Bindung an G4-Motive festgestellt.